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款服闵
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1 347 RT-PCR 方法检测贝类中诺沃克样病毒的研究张颖 1, 吴风亮 2 (1. 中国环境管理干部学院生态学系, 河北秦皇岛 ; 2. 河北农业大学农村发展学院, 河北保定 ) 摘要 : 目的 : 本研究从病毒富集和核酸提取两方面进行探索, 旨在建立一个反转录 (RT)PCR 技术检测贝类中诺沃克样病毒 (NLVs) 的方法方法 : 利用脊髓灰质炎病毒作为参照毒株, 优化了甘氨酸缓冲液 - 聚乙二醇 (PEG) 病毒浓缩方法 ; 同时比较了异硫氰酸胍法 SDS- 蛋白酶 K 法 Trizol- 异丙醇法试剂盒法四种 RNA 提取方法 ; 对市售贝类样品进行了检测, 并利用基因测序对阳性样品进行验证结果 : 本研究采用的 ph9.5 甘氨酸缓冲液 -16% 聚乙二醇病毒浓缩法, 病毒的回收率为 16.8%, 利用 Trizol- 异丙醇法提取 RNA, 检出限为 RT-PCR50/5g 贝肉, 实际检测贝类样品 25 件, 其中 3 件样品为阳性, 基因测序结果亦证实为阳性结论 : 本研究建立了一个灵敏度较高较为有效的 RT-PCR 技术检测贝类中诺沃克样病毒的方法关键词 : 诺沃克样病毒 ; 反转录 P C R ; 贝类 ; 检测 Study on Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Detection of Norwalk-like Virus in Shellfish ZHANG Ying 1,WU Feng-liang 2 (1.Department of Ecology, Environment Management College of China, ainhuangdao , China; 2. College of Rural Development, Agricultural University of Hebei, Baoding , China) Abstract :Objective:To explore the methods of both virus enrichment and nucleic acid extraction for establishing a Norwalklike viruses (NL Vs) detection method by RT-PCR. Method: In this study, with poliovirus as the model to optimize glycine-peg concentration method; The effects of 4 methods of extracting RNA from NLVs in shellfish were compared; Detection of Norwalklike viruses in commercial shellfish samples was performed, and positive samples were demonstrated by DNA sequencing. Results: This study conducted virus enrichment with ph 9.5 glycine buffer-16% polyethylene glycol (PEG) and RNA extraction with trizol-isopropanol. The recovery of viruses was 16.8% from seeded shellfish; and the detection limit was RT-PCR50/ 5 g shellfish. NLVs in 3 of 25 samples were found by RT-PCR and validated by DNA sequencing. Conclusion: In this study, a NLVs detection method from shellfish is established, which is sensitive and available. Key words:norwalk-like viruses;rt-pcr;shellfish;detection 中图分类号 :TS254.7 文献标识码 :A 文章编号 : (2008) 诺沃克样病毒 (Norwalk-like virus,nlvs) 属人类杯状病毒, 是引起成人和儿童非菌性急性胃肠炎暴发和散发的重要病原体, 它所致的腹泻在世界多个国家均有报道 N L V s 能耐受不良的外界环境感染持续时间长, [1] 它的危害性不可低估我国 1995 年在腹泻患儿的粪便标本中发现了第一例 N L V s 之后, 陆续的调查报告显 [2-9] 示,NLVs 感染在我国是很普遍的因此建立一种快速的检测方法, 可以监控贝类及其他食品质量, 避免疾病发生近年来我国研究者分别利用 ELISA 反转录 PCR 实时荧光 PCR 技术对粪便样品和贝类样品进行了诺沃克 [10-11] 样病毒检测的研究, 但均缺乏对于病毒富集和 RNA 提取方法的系统研究本研究主要针对贝类样品中的病毒富集浓缩和 R N A 提取方法进行了较为系统的比较研究, 建立一套灵敏度较高较为有效的 RT-PCR 检测贝类中诺沃克样病毒的方法 1 材料与方法 1.1 材料阳性病毒样品为由中国疾病预防控制中心提供的 N L V s 阳性粪便样品贝类为保定市售海产品, 于冷冻保存收稿日期 : 作者简介 : 张颖 (1982-), 女, 助教, 研究方向为有害微生物检测与控制 zhangyinguser2008@126.com

了甘氨酸缓冲液 - 聚乙二醇 (PEG) 病毒浓缩方法 ; 同时比较了异硫氰酸胍法 SDS- 蛋白酶 K 法 Trizol- 异丙醇法试剂盒法四种 RNA 提取方法 ; 对市售贝类样品进行了检测, 并利用基因测序对阳性样品进行验证结果 : 本研究采用的

2 , Vol. 29, No. 05 食品科学分析检测病毒富集方法回收率测定所用脊髓灰质炎病毒参照株为由保定市疾病预防控制中心提供的脊髓灰质炎疫苗 Hep-2 细胞株为河北省疾病预防控制中心细胞培养室提供 1.2 方法病毒滴定 NLVs 不能人工培养, 其病毒滴度用 RT-PCR 50 单位表示将病毒原液进行连续的 1 0 倍梯度稀释, 取每 1 个稀释度的病毒液进行病毒 RNA 的提取及 RT-PCR 实验, 每天进行 1 次, 连续进行 5d, 找到阳性率大于 50% 及小于 50% 的稀释度, 用 Reed-Muench 公式计算, 得到 RT-PCR50 单位参照株脊灰病毒的滴度用半数细胞培养物感染量 (TCID50) 表示将病毒原液进行连续的 10 倍梯度稀释, 取每 1 个稀释度的病毒液 0.1ml, 加入已长成单层的敏感细胞培养物中, 每个稀释度的病毒液接种 4~10 个细胞孔于 3 7 静置培养, 观察细胞病变情况, 用 R e e d - Muench 公式计算, 得到 TCID50 单位病毒回收率的测定病毒回收率是指将一定量的病毒加入贝类样品中成为人为模拟的阳性样品, 进行样品中病毒的富集, 将最后一次沉降的 PEG 沉淀 (RNA 提取前 ) 用 0.1mol/L PBS 缓冲液重悬浮, 形成 1ml 病毒混悬液将此混悬液接种于细胞进行病毒培养, 计算出此混悬液中的病毒量, 用下面公式进行计算便可得到此方法的回收率 RNA 提取前病毒混悬液中病毒量回收率 (%)= 100 样品中加入的病毒量回收率是衡量病毒富集方法好坏的直接标准贝类中病毒浓缩富集 [12-13] 基本方法参照 Lees 等的方法, 并加以改进利用脊灰病毒作为参照毒株对贝类样品进行人工污染, 采用 ph9.5 甘氨酸缓冲液 - 聚乙二醇, 浓缩贝样中病毒, 浓缩液接入正常细胞中, 检测其 T C I D 50 值取融冻后的贝类样品 5 g, 人工污染脊髓灰质炎病毒向人工污染的贝类中加入 ph9.5 甘氨酸缓冲液 35ml, 在匀浆机中匀浆, 室温放置 15min g 离心 30min, 取上清, 调节上清液 ph 值至 7.0 并转移至 50ml 离心管中上清液中加入等体积的 16% PEG8000,4 沉淀 2h,8000 g 离心 30min, 沉淀用 15ml ph9.1 的 P B S 重悬, 加入等体积氯仿, 充分混匀,4, g 离心 30min, 取上清液调节上清液 ph 值至 7.0, 重复 16% PEG8000 沉淀步骤 1 次, 沉淀用于 RNA 提取病毒富集方法分别对沉淀剂 PEG8000 的浓度做了 16% 14% 12% 三个比较, 对 16% PEG8000 沉淀次数做了 1 次和 2 次的比较病毒核酸的提取利用中优化的病毒富集方法处理人工污染诺沃克样病毒的贝类样品将浓缩得到的沉淀转移至 1.5ml RNase-free 的无菌离心管中, 用 Trizol 进行核酸分离和纯化, 异丙醇沉淀, 乙醇洗提, 所得沉淀干燥后用 DEPC H2O 溶解,- 70 保存同时比较了异硫氰酸胍法 S DS - 蛋白酶 K 法试剂盒法 RNA 提取法, 其中试剂盒采用的是 Trizol- 柱式 R N A 提取试剂盒核酸扩增引物 JV12Y JV13I 参考自 Koopmans [14-15] : JV12Y(+)5 ATACCACTATGATGCAGATTA 3 JV13I(-)5 TCATCATCACCATAGAAAGAG 3 反转录反应体系 : 总反应体系为 20μl 包括 AMV (5U/μl) 1μl 5 Reverse transcriptase buffer 4μl,RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl,dNTPs 混合物 (10mmol/L each) 2μl 下游引物 (10μmol/L)3.5μl, 模板 4μl, 水 5μl 反转录过程为 42 下 1h P C R 反应体系 : 总反应体系为 5 0μl 包括 R T - Mixture 20μl,10 PCR buffer 5μl Taq(5U/μl) 1μl, dntps 混合物 (2.5mmol/L each) 5μl, 上游引物 (10μmol/L) 2μl Mg 2+ (25mmol/L)6.6μl 水 10.4μl PCR 扩增程序 :94 预变性 3min; 变性 min, 退火 min, 延伸 min, 进行 40 个循环, 最后 72 延伸 5min 取 10μl 扩增产物在 2% 琼脂糖上电泳 (80mA)1h, 溴化乙锭染色, 紫外照射观察结果并成像阳性结果产生 327bp 的条带阳性扩增产物将 RT-PCR 阳性扩增产物送至大连宝生物公司测序 2 结果与分析 2.1 病毒滴度的测定诺沃克样病毒阳性粪便上清液滴度测定将阳性粪便溶于 ph7.0 的 PBS 中制成 10% 的粪便悬液,5000r/min 离心 30min, 取上清取 300μl 上清液, Trizol- 异丙醇法提取 RNA, 由 Reed-Muench 法计算得该病毒的滴度为 26 RT-PCR50/μl 结果见表 1 和电泳图脊髓灰质炎病毒滴度测定取脊灰病毒疫苗溶解在细胞生长液中, 对该液体进行连续 10 倍梯度稀释, 将这一系列病毒稀释液接入到长有正常细胞的 9 6 孔板中, 观察病变, 计算 T C I D 50 值本实验所用疫苗滴度为 , 结果见表贝类中诺沃克样病毒富集方法的选择

3 349 表 1 RT-PCR50 的测定和计算 (Reed-Muench 法 ) Table 1 Results of detection RT-PCR50 (Reed-Muench Method) 病毒液 RT-PCR 结果累计数阳性百总数稀释度阳性数阴性数阳性数阴性数分比 (%) DNA Marker 100 bp ;2~6. 将 NLVs 病毒原液稀释后进行 RT-PCR 的实验结果 ;7. 阴性对照 ;8. 阳性对照图 1 NLVs 滴度测定结果 Fig.1 Results of NLVs titer 表 2 脊髓灰质炎减毒疫苗滴度 (TCID50) 检测结果 Table 2 Results of titer of poliomyelitis virus vaccine (TCID50) 病变孔数 ( 总共 8 孔 / 稀释度 ) 本研究中使用了国际上普遍采用的聚乙二醇 (PEG) 进 [16-18] 行病毒富集, 分别比较了 16% 14% 12% PEG8000 的富集效果, 结果见表 3 5 6; 比较了 16% PEG8000 沉淀 2 次和 1 次的效果, 结果见表 3 4 方法 1 为 16% PEG8000 沉淀 2 次 ; 方法 2 为 16% PEG8000 沉淀 1 次 ; 方法 3 为 14% PEG8000 沉淀 2 次 ; 方法 4 为 12% PEG8000 沉淀 2 次由 Reed-Muench 公式可计算出 4 种方法的滴度分别表 3 方法 1 浓缩后脊髓灰质炎减毒疫苗滴度 (TCID50) 检测结果 Table 3 Results of titer of concentrated seeding poliomyelitis virus vaccine (TCID50) by method 1 in shellfish 病变孔数 ( 总共 8 孔 / 稀释度 ) 病变孔数 ( 总共 8 孔 / 稀释度 ) 病变孔数 ( 总共 8 孔 / 稀释度 ) 为 : 方法 1 的 TCID50 值分别为 , 方法 2 的 TCID50 值分别为 , 方法 3 的 TCID50 值分别为 , 方法 4 的 TCID50 值分别为 , 并计算出 4 种方法的平均回收率依次为 :16.8% 8.3% 12.2% 10.1% 由检测结果可知, 在 4 种回收方法中, 方法 1 的回收率最高, 方法 2 的回收率最低, 方法 3 4 居中, 分析其表 4 方法 2 浓缩后脊髓灰质炎减毒疫苗滴度 (TCID50) 检测结果 Table 4 Results of titer of concentrated seeding poliomyelitis virus vaccine (TCID50) by method 2 in shellfish 病变孔数 ( 总共 8 孔 / 稀释度 ) 病变孔数 ( 总共 8 孔 / 稀释度 ) 病变孔数 ( 总共 8 孔 / 稀释度 ) 表 5 方法 3 浓缩后脊髓灰质炎减毒疫苗滴度 (TCID50) 检测结果 Table 5 Results of titer of concentrated seeding poliomyelitis virus vaccine (TCID50) by method 3 in shellfish 病变孔数 ( 总共 8 孔 / 稀释度 ) 病变孔数 ( 总共 8 孔 / 稀释度 ) 病变孔数 ( 总共 8 孔 / 稀释度 ) 表 6 方法 4 浓缩后脊髓灰质炎减毒疫苗滴度 (TCID50) 检测结果 Table 6 Results of titer of concentrated seeding poliomyelitis virus vaccine(tcid50)by method 4 in shellfish 病变孔数 ( 总共 8 孔 / 稀释度 ) 病变孔数 ( 总共 8 孔 / 稀释度 ) 病变孔数 ( 总共 8 孔 / 稀释度 ) 原因可能是由于方法 2 种只做了 1 次 PEG 浓缩沉淀, 其浓缩液的浓度较其他方法低, 因此其回收率明显低于其他方法 ; 而方法 3 4 所用的浓缩剂浓度有所改变, 均低于方法 1, 浓缩的效果相对较差方法 1 浓缩后的回收率与国际上所报道的贻贝蚌类中诺沃克样病毒检测 [12] 的回收率为 17% 左右大致相符因此在本研究中选择 16% PEG8000 沉淀 2 次富集病毒 2.3 RT-PCR 检测贝类中诺沃克样病毒的检出限本研究中贝类人工污染诺沃克样病毒后, 经过病毒浓缩富集步骤, 可从含有 RT-PCR50 诺沃克样病毒的贝样中提取 RNA, 成功检测出诺沃克样病毒检测结果见电泳图 DNA Marker 100bp;2. 阳性对照 ;3. 阴性对照 ;4~11. 诺沃克样病毒液浓度依次为 RT-PCR50 的 RT-PCR 检测结果图 2 人工污染诺沃克样病毒 RT-PCR 检测结果 Fig.2 Results of detection seeding Norwalk-like virus in shellfish by RT-PCR 2.4 R N A 提取方法比较本研究比较了异硫氰酸胍法 Trizol- 异丙醇法

4 , Vol. 29, No. 05 食品科学分析检测 SDS- 蛋白酶 K 裂解法和试剂盒法, 从贝肉中提取诺沃克样病毒 R N A 的效果结果见电泳图 DNA Marker 100 bp; Trizol- 异丙醇法分别从人工污染 NLVs 浓度为 RT-PCR50 的贝类中提取 RNA 进行 RT-PCR 检测结果 ; 异硫氰酸胍法分别从人工污染 NLVs 浓度为 RT-PCR50 的贝类中提取 RNA 进行 RT-PCR 检测结果 ; SDS- 蛋白酶 K 裂解法分别从人工污染 NLVs 浓度为 RT-PCR50 的贝类中提取 RNA 进行 RT-PCR 检测结果 ; 试剂盒法分别从人工污染 NLVs 浓度为 RT-PCR50 的贝类中提取 RNA 进行 RT-PCR 检测结果 ;14. 阴性对照 ; 15. 阳性对照 ; 16. DNA Marker 100bp 图 3 贝类中诺沃克样病毒 RNA 提取方法比较结果 Fig.3 Results of 4 methods for extracting RNA from Norwalk-like virus in shellfish 由电泳图 3 可知,Trizol- 异丙醇法异硫氰酸胍法试剂盒法 3 种 RNA 提取方法均能检测到浓度为 RT-PCR50 的诺沃克样病毒, 其中 Trizol- 异丙醇法最优, 试剂盒法胍法效果次之,SDS- 蛋白酶 K 裂解法仅能检测到 RT-PCR50 分析其中的原因可能是对于病毒的 RNA 提取,SDS- 蛋白酶 K 的变性裂解效果不强, 提取过程中不能保护 R N A, 并且可能残留的 S D S 会影响 A M V 酶的活性试剂盒法是通过 Trizol 裂解病毒, 柱子吸附 RNA 来提取核酸的, 诺沃克样病毒的部分核酸与蛋白结合非常紧密, 很难去除, 这就使得部分核酸会带正电荷, 分析柱子吸附 R N A 的原理是其上吸附了带正电荷的试剂, 可以吸附带负电荷的 R N A, 如果所提取的部分 R N A 带有蛋白, 柱子不能将它们吸附上去, 因此提取效果不如 Trizol- 异丙醇法好异硫氰酸胍法提取 RNA 的基本原理与 Trizol- 异丙醇法相似, 在应用胍法提取 R N A 过程中, 加入了专门溶解 RNA 的 LiCl 试剂, 酚 - 氯仿两次抽提, 过程相对复杂, 在反复的裂解抽提过程中可能会造成一定的 RNA 损失, 但相对与其他方法来说,RT-PCR 反应抑制因子的去除效果较好考虑到快速检测, 因此, 在本研究中选择 Trizol- 异丙醇法作为模板提取方法 2.5 样品实际检测 RT-PCR 方法实际检测贝类样品 25 件, 共检出阳性样品 3 件, 检出率为 1 2 % 检测结果见电泳图 4 3 份贝类阳性样品毒株序列同源性较高在 89%~91% 之间, 与 G e n e B a n k 上诺沃克样病毒的序列对比, 与 DQ 株的同源性最高, 在 92%~94% 之间, 造 1 16.DNA Marker 100bp;2. 阳性对照 ;3. 阴性对照 ;4~15.12 份毛蚶样品检测结果 A DNA Marker 100bp;2. 阳性对照 ;3. 阴性对照 ;4. 毛蚶样品检测结果 ;5~8. 花蛤样品检测结果 ;9~12. 青蛤样品检测结果 ;13~16. 文蛤样品检测结果 B 图 4 实际检测贝类样品中诺沃克样病毒的结果 Fig.4 Results of detecting Norwalk-like virus in shellfish 成这种结果的原因主要是诺沃克样病毒的序列多变性 3 讨论 3.1 病毒的富集目前, 国际上对于诺沃克样病毒的浓缩回收主要针对两种基质 : 固体基质液体基质固体基质中的诺沃克样病毒一般采用絮凝沉淀剂, 处理制成匀浆的固体样品 ; 液体基质中的诺沃克样病毒富集一般采用过滤法, 利用带电荷的膜或柱过滤样品还有抗体捕捉法, 在微孔板或磁珠上包埋上提前制备好的抗体, 利用抗原抗体的免疫结合捕捉病毒贝类消化道中病毒粒子的提取主要采用碱性缓冲溶液提取法和免疫抗体捕捉法等碱性缓冲溶液提取法是贝类中肠道病毒分离提取的主要方法碱性条件下利用甘氨酸能快速便捷的进行病毒粒子的洗脱, 甘氨酸是一类能改变吸附特性的洗脱剂, 强碱性环境下 (ph9~10) 能减少病毒和吸附剂之间的静电作用 [19-21] 有研究报道利用 ph 值的改变, 使病毒吸附在贝肉微粒上 (ph < 5), 通过离心把病毒粒子沉淀下来, 再用碱性缓冲液洗脱病毒, 聚乙二醇 (PEG) 浓缩该方法可将贝肉混悬液中的部分蛋白去除, 减少 RT-PCR 反 [16] 应抑制因子 ;Richards 等人利用甘氨酸 -PEG(16% PEG8000) 沉淀浓缩了贝类中的诺沃克样病毒和甲型肝炎病毒, 样品只取富含病毒的胃肠组织, 总体积控制在 50ml 以内, 节省了提取试剂, 也简化了操作, 回收率为 17% 在本研究中, 利用了 ph9.5 的甘氨酸缓冲液洗脱,16% 的 PEG8000 沉淀两次, 在两次沉淀之间,pH 值调整, 用氯仿处理浓缩液, 去除贝肉混悬液中的蛋白质脂肪微粒, 浓缩贝类中的诺沃克样病毒, 回收

SDS- 蛋白酶 K 裂解法分别从人工污染 NLVs 浓度为 3.3 10 3 1.6 10 3 8.1 10 2 RT-PCR50 的贝类中提取 RNA 进行 RT-PCR 检测结果 ;11 12 13. 试剂盒法分别从人工污染 NLVs 浓度为 3.3 10 3 1.6 10 3 8.1 10 2 RT-PCR50 的贝类中提取 RNA 进行 RT-PCR 检测结果 ;14.

5 351 率为 16.8%, 较国内相关研究提高了 24.4% [22] 3.2 核酸提取 R N A 非常不稳定, 暴露于空气中十分容易被降解掉, 尽可能获得完整的 RNA 对于 RT-PCR 成功与否有很大影响, 待检的样品中往往含有一些抑制反转录酶或 D N A 聚合酶的因子, 因此, 衡量一个提取方法的好坏主要有两个方面 : 一是提取效率, 二是去除 RT-PCR 反应抑制因子的能力 [23] Jiang 等尝试用氟利昂处理病毒悬液, 苯酚 - 氯仿抽提热裂解透析寡聚纤维素层析都不能去除反应抑制因子后来在 P E G 沉淀, 蛋白酶 K 消化后, 十六烷基三乙基溴化铵 (CTAB) 处理,RT-PCR 阳性率大大 [24] 提高分析其原因氟利昂处理热裂解透析等方法的变性蛋白能力相对 CTAB 还较弱,CTAB 表面活性剂可以使细胞裂解, 蛋白质变性, 释放核酸, 去除多糖但 CTAB 的变性裂解效果相对稍低, 其 RT-PCR 阳性率在 81%~87% 之间 [25] Grinde 等利用硫氰酸胍 - 苯酚 - 氯仿联合作用, 乙醇沉淀处理诺沃克样病毒样品, 成功的提取出其 R N A, [26] 并且 RT-PCR 结果阳性 Griffin 等在胍 - 酚 - 仿抽提的基础上引入了嵌有寡聚 d T 的二氧化硅颗粒,R N A 的多聚 A 尾与寡聚 d T 结合, 从而就吸附在二氧化硅颗粒上, 通过硫氰酸胍缓冲液 7 0 % 乙醇和丙酮的洗涤, 去除 RT-PCR 反应抑制因子 RNA 用水洗脱下来, 也有用吸附上免疫血清或寡聚 d T 的磁珠来纯化 R N A 的目前, 病毒中 RNA 提取较常用的是一种商品名为 Trizol 的试剂,Trizol 是基于氰酸胍 - 酚 - 氯仿的原理来提取 RNA 的, 它比常规的氰酸胍 - 酚 - 氯仿方法操作更为简便, 也减少了对核酸的损伤, 能较好的得到完整的目的基因, 并且还能有效的去除样本中混杂的 P C R 反应抑制物硫氰酸胍法, 包括 Trizol 法, 是现在使用最成功的提取 R N A 去除反应抑制因子的方法本实验中, 对 Trizol- 异丙醇法异硫氰酸胍法试剂盒法 SDS- 蛋白酶 K 裂解法四种提取 RNA 方法的效果做了比较, 结果证实,Trizol- 异丙醇法效果最好 4 结论采用甘氨酸缓冲液 - 聚乙二醇富集贝样中病毒, Trizol- 异丙醇提取病毒 RNA, 病毒回收率为 16.8%,RT- PCR 检出限为 RT-PCR50, 整个过程可在 11h 内完成其中病毒回收率与国外水平相近, 高于国内水平, 但其水平仍然不高, 有待加强后续研究灵敏度高于国内水平参考文献 : [1] European Commission Health & Consumer Protection Directorate-general. Opinion of the scientific committee in veterinary measures relating to public health on norwalk-like viruses[r].wales: European Commision, [2] 方肇寅, 温乐英, 晋圣瑾, 等. 在我国腹泻患儿中发现诺瓦克样病毒感染 [J]. 病毒学报, 1995, 11(3): [3] 谢华萍, 方肇寅, 王光, 等. 长春市儿童医院 1998~2001 年婴幼儿杯状病毒腹泻流行病学研究 [J]. 病毒学报, 2002, 18(4): [4] 靖宇, 钱渊, 王洛平. 北京地区人群诺瓦克样病毒学清抗体水平调查 [J]. 病毒学报, 1998, 14(4): [5] 陈军林, 王滔, 高建民, 等. 福州地区腹泻患者诺瓦克样病毒感染的分子流行病学特点 [J]. 中国人兽共患病杂志, 2003, 19(2): [6] 靖宇, 钱渊, 吴立平, 等. 太原市部分人群诺瓦克样病毒徐庆抗体水平调查 [J]. 中华儿科杂志, 1999, 37(9): [7] 沈纪川, 刘于飞, 周秀珍, 等. 群体性诺瓦克样病毒性胃肠炎疫情分析 [J]. 中国公共卫生, 2005, 21(5): [8] 刘满清, 谭慧, 王斌, 等. 90 例非轮状病毒腹泻患儿粪便中诺瓦克样病毒的检测 [J]. 疾病监测, 2005, 20(7): [9] 诺瓦克样病毒引起的急性胃肠炎暴发疫情在广西首次证实 [J]. 广西医学, 2006, 28(3): 468. [10] 蒋力云, 吴新伟, 刘于飞, 等. 用 RT-PCR 和 ELISA 对暴发性急性胃肠炎事件中诺瓦克样病毒检测的比较 [J]. 中国人兽共患病杂志, 2005, 21(3): [11] 潘良文, 张舒亚, 李晓虹, 等. 贝类产品中诺沃克病毒的实时荧光 RT- PCR 检测方法研究 [J]. 检验检疫科学, 2004, 14(5): 1-3. [12] LEES D N, HENSHILWOOD K, W J. Development of a method for detection of enteroviruses in shellfish by PCR with poliovirus as a model[j]. Appl Environ Microbiol, 1994, 60: [13] LEES D N, HENSHILWOOD K, GREEN J, et al. Detection of small round structured viruses in shellfish by reverse transcription-pcr[j]. Appl Environ Microbiol, 1995, 61(12) : [14] VINJE J, KOOPMANS M. Simultaneous detection and genotyping of Norwalk-like viruses by oligonucleotide array in a reverse line blot hybridization format[j]. J Clin Microbiol, 2000, 38(7): [15] VINJE J, VENNEMA H, KOOPMANS M, et al. International collaborative study to compare reverse transcriptase PCR assays for detection and genotyping of Noroviruses[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(4) : [16] KINGGLEY D H, RICHARDS G P. Rapid and efficient extraction method for Reverse Transcription-PCR detection of Hepatitis A and Norwalk-like viruses in shellfish[j]. Appl Environ Microbiol, 2001, 67 (9): [17] Rutjes S A, ITALIAANDER R, HAROLD H, et al. Isolation and detection of Enterovirus RNA from large-volume water samples by using the NucliSens minimag system and real-time nucleic acid sequencebased amplification[j]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(7): [18] SCHWAB K J, NEILL F H, FANKHAUSER R L, et al. Development of methods to detect Norwalk-like viruses (NLVs) and Hepatitis A virus in delicatessen foods: application to a food-borne NLV outbreak[j]. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(1) : [19] JAYKUS L A, LEON R D, SOBEY M D. A virion concentration method for detection of human enteric viruses in oysters by PCR and oligoprobe hybridization [J]. Appl Environ Microbiol, 1996,62(6): [20] HARAMOTO E, KATAYAMA H, OGUMA K, et al. Application of cation-coated filter method to detection of Noroviruses, Enteroviruses, Adenoviruses, and Torque Teno viruses in the Tamagawa river in Japan [J]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(5): [21] ATMAR R L, NEILL F H, WOODLTY C M, et al. Collaborative evaluation of a method for the detection of Norwalk virus in shellfish tissues by PCR[J]. Appl Environ Microbiol, 1996, 62(1): [22] 陈广全, 饶红, 张惠媛, 等. 用 RT-PCR 法检测食品中诺沃克样病毒 [J]. 食品与发酵工业, 2004, 30(12): [23] JIANG X, WANG J, GRAHAM D Y, et al. Detection of Norwalk virus in stool by polymerase chain reaction[j]. J Clin Microbiol, 1992, 30 (10): [24] WANG J, JIANG X, MADORE H P, et al. Sequence diversity of small, round-structured viruses in the Norwalk virus group[j]. J Virol, 1994, 68 (9): [25] STENE-JOHANSEN K, GRINDE B. Sensitive detection of human caliciviridae by RT-PCR[J]. J Med Virol, 1996, 50(3): [26] GRIFFIN D W, DONALDSON K A, PAUL J H, et al. Pathogenic human viruses in coastal waters[j]. J Clin Microbiol, 2003, 16(1):

方面 : 一是提取效率, 二是去除 RT-PCR 反应抑制因子的能力 [23] Jiang 等尝试用氟利昂处理病毒悬液, 苯酚 - 氯仿抽提热裂解透析寡聚纤维素层析都不能去除反应抑制因子后来在 P E G 沉淀, 蛋白酶 K 消化后, 十六烷基三乙基溴化

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<453A5CCAB3C6B7BFC6D1A73131C4EA3134C6DA5C3134C6DA5C3032B7D6CEF6> 227 ELISA 刘沙洲 1,2, 桑小雪 1, 欧阳华学 3, 雷绍荣 3, 白林含 1, * (1. 四川大学生命科学学院, 四川成都 610065;2. 成都市食品药品检测中心, 四川成都 610045; 3. 四川省农业科学院分析测试中心, 四川成都 610066) 目的 : 比较