1743 phage injury and intracellular cholesterol accumulation and attenuated the ox-ldl-induced expression of SRA1 and GRP78 in a dose-dependent manner

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1 1742 Chinese Journal of Pathophysiology A-I D-4F * A1 赵莉 1,2, 姚树桐 2,3, 陈军 1, 苗成 2, 李严严 2, 田华 2, 周健 1, 翟雷 2, 桑慧 3, 王义围 1 2, 秦树存 A-I D-4F oxidized low-density lipoprotein ox- LDL A1 scavenger receptor A1 SR-A1 RAW D-4F mg /L sd-4f 50 mmol /L 1 h 5 mmol /L endoplasmic reticulum stress ERS 4-30 min ox-ldl 100 mg /L 12 h 50 mg /L D-4F sd-4f 1 h 2 mg /L ERS tunicamycin TM 4 h MTT real-time PCR SR-A1 ERS 78 glucose-regulated protein 78 GRP78 mrna DiI-ox-LDL D-4F ox-ldl ox-ldl SR-A1 GRP78 D-4F D-4F TM SR-A1 GRP78 ox-ldl D-4F SR-A1 ox-ldl GRP78 ERS A-I A1 R * No No No. zd056 No. zd057 Tel shucunqin@ hotmail. com Tel chengdewyw@ 126. com 1 A doi /j. issn Inhibitory effect of apolipoprotein A-I mimetic peptide D-4F on scavenger receptor A1 in macrophage-derived foam cells ZHAO Li 1 2 YAO Shu-tong 2 3 CHEN Jun 1 MIAO Cheng 2 LI Yan-yan 2 TIAN Hua 2 ZHOU Jian 1 ZHAI Lei 2 SANG Hui 3 WANG Yi-wei 1 QIN Shu-cun 2 1 Affiliated Hospital of Chengde Medical University Chengde China 2 Institute of Atherosclerosis Key Laboratory of Atherosclerosis in Universities of Shandong 3 College of Basic Medical Sciences Taishan Medical University Taian China. shucunqin@ hotmail. com chengdewyw@ 126. com ABSTRACT AIM To investigate the inhibitory effect of apolipoprotein A-I mimetic peptide D-4F on the scavenger receptor A1 SR-A1 in macrophage-derived foam cells induced by oxidized low-density lipoprotein ox-ldl. METHODS RAW cells were pretreated with different concentrations and 50 mg /L of D-4F or 50 mg / L inactive control peptide scrambled D-4F sd-4f for 1 h or endoplasmic reticulum stress ERS inhibitor 4-phenylbutyric acid 5 mmol /L for 30 min followed by the treatment with 100 mg /L ox-ldl for 12 h. In addition the cells were pretreated with 50 mg /L D-4F or sd-4f for 1 h and then stimulated with 2 mg /L tunicamycin TM an ERS inducer for 4 h. The viability of the cells was measured by MTT assay and the content of intracellular total cholesterol TC was measured by a tissue /cell TC assay. The protein and mrna levels of SR-A1 and glucose-regulated protein 78 GRP78 were analyzed by Western blotting and quantitative real-time PCR respectively. The fluorescence intensity of DiI-ox-LDL in the cells was detected by a multifunctional microplate reader. RESULTS D-4F significantly reduced ox-ldl-induced macro-

2 1743 phage injury and intracellular cholesterol accumulation and attenuated the ox-ldl-induced expression of SRA1 and GRP78 in a dose-dependent manner. Additionally D-4F significantly inhibited the TM-induced protein expression of SR-A1 and GRP78 and attenuated the uptake of ox-ldl by macrophages. CONCLUSION D-4F reduces ox-ldl-induced macrophage cholesterol accumulation and injury by inhibiting SR-A1 expression. The mechanism may be related to the inhibition of ERS signaling pathway mediated by GRP78. KEY WORDS Atherosclerosis Apolipoprotein A-I mimetic peptide Endoplasmic reticulum stress Scavenger receptor A1 Foam cells DMEM atherosclerosis AS Gibco RIPA BCA Solarbio SR-A glucose-regulated protein 78 GRP78 oxidized low-density lipoprotein ox-ldl Santa Cruz 4-4-phenylbutyric acid PBA TM β-actin Sigma A1 scavenger receptor A1 SR-A1 CD36 IgG ox-ldl enhanced chemiluminescence ECL PVDF Pierce Millpore Trizol Invitrogen cdna 2 Real Master Mix SYBR Green ox-ldl / total cholesterol TC AS AS DiI-ox-LDL high-density lipoprotein HDL 2 AS 细胞培养与处理 DMEM AS HDL 10% U /L 100 HDL AS mg /L 37 5% CO 2 RAW AS 1% DMEM 4 HDL 12 h D-4F mg / A-I apolipoprotein A-I ApoA-I L sd-4f 50 mmol /L 1 h 5 mmol /L PBA L-4F D-4F 5 30 min ox-ldl 100 mg /L AS 6 12 h 50 mg /L D-4F sd- 4F 1 h 2 mg /L TM 4 h 2. 2 MTT 法检测细胞活性 /well endoplasmic reticulum stress ERS 96 MTT SR-A1 CD g /L 37 4 h 7 ox-ldl ERS 200 μl dimethylsulfoxide DMSO tunicamycin TM Infinite F200 Tecan 490 ERS ApoA-I D-4F SR-A1 nm absorbance A 100% A A 2. 3 试剂盒检测细胞内 TC 的含量 / TC TC 1 TC μmol /g protein RAW Western blotting 检测 SR-A1 和 GRP78 蛋白的 D-4F Ac- 表达 RIPA DWFKAFYDKVAEKFKEAF-NH 2 scrambled D-4F sd-4f Ac-DWFAKDYFKKAF- SDS-PAGE 10% PVDF VEEFAK-NH 2 ox-ldl 5% SR-A

3 1744 GRP β-actin h Ⅱ 2 h ECL Image-Pro Plus integrated absorbance IA /β-actin IA 2. 5 实时荧光定量聚合酶链反应 ( real-time PCR) 技术检测 SR-A1 mrna 的表达 Trizol RNA RNA 1 μgrna cdna PCR 20 μl PCR SYBR Green 9 μl 2 μl cdna 2 Figure 1. μl 5 μl PCR Rotor-Gene Q Qiagen min s s s 40 β-actin 1 2 -ΔΔCt mrna SR-A1 5 -GTTAAAGGTGATCGGG- GACA-3 5 -TCCCCTTCTCTCCCTTTTGT bp β-actin 5 - CGGGGACCTGACTGACTACC AG- GAAGGCTGGAAGAGTGC bp ox-ldl TC P < D-4F mg /L ox-ldl TC ox-ldl 69. 9% 57. 6% 53. 4% P < P < 2. 6 DiI-ox-LDL 摄取的分析 PBA ox-ldl 7 50 mg /L D-4F sd-4f 1 h 2 mg /L TM 4 h DiI-ox- D-4F mg /L inhibited ox-ldl-induced macrophage injury. Mean ± SD. n = 6. * P < ** P < vs control group # P < ## P < vs ox-ldl group. D-4F ox-ldl 2 D-4F ox-ldl RAW TC P < LDL 50 mg /L 4 h PBS 3 RIPA BCA r /min 5 min 200 μl 96 Infinite F200 Tecan 530 nm 590 DiI-ox-LDL mg / L ox- LDL mg /g protein 3 ± mean ± SD SPSS for Windows SNK P < Figure 2. D-4F mg/l reduced ox-ldl-induced intracellular cholesterol accumulation in RAW cells. Mean ± SD. n = 6. * P < ** P < vs control group # P < 1 D-4F ox-ldl ## P < vs ox-ldl group. 2 D-4F ox-ldl RAW ox-ldl RAW % P < PBA D-4F ox-ldl 3 D-4F ox-ldl SR-A1 GRP78 P < P < ox-ldl + sd-4f ox-ldl ox-ldl SR-A1 P > GRP78 P < D-4F PBA ox-ldl SR-A1

4 1745 GRP78 P < Figure 3. The effect of D-4F mg /L on ox-ldl-induced SR-A1 and GRP78 protein expression in RAW cells. Mean ± SD. n = 3 3. * P < ** P < vs control group # P < vs ox-ldl group. D-4F ox-ldl SR-A1 GRP78 4 D-4F ox-ldl SR-A1 mrna ox-ldl SR-A1 mrna P < D-4F ox-ldl SR-A1 mrna P < P < D-4F TM SR-A1 GRP78 5 TM SR-A1 GRP78 P < D- 4F TM SR-A1 GRP % 42. 1% P < Figure 4. The effect of D-4F mg /L on ox-ldl-induced mrna 6 D-4F TM ox-ldl expression of SR-A1 in RAW cells. Mean ± SD. n = 4. * P < ** P < vs control group # P < Dil-ox-LDL ## P < vs ox-ldl group. TM Dil-ox-LDL P 4 D-4F ox-ldl SR-A1 mrna < D-4F TM ox-ldl TM 62. 9% P <

5 1746 Figure 5. 5 The effect of D-4F on tunicamycin TM -induced SR-A1 and GRP78 expression in RAW cells. Mean ± SD. n = 3. * P < ** P < vs control group # P < vs TM group. D-4F SR-A1 GRP78 ox-ldl AS SR-A1 ox-ldl ox-ldl AS 2 9 sirna SR-A AS SR-A AS 10 D- 4F ox-ldl Figure 6. The effect of D-4F on tunicamycin TM -induced uptake of ox-ldl in RAW cells. Mean ± SD. n = SR-A1 4. * P < ** P < vs control group # P < SR-A1 D-4F vs TM group. ERS AS 6 D-4F ox-ldl ERS HDL ERS AS 11 AS ox-ldl 1 ox-ldl receptor 1 HDL LOX-1 ERS AS HDL 1 inositol-requiring enzyme 1 IRE1 RNA AS R ER PKR-like ER kinase AS 4 8 ApoA-I HDL PERK LOX-1 12 ERS 6 activating transcription factor 18 ApoA-I 6 ATF6 GRP78 ox-ldl L-4F D-4F 7 13 ERS β-hdl PBA ox-ldl SR-A1 HDL HDL AS ERS ox-ldl D-4F ox-ldl PBA D-4F ox-ldl

6 1747 SR-A1 Exp Med GRP78 ERS 6 Qin S Kamanna VS Lai JH et al. Reverse D-4F an TM apolipoprotein-ai mimetic peptide inhibits atherosclerosis 7 12 CD36 SR-A1 LOX-1 14 in ApoE-null mice J. J Cardiovasc Pharmacol Ther D-4F ERS ox-ldl SR-A1 TM 7 Yao S Miao C Tian H et al. Endoplasmic reticulum ERS D-4F SR-A1 stress promotes macrophage-derived foam cell formation by ox-ldl D-4F up-regulating cluster of differentiation 36 CD36 expression J. J Biol Chem TM SR-A1 GRP78 ox-ldl D-4F ERS 8 Imaizumi S Navab M Morgantini C et al. Dysfunctional high-density lipoprotein and the potential of apolipoprotein SR-A1 ox-ldl A-I mimetic peptides to normalize the composition and function of lipoproteins J. Circ J ApoA-I D-4F GRP78 ERS 9 Zhou F Pan Y Huang Z et al. Visfatin induces cholesterol accumulation in macrophages through up-regulation of ox-ldl SR-A1 scavenger receptor-a and CD36 J. Cell Stress Chaperones AS CD36 ox-ldl ATP A1 10 Makinen PI Lappalainen JP Heinonen SE et al. Silencing of either SR-A or CD36 reduces atherosclerosis in hy- ATP-binding cassette transporter A1 ABCA1 ATP G1 ATP-binding cassette transporter perlipidaemic mice and reveals reciprocal upregulation of G1 ABCG1 these receptors J. Cardiovasc Res D-4F J Badimon L Storey RF Vilahur G. Update on lipids inflammation and atherothrombosis J. Thromb Haemost 12 Ishiyama J Taguchi R Akasaka Y et al. Unsaturated Suppl 1 S34-S42. FAs prevent palmitate-induced LOX-1 induction via inhibi- 2 Seimon T Tabas I. Mechanisms and consequences of tion of ER stress in macrophages J. J Lipid Res 2011 macrophage apoptosis in atherosclerosis J. J Lipid Res Suppl S382-S Farmer JA Liao J. Evolving concepts of the role of highdensity lipoprotein in protection from atherosclerosis J. Curr Atheroscler Rep Toth PP Davidson MH. High-density lipoproteins marker of cardiovascular risk and therapeutic target J. J Clin Lipidol Xie Q Zhao SP Li F. D-4F an apolipoprotein A-I mimetic peptide promotes cholesterol efflux from macrophages via ATP-binding cassette transporter A1 J. Tohoku J Yao S Zong C Zhang Y et al. Activating transcription factor 6 mediates oxidized LDL-induced cholesterol accumulation and apoptosis in macrophages by up-regulating CHOP expression J. J Atheroscler Thromb Hua Y Kandadi MR Zhu M et al. Tauroursodeoxycholic acid attenuates lipid accumulation in endoplasmic reticulum-stressed macrophages J. J Cardiovasc Pharmacol

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