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旧夏蒉
6 years ago
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1 RP-HPLC-MS 方法分析几种蛋白的胰蛋白酶酶解多肽产物的条件优化 AN_C_LC-4 张婷婷金燕赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司引言在生物体内, 蛋白的翻译后修饰过程是蛋白发挥各种不同生化功能的基础, 这些翻译后修饰包括糖基化氧化甲基化和磷酸化等作为生物药物的蛋白在生产运输保存过程中会产生变体, 从而影响到药物的活性和稳定性因此蛋白的肽谱经常被用来研究蛋白的翻译后修饰过程以及蛋白变体的存在同时也用于生物制药行业蛋 [-3] 白产品初级结构的确认, 从而更好地控制生化药品的质量和确保病人的用药安全本文采用胰蛋白酶酶解蛋白的方法, 得到各种蛋白的肽谱, 比较几款不同的反相色谱柱在分离蛋白酶解片断时的差异, 同时借助质谱, 评价蛋白酶解产物 - 多肽在酸性或者碱性流动相条件下表现出分离性能的差异仪器配置 Thermo Ultimate 3 系统 : 泵 :DGP-36RS; 自动进样器 : WPS-3TRS; 柱温箱 :TCC-3RS; 检测器 :DAD-3RS 质谱 :TSQ Vantage 色谱软件 :Chromeleon 6.8 测试条件与紫外检测器兼容的液相色谱条件色谱柱 : - Acclaim C8, 3mm 5mm, 3µm (P/N6369, S/N9); -Acclaim C8,.mm mm, 3µm (P/N593, S/N337); 3-Hypersil GOLD C4,.mm 5mm,.9µm (S/ N85 7, LOT63); 流动相 : 95% 超纯水 +5% 乙腈 +.%TFA:5% 超纯水 +95% 乙腈 +.8%TFA, 梯度洗脱 : Time/min A/% B/% 流速 :.5 ml/min (ID=3mm),.5 ml/min (ID=.mm) 分析时间 :6 min 检测器波长 :4 nm 进样量 : µl 柱温 :35 与质谱兼容的液相色谱条件色谱柱 :- Acclaim C8, 3mm 5mm, 3µm (P/ N6369,S/N9); -Acclaim C8,.mm mm, 3µm (P/N593, S/N337); 3-Hypersil GOLD C4,.mm 5mm,.9µm (S/ N85 7, LOT63); 流动相 :A:% 乙腈, B:98% 乙腈, C: mmol/l 醋酸铵, 用乙酸调节 ph=3.75, D:mmol/L 醋酸铵, 用氨水调节 ph=9.79, 梯度洗脱 : Time/min A/% B/% C/D%

2 流速 :.5 ml/min (ID=3mm),.5 ml/min (ID=.mm) 分析时间 :6 min 质谱条件 : 离子化方式 : ESI, Positive Voltage: 3 V; Capillary Temperature: 35. Vaporizer Temperature: 4. Sheath Gas Pressure: 4. arb, Ion Sweep Gas Pressure: arb Auxiliary Gas Pressure:. arb; Scan Range:5-5 质谱扫描参数 :Scan time.86 s 分辨率 :QPeak Width.7 FWHM. 进样量 : µl 柱温 :35 样品前处理准备牛血清白蛋白 (BSA) 马肌红蛋白细胞色素 C 以及胰蛋白酶 (Trypsin) 四种蛋白标准品胰蛋白酶酶解过程 : 称量 5 mg 蛋白到离心管中, 加入 ml 的 6 mol/l 的盐酸胍溶液 ( 盐酸胍固体溶解于 mmol/l 的 NH 4 HCO3, ph=8.), 溶解混匀 ; 加入 µl 的.5 mol/l 的二硫苏糖醇 (DTT) 到离心管中, 混匀在 56 保温 6 min; 3 冷却到室温; 4 加入 4 µl 的.5 mol/l 的碘乙酰胺到混合溶液中, 混匀避光在室温下放置 3 min; 5 加入 8 µl 的.5 mol/l 的 DTT 到混合溶液中, 混匀室温放置 3 min; 6 透析 (3.5KD 分子量 ) 烷基化的蛋白样品, 在 L 的 5 mmol/l 的甲酸铵溶液中室温透析 4 小时, 其中更换一次透析溶液 ; 7 将 mg 的胰蛋白酶溶解于 µl 的碳酸氢铵溶液 (. mol/l) 中取 µl 的胰蛋白酶溶液 ( µg/µl) 到蛋白混合液中混匀,37 酶解小时 ; 在沸水中加热 5 min 终止酶解反应 ; 8 酶解液用. µm 有机滤膜过滤, 直接上机分析结果和讨论前处理过程的考察胰蛋白酶酶解原理利用蛋白水解酶可将蛋白质水解, 产生小肽和多肽片断 ( 一般将个氨基酸以下的称为寡肽或者小肽, 个氨基酸以上的称为多肽 ) 胰蛋白酶为蛋白酶的一种, 是肽链内切酶, 选择地水解蛋白质中所有的由赖氨酸 (Lys) 或 ( 精氨酸 ) Arg 的羧基所构成的肽键酶水解的优点是专一性强, 利用不同的水解酶可有专一的切点, 在蛋白质的一级结构的测定上非常有用胰蛋白酶酶解过程考察按照样品前处理方法的胰蛋白酶酶解过程, 分别对三种蛋白 ( 细胞色素 C 牛血清白蛋白和马肌红蛋白 ) 进行酶解, 处理后样品在反相色谱条件下进行分析如图所示为马肌红蛋白酶解液的液相色谱图, 图为其中几个色谱峰的 MS 定性图谱, 表将部分马肌红质谱数据与文献中的质谱数据进行比较, 能够确认马肌红蛋白酶解的几个特征肽 [4] 谱, 表明胰蛋白酶酶解和分离的结果与文献一致, 满足分析要求 RT: E6 TIC F: + c [5.- 5.] MS c 图. 马肌红蛋白酶解液液相色谱图

3 A B 7.9 C E5 c#458 RT: 37.7 AV: F: + c [5.- 5.].35E6 c#989 RT: 7. AV: F: + c [5.- 5.].5E5 c#59 RT:.76 AV: F: + c [5.- 5.] 注 :A 图 : 保留时间 min 色谱峰对应的质谱图 ;B 图 : 保留时间 7.4 min 色谱峰对应的质谱图 ; C 图 : 保留时间.75 min 色谱峰对应的质谱图图. 马肌红蛋白酶解多肽片断的质谱图表. MS 确认马肌红蛋白酶解多肽片断 ( 与文献比较 ) Retention Time/min Expected Observed Range Sequence.75(double charged) VEADIAGHGQEVLIR 37.7(triple charged) KGHHEAELKPLAQSHATK 7.(single charged) ALELFR 色谱条件考察色谱柱对分离的影响比较不同的反相色谱柱对马肌红蛋白酶解肽谱的分析结果, 如图 3 所示分别在 Acclaim C8 (3 µm,3. 5mm) 和 Hypersil GOLD C4 (.9 µm,. mm) 色谱柱上分离结果, C4 色谱柱上的峰容量较大 (C4 为 39 个色谱峰,C8 为 3 个色谱峰 ), 同时分离度和柱效较 C8 色谱柱更佳 ( 参见放大图 ) 比较了两根色谱柱的差异,C4 色谱柱的填料粒径为.9 µm,c8 色谱柱的填料粒径为 3 µm, 根据 Van Deemter 方程 (H=A+B/u+Cu), 涡流扩散项 A 与固定相颗粒大小及填充的均匀性有关, 填料大小越均匀且粒径越小, 其分离柱效越高, 因此.9 µm 粒径的色谱柱分离度和柱效更好 35 马马马马马马马马马马 -C min min 图 3. 马肌红蛋白在 Acclaim C8 和 Hypersil GOLD C4 色谱柱上分离图谱

4 4 梯度条件对分离的影响比较了牛血清白蛋白 (BSA) 酶解液在不同梯度时间条件下的分离情况, 结果表明 : 针对肽谱比较复杂的蛋白质, 在起始和终止相同有机相比例的条件下, 适当延长梯度的时间, 能够显著提高肽段之间的分离度 3 流动相的 ph 对分离的影响在反相色谱条件下, 一般采用含. %TFA 的乙腈 / 水梯度洗脱的方法分离多肽片断, 而多肽是由碱性中性或酸性氨基酸缩合而成, 因此在碱性流动相条件下多肽色谱行为与酸性条件有差异, 基于色谱柱 Hypersil GOLD C4 能够耐受较宽的 ph 范围 (ph-), 比较了细胞色素 C 和马肌红蛋白的酶解液在 ph3.75 和 ph9.79 条件的分离图谱, 在酸性条件下的分离度和色谱峰容量更有优势, 但是碱性条件下也能分离一些肽段, 针对某些疏水性和低溶解性的多肽, 可考虑使用碱性条件进行分离考察了细胞色素 C 和马肌红蛋白酶解液在碱性和酸性条件下的分离结果, 并对其中的色谱峰用 MS 进行了定性分析如表所示细胞色素 C 的酶解肽段的保留时间顺序在酸碱条件下基本一致, 只是保留时间存在差异 ; 而表 3 显示马肌红蛋白的酶解肽段的保留时间顺序发生很大变化, 尤其是 =65.6 的色谱峰, 在碱性条件下是最后出峰, 而在酸性条件下是最先出峰因此针对不同的多肽片断其在碱性和酸性流动相条件下的保留行为会有较大的差异, 可以为我们后续的多肽分离分析工作提供一定的参考表. 碱性和酸性条件下细胞色素 C 酶解多肽色谱峰保留行为差异比较碱性 /min 酸性 /min 表 3. 碱性和酸性条件下马肌红蛋白酶解多肽色谱峰保留行为差异比较碱性 /min 酸性 /min 温度对多肽分离的影响图 4 和图 5 比较了温度对多肽分离的影响 (ph=9.75), 由图 4 可知, 随着温度的升高, 被考察的三个峰越来越靠近, 分离度减小, 并且通过 MS 对其中的小色谱峰进行定性跟踪分析, 结果得到更进一步确认 ; 而图 5 的分离结果恰恰相反, 随着温度的升高, 被考察的三个色谱峰分离度越来越好因此不同多肽的分离都有各自合适的温度, 不能一概而论, 为了达到最好的分离度, 需考察不同温度对分离的影响 e:\method development\...\data\c-6 6/9/3 7:4:58 AM RT: E5 UV c-ph E5 UV cph E5 UV c c-6 #94 RT: 5.93 AV:.3E4 F: + c [5.-5.] 图 4. 比较了温度对细胞色素 C 肽段分离的影响 (ph=9.75)

5 e:\method development\...\data\m-6 6/9/3 4:38:4 AM RT: E5 5 UV m-ph E5 UV m-ph E5 5 UV m AN_C_LC E5 m-ph#9 RT:.73 AV: F: + c 59.5 [5.-5.] E4 m-6#748 RT: 9. AV: F: + c ESI QMS [5.-5.] 图 5. 比较了温度对马肌红蛋白肽段分离的影响 (ph=9.75) 讨论本文考察了几种蛋白的胰蛋白酶酶解肽段在反相色谱条件下的分离行为通过对肽段的色谱分离和质谱定性确定了胰蛋白酶酶解过程的准确性, 在此基础上比较了不同色谱柱液相色谱梯度条件流动相 ph 和温度对多肽分离的影响, 并采用质谱进行定性, 结果对多肽的分离有一定的参考意义参考文献 [] Kauffman, J.S. Analytical Testing to Support Biopharmaceutical Products. Biopharm.International, 7, April, -5. [] Dionex Corporation. Phosphopeptide Enrichment Using a TiO Nano Precolumn, Application Note 53,LPN 898, Sunnyvale, CA. [3] Knight, Z.A.; Schilling, B.; Row, R.H.; Kenski, D.M.; Gibson, B.W.; Shokat, K.M. Phosphospecific Proteolysis for Mapping Sites of Protein Phosphorylation. Nat. Biotechnol. 3, : [4] Thermo Fisher Scientific. Separation of Peptides from Enzymatic Digestion on Different Acclaim Columns: A Comparative Study. AU 83,, Sunnyvale, CA 赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司免费服务热线 : ( 支持手机用户 ) AN_C_LC-4

2 图 1. TFA-Fix 技术的色谱系统结构图测试条件二仪器 :Ultimate DGP 3600 系列, 包括带有在线脱气单元的双三元梯度泵 DGP-3600RS 自动进样器 WPS-3000TRS 柱温箱 TCC-3000RS 检测器 DAD-3000RS 和 MS TSQ Vantage

2 图 1. TFA-Fix 技术的色谱系统结构图测试条件二仪器 :Ultimate DGP 3600 系列, 包括带有在线脱气单元的双三元梯度泵 DGP-3600RS 自动进样器 WPS-3000TRS 柱温箱 TCC-3000RS 检测器 DAD-3000RS 和 MS TSQ Vantage 采用柱后 TFA-Fix 技术或抑制器技术降低流动相中三氟乙酸 (TFA) 对多肽质谱信号抑制作用 Application Notes C_LC-39 引言在反相色谱分离多肽和蛋白质的实验中, 使用三氟乙酸 (TFA) 作为离子对试剂是常见的手段, 流动相中的三氟乙酸通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用, 来改善峰形克服峰展宽和拖尾问题同时反相色谱与电喷雾质谱联用已成为多肽和蛋白质的分子量测定和结构分析的重要工具,