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倍易松
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1 农学学报 2014,4(11):80-84 Journal of Agriculture 海带属配子体 DNA 提取及 ISSR-PCR 体系优化李言, 崔翠菊, 罗世菊, 李晓捷, 赵聚萍, 赛珊, 钱瑞, 武瑞娜 ( 山东东方海洋科技股份有限公司 / 国家海藻工程技术研究中心 / 山东省海藻遗传育种与栽培技术重点实验室, 山东烟台 ) 摘要 : 为了建立一个重现性好稳定性高, 适用于海带属 ISSR 遗传分析的 PCR 反应体系, 从海带属配子体材料中提取基因组 DNA 作为模板, 应用正交设计试验对反应体系中各因子的不同浓度进行组合优化结果显示 : 适用于海带 ISSR 扩增反应的最佳体系 (20 μl) 为 :1 PCR buffer, mmol/l Mg 2 +, mmol/l dntps, μmol/l ISSR 引物,40 ng 模板 DNA, U Taq DNA 聚合酶 ; 扩增 PCR 程序为 : 95 预变性 3 min;95 变性 45 s,52 退火 45 s,72 延伸 2 min, 共 38 个循环 ; 最后 72 延伸 10 min 在优化的海带 ISSR 反应条件下, 扩增条带稳定, 重现性好, 为应用 ISSR 分子标记技术进行海带属遗传多样性研究和分子鉴定奠定了技术基础关键词 : 海带属 ; 配子体 ;DNA 提取 ;ISSR; 体系优化中图分类号 :Q75 文献标志码 :A 论文编号 : Genomic DNA Extraction and Optimization of ISSR-PCR Reaction System for Saccharina Li Yan, Cui Cuiju, Luo Shiju, Li Xiaojie, Zhao Juping, Sai Shan, Qian Rui, Wu Ruina (Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co. Ltd/National Alage Project Technology Research Centre/ Algae Genetic Breeding and Cultivation Technology Key Laboratory of Shandong Province, Yantai , Shandong, China) Abstract: In order to establish a reproducible, stable, and suitable reaction system of Saccharina for ISSR analysis of genetic differences, the genomic DNA extracted from gametophytes of Saccharina was used as template, the different concentrations of the factors in reaction system were optimized by orthogonal design experiment. The results showed that, the optimal ISSR reaction system (20 μl) contained 1 PCR buffer, mmol/l Mg 2 +, mmol/l dntps, 1 μmol/l ISSR primer, 40 ng template DNA and U Taq DNA polymerase. The PCR program was pre-denatured at 95 for 3 min and followed by 38 cycles of 45 s at 95, 45 s at 52, 2 min at 72, and final extension of 10 min at 72. The optimal ISSR reaction system was stable and repeatable. This system could provide the technical foundation for the application of ISSR molecular marker technology for the study on genetic diversity and molecular identification of Saccharina. Key words: Saccharina; Gametophyte; DNA Extraction; ISSR; System Optimization 0 引言海带 (Saccharina japonica) 属于褐藻门 (Phaeophyta) 海带目 (Laminariales) 海带科 (Laminariaceae) 海带属 (Saccharina) 藻类,19 世纪 20 年代从日本首次引进, 并逐渐适应中国海域条件, 现在是中国人工栽培历史最长产量最高的大型经济海藻, [1-2] 在医药食品化工等方面都有广泛的应用近年来, 中国又陆续引进了多个海带种类如 Saccharina 基金项目 : 国家科技支撑计划海藻栽培新种质苗种繁育与栽培技术研究及产业化示范 (2012BAD55G01); 国家 863 重大项目基于全基因组信息的藻类遗传选育 (2012AA10A406); 烟台市科技发展计划项目药用和食用海藻新种质苗种繁育与栽培技术研究及产业化示范 (2013LGS002) 第一作者简介 : 李言, 女,1983 年出生, 山东烟台人, 工程师, 硕士, 研究方向为藻类遗传学通信地址 : 山东烟台莱山区澳柯玛大街 18 号东方海洋保税库实验楼 305,Tel: , liyan-pig@163.com 通讯作者 : 崔翠菊, 女,1984 年出生, 山东济宁人, 工程师, 博士, 研究方向为藻类遗传育种通信地址 : 山东烟台莱山区澳柯玛大街 18 号东方海洋保税库实验楼 305,Tel: , cuicuiju@163.com 收稿日期 : , 修回日期 :

264003) 摘要 : 为了建立一个重现性好稳定性高, 适用于海带属 ISSR 遗传分析的 PCR 反应体系, 从海带属配子体材料中提取基因组 DNA 作为模板, 应用正交设计试验对反应体系中各因子的不同浓度进行组合优化结果显示 : 适用于海

2 81 longissima Saccharina angustata Saccharina 将配子体迅速研碎再加入 600 μl 2 CTAB 提取缓冲 ochotensis Saccharina religiosa 等丰富了海带种质资液置于 65 水浴 30 min, 期间每隔 5 min 上下颠倒数源也为开展遗传育种和新品种杂交选育工作提供了次 r/min 离心 10 min 取上清加入等体积的海带的分子遗传学方面的基础研究开展较酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 轻摇混匀 r/min 离晚目前针对海带遗传多样性研究的报道中主要以心 10 min 重复上述两个步骤 2~3 次直至有机相和水 SSR RAPD 标记技术为主 ISSR Inter- Simple 相界面无白色蛋白层加入 2 倍体积的无水乙醇充分 Sequence Repeat 简单重复间序列是在 1994 年由混匀后-20 静置 2 h r/min 离心 10 min 70% Ziekiewicz 等在 SSR 标记的基础上开发的一种新的乙醇洗涤 2~3 次超净工作台中风干加 80 μl 的 TE 溶分子标记与 SSR 标记相比 ISSR 不需要预先知道基解用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测所提因组的序列信息也不需要开发引物成本低操作简 DNA 的浓度和纯度 DNA 浓度统一稀释为 40 ng/μl 以便反应的遗传多态性丰富但在使用 ISSR 标记进行方便后续使用 -20 保存备用 PCR 扩增试验时不同物种的试验材料对引物反应条 1.3 ISSR 反应体系的优化材料 [3-4] [5-6] [7] 件的要求也不同因此需要对引物进行筛选和反应体参照哥伦比亚大学公布的 ISSR 引物序列系的优化邵峰等采用高盐低 ph 法提取紫色观赏 (UBC801-UBC900) 由上海捷瑞生物工程有限公司合辣椒的基因组 DNA 并通过正交设计试验优化了成经预试验筛选对 Mg2 + dntp 引物浓度 Taq ISSR-PCR 反应体系陈名红等[9]采用单因素试验对影 DNA 聚合酶(Promega USA)4 个因素分别取 3 个水响百合 ISSR-PCR 反应体系中的 6 个主要因素进行优平设计 L9(34)正交表进行正交试验表 1 取最适反化筛选建立了适合百合属的 ISSR 最佳反应体系汪应体系进行退火温度的梯度试验 PCR 反应程序斌等筛选出适合红麻的 ISSR 引物进行了体系优 95 预变性 3 min 95 变性 45 s 52 退火 45 s 72 延化并利用 ISSR 扩增条带建立了 6 份红麻种质材料的伸 2 min 共 38 个循环最后 72 延伸 10 min 扩增产指纹数据库王新宇等用 ISSR 分子标记技术构建了物在 %的琼脂糖凝胶上电泳检测 [8] [10] [11] 多态性水平较低的小麦种内指纹图谱能将亲缘关系表 1 ISSR 反应的 L9(34)正交试验设计很近的品种或品系区分开目前 ISSR 已被广泛应用于物种的系统发育品种鉴定和遗传多样性研究[12-14] 目前在国内沈永宝等陈海云等是利用 ISSR 分 [15] [16] 编号 Mg2+浓度/ dntp 浓度/ 引物浓度/ Taq DNA 聚合酶/ (mmol/l) (mmol/l) (μmol/l) U 子标记技术在种质鉴定方面做得较好的专家在海带 1 属的分子标记技术研究中尚未见有对 ISSR 反应体系 2 优化的相关报道因此本研究以海带配子体的基因组 3 DNA 为模板应用正交设计试验对海带 ISSR-PCR 反 4 应体系进行优化为后续开展海带品种鉴定和遗传多 5 样性研究奠定基础 6 1 材料与方法试验材料 8 9 以保存在国家海藻工程技术研究中心海藻种质库的海带配子体为试验材料取状态良好干净的克隆材料进行 DNA 提取 2 结果与分析基因组 DNA 提取 2.1 海带配子体基因组 DNA 的提取采用改进的 CTAB 法提取配子体基因组 DNA 具提取的海带配子体 DNA 条带整齐无降解和杂质体方法取 g 湿重的配子体材料尽可能的吸干水污染图 1 紫外分光光度计测定的 A260/A280 比值在分在 μl 离心管中加入 100 μl 2 CTAB 提取缓冲 1.9 左右浓度约为 50~100 ng/μl 可满足试验需要液包括 2% CTAB(W/V) 2% PVP polyvinylpyrrolidone 聚乙烯吡咯烷酮 100 mmol/l Tris- HCl 20 mmol/l EDTA( ph 8.0) 1.4 mmol/l NaCl 2%β-巯基乙醇(V/V) 用尖头研磨棒在离心管中该方法不需使用液氮研磨只需用很少的试验材料便可提取质量符合要求的基因组 DNA 2.2 海带配子体 ISSR 反应体系优化本试验根据 4 因素 3 水平正交设计表共有 9 个试

Sequence Repeat 简单重复间序列是在 1994 年由混匀后-20 静置 2 h 4 1200 r/min 离心 10 min 70% Ziekiewicz 等在 SSR 标记的基础上开发的一种新的乙醇洗涤 2~3 次超净工作台中风干加 80 μl 的 TE 溶分子标记与 SSR 标记相比 ISSR 不需要预先知道基解

3 82 李言等 : 海带属配子体 DNA 提取及 ISSR-PCR 体系优化 M M:λDNA(100 ng);1~4: 部分配子体 DNA 图 1 提取的部分海带配子体基因组 DNA 验组合,PCR 扩增结果见图 2, 可知, 除个别泳道条带模糊之外, 大部分组合都能扩出清晰的条带综合考虑各因素及用量, 觉得第 5 号组合扩增效果最好, 扩增位点多, 条带清楚, 该体系 (20 μl) 为 :1 PCR buffer, mmol/l Mg 2+, mmol/l dntps, μmol/l 引物, 40 ng 模板 DNA, U Taq DNA 聚合酶 ; 扩增 PCR 程序为 :95 预变性 3 min;95 变性 45 s,52 退火 45 s, 72 延伸 2 min, 共 38 个循环 ; 最后 72 延伸 10 min 选取 5 号组合的反应体系进行温度梯度试验, 另选取 4 个个体, 分设个温度, 扩增结果电泳图谱见图 3 48 时扩增条带明亮清晰扩增效率高, 但相 M c C: 阴性对照 ;1~9:9 个试验组合 ;M:100 bp plus DNA marker 图 2 ISSR 正交试验组合电泳图 M 1 图 3 3 个温度梯度下的扩增电泳图 M:100 bp plus DNA marker;1~4: 退火温度为 48 ;5~8: 退火温度为 52 ;9~12: 退火温度为 55

预变性 3 min;95 变性 45 s,52 退火 45 s, 72 延伸 2 min, 共 38 个循环 ; 最后 72 延伸 10 min 选取 5 号组合的反应体系进行温度梯度试验, 另选取 4 个个体, 分设 48 52 55 3 个温度, 扩增结果电泳图谱见图 3 48 时扩增条带明亮清

4 83 比较 52 条件下个体间的特异条带较多能较好地反 3 结论映出个体间的差异虽然扩增效率不如 48 高但条带试验找到了一种适用于 ISSR-PCR 反应的海带基也清晰可见所以综合各方面考虑选取 52 作为最因组 DNA 提取方法该方法不需使用液氮研磨只需适反应条件用于后续群体的扩增用很少的试验材料便可提取质量符合要求的基因组 2.3 海带配子体 ISSR 反应体系稳定性检测 DNA 节约材料通过预试验和多因子正交设计试验利用优化的 ISSR 反应体系选择 12 个海带配子得到适合海带的 ISSR-PCR 反应体系 1 PCR buffer 体材料 DNA 对该体系进行稳定性检测从图 4 可以 mmol/l Mg2 + mmol/l dntps μmol/l ISSR 看出经正交试验优化和温度梯度试验后的 PCR 体系引物 40 ng 模板 DNA U Taq DNA 聚合酶扩增扩增出的条带清晰位点多表明该体系稳定可靠可 PCR 程序为 95 预变性 3 min 95 变性 45 s 52 用于后续海带配子体种质鉴定和遗传多样性分析等相退火 45 s 72 延伸 2 min 共 38 个循环 72 延伸关研究 10 min M 1 M 100 bp plus DNA marker 1~12 12 个不同的海带属配子体 PCR 扩增结果图 4 12 个个体在最佳条件下的扩增电泳图姜翠翠等[17]研究发现 PCR 反应体系中的各因素间存在一定的互作效应所以本试验用正交试验代替单稳定性高但此方法步骤较繁琐还需用到有机试剂所以还有待进一步探索研究因素试验进行 PCR 体系的优化对 ISSR-PCR 反应体在设计优化试验的预试验中试用了不同商家的系中主要的 4 个因素 Mg dntp 引物浓度 Taq Taq DNA 聚合酶发现聚合酶的质量对 PCR 扩增结果 DNA 聚合酶分别选取 3 个水平进化优化试验从试影响非常大不论是从条带的有无带型的清晰度还验结果看出不同的引物浓度对扩增的条带有无或亮是扩增的重现性和稳定性等方面都有着直接的影响度无明显影响但 Mg 浓度对条带的影响非常明显这与何礼等 [18] 姜翠翠等 [17] 陈名红等 [9] 在进行随机引当 Mg2+浓度低时出现部分条带的缺失 dntp 浓度的物扩增时得出的结论相同结合条带扩增的质量和影响也无明显差异退火温度影响扩增条带的式样这 DNA 聚合酶的价格评估了不同商家聚合酶的性价点研究结果与邵峰等和陈名红等的研究相符合比决定选用 Promega 生产的 GoTaq Flexi DNA 聚合 4 讨论酶进行 PCR 扩增条件优化和后续的 ISSR 试验本研 [8] [9] ISSR-PCR 反应对基因组 DNA 的质量要求很高究通过对 ISSR-PCR 反应体系中各因素的调整和优预试验中也采用基因组 DNA 提取试剂盒天根中国化建立了适合海带进行 ISSR-PCR 扩增反应的体系进行过海带的基因组 DNA 提取但因海带本身含多和 PCR 扩增程序为以后利用 ISSR 标记技术进行海糖多酚目前还没有针对海带专门设计的基因组提取带种质鉴定和遗传多样性分析提供了技术支持试剂盒所以效果不佳本试验采用直接研磨配子体参考文献法并利用改良的 CTAB 法进行基因组 DNA 的提取得到的 DNA 纯度好无杂质无降解在 PCR 扩增中 [1] 李宏基.中国海带养殖若干问题[M].北京:海洋出版社,1996:3-14.

PCR 体系引物 40 ng 模板 DNA U Taq DNA 聚合酶扩增扩增出的条带清晰位点多表明该体系稳定可靠可 PCR 程序为 95 预变性 3 min 95 变性 45 s 52 用于后续海带配子体种质鉴定和遗传多样性分析等相退火 45 s 72 延伸 2 min 共 38 个循环 72 延伸关研究 10 min 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

5 84 李言等 : 海带属配子体 DNA 提取及 ISSR-PCR 体系优化 [2] Tseng C K. Algal biotechnology industries and research activities in China[J].Journal of Applied Phycology, 2001,13: [3] Masao O, Alan T C. Seaweed cultivation and marine ranching[j]. Taxon,1993,43:151. [4] 张全胜, 曲善村, 解建祖, 等. 芝罘湾养殖日本长海带实验 [J]. 齐鲁渔业,2000,17(1): [5] Li B J, Shi Y Y, Yang G P, et al. Microsatellite DNA variation of the gametophyte clones isolated from introduced Laminaria japonica (phaeophyta) and L.longissima of China and varieties derived from them[j]. Journal of Integrative Plant Biology, 2008,50(3): [6] Bi Y H, Hu Y J, Zhou Z G. Genetic variation of Laminaria japonica (phaeophyta) populations in China as revealed by RAPD markers[j]. Acta Oceanologica Sinica,2011,30(2): [7] Ziekiewicz E, Rafalski A, Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)- anchored polymerase chain reaction amplification [J]. Genomics,1994(20): [8] 邵峰, 乙引, 徐娟, 等. 紫色观赏辣椒基因组 DNA 提取及 ISSR-PCR 体系的优化 [J]. 中国农学通报,2013,29(28): [9] 陈名红, 李玉, 刘多, 等. 百合属 ISSR 反应条件优化的研究 [J]. 中国农学通报,2013,29(4): [10] 汪斌, 祁伟, 兰涛, 等. 应用 ISSR 分子标记绘制红麻种质资源 DNA 指纹图谱 [J]. 作物学报,2011,37(6): [11] 王新宇, 陈佩度, 亓增军, 等. ISSR 标记在小麦指纹图普分析中的应用研究初探 [J]. 农业生物技术,2001, 9 ( 3): [12] Guo W H, Jeong J H, Kim Z S, et al. Genetic diversity of Lilium tsingtauense in China and Korea revealed by ISSR markers and morphological characters[j].biochemical Systematics and Ecology, 2011,39(4-6): [13] 朱岩芳, 祝水金, 李永平, 等.ISSR 分子标记技术在植物种质资源研究中的应用 [J]. 种子,2010,29(2): [14] 黄光文, 陈觉梁, 王伟成, 等. 运用 ISSR 标记鉴别水稻品种的初步研究 [J]. 杂交水稻,2006,21(3): [15] 沈永宝, 施季森, 赵洪亮. 利用 ISSR DNA 标记鉴定主要银杏栽培品种 [J]. 林业科学,2005,41(1): [16] 陈海云, 宁德鲁, 李勇杰, 等.59 个油橄榄种质的 ISSR 分子鉴定 [J]. 东北林业大学学报,2013,41(3): [17] 姜翠翠, 卢新坤, 方智振, 等. 无患子基因组 DNA 提取及 ISSR-PCR 反应体系的建立与优化 [J]. 东南园艺,2013(1): [18] 何礼, 袁水全, 莫邦辉, 等.RAPD 扩增中商品酶体系对扩增产物的影响 [J]. 应用与环境生物学报,2002,8(3): ( 上接第 76 页 ) treatment on leaf photosynthesis is related with increase of antioxidant enzymeactivity in watermelon seedlings grown under shade condition[j]. Photosynthetica,2009,47(3): [30] Wang L J, Jiang W B, Zhang Z H, et al. Biosynthesis and biological activities of 5- aminolevulinic acid and its potential application agriculture[j]. Plant Physiology Communications,2003,39(3): [31] Gadmar O B, Moan J, Scheie E, et al. The stability of 5- aminolevulinic acid in solution[j]. Photochem PhotobiolBiology, 2002,67(3): [32] 汪良驹, 石伟, 刘晖, 等. 外源 5- 氨基乙酰丙酸处理对小白菜叶片的光合作用效应 [J]. 南京农业大学学报,2004,27(2):34~38 [33] 张正斌. 作物抗旱节水的生理遗传育种基础 [M]. 北京 : 科学出版社,2003.

[5] Li B J, Shi Y Y, Yang G P, et al. Microsatellite DNA variation of the gametophyte clones isolated from introduced Laminaria japonica (phaeophyta) and L.

Syngene GBOXHR Retsch MM400 KQ DE Eppendorf Table 1 The sources of Astragali Radix and Hedysarum Radix No. 1 AMM2011_NMGTY Astr

Syngene GBOXHR Retsch MM400 KQ DE Eppendorf Table 1 The sources of Astragali Radix and Hedysarum Radix No. 1 AMM2011_NMGTY Astr PCR 龙平, 崔占虎, 李虔全, 徐建平, 张春红, 周立社 * *, 李旻辉 ( 包头医学院, 内蒙古包头 014060) DNA 30 28 DNA trnl-trnf PCR PCR 136 bp 323 bp 10% PCR PCR Astragalus membranaceus Fisch. Bge. var. mongho- licus Bge. Hsiao A. membranaceus