2 图 1. TFA-Fix 技术的色谱系统结构图 测试条件二仪器 :Ultimate DGP 3600 系列, 包括带有在线脱气单元的双三元梯度泵 DGP-3600RS 自动进样器 WPS-3000TRS 柱温箱 TCC-3000RS 检测器 DAD-3000RS 和 MS TSQ Vantage
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1 采用柱后 TFA-Fix 技术或抑制器技术降低 流动相中三氟乙酸 (TFA) 对多肽质谱信号抑制作用 Application Notes C_LC-39 引言在反相色谱分离多肽和蛋白质的实验中, 使用三氟乙酸 (TFA) 作为离子对试剂是常见的手段, 流动相中的三氟乙酸通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用, 来改善峰形 克服峰展宽和拖尾问题 同时反相色谱与电喷雾质谱联用已成为多肽和蛋白质的分子量测定和结构分析的重要工具, 但是含有三氟乙酸的流动相对质谱离子的产生具有抑制作用, 一定程度上降低了液质联用技术的灵敏性和分析可靠性 目前常用的方法是降低流动相中 TFA 浓度, 达到降低这种抑制作用, 但是也会造成色谱分析质量的降低 ; 而如果用甲酸代替 TFA, 会造成色谱分离柱效降低, 达不到理想的分离效果 本文采用双三元液相色谱系统 (DGLC), 充分利用双泵的优势, 将两个泵分别作为流动相的输液泵和柱后溶液的传输泵, 实现与质谱的全自动连接 采用 TFA-Fix 技术或者抑制器技术降低流动相中 TFA 对 MS 的离子产生的抑制作用, 尤其是柱后抑制器技术大大提高了多肽样品在质谱上的灵敏度 测试条件一仪器 :Ultimate DGP 3600 系列, 包括带有在线脱气单元的双三元梯度泵 DGP-3600RS 自动进样器 WPS-3000TRS 柱温箱 TCC-3000RS 检测器 DAD-3000RS 和 MS TSQ Vantage 仪器连接装置见图 1 色谱质谱条件见表 1 表 1. 色谱质谱条件 右泵分析流动相 : 流动相 A:95%H 2 O+5%ACN+0.1%TFA 流动相 B:5%H 2 O+95%ACN+0.08%TFA 梯度条件 : 时间 /min A B 色谱条件 流速 :0.25 ml/min 色谱柱 :Acclaim C18,2.1 mm 150 mm, 3 µm (S/N002486,P/N059130) 左泵流动相 :1% 丙酸 : 异丙醇 = 20:80 流速 :50 µl/min 通过三通连接器与右泵 的流动相混合后进入 MS 分析 紫外检测器条件 :UV 214nm 离子化方式 :ESI, Postive Voltage: 3000 V Capillary Temperature: Vaporizer Temperature: 质谱条件 Sheath Gas Pressure: 40.0 arb Ion Sweep Gas Pressure: 0 arb Auxiliary Gas Pressure: 12.0 arb Scan Range: m/z 质谱扫描参数 :Scan time s 分辨率 :Q1Peak Width 0.7 FWHM.
2 2 图 1. TFA-Fix 技术的色谱系统结构图 测试条件二仪器 :Ultimate DGP 3600 系列, 包括带有在线脱气单元的双三元梯度泵 DGP-3600RS 自动进样器 WPS-3000TRS 柱温箱 TCC-3000RS 检测器 DAD-3000RS 和 MS TSQ Vantage 仪器连接装置见图 2 色谱质谱条件见表 2 表 2. 色谱质谱条件 右泵分析条件 : 流动相 A:95%H 2 O+5%ACN+0.1%TFA 流动相 B:5%H 2 O+95%ACN+0.08%TFA 梯度条件 : 时间 /min A B 色谱条件 流速 :0.25 ml/min 色谱柱 :Acclaim C18,2.1 mm 150 mm, 3 µm (S/N002486,P/N059130) 左泵条件 : 抑制器 : CSRS Ultra II, 2 mm, 化学抑制模式 再生溶液 :50 mm NH 4 HCO 3, 流速 1mL/min 紫外检测器条件 :UV 214nm 离子化方式 : ESI, Postive Voltage: 3000 V Capillary Temperature: Vaporizer Temperature: 质谱条件 Sheath Gas Pressure: 40.0 arb Ion Sweep Gas Pressure: 0 arb Auxiliary Gas Pressure: 12.0 arb Scan Range: m/z 质谱扫描参数 :Scan time s 分辨率 :Q1Peak Width 0.7 FWHM 样品前处理方法 细胞色素 C (Cytochrome C digest) 的溶液配制 : 将 1.6 nmol/l 的 固体样品溶解于 200 μl 流动相 A 溶液中, 得到 8 pmol/l 的待 测样品溶液, 具体样品分子量结构及分子量见下表 表 3. 细胞色素 C 酶解多肽片断的信息 Peptides Sequence (AA) Exper.mass Theor.mass(M) (MH+) (monoisotopic) s-1 KYIPGTK (+2) s-2 YIPGTK (+2) s-3 IFVQK (+2) s-4 KTGQAPGFSYTDANK (+2) s-5 TGQAPGFSYTDANK (+2) s-6 TGPNLHGLFGR (+2) s-7 GEREDLIAYLKK (+2) s-8 MIFAGIK (+1) s-9 EDLIAYLK (+1) s-10 IFVQKCAQCHTVEK (+2) s-11 GITWGEETLMEYLENPKK (+3) s-12 GITWGEETLMEYLENPK (+2) 结果与讨论 1.1 柱后 TFA-Fix 技术 柱后 TFA-Fix 技术原理 丙酸的沸点高于 TFA, 在 ESI 过程中,TFA 先挥发, 丙酸和分子离子形成的离子对稳定性较差, 倾向于形成丙酸根和准分子离子, 降低 TFA 的离子抑制效应, 提高样品在质谱中的灵敏度而不用改变 LC 的条件和分离效果 实验过程中以细胞色素 C 的酶解多肽作为样品进行分析, 比较了直接进样和柱后加入丙酸 / 异丙醇后多肽的在 MS 上的灵敏度, 由表 4 可知, 多肽样品的灵敏度平均提高 1.23 倍, 最高达到 1.77 倍
3 3 图 2. 柱后抑制器技术的色谱系统结构图 图 3. 柱后抑制器 CSRS 的抑制原理图 TFA-Fix 溶液不同丙酸含量的影响 比较了 TFA-Fix 溶液中不同丙酸含量对多肽片断的影响, 针对某些多肽 S-1 ( 图 4) S-5 ( 图 5) 和 S-11, 提高丙酸浓度能提高其灵敏度, 但多肽 S-4 和 S-7 ( 图 7) 灵敏度反而降低, 而对多肽 S-6 ( 图 6) 和 S-12 来说, 丙酸浓度对改变其灵敏 度影响不大 因此 TFA-Fix 的作用大小与样品本身性质的有 一定关系, 针对不同的待测物质来优化丙酸的含量对提高 样品的质谱灵敏度比较重要
4 4 表 4. TFA-Fix 技术对多肽的 MS 灵敏度 (S/N) 影响 : Samples m/z RT/ min S/N/ 直接进样 S/N / 1% 丙酸 Ratio/1% 丙酸 S/N / 2% 丙酸 Ratio/2% 丙酸 S S S S S S S S S S 图 4. 多肽样品 S-1 在直接进样及不同 TFA-Fix 丙酸浓度下灵敏度的比较 图 5. 多肽样品 S-5 在直接进样及不同 TFA-Fix 丙酸浓度下灵敏度的比较
5 图 6. 多肽样品 S-6 在直接进样及不同 TFA-Fix 丙酸浓度下灵敏度的比较 图 7. 多肽样品 S-7 在直接进样及不同 TFA-Fix 丙酸浓度下灵敏度的比较 1.2 抑制器技术 抑制器技术原理 柱后抑制器技术利用了 CSRS 的阴离子膜交换的原理 ( 如图 3 所示 ), 将再生液中的 HCO3- 交换流动相的 TFA-, 从根本上减少流动相中进入 MS 的 TFA 量, 达到降低 TFA 的抑制作用 ; 比较直接进 MS 和经过抑制器后再进质谱的多肽样品的灵敏度, 由表 5 可知, 经过抑制器抑制后大部分多肽的响应值显著提高 ( 图 9), 最高的可达到 10 倍以上 比较部分多肽样品 S-10 和 S12 ( 图 11) 抑制前后的灵敏度, 由表 5 可知, 抑制器抑制后多肽灵敏度反而降低, 可能原因 :a 与多肽本身结构有关, 因为是离子交换膜原理, 有可能有些多肽被作为离子交换到再生液中而降低其响应值 ;b 梯度条件乙腈含量越来越高, 而 CSRS 的离子交换膜对有机试剂的耐受性不好, 因此会影响后面出峰的多肽样品的灵敏度
6 6 表 5. 柱后抑制器抑制技术对多肽的 MS 灵敏度影响 (NH 4 HCO 3 浓度影响 ) Samples m/z RT / min 直接进样 S/N100 mm Ratio/100 mm S/N 50 mm Ratio/50 mm S/N 25 mm Ratio/25 mm NH 4 HCO 3 NH 4 HCO 3 NH 4 HCO 3 NH 4 HCO 3 NH 4 HCO 3 NH 4 HCO 3 NH 4 HCO 3 S S S S S S S S S S S 抑制器中不同再生液浓度对灵敏度的影响 比较了柱后抑制器的再生液浓度对多肽样品灵敏度的影响, 在 50 mmol/l NH 4 HCO 3 浓度时, 灵敏度较 100 mmol/l 和 25 mmol/l NH 4 HCO 3 更高, 如表 5 所示, 在此浓度条件下 HCO 3 - 能够最大限度地将 TFA 交换到再生液中, 从而更好降低 TFA 的影响 图 8. 多肽样品 S-1 在直接进样及不同再生液浓度下灵敏度的比较 图 9. 多肽样品 S-3 在直接进样及不同再生液浓度下灵敏度的比较
7 图 10. 多肽样品 S-6 在直接进样及不同再生液浓度下灵敏度的比较 图 11. 多肽样品 S-12 在直接进样及不同再生液浓度下灵敏度的比较 抑制器中不同再生液流速对灵敏度的影响 比较了柱后抑制器的再生液流速对灵敏度的影响, 随着流 速的增加, 灵敏度有降低的趋势 ( 如图 12 和图 13 所示 ), 所以一般推荐 1ml/min 作为最佳再生液的流速 表 6. 柱后抑制器抑制技术对多肽的 MS 灵敏度影响 ( 再生液流速影响 ): Samples m/z RT / min 直接进样 S/N/ Ratio/ S/N / Ratio/ S/N / Ratio/ 3ml/min 3ml/min 2ml/min 2ml/min 1ml/min 1ml/min S S S S S S S S S S S
8 图 12. 多肽样品 S-1 在直接进样及不同再生液流速下灵敏度的比较 图 13. 多肽样品 S-6 在直接进样及不同再生液流速下灵敏度的比较 总结 柱后 TFA-Fix 技术和抑制器离子交换的方法, 经过实验验证, 表明两种方法都具有降低流动相中 TFA 对多肽的质谱抑制作用, 提高样品在 MS 上的灵敏度 采用双三元液相色谱系统, 充分利用双泵的功能, 同时进行样品分析和柱 后自动试剂添加, 大大提高多肽样品在 MS 上的灵敏度 但是针对某些多肽样品可能反而降低其在 MS 上的灵敏度, 因此我们还需要做更细致工作来对这些技术作更深入的研究, 以扩大这项技术的应用范围
9 参考文献 [1] Wilson Z. Shou,Wang Naidong. Simple means to alleviate sensitivity loss by trifluoroacetic acid (TFA) mobile phases in the hydrophilic interaction chromatography electrospray tandem mass spectrometric (HILIC ESI/MS/MS) bioanalysis of basic compounds. Journal of Chromatography B, 2005,825: [2] Thomas M. Annesley. Ion Suppression in Mass Spectrometry. Clinical Chemistry,2003, 49(7): [3] Alex Apffel, Stenven Fisher, Gerson Goldberg, Paul C. Goodley, Frank E. Kuhlmann. Enhanced sensitivity for peptide mapping with electrospray Liquid chromatography-mass spectrometry in the presence of signal suppression due to trifluoroacetoc acidcontaining mobile phase. Journal of chromatography A, 1995, 712: Application Notes C_LC Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. ISO is a trademark of the International Standards Organization. All other trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries. This information is presented as an example of the capabilities of Thermo Fisher Scientific Inc. products. It is not intended to encourage use of these products in any manners that might infringe the intellectual property rights of others. Specifications, terms and pricing are subject to change. Not all products are available in all countries. Please consult your local sales representative for details. 上海上海浦东新金桥路 27 号 6 号楼 北京北京东城区安定门东大街 28 号雍和大厦西楼 F 楼 7 层 广州广州市东风中路 号时代地产中心 室 服务热线 成都成都市武侯区临江西路 1 号锦江国际大厦 1406 沈阳沈阳市沈河区惠工街 10 号卓越大厦 3109 室 西安西安市高新区科技路 38 号林凯国际大厦 单元 AN_C_LC-39
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