9 期卢燕等 : 高效液相色谱多阀多柱技术同时分析水溶性和脂溶性维生素 1443 制品检定所色谱条件色谱柱 :Acclaim PA 色谱柱,3 μm,3. 0 mm 150 mm, 用于水溶性维生素 ;Acclaim C18 色谱柱, 3 μm,3. 0 mm 150mm, 用于脂溶性

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萧羊
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1 第 31 卷第 9 期 2012 年 9 月环境化学 ENVIRONMENTAL CHEMISTRY Vol. 31,No. 9 September 年 11 月 29 日收稿. 高效液相色谱多阀多柱技术同时分析水溶性和脂溶性维生素卢燕许群通讯联系人,Tel: ;E mail:qun. Xu@ dionex. com ( 赛默飞世尔科技, 上海,200021) 陈静安保超摘要采用双三元高效液相色谱多阀多柱技术, 对同一样品中水溶性维生素和脂溶性维生素不同方法处理得到的样品进行双进样, 可同时分析样品中 21 种维生素. 该方法自动化程度高, 各组分保留时间的 RSD 值均小于 0 1%, 色谱峰面积的 RSD 值均小于 4. 5% (V C 除外 ), 各维生素的方法检出限可达 μg ml 范围, 本方法可用于多种样品的维生素检测和分析工作. 关键词水溶性维生素, 脂溶性维生素, 多阀多柱. 维生素是维持人类健康非常重要的一组化合物. 维生素被分为水溶性维生素和脂溶性维生素. 其中, 水溶性维生素主要包含 B 族维生素 : 硫胺 / B 1 核黄素 / B 2 烟碱 / 烟酸 / B 3 泛酸 / B 5 吡哆醇 / 盐酸吡哆醛 / B 6 叶酸 / B 9 钴胺素 / B 12 ; 以及抗坏血酸维生素 C. 脂溶性维生素主要包括视黄醇 ( 维生素 A), 生育酚 ( 维生素 E) 抗佝偻素 ( 维生素 D) 和抗出血维生素 ( 维生素 K). 这些维生素在人体代谢中起着非常特殊和重要的作用, 缺乏和过量都会造成健康问题. 维生素的供应依赖于饮食, 然而食物在保存, 处理和烹饪的过程中所包含的必须维生素含量会减少. 因此, 许多人会食用维生素片, 以及富含维生素的奶粉和饮料来补充所需维生素. 为了保证这些食品和药品的维生素含量, 必须要有相应的质量管理方法. 反相 HPLC 是分析维生素非常适合的一种方法 [1]. 在标准方法 [2 3] 和常用方法 [4 7] 中, 水溶性维生素使用含有低有机溶剂的水相流动相来测定, 而脂溶性维生素用有机溶剂的流动相. 这是由于两类维生素具有不同的溶解性和反相保留性能. 也有许多报道是同时分析水溶性和脂溶性维生素的. 但由于两种类型维生素的前处理方式差异大, 对于固体样品来说, 势必要用到多种溶剂来提取, 因此, 单次进样也就不太现实. 本方法采用多阀多柱串联模式, 对同一样品进行双进样分析, 可同时检测不同样品类型, 诸如多种维生素片和饮料中的水溶性和脂溶性维生素. 1 实验部分 1. 1 仪器 Dionex UltiMate 3000 HPLC 系统, 包含 :DGP 3600SD 双三元泵带 SRD 3600 脱气机 ;WPS 3000TSL 自动进样器 ;TCC 3200 带 2p 6p 切换阀的柱温箱 ;VWD 3400RS 紫外检测器 ;Chromeleon 6. 8 色谱工作站试剂去离子水,Milli Q R Gradient A10; 乙腈甲醇甲基叔丁基醚 (MTBE) 二氯甲烷,HPLC 级,Fisher; 磷酸二氢钾磷酸碳酸氢钾, 分析级,SCRC, 中国 ; 叶酸 (VB 9 ) 抗坏血酸 (VC) 叶绿醌 (VK 1 ) 生育酚 (VE) 醋酸生育酚酯 β 胡萝卜素视黄醇 (VA) 醋酸视黄酯, 98%,Sigma Aldrich; 视黄醇棕榈酸酯, Supelco; 硫胺素 (VB 1 ) 核黄素 (VB 2 ) 烟碱 (VB 3 ) 烟酸 (VB 3 ) 泛酸 (VB 5 ) 盐酸吡哆醇 (VB 6 ) 盐酸吡哆醛 (VB 6 ) 钴胺素 (VB 12 ) 钙化醇 (VD 2 ) 胆钙化醇 (VD 3 ) 叶黄素番茄红素, 97%, 中国药品生物

2 9 期卢燕等 : 高效液相色谱多阀多柱技术同时分析水溶性和脂溶性维生素 1443 制品检定所色谱条件色谱柱 :Acclaim PA 色谱柱,3 μm,3. 0 mm 150 mm, 用于水溶性维生素 ;Acclaim C18 色谱柱, 3 μm,3. 0 mm 150mm, 用于脂溶性维生素 ; 柱温 :25 ; 自动进样器温控 :15 ; 流动相 : 用于测定水溶性维生素 ( 右泵 ):A)25 mmol L 磷酸缓冲液 ( 在 1000 ml 水中溶解 3. 4 g KH 2 PO 4, 用磷酸调节 ph 值到 3. 6);B) 乙腈流动相 A(7 3,V / V);C) 甲醇甲基叔丁基醚 (MTBE)(7 3, V / V). 用于测定脂溶性维生素 ( 左泵 ):A) 甲醇乙腈 (8 2,V / V);B) 甲基叔丁基醚. 紫外检测和梯度见下表, 进样量 :10 μl. 时间 / min Table 1 表 1 双梯度泵流速梯度以及双阀波长切换过程表 (L: 左 ;R: 右 ) Flow rate,gradient of Dual Gradient pump and valve,wavelength switch (L:left;R:right) 左泵 / % 右泵 / % 流速 /(ml min ) 左泵右泵左阀右阀波长 / nm A B A B C 第一次进样 _1 6_ _ _ _ 第二次进样 _2 6_ _ 标准溶液配置及样品处理水溶性维生素 : 分别准确称取 mg 维生素 B 1 B 3 B 5 B 6 B 12 和维生素 C 粉末, 溶于 g 去离子水中, 配成 1. 0 mg kg 的储备液. 由于维生素 B 2 和 B 9 在水中的溶解性有限, 所以用 5 mmol L KOH 来制备 VB 2 的储备液, 用 20 mmol L KHCO 3 来制备 VB mg kg 的储备液. 由于维生素 C 和

1444 环境化学 31 卷 B 2 的稳定性问题, 随用随配. 脂溶性维生素 : 分别准确称取 10 20 mg 维生素 A 和它的醋酸盐棕榈酸盐,D 2 D 3 E 和它的醋酸盐粉末, 然后分别溶于 10 20 g 甲醇中, 配成 1. 0 mg kg 的储备液. 采用丙酮配制 VK 1 的储备液, 采用二氯甲烷配制 β 胡萝卜素叶黄素和番茄红素的储备液.

3 1444 环境化学 31 卷 B 2 的稳定性问题, 随用随配. 脂溶性维生素 : 分别准确称取 mg 维生素 A 和它的醋酸盐棕榈酸盐,D 2 D 3 E 和它的醋酸盐粉末, 然后分别溶于 g 甲醇中, 配成 1. 0 mg kg 的储备液. 采用丙酮配制 VK 1 的储备液, 采用二氯甲烷配制 β 胡萝卜素叶黄素和番茄红素的储备液. 由于 β 胡萝卜素的溶解性限制, 储备液浓度为 0. 5 mg kg. 储备液需保存在 4 条件下, 脂溶性维生素的储备液需避光保存. 在需要标准溶液的当天, 采用去离子水稀释水溶性维生素储备液, 采用甲醇二氯甲烷 (1 1,V / V) 稀释脂溶性维生素储备液. 样品准备 :1) 从维生素和矿物质补充片和动物饲料中提取水溶性维生素 : 把样品用研钵研碎, 准确称取 g 粉末到 100 ml 容量瓶, 加入 80 ml 水, 超声萃取 15 min 后加水到刻度 ;2) 提取脂溶性维生素 : 准确萃取 g 研碎粉末到 10 ml 容量瓶中加入 8 ml 甲醇二氯甲烷 (1 1,V / V), 超声萃取 15 min 后加甲醇二氯甲烷 (1 1,V / V) 到刻度 ; 处理好的样品溶液必须避光保存, 如果需要可以稀释. 进样前用 0. 2 μm 膜过滤. 2 结果与讨论 2. 1 双阀双柱双进样模式由于水溶性维生素和脂溶性维生素溶解性的差异, 很难用一种溶剂完全溶解. 因此, 两种维生素需要分别用反相 HPLC 和非水反相 HPLC 来测定. 非水反相 HPLC 中通常会采用一种或几种洗脱能力比甲醇和乙腈更强的试剂, 这里采用的是甲基叔丁基醚, 除了能有效洗脱脂溶性维生素外, 由于其和甲醇乙腈的密度相当, 混合效果更好, 可提供更佳的重现性. UltiMate 3000 双泵系统可以有效地把这两种分析系统整合在一起, 达到同时分析的目的. 通过紫外检测器的波长切换功能, 在最佳的色谱条件下, 两次进样可以同时分析 21 种水溶性和脂溶性维生素. 变色龙软件的自定义功能可允许在方法程序中添加进样命令. 如图 1 所示为双进样模式的阀切换示意. Fig. 1 同时测定水溶性和脂溶性维生素的阀切换示意图图 1 Schematic of valve switching for the simultaneous determination of water and fat soluble vitamins 如图 1 所示,(A)0. 00 min 时, 右泵连接自动进样器, 准备为水溶性维生素在 Acclaim PA 柱上的分析 ;(B)0. 50 min 时, 完成水溶性维生素的进样 ( 第一次进样 ), 切换右阀到 1_2 位置并连接左泵到自动进样器. 用于分析脂溶性维生素的 Acclaim 120 C18 柱此时在平衡 ;(C) min 时, 切换左阀到 1_2

4 9 期卢燕等 : 高效液相色谱多阀多柱技术同时分析水溶性和脂溶性维生素 1445 外置, 开始为脂溶性维生素进样 ( 第二次进样 ), 同时左泵和自动进样器连接到紫外检测器. 开始脂溶性维生素的分析. (D)10. 5 min 时, 完成第二次进样, 右阀切换到 6_1 位置, 右泵再次连接到自动进样器. 在分析脂溶性维生素的同时开始平衡 Acclaim PA 柱 min 时, 阀回归最初位置 (A) 标准溶液分析两次进样同时分析 21 种水溶性和脂溶性维生素的标准溶液结果见表 2. 水溶性维生素和脂溶性维生素的校正曲线是通过连续 5 次分别进 6 个不同浓度的混标而得到的. 通过外标法得到曲线和定量. 方法检出限由以下公式计算 : MDL = St(n,1 - α = 0. 99) 式中,t 为 99% 置信水平时 t 为 99% 置信水平自由度为 n 时 stduent s t 值 ;[n = 10 时,t = 3. 25];S 为标准偏差. 从结果可以看出, 虽然有两次进样和多次的阀切换, 但是各维生素的出峰时间重现性非常好. 由于个别维生素, 如维生素 C 稳定性差的原因会导致其峰面积的重现性稍差, 其它组分的峰面积重现性也都很好. 方法检出限范围在 μg ml 范围内. 表 2 21 种维生素分析结果 (n = 10) Table 2 Analysis result of 21 vitamins(n = 10) 色谱峰名称保留时间 RSD / % 峰面积回归方程线性范围 r / % RSD / % /(μg ml ) 校正曲线 RSD / % MDL /(μg ml ) 1 硫胺素 (B 1 ) A = C 抗坏血酸 (C) A = C 烟酸 (B 3 ) A = C 盐酸吡哆醛 (B 6 ) A = C 盐酸吡哆醇 (B 6 ) A = C 烟碱 (B 3 ) A = C 泛酸 (B 5 ) A = C 叶酸 (B 9 ) A = C 钴胺素 (B 12 ) A = C 核黄素 (B 2 ) A = C 视黄醇 (A) A = C 叶黄素 A = C 醋酸视黄酯 A = C 钙化醇 (D 2 ) A = C 胆钙化醇 (D 3 ) A = C 生育酚 (E) A = C 醋酸生育酚酯 A = C 叶绿醌 (K 1 ) A = C 番茄红素 A = C 视黄醇棕榈酸酯 A = C β 胡萝卜素 A = C 样品分析实际样品分析结果见表 3. 从结果可以看出, 用于人类服用的维生素补充片中富含多种水溶性和脂溶性的维生素, 对于特殊人群, 比如孕妇, 会添加更多孕妇所需维生素, 如叶酸. 而在鸡饲料中维生素种类相对较少. 在饮料中, 由于其溶解性的限制, 只检测到几种水溶性维生素. 同时对于实际样品的加标实

5 1446 环境化学 31 卷验显示, 该方法的回收率较好, 可用于多种样品的维生素检测. 表 3 样品 / 维生素 Table 3 样品中水溶性维生素和脂溶性维生素的分析 Analysis of water and fat soluble vitamins in the samples 标识 / 女士专用维生素片测得 / 基质加标 / 检测 1) / 回收率 / % 孕妇专用维生素片测得 / (mg g ) 标识 / (mg g ) (mg g ) (mg g ) (μg ml ) (μg ml ) B B B 3 烟碱烟酸 3) 水溶性维生素 B B 6 吡哆醇吡哆醛 B B ND 2) C A 醋酸视黄醇视黄醇棕榈酸酯脂溶性维生素 D D D 3 E 醋酸生育酚酯 K β 胡萝卜素样品 / 维生素鸡饲料样品标识 /(mg g ) 测得 /(mg g ) 某饮料样品标识 /(mg g ) 测得 /(mg g ) B B B 3 烟碱烟酸水溶性维生素 B B 6 吡哆醇吡哆醛 B B ND C A 醋酸视黄醇视黄醇棕榈酸酯脂溶性维生素 D D 2 D E 65 ND 醋酸生育酚酯 K 注 :1) 基质加标后的检验值减去基质检测值所得 ;2)ND 表示未检出 ;3) 表示未标识或未检测. 3 结论本方法采用液相中色谱多阀多柱技术, 通过两次进样, 同时分析样品中的水溶性和脂溶性维生素. 此方法可适用于不同类型的样品, 具有通用性. 此外, 该方法利用 Chromeleon 色谱软件和 UltiMate 3000

6 9 期卢燕等 : 高效液相色谱多阀多柱技术同时分析水溶性和脂溶性维生素 1447 液相系统出色的自动化控制, 实现了维生素全分析的新里程. 参考文献 [1 ] Nollet,Leo M L. Food analysis by HPLC;2nd Edition[M]. New York:Marcel Dekker,Inc.,2000 [2 ] 保健食品中盐酸硫胺素盐酸吡哆醇烟酸烟酰胺和咖啡因的测定 [S]. GB / T [3 ] 婴幼儿配方食品和乳粉维生素 A D E 的测定 [S]. GB / T [4 ] Moreno P,Salvado V. Determination of eight water and fat soluble vitamins in multivitamin pharmaceutical formulations by high performance liquid chromatography[j]. J Chromatogr A,2000,870: [5 ] 吴淑君, 庄志辉, 朱孟丽, 等. 高效液相色谱法测定保健品中的 6 种水溶性维生素及咖啡因 [J]. 色谱,2006,24:319 [6 ] 郝荣辉, 夏敏, 谷学新. 反相高效液相色谱同时测定动物营养液中脂溶性维生素 A,D 3 和 E[J]. 分析科学学报,2006,22: [7 ] Dionex Corporation. Determination of water and fat soluble vitamins in nutritional supplements by HPLC with UV detection[r]. Application Note 251,LPN 2533,2010,Sunnyvale,CA Determination of water and fat soluble vitamins by HPLC multi valve / column technology LU Yan XU Qun CHEN Jing AN Baochao (Thermo Fisher Scientific,Shanghai,200021,China) ABSTRACT This article tested a method with multi valve / column mode and two injections during the same analysis (injecting the extracts for water and fat soluble vitamins,respectively)which could determine 21 vitamins simultaneously. The method uses highly automated technology with good reproducibility. The relative standard deviations (RSDs)of each analyte for retention time are all less than 0. 1%,and that for peak area are all than 4 5% except for vitamin C (Vc). The MDL of all the vitamins is in the range of μg ml. This method can be used for vitamin analysis in different types of samples. Keywords:water soluble vitamins,fat soluble vitamins,multi valve / column mode.

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.

9 期卢燕等 : 高效液相色谱多阀多柱技术同时分析水溶性和脂溶性维生素 1443 制品检定所 色谱条件色谱柱 :Acclaim PA 色谱柱,3 μm,3. 0 mm 150 mm, 用于水溶性维生素 ;Acclaim C18 色谱柱, 3 μm,3. 0 mm 150mm, 用于脂溶性

9 期卢燕等 : 高效液相色谱多阀多柱技术同时分析水溶性和脂溶性维生素 1443 制品检定所色谱条件色谱柱 :Acclaim PA 色谱柱,3 μm,3. 0 mm 150 mm, 用于水溶性维生素 ;Acclaim C18 色谱柱, 3 μm,3. 0 mm 150mm, 用于脂溶性