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窘盎颜
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1 第 26 卷第 3 期中国现代医学杂志 Vol. 26 No 年 2 月 China Journal of Modern Medicine Feb DOI: /j.issn 文章编号 : (2016) 论著慢病毒介导磷酸二酯酶 7A 基因沉默细胞株的构建及三磷酸腺苷结合盒转运体 A1 的表达变化鄢向乐, 唐菀泽, 张志珍, 马卫列 ( 广东医学院生物化学与分子生物学教研室, 广东东莞 ) 摘要 : 目的利用慢病毒介导构建磷酸二酯酶 7A( ) 基因沉默人单核巨噬细胞 (THP-1) 株, 并分析沉默细胞株的三磷酸腺苷结合盒转运体 A1(ABCA1) 的表达变化方法以基因为靶点, 设计合成 3 段 shrna 片段, 与慢病毒载体 PmiRzip 连接, 构建重组质粒测序鉴定后进行病毒包装, 感染 THP-1 细胞, 实时荧光定量聚合酶链反应 (qpcr) 进行分析, 确定最佳干扰片段嘌呤霉素筛选得到基因沉默稳转细胞株 qpcr 和 Western blot 检测鉴定所构建的细胞株, 将其诱导成为泡沫细胞后鉴定基因的表达结果转染 shrna1 shrna2 shrna3 细胞的 PDE7A 相对表达量分别为 (0.480±0.028) (0.561±0.016) 和 (0.377±0.013), 故选择 shrna3 作为干扰基因的最佳片段采用 1.4 g/l 嘌呤霉素成功筛选出沉默细胞株,qPCR 和 Western blot 检测基因的干扰效率, 其抑制效率 >70% 将其诱导成巨噬泡沫细胞后,Western blot 检测显示,ABCA1 的表达量增加 40% 结论成功构建 shrna 慢病毒干扰载体, 并筛选出基因沉默的 THP-1 细胞株, 且 ABCA1 的表达量增加关键词 : 磷酸二酯酶 7A;RNA 干扰 ; 慢病毒 ; 三磷酸腺苷结合盒转运体 A1 中图分类号 :R341 文献标识码 :A Construction of gene silencing THP-1 cell lines by 鄢 lentivirus-mediated RNA interference and expression of ABCA1 Le Xiang, Wan-ze Tang, Zhi-zhen Zhang, Wei-lie Ma (Department of Biochemistry and Molecular Biology, Guangdong Medical College, Dongguan, Guangdong , China) Abstract: Objective To construct phosphodiesterase 7A ( ) gene silence human acute monocytic leukemia (THP-1) cell lines by lentivirus-mediated RNA interference technique, and to analyze the expression of ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) in THP-1 cell lines. Methods Three human gene targeted shrna fragments (shrna1, shrna2 and shrna3) and shrna-nc fragment were designed and syn 原 thesized, then connected with lentiviral vector PmiRzip to construct recombinant plasmids. After DNA sequencing, the lentivirus was packaged, and infected the THP-1 cells. The inhibitory effect of shrnas was ana 原 lyzed by qpcr. Subsequently, the THP-1 cells were screened with Puromycin to get stable gene silencing cell lines which were then identified by qpcr and Western blot. The expression of ABCA1 was de 原 termined after THP-1 cells were induced to develop macrophage foam cells. Results The relative expression of in the cells transfected with shrna1, shrna2 or shrna3 was (0.480 依 0.028), (0.561 依 0.016) and (0.377 依 0.013) respectively; then shrna3 was chosen as interferent gene fragment. silence cell lines were successfully screened with 1.4 g/l Puromycin. gene interference efficiency was identi 原 fied by qpcr and Western blot, and inhibition efficiency was more than 70%. The expression of ABCA1 was 收稿日期 : 鄢基金项目 : 国家自然科学基金 (No: ); 广东省高等学校人才引进专项 [No: 粤财教 (2013)246 号 ] [ 通信作者 ] 马卫列, mazhangwu@163.com 1

2 中国现代医学杂志第 26 卷 increased by more than 40% after THP-1 cells were induced into macrophage foam cells. Conclusions silencing lentivirus interference vector has been successfully constructed, and gene silencing THP-1 cell lines have been screened out in which ABCA1 expression is increased. Keywords: phosphodiesterase 7A; RNA interference; lentivirus; ATP-binding cassette transporter A1 胆固醇在巨噬细胞中积累是动脉粥样硬化形成的关键因素, 促进细胞中胆固醇的逆向转运 (reverse cholesterol transport,rct) 是防治动脉粥样硬 [1-2] 化的有效方法三磷酸腺苷结合盒转运体 A1(ATP binding cassette transporter A1,ABCA1) 主要转运细胞内胆固醇至贫脂的载脂蛋白 A-1(apolipoprotein A-1,apoA-1), 通过增加高密度脂蛋白来启动 RCT, 促进细胞中胆固醇外排磷酸二酯酶 7A(phosphodiesterase 7A,PDE7A) 作为环腺苷一磷酸 (cyclic adenosine monophosphate, camp) 特异性蛋白水解酶, 可降低细胞中 camp 浓 [3-4] 度 camp 作为第二信使, 通过 camp/pka 信号通 [5-6] 路上调 ABCA1 表达, 促进细胞内胆固醇外流因此, 干扰细胞 PDE7A 的表达, 使细胞内 camp 浓度增加而上调 ABCA1 表达, 进而促进胆固醇外流为研究 PDE7A 在促进细胞内胆固醇外流中的作用, 需要构建合适的细胞模型本实验以人单核巨噬细胞 (human acute monocytic leukemia cell line,thp-1) 为研究对象, 通过慢病毒介导的 shrna 干扰技术构建基因沉默细胞株, 为后续研究基因功能及巨噬细胞内胆固醇逆向转运提供实验基础 1 材料与方法 1.1 细胞株与主要试剂 THP-1 细胞购自湘雅医学院细胞库,HEK-293FT 细胞 HEK-293T 细胞及慢病毒包装系统由中国医学科学院医药生物技术研究所免疫生物学室惠赠, Lipofectine2000 购自美国 Life 公司, 改良杜氏伊格尔培养基 (dulbecco modified eagle medium,dmem) 洛斯维 -1640(roswell park memorial institute 1640, RPMI 1640) 培养基胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS) 购自美国 Gibco 公司, 嘌呤霉素购自美国 Sigma 公司, 聚凝胺 (Polybrene) 购自上海翊圣生物科技有限公司, 佛波酯 (phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA) 购自美国 Promega 公司,ac-LDL 购自上海经科化学科技有限公司,apoA-1 购自美国 Sigma 公司, 无内毒素质粒大提试剂盒购自北京天根生物公司, 荧光定量聚合酶链反应 (polymerase chain reaction,pcr) 试剂盒购自大连宝生生物工程有限公司兔抗甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 (glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase,gapdh) 一抗购自杭州至贤生物公司, 兔抗 PDE7A 一抗购自英国 Abcam 公司, 兔抗 ABCA1 一抗购自美国 Sigma 公司, 辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase,hrp) 标记的山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥公司 1.2 方法 shrna 设计合成根据 GenBank 中 mrna 全序列 (NM_002603) 及短发夹 RNA(shRNA) 设计原则, 分别设计合成 3 条靶序列和阴性对照序列的 shrna 寡核苷酸单链 :15'-GGCCATGCACTG TTACTTAAA-3';25'-GAAATAGTCTAGTAAGCTTA A-3';35'-GATCGTCACACTGAATCTATT-3';4NC: 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3', 由上海吉泰生物技术有限公司合成慢病毒干扰载体构建及慢病毒包装 1 慢病毒干扰载体构建 : 将设计合成的 3 条靶序列和阴性对照序列连接到慢病毒载体 Pmi Rzip 中, 构建重组质粒 PmiRzip-shRNA1 PmiRzip-shRNA2 Pmi RzipshRNA3 PmiRzip-shRNA-NC; 将重组质粒转化为大肠杆菌 DH5α, 筛选得到单菌落, 挑取单菌落扩大培养, 提取质粒用 Ⅰ 和 Ⅰ 双酶切鉴定, 实验重复 >3 次将酶切鉴定结果一致的质粒, 送上海吉泰生物技术有限公司进行测序 2 慢病毒包装 : HEK-293FT 细胞铺 10 cm 培养皿,37 5% 二氧化碳 CO 2 培养至细胞密度约为 85% 时, 更换无抗生素无血清的 DMEM 培养基取 10.0ml 离心管, 加入 1.5 ml 无血清无双抗 DMEM, 按 pmd 2.0 pspax2 Pmi Rzip-shRNA=1 1 2 加入 24μg 质粒进行稀释取 1.5 ml Ep 管, 各加 1.5μl 无血清无双抗 DMEM, 加入 48μl Lipofectamine 2000, 轻轻混匀, 静置 5min; 将稀释的 Lipofectamine 2000 与稀释质粒混匀, 静置 15 min 后制备成转染复合物将质粒与 Lipofectamine2000 的复合物加入培养皿中, 轻轻震荡, 使复合物均匀地分散在细胞中 ;37 5% CO 2 培养 6h 后更换新鲜无抗生素的 DMEM 完全培养基继续培养,48 h 后在荧光显微镜下观察转染效率, 收集病毒, 用 0.45μm 滤器过滤, 装, 置入 -80 冰箱冷冻保存病毒包装实验重复 >3 次 2

3 第 3 期向乐, 等 : 慢病毒介导磷酸二酯酶 7A 基因沉默细胞株的构建及三磷酸腺苷结合盒转运体 A1 的表达变化 3 慢病毒滴度的测定 : 将 HEK-293T 细胞培养至对数生长期, 经胰酶消化后, 按个细胞 / 孔, 接种 96 孔板, 待细胞长至 30%~50% 密度时, 更换含病毒的完全培养基, 病毒用含有 10%FBS 的 DMEM 培养基进行梯度稀释 48 h 后去除含慢病毒的培养基, 加入 100μl 完全培养基 96h 后在荧光显微镜下观察各孔荧光细胞数, 病毒滴度为表达荧光的细胞数乘以相应稀释倍数慢病毒 shrna 干扰效果鉴定接种 THP-1 细胞于 24 孔板, 每孔个细胞, 加入聚凝胺 (Polybrene) 至浓度 8g/L 12 h 后用 RPMI 1640 完全培养基将病毒浓缩液稀释 5 倍, 加入 Polybrene 至浓度 8g/L, 弃 24 孔板的培养基, 加入含病毒的 RPMI 1640 完全培养基 24 h 后更换新鲜 RPMI 1640 完全培养基, 培养 72 h 后实时荧光定量聚合酶链反应 (real-time quantitative polymerase chain reaction, Real-time qpcr) 鉴定最佳干扰片段沉默细胞株的构建 1 嘌呤霉素最佳浓度确定 : 将 THP-1 细胞接种至 24 孔板, 个细胞 / 孔, 置 37 CO 2 培养箱中培养 24h 分别用和 1.6 g/l 嘌呤霉素对正常 THP-1 细胞进行筛选预实验,14 d 后观察细胞全部死亡的最小浓度作为最佳筛选浓度 2 建立 PDE7A 沉默细胞株 : 接种 THP-1 细胞至 6 孔板, 个细胞 / 孔, 加入 Polybrene 至浓度 8g/L 12h 后用 RPMI 1640 完全培养基将最佳干扰片段 shrna3 病毒上清液稀释 5 倍, 加入 Polybrene 至浓度 8g/L, 弃 6 孔板的培养基, 加入含病毒的 RPMI 1640 完全培养基 24 h 后更换新鲜 RPMI 1640 完全培养基, 培养 48 h 后用 0.4 g/l 嘌呤霉素 RPMI 1640 完全培养基筛选细胞, 正常 THP-1 细胞做对照组, 逐渐增加嘌呤霉素的浓度至最佳筛选浓度 1.4 g/l, 直至无细胞死亡连续培养 50 代后, 采用 qpcr 和 Western blot 检测鉴定 PDE7A 的表达沉默细胞株的鉴定 1 基因沉默细胞株的 qpcr 鉴定 : 分别取 THP-1 细胞沉默的 THP-1 细胞和 shrna-nc-thp-1 细胞, 按 RNA 提取试剂盒说明书进行提取各细胞的总 RNA, 逆转录成 cdna 以 GAPDH 为内参, 使用 Light Cycler@96 实时荧光定量 PCR 仪检测 THP-1 细胞和各组基因沉默细胞基因的相对表达, 实验重复 3 次 2PDE7A 蛋白表达分析, 分别取 THP-1 细胞沉默的 THP-1 细胞和 shrna-nc-thp-1 细胞,800 r/min 离心 5min 去培养基, 加入细胞裂解液置冰上裂解 40 min; r/min 离心 10 min; 加入 5 十二烷基硫酸钠 (sodium dodecyl sulfate,sds) 上样缓冲液, 沸水浴中变性 5min; 进行 10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳, 将蛋白电转至聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene fluoride, PVDF) 膜,5% 牛血清蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 封闭 2h; 分别用 PDE7A 和 GAPDH 抗体 4 孵育过夜 ;TBST 缓冲液 (tris buffered saline with tween-20,tbst) 洗膜 5 次, 每次 5min, 加入二抗, 室温孵育 2h,TBST 洗膜 5 次, 每次 5min, 加入增强化学发光法 (enhanced chemiluminescence,ecl) 化学发光试剂后进行成像, 并用蛋白灰度分析软件分析结果, 实验重复 3 次 Western blot 检测沉默的巨噬泡沫细胞中 ABCA1 的表达取 6 孔板, 个细胞 / 孔, 实验分 4 组第 1 2 组接种 THP-1 细胞 ; 第 3 组接种 shrna-nc-thp-1 细胞, 第 4 组接种沉默的 THP-1 细胞加入 PMA 至终浓度 160 nmol/l, 37 5%CO 2 培养 48h, 使悬浮细胞分化为贴壁巨噬细胞加入含 0.2%BSA 和 37.5 g/lac-ldl 的 1640 完全培养基,37 5%CO 2 培养 48 h, 使巨噬细胞变为泡沫细胞加入含 10 g/l apoa-1 的 1640 完全培养基,12 h 提取蛋白,Western blot 检测分析泡沫细胞中 ABCA1 的表达 1.3 统计学方法采用 SPSS 17.0 统计软件进行数据分析, 计量资料以均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 用单因素方差 (Oneway,ANOVA) 分析, 两两比较用 LSD- 检验, <0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 慢病毒干扰载体的构建根据的基因序列设计 3 段寡核苷酸片段, 构建慢病毒重组质粒, 用 Ⅰ 和 Ⅰ 双酶切鉴定 ( 见图 1) 将阳性重组质粒测序, 证实插入的核酸序列与前期设计完全一致 ( 见图 2), 提示基因 shrna 慢病毒表达载体构建成功 2.2 慢病毒包装如图 3 所示, 按 pmd2.0 pspax2 Pmi RzipshRNA=1 1 2 共转染 HEK-293FT 细胞,37 5% CO 2 培养 6h, 更换新鲜无抗生素的 DMEM 完全培养基继续培养,48 h 后在荧光显微镜下观察转染 3

4 中国现代医学杂志第 26 卷 M NC bp M:Marker;NC:PmiRzip-shRNA-NC;1:PmiRzip-shRNA1; 2:PmiRzip-shRNA2;3:PmiRzip-shRNA3 图 1 慢病毒重组质粒的双酶切鉴定有效率 >90% 2.3 慢病毒滴度测定将 HEK-293T 细胞按个细胞 / 孔, 接种 96 孔板, 待细胞长至 30%~50% 的密度时, 更换含病毒的完全培养基, 病毒用含有 10% FBS 的细胞培养液梯度稀释至 ~ h 后去除含慢病毒的培养基, 加入 100μl 完全培养基 96 h 后在荧光显微镜下观察各孔荧光细胞数, 病毒滴度为 A B C D A:PmiRzip-shRNA-NC;B:PmiRzip-shRNA1;C:PmiRzip-shRNA2;D:PmiRzip-shRNA3 图 2 慢病毒重组质粒测序图谱 4

5 第 3 期向乐, 等 : 慢病毒介导磷酸二酯酶 7A 基因沉默细胞株的构建及三磷酸腺苷结合盒转运体 A1 的表达变化 A B C D E F G H A:PmiRzip-shRNA1 转染后的绿色荧光 ;B:PmiRzip-shRNA2 转染后的绿色荧光 ;C:PmiRzip-shRNA3 转染后的绿色荧光 ;D: PmiRzip-shRNA-NC 转染后的绿色荧光 ;E:PmiRzip-shRNA1 转染后的白光 ;F:PmiRzip-shRNA2 转染后的白光 ;G:PmiRzip-shRNA3 转染后的白光 ;H:PmiRzip-shRNA-NC 转染后的白光图 3 共转染 48h 后 HEK-293FT 细胞荧光显微镜观察结果 ( 100) TU/ml 见图 shrna 片段的干扰效果分析 3 个干扰片段和阴性对照组病毒稀释液感染 THP-1 细胞,72h 后荧光显微镜下观察, 感染有效率达 90%( 见图 5) 通过 qpcr 分析, 感染 shrna1 shrna2 和 shrna3 片段慢病毒细胞的 PDE7A A B C D E F G H I J 5

6 中国现代医学杂志第 26 卷 K L M N A~G: 病毒稀释 ~ 感染 HEK-293T 细胞的荧光表达 ;H~N: 白光下的 HEK-293T 细胞图 4 病毒稀释液感染 HEK-293T 细胞的荧光图 ( 100) A B C D E F G H A: 含 shrna1 片段的绿色荧光 ;B: 含 shrna2 片段的绿色荧光 ;C: 含 shrna3 片段的绿色荧光 ;D: 含 shrna-nc 片段的绿色荧光 ;E: 含 shrna1 片段的白光 ;F: 含 shrna2 片段的白光 ;G: 含 shrna3 片段的白光 ;H: 含 shrna-nc 片段的白光图 5 慢病毒感染 THP-1 细胞 72h 后荧光显微镜下观察结果 ( 100) 相对表达量分别为 (0.480±0.028) (0.561±0.016) 和 (0.377±0.013), 提示 shrna3 片段对 PDE7A 干扰效果较好, 故后续实验选择 shrna3 片段作为干扰片段 2.5 嘌呤霉素最佳浓度确定本实验分别用和 1.6 g/l 嘌呤霉素对正常 THP-1 细胞进行筛选,14 d 后 0.4 g/l 少部分细胞死亡,0.8 g/l 大部分细胞死亡,1.4 g/l 细胞几乎全部死亡, 故确定嘌呤霉素最佳浓度为 1.4 g/l 2.6 沉默细胞株的鉴定连续培养 50 代后,qPCR 结果表明, shrna- NC-THP-1 和 shrna3- THP-1 细胞中 mrna 相对表达量分别为 (0.859±0.016) 和 (0.293±0.032), 差异有统计学意义 ( =0.000)( 见图 6 和表 1 ) Western blot 检测 THP-1 细胞 shrna- NC-THP-1 和 shrna3- THP-1 细胞中 PDE7A 蛋白表达 ( 见图 7 和表 2) 蛋白灰度分析软件分析表明,shRNA3-THP-1 细胞中 PDE7A 蛋白的相对表达量为 (0.153±0.025), 差异有统计学意义 6

7 第 3 期向乐, 等 : 慢病毒介导磷酸二酯酶 7A 基因沉默细胞株的构建及三磷酸腺苷结合盒转运体 A1 的表达变化 kd ABCA kd GAPDH : 正常 THP-1 细胞 ;2: 含 shrna-nc 病毒感染细胞 ;3: 含 1.0 shrna3 病毒感染细胞 ; 与正常 THP-1 细胞比较, <0.01 图 6 mrna 相对表达水平 0.5 表 1 mrna 在 THP-1 shrna-nc-thp-1 和 shrna3-thp-1 的相对表达水平方差分析变异来源 SS df MS 值值处理组间误差合计 :Ac-LDL 处理组 ;2:apoA-1 处理组 ;3:shRNA-NC 处理组 ;4: shrna3 处理组 ; 与 apoa-1 处理组比较, <0.01 图 8 不同处理组 ABCA1 蛋白的相对表达量组比较,shRNA3 处理组 ABCA1 蛋白相对表达量为 (1.400±0.023), 差异有统计学意义 ( =0.000) 56 kd PDE7A 3 讨论 37 kd GAPDH 1:THP-1 细胞 ;2:shRNA-NC 病毒感染细胞 ;3:shRNA3 病毒感染细胞图 7 PDE7A 蛋白相对表达水平表 2 PDE7A 蛋白在 THP-1 shrna-nc-thp-1 和 shrna3-thp-1 的相对表达水平方差分析变异来源 SS df MS 值值处理组间误差合计 ( =0.000) 2.7 沉默的巨噬泡沫细胞中 ABCA1 蛋白相对表达水平 Western blot 检测巨噬泡沫细胞各组中 ABCA1 的相对表达量 ( 见图 8 和表 3), 与 apoa-1 处理表 3 不同处理组的 ABCA1 蛋白相对表达水平的方差分析变异来源 SS df MS 值值处理组间误差合计 camp 作为第二信使在细胞内有重要作用, 当其含量变化时会使细胞内信号通路细胞的增殖及新陈代谢等生理活动受影响细胞内 camp 含量受腺苷酸环化酶 (adenylate cyclase,ac) 和磷酸二酯酶 (phosphodiesteras,pdes) 的动态调节, 通过专一性抑制 PDEs 活性, 可减少细胞内 camp 降解, 促进细胞内过量胆固醇流出,PDEs 抑制剂用于抗动脉粥样硬 [7] 化形成受到关注细胞内 camp 特异性 PDEs 主要为 PDE4 和 PDE7 [8] 临床上, 现有的 PDE4 抑制剂有 [9] 明显的副作用, 如呕吐痉挛, 所以需要寻找新的 PDEs 抑制剂 PDE7 家族有两种亚型即 PDE7A 和磷酸二酯酶 7B(phosphodiestera 7B,PDE7B), 主要 [10] 分布在免疫和炎症细胞中, 已有多种合成抑制剂 PDE7B 广泛分布于人体不同组织器官, 而 PDE7A 则局限于心脏等器官, 且 PDE7A 表达水平比 PDE7B 高出约 10 倍, 通过 camp/pka 通路调节 ABCA1 介导的胆固醇流出, 可作为新的心血管疾病治疗靶点本实验选择人单核 THP-1 细胞作为靶细胞, 针对基因设计干扰片段, 与慢病毒载体连接构建重组质粒, 经转化质粒抽提后, 电泳与基因测序鉴定慢病毒 PDE7A 干扰载体构建成功 PDE7A 慢病毒干扰载体与病毒包装质粒共转染 HEK-293FT, 7

8 中国现代医学杂志第 26 卷荧光显微镜下观察到大量绿色荧光蛋白表达, 显示慢病毒成功包装慢病毒感染 THP-1 细胞后经嘌呤霉素筛选出稳定的干扰细胞株,qPCR 和 Western blot 检测证实 PDE7A 的干扰效率可达 70% ABCA1 作为主要体内转运体将细胞内胆固醇排出至 apoa-1, 是高密度脂蛋白 (high density lipoprotein, HDL) 颗粒形成的关键过程 apoa-1 与 ABCA1 结合后促进细胞胆固醇流出, 促使贫脂的 apoa-1 形成富 [11-13] 含胆固醇的 HDL 进入 RCT 循环实验结果显示, apoa-1 处理组比 Ac-LDL 处理组的 ABCA1 表达量升高, 提示 apoa-1 可通过提高 ABCA1 表达, 增强泡沫细胞内胆固醇的流出,shRNA3-apoA-1 处理组的 ABCA1 表达量比 apoa-1 处理组增加 40%, 说明干扰后基因的 ABCA1 表达量增加本实验为进一步研究 PDE7A 在胆固醇逆向转运中的作用提供实验基础, 同时也为发现新的治疗心血管疾病药物提供潜在靶点参考文献 : [1] Yin K, Liao DF, Tang CK. ATP-binding membrane cassette transporter A1 (ABCA1): a possible link between inflammation and reverse cholesterol transport[j]. Mol Med, 2010, 16(9): [2] Lin G, Bornfeldt KE. camp-specific PDE4 inhibitors promote ABCA1 expression and cholesterol efflux[j]. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 290(2): [3] Irene P, Emanuela M, Carmen G, et al. PDE-7 Inhibitors: new potential drugs for the therapy of spinal cord injury [J]. PLoS One, 2010, 1(6): [4] Hu YW, Ma X, Li XX, et al. Eicosapentaenoic acid reduced ABCA1 serine phosphorylation and impairs ABCA1-dependent cholesterol sfflux through cyclic AMP/protein kinase A signaling pathway in THP-1 macrophage-derived foam cells[j]. Atherosclerosis, 2009, 204(2): [5] Shao B, Tang C, Sinha A, et al. Humans with atherosclerosis have impaired ABCA1 cholesterol efflux and enhancedhigh-density lipoprotein oxidation by myeloperoxidase[j]. Circ Res, 2014, 114(11): [6] Feig JE, Hewing B, Smith JD, et al. High-density lipoprotein and atherosclerosis regression: evidence from preclinical and clinical studies[j]. Circ Res, 2014, 114(1): [7] 饶勇, 马卫列, 张志珍, 等. 磷酸二酯酶 7 及其抑制剂 [J]. 中国生物化学与分子生物学报,2014,28(10): [8] Omori K, Kotera J. Overview of PDEs and their regulation [J]. Circ Res, 2007, 100(3): [9] Chapman RW, House A, Richard J, et al. Pharmacology of a potent and selective inhibitor of PDE-4 for inhaled administration[j]. Eur J Pharmacol, 2010, 643(2/3): [10] Gewald R. Synthesis and structure-activity relationship studies of dihydronaphthyridinediones as a novel structural class of potent and selective PDE7 inhibitors[j]. Bioorg Med Chem Lett, 2011, 21(22): [11] Areenault BJ, Dube MP, Brodeur MR, et al. Evaluation of links between high-density lipoprotein genetics, functionality, and aortic valve stenosis risk in humans [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2014, 34(2): [12] 吴剑锋, 唐艳艳, 曾高峰, 等. 载脂蛋白 A-I 对 HDL 生成影响的研究新进展 [J]. 生理科学进展,2014,45(2): [13] Hafiane A, Bielicki JK, Johansson JO, et al. Apolipoprotein E derived HDL mimetic peptide ATI-5261 promotes nascent HDL formation and reverse cholesterol transport in vitro[j]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1842(10): ( 童颖丹编辑 ) 8

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

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