1822 刘 敏, 等 食 管 癌 组 织 表 皮 生 长 因 子 受 体 Ⅲ 型 突 变 体 表 达 及 其 意 义 的 探 讨 食 管 癌 是 我 国 高 发 肿 瘤 之 一, 表 皮 生 长 因 子 受 体 Ⅲ 型 突 变 体 (epidermalgrowthfactorreceptorvar

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1 中华肿瘤防治杂志 ９ 年 月第 ６ 卷第 ３ 期 ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶ ＴＲＥＡＴ Ｄ ｍｂ ９ Ｖ ６ Ｎ ３ ８ 前沿报道 食管癌组织表皮生长因子受体 Ⅲ 型突变体 表达及其意义的探讨 刘敏 郭晓娟 郭佑民 段小艺 首都医科大学附属北京朝阳医院放射科 北京 西安交通大学医学院第一附属医院影像中心 陕西 西安 ７６９ Ｅｘ ｄ ｄ ｍ ｗ Ⅲ ｍ ｍ 犔犐犝 犕 狀 犌犝犗犡 狅 犿 狀 犇犝犃犖 犡 狅 狔 犼狌狀 犌犝犗犢狅狌 犇狆狉 犿狀 狅犳 犚犱 狅 狅犵狔 犅 狀犵狅狔狀犵 犎狅 狊狆 犆狆 犕犱 犮 犝狀 狏 狉 狊 狀犵 犘 犚 狀 犼 狔 犅 犼 犐犿犵 狀犵犆狀 狉 犉 狉 狊 犃犳犳 犱 犎狅 狊狆 犕犱 犮 犆狅 犵狅犳 犡 狀犑 狅 狅狀犵 犝狀 狏 狉 狊 狀７６９ 犘 犚 狀 狔 犡 摘要 目 的 检 测 表 皮 生 长 因 子 受 体 Ⅲ 型 突 犃犅犛犜犚犃犆犜 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 Ｔ ｄ ｘ ｄ 变体 ＥＧＦＲⅢ 在 食 管 癌 组 织 中 的 表 达 探 讨 ｄ ｍ ｗ Ⅲ 其与食管癌发生 发展 的 关 系 方 法 采 用 免 疫 ＥＧＦＲⅢ ｄｄ ｍ ｍ 组化和蛋白质 印 迹 实 验 检 测 ＥＧＦＲⅢ 在 ６６ 例 ｍ ｍ 犕犈犜犎犗犇犛 Ｉｍｍ ｄ Ｗ 人食管癌组织 的 表 达 情 况 评 价 ＥＧＦＲⅢ 表 达 ｂ ｗ ｄ ｍ ｘ ｑ ｄ 在 食 管 癌 患 者 的 性 别 年 龄 分 布 肿 瘤 大 小 生 ６６ｍ ＥＧＦＲⅢ 长方式 ＴＮＭ 分期和淋巴结转 移 等 临 床 病 理 参 ｍ ｄ ｗ ｂ 数的表达 分 布 情 况 结 果 免 疫 组 化 结 果 显 示 ｄ ＥＧＦＲⅢ ｗ ｚ ｄ 犚犈犛犝犔犜犛 Ｔ ＥＧＦＲⅢ 主要分 布 于 胞 膜 及 胞 质 内 在 肿 瘤 及 ｍｄ ｍ 正常组织表达 的 平 均 净 灰 度 值 分 别 为 ４６± ｂ ｍｍ ｍ ４６ ± ４ ｄ ｗ ５４±３ 两 者 相 比 差 异 有 统 计 学 意 ４ 和 ５ ｗｄ ｄ ５ ５４±３ ｗ 义 ６ ７ 犘 蛋白质印迹实验结果 ６ ７ 犘 Ｔ ｂ ｗ 显示 ＥＧＦＲⅢ 在 肿 瘤 及 瘤 旁 正 常 组 织 中 表 达 ｍｂｗ ｂ ｗ ８８± ５ｄ ８３± ４９ 的平 均 净 灰 度 值 分 别 为 ８８ ± ５ 和 ｗｄ ｄ ９ ３６ ｗ ８３± ４９ 两者相比差异有统计学意义 犘 Ｔ ｄ ｗ ｂ ｄ ９ ３６ 犘 两种 检 验 方 法 均 显 示 不 同 ＴＮＭ ｄ 犘 ｍ ｄ ｍ 性别 年龄 肿瘤 大 小 生 长 方 式 组 间 ＥＧＦＲⅢ ５ ｂ ｄ ｗ ｄ ｘ 表达 差 异 无 统 计 学 意 义 犘 ５ ＴＮＭ 分 ｍ ｚ ｄ ｗ 犘 ５ Ｔ 期 淋巴结转移 和 病 理 分 级 中 ＥＧＦＲⅢ 表 达 差 ｂ ｗ ｍｍ ｍ ｂ ｗｄ ｄ Ｗ 异均 有 统 计 学 意 义 犘 ５ ＥＧＦＲⅢ 在 两 狉 ９７ 犘 种实 验 方 法 的 一 致 性 检 验 狉 ９７ 犘 ｄ 犆犗犖犆犔犝犛 犐犗犖犛 Ｈｍ 提 示 两 种 方 法 结 果 一 致 性 好 结 论 ｍ ｍ ｘ ＥＧＦＲⅢ ＥＧＦＲⅢ ｍ ＥＧＦＲⅢ 可能参 与 食 管 癌 发 生 并 在 食 管 癌 的 ｄｄ ｍ ｍ 侵袭和转移中起重要作用 ｍ 中华肿瘤防治杂志 ９ ６ ３ ８ ８４ 狀犑犆狀犮 狉犘狉 狏犜狉 ９ ６ ３ ８ ８４ 关键词 表皮生长因子 食管肿瘤 病理学 免疫组织化学 犓犈犢犠犗犚犇犛 ｄ ｍ ｗ ｍ ｍｍ ｍ 中图分类号 Ｒ７３５ 文献标识码 Ａ 文章编号 ６７３ ５６９ ９ ３ ８ ４ 基金项目 国家自然科学基金 ３６７４４ ３７７６９ 教育部博士点基金 ６６９８４９ 通讯作者简介 刘敏 女 辽宁锦州人 博士 主治医师 主要从事肿瘤分子影像学的研究工作 Ｔ ８６ ８５３８３ Ｅ ｍ ＬＭ７８４ ｍ ｄ

2 1822 刘 敏, 等 食 管 癌 组 织 表 皮 生 长 因 子 受 体 Ⅲ 型 突 变 体 表 达 及 其 意 义 的 探 讨 食 管 癌 是 我 国 高 发 肿 瘤 之 一, 表 皮 生 长 因 子 受 体 Ⅲ 型 突 变 体 (epidermalgrowthfactorreceptorvariant Ⅲ,EGFRvⅢ ) 是 表 皮 生 长 因 子 受 体 (epidermal growthfactorreceptor,egfr) 最 常 见 的 突 变 类 型, 与 恶 性 肿 瘤 的 发 生 发 展 有 密 切 关 系 EGFRvⅢ 在 食 管 癌 组 织 中 的 表 达 情 况 及 其 与 食 管 癌 发 生 发 展 的 关 系 尚 不 清 楚 本 课 题 通 过 免 疫 组 化 和 蛋 白 质 印 迹 实 验 检 测 食 管 癌 组 织 中 EGFRvⅢ 表 达, 分 析 与 肿 瘤 分 级 分 期 淋 巴 结 转 移 的 关 系, 探 讨 EGFRvⅢ 表 达 在 食 管 癌 发 生 发 展 中 的 意 义 1 材 料 与 方 法 1.1 标 本 来 源 收 集 经 病 理 确 诊 的 66 例 食 管 癌 及 癌 旁 5cm 外 食 管 组 织 标 本, 其 中 首 都 医 科 大 学 附 属 北 京 朝 阳 医 院 33 例, 西 安 交 通 大 学 第 一 附 属 医 院 14 例, 西 安 交 通 大 学 第 二 附 属 医 院 19 例 男 44 例, 女 22 例 年 龄 37~76 岁, 中 位 年 龄 64 岁 患 者 临 床 病 理 资 料 见 表 1 所 有 患 者 术 前 均 未 进 行 过 放 射 治 疗 及 化 学 药 物 治 疗 1.2 免 疫 组 化 染 色 及 图 像 分 析 EGFRvⅢ 单 克 隆 抗 体 为 美 国 Zymed 公 司 产 品, 稀 释 后 作 为 一 抗, 生 物 素 二 抗 及 DAB 显 色 系 统 购 自 武 汉 博 士 德 生 物 公 司 SABC 法 染 色, 石 蜡 切 片 常 规 脱 蜡, 梯 度 乙 醇 脱 水,3%H 2O 2 室 温 灭 活 30min, 微 波 抗 原 修 复, 山 羊 血 清 封 闭 30min, 加 入 一 抗 4 过 夜, 滴 加 二 抗,DAB 显 色 脱 水 透 明 封 片 用 已 知 的 阳 性 切 片 作 为 阳 性 对 照, 用 PBS 代 替 一 抗 作 为 阴 性 对 照 利 用 LeicaQ570c 真 彩 图 像 分 析 仪 ( 德 国 ) 及 Ni koneclipsee1000 采 图 摄 像 系 统 ( 日 本 ) 对 染 色 组 织 进 行 图 像 分 析 镜 下 观 察, 以 肿 瘤 细 胞 膜 或 胞 质 着 色 棕 黄 或 棕 褐 者 为 阳 性 细 胞 用 Q550CW 图 像 采 集 分 析 系 统 将 切 片 上 的 阳 性 染 色 信 号 转 化 为 灰 度 进 行 分 析 选 择 每 张 免 疫 组 化 切 片 空 白 处 入 射 光 值 作 为 定 标 每 张 切 片 测 定 至 少 5 个 高 倍 视 野 的 每 个 阳 性 细 胞 灰 度, 取 平 均 值 为 测 定 值 灰 度 值 越 高 表 明 相 应 蛋 白 表 达 越 低, 反 之 表 明 相 应 蛋 白 表 达 越 高 净 灰 度 值 = 间 质 处 灰 度 值 - 阳 性 细 胞 的 灰 度 值 1.3 蛋 白 质 印 迹 法 测 定 蛋 白 含 量 每 50~100 mg 组 织 裂 解 后 低 温 匀 浆, 所 有 蛋 白 样 品 调 至 等 浓 度, 混 合 沉 淀 加 上 样 缓 冲 液 上 样 ; 初 始 电 压 为 80V, 待 条 带 跑 至 胶 的 交 界 处 后,120 V 稳 压 电 泳 至 目 的 蛋 白 泳 动 至 距 胶 下 缘 1cm; 转 膜 1.5h, 离 子 水 与 PBST 漂 洗 10 min 3, 封 闭 液 中 缓 慢 摇 荡 1h; 按 一 抗 与 封 闭 液 浓 度 滴 加 于 玻 璃 皿 的 封 口 膜 上, 将 NC 膜 贴 在 一 抗 上, 室 温 下 孵 育 3h 一 抗 孵 育 结 束 后,PBST 漂 洗 膜 后 浸 洗 ; 按 稀 释 二 抗, 室 温 孵 育 1.0h 后,PBST 漂 洗 膜 后 再 浸 洗 10 min 3;HRP ECL 发 光 法 发 光 成 像, 用 SynGene 扫 描 系 统 对 发 光 的 膜 直 接 拍 照, 以 β actin 为 内 参 以 每 一 个 样 品 的 目 的 条 带 的 光 密 度 值 / β actin 的 光 密 度 值, 即 为 目 的 条 带 的 半 定 量 结 果 临 床 病 理 参 数 年 龄 表 1 66 例 食 管 癌 患 者 的 临 床 病 理 资 料 ( 狓 - ± 狊 ) 狀 EGFRvⅢ 净 灰 度 值 ( 免 疫 组 化 法 ) EGFRvⅢ 净 灰 度 值 ( 蛋 白 质 印 迹 法 ) < ± ± ~ ± ±0.31 > ± ±0.12 性 别 男 ± ±0.21 女 ± ±0.11 部 位 上 段 ± ±0.45 中 段 ± ±0.22 下 段 ± ±0.15 肿 瘤 大 小 (cm) < ± ±0.19 3~ ± ±0.20 > ± ±0.31 病 理 类 型 鳞 癌 ± ±0.25 其 他 ± ±0.31 大 体 分 型 髓 质 型 ± ±0.17 蕈 伞 型 ± ±0.20 溃 疡 型 ± ±0.25 缩 窄 型 ± ±0.19 TNM 分 期 Ⅰ ± ±0.40 Ⅱ ± ±0.22 Ⅲ ± ±0.40 Ⅳ 0 淋 巴 结 转 移 有 ± ±0.30 无 ± ±0.21 病 理 分 级 Ⅰ ± ±0.16 Ⅱ ± ±0.34 Ⅲ ± ±0.20 合 并 食 管 上 中 段 癌 后 狏 狊 下 段 癌 EGFRvⅢ 表 达, 犘 <0.001; 其 他 包 括 1 例 腺 癌 数 及 1 例 腺 鳞 癌, 数 量 少, 组 织 病 理 类 型 间 未 作 统 计 学 比 较 ; TNM 分 期 病 理 学 分 级 淋 巴 结 转 移 各 组 内 EGFRvⅢ 表 达 比 较, 犘 < 统 计 学 方 法 采 用 SPSS13.0 统 计 分 析 软 件,EGFRvⅢ 在 食 管 癌 组 织 与 癌 旁 正 常 组 织 两 组 间 表 达 行 配 对 检 验, 每 一 临 床 指 标 组 内 两 分 组 分 析 行 独 立 样 本 检 验, 多 分 组 行 单 因 素 方 差 分 析, 采 用 Proximity Matrix 一 致 性 检 验 分 析 免 疫 组 化 实 验 与 蛋 白 质 印 迹 实 验 结 果, 检 验 水 准 α=0.05

3 中华肿瘤防治杂志 ９ 年 月第 ６ 卷第 ３ 期 ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶ ＴＲＥＡＴ Ｄ ｍｂ ９ Ｖ ６ Ｎ ３ ８３ 免疫组化及蛋白质印迹法分析结果 免疫组织化学 及 蛋 白 印 迹 法 检 测 ＥＧＦＲⅢ 表 达 结果 ＥＧＦＲⅢ 检测结果 免疫组化检测结果显 示 ＥＧＦＲⅢ 不 仅 定 位 于 胞 灰度值见表 与临 床 指 标 表 达 方 差 分 析 结 果 见 表 膜图 Ａ 胞质中也有明显分布图 Ｂ 阳性 细胞 呈 大小 生长方式间差异无统 计学 意 义 犘 ５ 与 组 片状分布的棕黄色或棕褐色颗粒 蛋白质印迹法分析 织病理类型关系尚有待病例资料的积累 免疫组化法 显示蛋白大 小 为 ３４ ３ 与 预 测 分 子 相 同 图 显示食管 中 上 段 癌 表 达 高 于 下 段 表 达 犘 ３ 免疫 组 化 检 测 食 管 癌 和 癌 旁 组 织 中 ＥＧＦＲⅢ 表 达 的 平均灰度值分别 为 ４６±４ 和 ５ ５４±３ ＥＧＦＲⅢ 表达在 ＴＮＭ 分 期 淋 巴 结 转 移 以 及 病 理 分 级方面差异均有 统 计 学 意 义 ＬＳＤ 检 验 Ⅰ 与 Ⅱ ６ ７ 犘 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 食 管 癌 和 癌 旁 组织中 ＥＧＦＲⅢ 表 达 的 平 均 灰 度 值 分 别 为 ８８± ９ ８９ 犘 ３３ Ⅰ 与 Ⅲ ９ ３９ 犘 Ⅱ 与 ７６ 犘 ９ 提示 ＥＧＦＲⅢ 在食管癌的 Ⅲ ５ 和 ８３± ４９ ９ ３６ 犘 瘤旁组 织内几乎检测不到 ＥＧＦＲⅢ 表 达见 图 免 疫 组 化 表达量随 ＴＮＭ 分期越大 表达越多 有淋 巴结 转移 者 表达量高 病理分级越高 含量越高 蛋白质印迹法检 及蛋白质印迹法均提示肿瘤组织高表达 ＥＧＦＲⅢ 测 ＥＧＦＲⅢ 表达显示 食管中上段癌表达高于下段表 两种方 法 均 提 示 ＥＧＦＲⅢ 表 达 在 性 别 年 龄 组 肿 瘤 达 犘 ３７ ＥＧＦＲⅢ 表 达 在 ＴＮＭ 分 期 淋 巴 结 转移以及 病 理 分 级 组 内 差 异 均 有 统 计 学 意 义 ＬＳＤ 检验 Ⅰ 与 Ⅱ ３ 犘 ３８ Ⅰ 与 Ⅲ ５６ ３ 犘 ３ Ⅱ 与 Ⅲ ４３ 犘 ５ 提 示 ＥＧＦＲⅢ 在食管癌的 表 达 量 随 ＴＮＭ 分 期 越 大 表 达 越高 有淋 巴 结 转 移 者 表 达 量 高 病 理 分 级 越 高 含 量 越高 图 癌旁组织与食管癌组织 ＥＧＦＲⅢ 蛋白质印 迹分析 ＨＲＰ ＥＣＬ 法 ３ 免疫组化及蛋白质印迹实验的一致性分析 采用 Ｐ ｘ ｍ ｘ 检 验 一 致 性 分 析 ＥＧＦＲ Ｍ Ⅲ 在免疫 组 化 及 蛋 白 印 迹 实 验 结 果 相 关 系 数 为 狉 ９７ 犘 具有很好的一致性图 ３ 图 食管癌 ＥＧＦＲⅢ 免疫组化分析 ＳＡＢＣ Ａ ＥＧＦＲⅢ 定位于胞膜 Ｂ ＥＧＦＲⅢ 定位于胞质 表 免疫组化法及蛋白质印迹法 ＥＧＦＲⅢ 肿瘤表达与临床指标关系 临床参数 性别 年龄分布 生长方式 肿瘤大小 生长部位 ＴＮＭ 分期 淋巴结转移 Ｆ ７６ ３ ５ ６８７ ７ ５９ ５ ４９８ ６ ３３ ４ ４３９ Ｓ 蛋白质印迹法 ８ ９８７ ８７９ ９７ ３ ８ ３ Ｆ ６９ ５６ ４ ３６ ３ ４５ ８ ７８ ４ ５３ ３ ８５ Ｓ ８３ ９４６ ７８８ ７４ ３７ ６ ３ 病理分级 免疫组化法 ５ 差异有统计学意义 两组间 ｄｄ ｍ 检验 中上段癌合并后与下段行 ｄｄ ｍ 检验 犘 ３ 讨论 ＥＧＦＲ 是表皮 生 长 因 子 酪 氨 酸 激 酶 受 体 中 ｂｂ 家族中的重 要 成 员 与 肿 瘤 的 发 生 发 展 有 着 密 切 关 系 ＥＧＦＲ 表达不很 稳 定 常 常 出 现 基 因 的 扩 增 和 重 排 导致基因突变 使得肿瘤细胞表面的抗原表型发生

4 1824 刘 敏, 等 食 管 癌 组 织 表 皮 生 长 因 子 受 体 Ⅲ 型 突 变 体 表 达 及 其 意 义 的 探 讨 改 变, 其 中 最 常 见 的 突 变 类 型 为 EGFRvⅢ [1] EG FRvⅢ 是 恶 性 肿 瘤 特 异 性 表 达 的 蛋 白, 在 正 常 组 织 中 [2 4] 不 表 达, 已 在 其 他 多 种 肿 瘤 的 检 测 中 得 到 证 实 本 研 究 分 别 用 免 疫 组 化 和 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 食 管 肿 瘤 组 织 和 正 常 组 织 的 表 达 含 量, 两 实 验 均 证 实 EGFRvⅢ 在 肿 瘤 组 织 中 表 达 含 量 较 正 常 组 织 的 含 量 高 蛋 白 质 印 迹 实 验 的 灵 敏 度 高 并 可 以 半 定 量 分 析, 在 相 同 的 实 验 条 件 下, 正 常 组 织 几 乎 检 测 不 到 荧 光 条 带 本 实 验 有 4 例 与 其 他 正 常 样 本 相 比 有 稍 亮 荧 光 条 带, 但 是 条 带 不 均 匀, 有 拖 尾 现 象, 考 虑 可 能 是 非 特 异 性 着 色 因 此, 提 示 在 正 常 食 管 组 织 中 不 表 达, 而 食 管 癌 组 织 中 特 异 性 表 达 EGFRvⅢ 本 组 免 疫 组 化 的 结 果 发 现,EGFRvⅢ 不 仅 定 位 于 细 胞 膜 上, 并 且 在 细 胞 内 也 有 较 明 显 的 表 达, 推 测 这 是 [5] 由 于 这 种 变 异 体 在 胞 内 有 异 常 的 运 输 途 径 所 致, 具 体 原 因 尚 待 进 一 步 研 究 免 疫 组 化 还 发 现 在 肿 瘤 组 织 与 周 围 正 常 组 织 交 界 处 的 细 胞 EGFRvⅢ 着 色 较 肿 瘤 组 织 内 的 细 胞 的 染 色 重, 可 能 是 由 于 交 界 处 的 细 胞 更 [6] 具 有 侵 袭 表 型 研 究 食 管 癌 EGFRvⅢ 表 达 与 患 者 临 床 资 料 关 系 显 示 该 蛋 白 在 性 别 年 龄 大 小 生 长 方 式 组 内 无 表 达 差 异, 而 在 肿 瘤 的 生 长 部 位 TNM 分 期 淋 巴 结 转 移 以 及 病 理 分 级 方 面 上 差 异 有 统 计 学 意 义, 与 赵 荫 农 [3] 等 乳 腺 癌 标 本 的 实 验 结 论 基 本 一 致 但 本 组 病 例 病 灶 分 布 明 显 不 均 匀, 同 时 病 理 类 型 中 仅 有 1 例 腺 癌 及 1 例 腺 鳞 癌, 部 位 及 病 理 类 型 与 EGFRvⅢ 表 达 间 关 系 有 待 的 病 例 样 本 积 累 瘤 恶 性 表 型 其 他 研 究 只 是 从 不 同 病 理 类 型 的 表 达 率 证 明 表 达 情 况, 而 本 实 验 通 过 免 疫 组 化 的 灰 度 分 析 和 蛋 白 质 印 迹 法 的 更 精 确 的 半 定 量 分 析 进 一 步 确 定 了 EGFRvⅢ 的 表 达 量 与 病 理 分 级 成 正 相 关 肿 瘤 细 胞 的 侵 袭 转 移 过 程 是 一 个 多 步 骤 复 杂 的 过 [8] 程,Damstrup 等 发 现 转 染 EGFRvⅢ 阳 性 的 小 细 胞 癌 细 胞 GLC3 EGFRvⅢ 的 侵 袭 能 力 较 亲 代 细 胞 系 显 著 提 高 本 实 验 通 过 对 不 同 TNM 分 期 的 组 织 检 测 发 现, 高 侵 袭 性 的 肿 瘤 表 达 EGFRvⅢ 高, 同 样 有 淋 巴 结 转 移 组 表 达 量 也 高 于 非 转 移 组, 进 一 步 证 实 EGFRvⅢ 能 促 进 肿 瘤 侵 袭 和 转 移, 使 肿 瘤 细 胞 更 具 恶 性 表 型 对 免 疫 组 化 实 验 和 蛋 白 质 印 迹 实 验 结 果 进 行 一 致 性 分 析, 两 种 方 法 具 有 高 度 的 一 致 性, 进 一 步 证 实 EGFRv Ⅲ 在 食 管 癌 肿 瘤 的 分 化 侵 袭 和 转 移 中 有 重 要 意 义 本 课 题 利 用 免 疫 组 化 实 验 和 蛋 白 质 印 迹 实 验 两 种 方 法 证 实,EGFRvⅢ 在 食 管 癌 组 织 中 特 异 性 表 达, 且 随 恶 性 程 度 增 高 而 增 加, 分 期 越 高, 表 达 含 量 越 高 淋 巴 结 转 移 者 表 达 多, 提 示 EGFRvⅢ 在 食 管 癌 发 生 发 展 及 转 移 方 面 起 到 了 重 要 的 作 用, 其 表 达 量 也 能 反 映 食 管 癌 的 恶 性 程 度, 因 此 可 作 为 预 测 食 管 癌 的 重 要 因 子 本 课 题 的 实 验 结 果 为 EGFRvⅢ 作 为 肿 瘤 靶 向 分 子 成 像 及 治 疗 奠 定 了 基 础 参 考 文 献 [1] YanX,LinY,YangD,etal.Anovelanti CD146 monoclonal antibody,aa98,inhibitsangiogenesisandtumorgrowth[j]. Blood,2003,102(1): [2] 段 小 艺, 王 健 生, 张 明 鑫, 等. 人 肾 透 明 细 胞 癌 中 EGFRvⅢ 的 表 达 及 意 义 [J]. 西 安 交 通 大 学 学 报,2008,29(4): [3] 赵 荫 农, 何 妮, 欧 超, 等. 乳 腺 肿 瘤 组 织 中 EGFR 与 EGFRv Ⅲ 的 表 达 及 临 床 意 义 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,2007,14(3): [4] 欧 超, 吴 飞 翔, 罗 元, 等. 表 皮 生 长 因 子 受 体 Ⅲ 型 突 变 体 在 肝 细 胞 癌 中 的 表 达 及 意 义 [J]. 癌 症,2005,24(2): [5] MoscateloDK,MontgomeryRB,SundareshanP,etal.Transfor mationalandalteredsignaltransductionbyanaturalyoccuringmu tantegfreceptor[j].oncogene,1996,13(1): [6] PawlowskiV,RevilionF,HebbarM,etal.Prognosticvalueof thetypeigrowthfactorreceptorsinalargeseriesofhumanpri 图 3 免 疫 组 化 与 蛋 白 印 迹 的 一 致 性 分 析 狉 =0.917 本 实 验 在 对 食 管 癌 的 研 究 中 发 现 分 化 程 度 越 低 的 [3] 肿 瘤 组 织 EGFRvⅢ 表 达 也 越 高 赵 荫 农 等 在 乳 腺 癌 方 面 证 实 了 相 似 的 结 论 但 在 其 他 肿 瘤 中 结 论 不 [4,7] 同 由 于 EGFRvⅢ 在 各 类 肿 瘤 的 表 达 不 均 衡, 因 此 对 于 不 同 的 结 果 可 能 是 由 于 不 同 类 型 的 组 织 在 表 达 上 有 所 差 异, 但 是 各 项 研 究 均 认 为 EGFRvⅢ 能 增 加 肿 marybreastcancersquantifiedwithareal timereversetranscrip tion polymerasechainreactionassay[j].clincancerres,2000, 6(11): [7] OkamotoI,KenyonLC,EmletDR,etal.Expressionofcon stitutivelyactivatedegfrvⅢinnon smalcellungcancer[j]. CancerSci,2003,94(1): [8] DamstrupL,WandahlPM,BastholmL,etal.Epidermalgrowthfac torreceptormutationtypeⅢtransfectedintoasmalcellungcancer cellineispredominantlylocalizedatthecelsurfaceandenhancesthe malignantphenotype[j].intjcancer,2002,97(1):7 14. 收 稿 日 期 : 修 回 日 期 : ( 编 辑 : 边 莉 )

5 中华肿瘤防治杂志 ９ 年 月第 ６ 卷第 ３ 期 ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶ ＴＲＥＡＴ Ｄ ｍｂ ９ Ｖ ６ Ｎ ３ ８５ 流行病学研究 舌鳞癌及癌前病变组织中环氧化酶 表达的研究 樊大庆 夏和顺 吴焕明 湖北省肿瘤医院头颈外科 樊大庆 病理科 夏和顺 湖北 武汉 ４３７９ 华中科技大学同济医学院病理科 湖北 武汉 ４３３ Ｅｘ ｘ ｑｍ ｍ ｄ 犉犃犖 犇 狀犵 犡犐犃 犎 狊 犺狌狀 犠犝 犎狌狀 犿 狀犵 狇 犎狌犫 犆狀犮 狉犎狅 狊狆 犠狌犺狀 ４３７９ 犘 犚 狀 犇狆狉 犿狀 狅犳 犘 犺狅 狅犵狔 犜狅狀犵犼 犕犱 犮 犆狅 犵狅犳 犎狌狕犺狅狀犵犛犮 狀犮 狀犱犜 犮犺狀狅 狅犵狔 犝狀 狏 狉 狊 狔 犠狌犺狀 ４３３ 犘 犚 狀 摘 要 目 的 探 讨 环 氧 化 酶 犃犅犛犜犚犃犆犜 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 Ｔ ｘ ｄ ＣＯＸ 在舌鳞癌以 及 癌 前 病 变 中 的 表 ｘ ＣＯＸ ｑｍ 达意义 方 法 免 疫 组 织 化 学 染 色 法 检 ＴＳＣＣ ｄ 犕犈犜犎犗犇犛 Ｔｍｍ ｍ 测舌 鳞 癌 ４７ 例 舌 上 皮 性 异 常 增 生 ｍ ｋ ｄ ｄ ｘ ｗ 例 及正 常 舌 组 织 例 ＣＯＸ 的 ＣＯＸ ３ ＴＳＣＣ ４７ 表达 分析 ＣＯＸ 表 达 与 病 理 诊 断 舌 ｄ ｍ Ｔ ｗ ｂ 鳞癌术前化 疗 分 化 程 度 ＴＮＭ 分 期 和 ｘ ＣＯＸ ｄ 淋巴结 转 移 的 关 系 结 果 ＣＯＸ 在正 ｍ ＴＮＭ ｄ ｄ ｍ 常舌组织中 不 表 达 舌 鳞 癌 中 表 达 总 阳 ｄ ｍ ｗ ｄ ｗ 犚犈犛犝犔犜犛 ＣＯＸ 性率为 ６３ ８ 舌 上 皮 性 异 常 增 生 中 表 ｘ ｄｂ ｍ ｗ ｘ 达阳性率为 ３ ３ 舌 癌 组 与 舌 正 常 组 ６３ ８ ＴＳＣＣｄ３ ３ ｄ 织及舌上皮异常增生组的差 异 有 统 计 学 Ｃｍ ｄ ｍ ｄ ｄ 意义 犘 其 中 在 舌 癌 发 生 转 移 ｘ ＣＯＸ ｗ ＴＳＣＣ 组和未发 生 转 移 组 中 ＣＯＸ 表达的差 犘 Ｔ ｗ ｄ ＣＯＸ ｘ 异无统 计 学 意 义 犘 ７５ 舌 鳞 癌 中 犘 ７５ Ｔ ｍ ｄ ｍ 是否接受术 前 化 疗 临 床 分 期 和 病 理 分 ｘ ＣＯＸ ＴＳＣＣｄ ｗ ｍ 级各组中 的 ＣＯＸ 表达差异均无统计 ｄ ｄ ｍｄｍ 学意义 犘 ５ 结 论 ＣＯＸ 在舌鳞 ｄ 犘 ５ 犆犗犖犆犔犝犛 犐犗犖犛 ＣＯＸ ｄ ｘ 癌及癌 前 病 变 中 存 在 不 同 程 度 的 高 表 ｂ ｗ ＴＳＣＣｄ ｗ 达 对舌鳞 癌 的 发 生 和 发 展 起 着 重 要 作 ｍ ｄｄ ｍ ｑｍ 用 舌鳞癌各分 组 中 ＣＯＸ 的表达差异 ｍ Ｔ ｄ ｘ ＣＯＸ 无统计 学 意 义 提 示 ＣＯＸ 可能是一 ｄ ｍ ｄ ＣＯＸ ｍｂ 个舌鳞癌靶向治疗的标志 ｄ 中华肿瘤防治杂志 ９ ６ ３ ８ ５ ８ ７ 狀犑犆狀犮 狉犘狉 狏犜狉 ９ ６ ３ ８５ ８７ 关键词 舌肿瘤 酶学 癌 鳞状细胞 癌前状态 酶学 免疫组织化学 犓犈犢犠犗犚犇犛 ｍ ｚ ｍ ｄ ｚ ｍｍ ｍ ｑｍ ｍ ｍ 中图分类号 Ｒ７３９ ８６ 文献标识码 Ａ 文章编号 ６７３ ５６９ ９ ３ ８５ ３ 通讯作者简介 樊大庆 男 湖 北 黄 冈 人 硕 士 副 主 任 医 师 ＣＯＸ 在 包 括 胃 近年来研究 发 现 环 氧 化 酶 肠道肿瘤在 内 的 多 种 肿 瘤 组 织 都 有 高 表 达 同 时 主要从事头颈肿瘤临床诊治与基础研究工作 在部分癌前病变如呼吸道黏膜化 生 结 肠腺 瘤等 亦 Ｔ ８６ ７ ８７６７４３ Ｅ ｍ ｄｑ６４ ６３ ｍ 有表达 本研究 探 讨 了 ＣＯＸ 在舌鳞癌组织和舌鳞

6 ８６ 攀大庆 等 舌鳞癌及癌前病变组织中环氧化酶 表达的研究 癌前病变中的表达 以及与舌鳞癌的临床分期 病理分 无 ＣＯＸ 表达 阳性表 达 率 为 ３ 组 之 间 的 ＣＯＸ 级和颈淋巴结转移间 的 关 系 旨 在 为 舌 鳞 癌 的 科 学 研 表达差异有统计学意义 犘 舌 鳞 癌 组 与 舌 鳞 究和临床综合治疗提供新的思路和帮助 癌前病变组 的 比 较 ＣＯＸ 表 达 差 异 有 统 计 学 意 义 材料与方法 犘 ３ 舌鳞癌组 与 舌 正 常 组 织 间 的 比 较 ＣＯＸ 表达差异有统计学意义 犘 舌 鳞 癌 前 病 变 与 标本来源 收集湖北省肿瘤医院９９８ ７ ４ ８ ４ 手术 组 病 例 中 ＣＯＸ 的 表 达 见 图 舌 鳞 癌 中 各 分 组 切除舌鳞癌石蜡包埋标本 ４７ 例 男 ３ 例 女 ６ 例 年 ＣＯＸ 的表达见表 舌正常组织间比较 差异 有 统 计 学 意 义 犘 ４９ ３ 龄 ８ ５ 岁 平均年龄 ３ 岁 中位年龄 ３ 岁 舌鳞癌 前病变病例６ 例 男 例 女４ 例 年龄４ ５７ 岁 平 均年龄 ４ ６ 岁 中位年龄 ４３ 岁 另外正常舌组织标本 例作为对照组 男 ５ 例 女 ５ 例 年龄 ７ ４ 岁 平 均年龄 ３５ 岁 中位年龄 ３３ 岁 ３ 组病例术前均未接 受放疗及非甾体类抗感染药治疗 ４７ 例舌鳞癌组织按 是否接受术前化疗 是否有转移 临床分期 病理诊断分 级分成四组进行数据对照分析 实验选用 无明显出 血 和坏死的与 ＨＥ 染色一致的蜡块作 ５μｍ 厚连续切片 供免疫组织化学染色备用 主要试剂 所有试剂均购自 北 京 中 山 生 物 技 术 有 限 公 司 包 括特异性 ＣＯＸ 鼠抗人单克隆抗体浓缩液浓缩 型效 价 山羊抗 小 鼠 通 用 二 步 法 试 剂 盒 ＤＡＢ Ｋ ＺＬＩ ９３３ 试剂盒以及防脱片剂 ＡＰＥＳ 等 ３ 免疫组化方法 免疫 组 化 染 色 采 用 ＳＰ 法 检 测 蛋 白 表 达 实 验 操 作严格按试剂盒说明书进行 ４ 结果判定 ＣＯＸ 免疫组化染色以细胞胞质内出现棕黄色颗 粒者为阳性 ＣＯＸ 表达结果判断参照 Ｍ ｘ 的判定 方法 在高倍镜下 ４ 随机选择 ５ 个视野 每个视野 计数 个细胞 计算平均百分率 根据细胞染色强度 和染色细胞所占面积两者积分之和来 判断 染 色强度 积分为不染色 轻度染 色 中度 染色 强染色 ３ 染色面积积 分 为无细胞染色 ５ 细 胞染色 ５ ５ 细 胞 染 色 ５ ７５ 细 胞 染 色 ３ ７５ 细胞染色 ４ 若两者积分之和 可判为阳 性 阳性中 ３ 分为 ４ ５ 分为 ６ ７ 分为 结果判定由两位病理医师进行 ５ 统计学方法 采用 ＳＰＳＳ 根据数据类型采用 χ ３ 统计软件分析 检验和多个样本率采用 χ 检验 如果差异有统计学意义 则进一步行两两比较的狇 检验 检验水准 α ５ 结果 图 舌正常组织和舌上皮异常增生组织及舌鳞癌组织中 ＣＯＸ 的表达 ４７ 例舌鳞癌组织中 ＣＯＸ 阳 性 ３ 例 总 表 达 阳 性率 ６３ ８ 而在 ６ 例 舌 鳞 癌 前 病 变 组 织 中 ＣＯＸ 阳性 ５ 例 表 达 阳 性 率 ３ ３ 例 正 常 舌 组 织 中 均 Ａ 正常舌组织 ＣＯＸ 阴 性 表 达 ＳＰ Ｂ 舌 上 皮 异 常 增 生 ＣＯＸ 阳性表达 ＳＰ Ｃ 低分 化 鳞 癌 组 织 ＣＯＸ 阳性表达 ＳＰ ４ Ｄ 高分化鳞癌组织 ＣＯＸ 阴性表达 ＳＰ

7 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2009 年 12 月 第 16 卷 第 23 期 CHINJCANCERPREV TREAT,December2009,Vol.16 No 表 1 舌 鳞 癌 组 织 中 COX 2 表 达 与 各 临 床 病 理 指 标 间 的 关 系 临 床 病 理 指 标 狀 COX 2 表 达 犘 值 TNM 临 床 分 期 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 淋 巴 转 移 无 有 病 理 分 级 高 中 低 术 前 化 疗 有 无 治 疗 药 物, 比 如 COX 2 抑 制 剂 以 改 善 舌 鳞 癌 的 治 疗 效 果, 而 COX 2 的 表 达 情 况 则 是 分 组 治 疗 的 指 标 已 经 [9] 有 些 小 规 模 的 研 究 在 开 展, 例 如 Schuon 等 报 道 非 选 择 性 COX 2 抑 制 剂 乙 酰 水 杨 酸 可 以 有 效 的 降 低 COX 2 的 代 谢 产 物 前 列 腺 素 E 2 在 头 颈 部 鳞 癌 和 其 周 围 黏 膜 中 的 高 水 平 的 表 达 总 之, 本 研 究 认 为 COX 2 表 达 与 舌 鳞 癌 的 病 理 分 [10] 化 程 度 不 相 关 ( 犘 =0.936) 任 国 欣 等 报 道 COX 2 在 舌 鳞 癌 组 织 中 表 达 阳 性 率 为 78.33%, 但 未 发 现 鳞 癌 分 级 与 表 达 之 间 的 显 著 相 关 性 ( 犘 =0.5519) 同 样 [11] 的 结 论 李 海 刚 等 也 有 报 道 意 味 着 针 对 COX 2 的 分 子 靶 向 治 疗 药 物 对 鳞 癌 的 不 同 病 理 分 级 都 有 相 近 的 疗 效 COX 2 在 舌 鳞 癌 组 织 中 表 达 的 研 究 揭 示 其 在 舌 鳞 癌 的 发 生 发 展 中 起 重 要 作 用 参 考 文 献 3 讨 论 舌 鳞 癌 是 一 种 常 见 头 颈 肿 瘤, 其 中 鳞 癌 占 95%,5 年 生 存 率 在 50% 左 右, 相 对 于 头 颈 部 其 他 肿 瘤, 治 疗 效 果 较 差 统 计 资 料 表 明,COX 2 在 包 括 舌 上 皮 异 常 增 生 头 颈 部 鳞 状 细 胞 癌 等 多 种 疾 病 中 高 表 达, 可 能 通 过 对 致 癌 物 的 代 谢 凋 亡 免 疫 监 视 血 管 生 成 等 多 条 [2 5] [6] 途 径 再 调 整 来 促 进 肿 瘤 发 生 发 展 Sudbo 等 在 41% 的 口 腔 上 皮 异 常 增 生 中 检 测 到 COX 2 高 表 达, 并 且 对 其 中 7 例 患 者 进 行 了 随 访 研 究, 结 果 发 现, 在 5 年 或 更 长 的 一 段 时 间 内 有 6 例 发 展 成 为 口 腔 癌, 这 说 明 COX 2 的 表 达 是 口 腔 肿 瘤 发 生 的 早 期 事 件 Ren [7] konen 等 通 过 免 疫 组 化 的 方 法 观 察 正 常 口 腔 黏 膜 不 同 程 度 的 舌 上 皮 异 常 增 生 及 鳞 癌 侵 害 时 发 现, COX 2 的 染 色 在 正 常 的 增 生 的 发 育 异 常 的 和 鳞 状 上 皮 组 织 中 依 次 增 高 本 研 究 结 果 显 示, 在 10 例 正 常 舌 组 织 中 COX 2 没 有 表 达, 而 舌 上 皮 异 常 增 生 组 COX 2 阳 性 率 是 31.3%, 舌 鳞 癌 组 织 中 的 COX 2 阳 性 率 为 63.8% 舌 上 皮 异 常 增 生 组 对 比 正 常 舌 组 织 组, 差 异 有 统 计 学 意 义, 而 舌 鳞 癌 组 对 比 另 外 两 组 差 异 均 有 统 计 学 意 义 [8] 与 何 家 才 等 报 道 相 同, 并 由 COX 2 分 别 在 正 常 舌 组 织, 舌 上 皮 异 常 增 生 和 舌 鳞 癌 中 表 达 比 率 的 逐 渐 增 高 分 析,COX 2 的 表 达 和 肿 瘤 发 生 及 发 展 相 关 在 舌 鳞 癌 组 中, 以 是 否 接 受 术 前 化 疗 为 条 件 分 组 的 比 较 中 得 出 COX 2 表 达 在 两 组 差 异 无 统 计 学 意 义, 说 明 现 有 的 术 前 化 疗 方 案 并 不 能 阻 止 或 逆 转 COX 2 的 表 达, 这 可 能 与 化 疗 方 案 疗 效 不 佳 有 关, 应 该 考 虑 加 入 新 的 靶 向 [1] Soslow R A,Dannenberg A J,Rush D,etal.COX 2isex pressedinhumanpulmonary,colonicandmammarytumors[j]. Cancer,2000,89(12): [2] Marx J.Cancer research Anti inflammatoriesinhibit cancer growth buthow?[j].science,2001,291(5504): [3] PrescotS M,FetzpatrickF A.Cyclooxygenase 2andcarcino genesis[j].biochembiophysacta,2000,1470(2): [4] LouY,WuK,SunA,etal.SignificanceofCOX 1,COX 2and Inosexpressioninsuperificialgastritis,gastricmucosalatypical hyperplasiaandgastriccarcinoma[j].chinjd,2000,20(4): [5] XuXC.COX 2inhibitorsincancertreatmentandprevention,are centdevelopment[j].anticancerdrugs,2002,13(2): [6] SudboJ,RistimakiA,SondresenJE,etal.Cyclooxygenase 2 (COX 2)expressioninhigh riskpremalignantorallesions[j]. OralOncol,2003,39(5): [7] RenkonenJ,Wolf H,Paavonen T,etal.Expressionofcy clooxygenase 2inhumantonguecarcinomaanditsprecursorle sions[j].virchowsarchiv,2002,440(6): [8] 何 家 才, 阮 敏, 陈 乔 尔, 等. 口 腔 鳞 癌 组 织 中 环 氧 化 酶 2 和 血 管 内 皮 生 长 因 子 的 表 达 及 其 相 关 性 研 究 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志, 2006,13(6): [9] SchuonRJ,BriegerL,FrankeRL,etal.IncreasedPGE2Lev elsinnonmalignantmucosaadjacenttosquamouscelcarcino maoftheheadandneck[j].orljotorhinolarvngolrelat spec,2005,67(2): [10] 任 国 欣, 郭 伟. 环 氧 化 酶 2 在 人 舌 鳞 癌 及 癌 前 病 变 组 织 中 的 表 达 [J]. 口 腔 颌 面 外 科 杂 志,2004,2(14):102. [11] 李 海 刚, 吕 志 强, 李 劲 松, 等. 舌 鳞 癌 MMPs 与 COX 2 的 表 达 及 其 相 互 关 系 [J]. 中 国 肿 瘤,2004,13(9): 收 稿 日 期 : 修 回 日 期 : ( 编 辑 : 刘 翠 玲 )

8 郭跃华 等 卡铂碳铁纳米球对大鼠移植性肝癌的靶向性研究 ８８ 实验研究 卡铂碳铁纳米球对大鼠移植性肝癌的靶向性研究 郭跃华 严文辉 桂玲 庞学斌 李富荣 鲍世韵 周汉新 暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院肝胆胰外科 广东 深圳 ５８ 华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部 湖北 武汉 ４３３ Ｔ ｄｂ ｄ ｂ ｂ ＣＦ ｄｄ ｗ ｄ 犌犝犗犢狌 犺狌 犢犃犖 犠狀 犺狌 犌犝犐犔 狀犵 犘犃犖犌犡狌 犫 狀 犔犐犉狌 狉 狅狀犵 犅犃犗犛犺 狔狌狀 犣犎犗犝 犎狀 狓 狀 犇狆狉 犿狀 狅犳 犎狆 狅 犫 狉狔犛狌狉犵 狉狔 犛犺狀狕犺狀犘 狅狆 狊犎狅 狊狆 犛 犮 狅狀犱犆 狀 犮 犕犱 犮 狀犆狅 犵狅犳犑 狀狀 犚 狀 犝狀 狏 狉 狊 狔 犛犺狀狕犺狀５８ 犘 犇狆狉 犿狀 狅犳 犘犺狉犿犮狔 犜狅狀犵犼 犎狅 狊狆 犜狅狀犵犼 犕犱 犮 犆狅 犵 犎狌狕犺狅狀犵犝狀 狏 狉 狊 狀犮 狀犱 狔狅犳犛犮 犚 狀 犜 犮犺狀狅 狅犵狔 犠狌犺狀 ４３３ 犘 摘要 目 的 观 察 卡 铂 碳 铁 纳 米 球 犃犅犛犜犚犃犆犜 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 Ｔｂ ｄｂ ｄ ｂ Ｃ Ｃ Ｆ Ｎ 经 肝 动 脉 注 射 结 合 体 Ｃ ｂ Ｃ Ｆ Ｎ ｄｄ Ｃ Ｎ Ｃ Ｃ 外磁场引导下 在移植性肝癌大鼠体内 ｄｂ ｍ ｄ ｗ Ｆ Ｎ ｊ ｄ 的靶向分布情况 方法 移植性肝癌大 ｄ 犕犈犜犎犗犇犛 Ｆ ｗ ｄ 鼠 ４ 只 为 Ａ 组 健 康 大 鼠 ４ 只 为 Ｂ ｗ ｍ ｄ Ｇ Ａ Ｆ ｍ ｗ ｍ ｄ 组 肝动脉插管 注入 Ｃ Ｃ Ｆ Ｎ 以 Ｇ Ｂ Ａｂｄｍ ｘ ｗ ｄ ｍ ｄ 肿瘤 Ａ 组 或肝左叶 Ｂ 组 为 靶 区 施 ｄ ｗ ｄ ｘｄ Ｃ Ｃ ｄ 加磁场 ３ ｍ ５ Ｇ 分 别 于 相 Ｆ Ｎ ｗ ｄ ｍ Ｇ Ａ ｄ ｊ Ｔ 应时间点 采 集 肿 瘤 或 靶 区 肝 非 靶 区 Ｇ Ｂ ｗ ｄ ５Ｇｍ ｄ ｂ 肝 肾 脾 肺 和 心 组 织 标 本 测 定 卡 铂 ｄ ３ ｍ Ａｄ ｍ ｊ 浓度 显 微 镜 观 察 Ｃ Ｃ Ｆ Ｎ在 各 脏 ｄ ｗ ｄ ｍ Ｔｄ 器沉积情况 结果 Ａ 组靶区肿瘤组织 ｄ ｋ ｄ ｄ ｗ ｍ ｄｂ 卡铂峰浓度 为 Ｂ 组 Ｃｍ ｘ ６５ μ 靶 区 肝 组 织３８ 的 ４７μ ７ 倍 为 Ａ ｍ ｍ ｂ ｍ ｗ Ｔ 组非靶区肝组织 ４ 的 ４ ３６μ ５ 倍 ＴＣｍｘ ｂ ｄ ｍ Ｇ Ａ ６５ μ ４８ 时 Ａ 组 靶 区 肿 瘤 组 织 卡 铂 浓 度 ｗ ７ ｍ ｄ Ｇ Ｂ 为 Ｂ 组 靶 区 肝 组 织 ７ ７ μ 的 ３ μ ３ 倍 为 Ａ 组非靶区肝组 ３８ ４７μ ｄ４ ５ ｍ ｄ Ｇ Ａ ４ ３６ μ Ｔ ｂ ｄ 织 的 ３μ ７ 倍 各 时 间 点 Ａ ｍ ４８ Ｇ Ａ ７ ７μ ｗ ３ ｍ 组肿瘤组 织 药 物 浓 度 均 成 倍 高 于 Ｂ 组 ３ μ ｄ ７ ｍ ｄ Ｇ Ｂ 靶区肝组织和 两 组 非 靶 区 肝 组 织 差 异 ｄ Ｇ Ａ ３μ Ｔｄ 有统计 学 意 义 犘 ５ Ａ 组 靶 区 肿 ｍ ｍｗ 为 瘤组 织 卡 铂 ＡＵＣ 是９６ μ 的 Ｂ 组 靶 区 肝 组 织４ ３４ μ ｄ Ｇ Ｂｄ ｄ ｂ 倍 为 Ａ 组 非 靶 区 肝 组 织 ｗ Ｇ Ａ ９６ ｍ ｄ μ 的 ８６ ４７ ５ 倍 结 论 Ｃ Ｃ μ ｄ Ｇ Ｂ ４ ３４ ５ ｍ μ Ｆ Ｎ在体内 显 示 出 良 好 的 磁 靶 向 性 犆犗犖犆犔犝犛 ｄ Ｇ Ａ ８６ ４７ 犐犗犖犛 μ ｄｂｈｅ ｂ Ｃ Ｃ Ｆ Ｎ 犚犈犛犝犔犜犛 犘 ５ Ｔ ｄ ｂ ｄ ｍ 和药物缓释性 并 且 对 肿 瘤 组 织 具 有 更 Ｃ Ｃ Ｆ Ｎｗ ｍ ｋｂ ｍ ｄｄ ｄ 狀 强的靶向性 能 成 倍 提 高 肿 瘤 组 织 中 的 狏 狏狅 ｗ ｍ ｄ Ｔ 药物浓度 延长维持时间 ｄ ｍ ｍ ｄ ｄ ｍ ｄ 中华肿瘤防治杂志 ９ ６ ３ ８ ８ ８ ３ 狀犑犆狀犮 狉犘狉 狏犜狉 ９ ６ ３ ８８ ８３ 基金项目 深圳市科技计划重点项目 ６６ 广东省自然科学基金 ４６９６６ 广东省名医工程研究项目 深圳市科技计划项目 Ｋ３ 通讯作者简介 郭跃华 男 河北唐山人 博士 副主任医师 主要从事肝癌纳米靶向治疗的研究工作 Ｔ ８６ ７５５ ５５３３８ ５６４ Ｅ ｍ ５ ６ ｍ

9 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2009 年 12 月 第 16 卷 第 23 期 CHINJCANCERPREV TREAT,December2009,Vol.16 No 关 键 词 磁 靶 向 ; 纳 米 球 ; 卡 铂 ; 肝 肿 瘤 ; 大 鼠 [ 犓 犈 犢 犠 犗 犚 犇 犛 ] magnetictarget;nanoparticles;carboplatin;liverneoplasms;rats 中 图 分 类 号 R73-3 文 献 标 识 码 A 文 章 编 号 (2009) 载 药 磁 性 纳 米 球 在 磁 场 引 导 下 能 将 药 物 靶 向 肿 瘤 [1] 部 位, 提 高 肿 瘤 组 织 药 物 浓 度, 增 强 疗 效 我 们 在 前 期 研 究 中 采 用 反 相 乳 液 法 研 制 了 卡 铂 碳 铁 纳 米 球 (Carboplatin C & FeNanoparticles,C C & Fe N), 卡 铂 为 负 载 药 物, 碳 包 铁 纳 米 笼 为 磁 性 内 核, 壳 聚 糖 为 包 裹 材 料 碳 包 铁 纳 米 笼 由 活 性 炭 (C) 和 纯 铁 (Fe) 构 成, 呈 中 空 的 笼 状 结 构, 纯 铁 使 C C & Fe N 具 有 磁 性, 活 性 炭 和 中 空 结 构 增 加 了 C C & Fe N 对 药 物 的 吸 附 功 能, 因 此,C C & Fe N 能 通 过 壳 聚 糖 包 裹 和 碳 包 铁 纳 米 笼 吸 附 双 重 物 理 机 制 负 载 卡 铂 前 期 研 究 表 明,C C & Fe N 在 体 外 显 示 出 良 好 的 磁 靶 向 性 和 药 [2] 物 缓 释 性 本 研 究 旨 在 观 察 C C & Fe N 经 肝 动 脉 注 入 体 内 后, 在 磁 场 引 导 下 对 大 鼠 移 植 性 肝 癌 的 靶 向 效 果 1 材 料 与 方 法 1.1 试 剂 与 实 验 动 物 卡 铂 标 准 品 ( 纯 度 >99%) 和 注 射 剂 由 齐 鲁 制 药 厂 提 供 C C & Fe N 由 本 实 验 室 采 用 反 相 乳 液 法 制 备, 平 均 粒 径 为 (207±21)nm, 载 药 量 为 (11.40± 1.31)% 体 外 释 药 持 续 5 d, 累 计 释 药 量 依 次 为 51% 68% 80% 87% 和 91% 将 C C & Fe N 按 5mg/ 支 进 行 分 装, 分 装 后 送 广 州 辐 照 中 心, 采 用 60 Co 辐 射 灭 菌, 辐 射 剂 量 为 15kGrey SPF 级 健 康 雄 性 SD 大 鼠 ( 动 物 许 可 证 号 :No ), 体 质 量 250~ 270g,SPF 级 健 康 雄 性 SD 幼 鼠 ( 动 物 许 可 证 号 :No ), 体 质 量 80~100g, 均 购 自 广 东 省 医 学 实 验 动 物 中 心 饲 养 条 件 : 温 度 20~26, 湿 度 50% ~ 70% 大 鼠 Walker 256 瘤 株 购 自 武 汉 大 学 典 型 培 养 物 保 藏 中 心 1.2 仪 器 与 设 备 AA 6800 型 石 墨 炉 原 子 吸 收 分 光 光 度 计, GFA EX7 型 石 墨 炉 原 子 化 器,ASD 6100 型 自 动 进 样 器, 热 解 涂 层 石 墨 管 ( 日 本, 岛 津 公 司 ), 铂 元 素 空 心 阴 极 灯 ( 北 京 同 立 有 限 公 司 ) YZ2074 型 手 术 显 微 镜 ( 苏 州 医 疗 器 械 总 厂 ) 2cm 2cm 大 小 钕 铁 硼 稀 土 永 久 磁 铁 (5000Gs, 深 圳 福 永 磁 材 料 厂 ) 1.3 大 鼠 移 植 性 肝 癌 模 型 的 建 立 将 Walker 256 瘤 株 常 规 复 苏 后, 在 含 10% 胎 牛 血 清 的 RPMI1640 培 养 液 中 于 37 5% CO 2 条 件 下 培 养 扩 增, 调 整 细 胞 悬 液 密 度 至 ml -1, 注 入 SD 幼 鼠 腹 腔 0.5 ml 5d 后 幼 鼠 出 现 腹 水, 脱 颈 处 死, 无 菌 条 件 下 抽 取 腹 水, 其 中 0.5mL 再 注 射 到 幼 鼠 腹 腔 内 保 种 传 代, 其 余 用 作 种 植 皮 下 实 体 瘤 将 含 肿 瘤 细 胞 的 腹 水 注 射 到 幼 鼠 双 侧 腹 股 沟 区 皮 下, 每 个 注 射 点 0.5mL 7d 后 脱 颈 处 死 幼 鼠, 无 菌 条 件 下 切 取 皮 下 种 植 瘤 块, 挑 选 瘤 块 中 鱼 肉 状 组 织, 切 成 2 mm 2mm 2mm 大 小 若 干 块, 置 于 生 理 盐 水 中 以 备 肝 脏 种 植, 保 存 时 间 2~3h SD 大 鼠 用 10% 水 合 氯 醛 按 3.5mL/kg 体 质 量 腹 腔 注 射 麻 醉, 作 上 腹 长 约 2cm 的 正 中 切 口 进 腹, 显 露 左 肝 叶, 在 肝 包 膜 下 作 0.5~1cm 长 的 隧 道, 植 入 瘤 块, 关 腹 14d 后 再 次 开 腹 探 查 肿 [3] 瘤 生 长 情 况 移 植 性 肝 癌 大 鼠 80 只, 体 质 量 250~270g,A B 组 各 40 只 健 康 大 鼠 1.4 给 药 方 法 实 验 大 鼠 麻 醉 后, 作 上 腹 正 中 切 口, 在 手 术 显 微 镜 下 解 剖 出 胃 十 二 指 肠 动 脉, 远 端 结 扎, 分 离 肝 总 动 脉, 动 脉 夹 夹 闭 在 胃 十 二 指 肠 动 脉 结 扎 线 上 方 纵 行 剪 开 动 脉 壁, 将 自 制 外 径 0.2 mm 的 导 管 自 胃 十 二 指 肠 动 脉 插 入 肝 固 有 动 脉, 经 注 入 美 蓝 证 实 插 管 位 置 合 适 后, 结 扎 固 定 导 管, 以 备 肝 动 脉 注 射 给 药 两 组 均 按 卡 铂 5 mg/kg 体 质 量, 经 肝 动 脉 注 入 C C & Fe N 生 理 盐 水 分 散 液, 注 药 时 间 为 5 min,a 组 以 肿 瘤 为 靶 区,B 组 以 左 肝 叶 为 靶 区, 在 其 上 方 放 置 5000Gs 磁 场, 维 持 30min 后 移 走 注 药 后 取 出 肝 动 脉 导 管, 结 扎 胃 十 二 指 肠 动 脉, 松 开 肝 总 动 脉 夹, 移 走 磁 场 后 分 层 缝 合 切 口 大 鼠 苏 醒 后 常 规 饲 养, 于 即 定 时 间 点 重 新 开 腹 取 标 本 1.5 标 本 采 集 分 别 于 给 药 后 和 和 48h 各 时 间 点, 每 组 取 5 只 大 鼠 腹 主 动 脉 放 血 处 死 后, 即 刻 切 取 肿 瘤 或 靶 区 肝 非 靶 区 肝 ( 右 肝 ) 肾 脾 肺 和 心 组 织 标 本, 生 理 盐 水 冲 净 表 面 血 液, 滤 纸 吸 干, 称 重 后 -20 冷 冻 保 存 待 测 卡 铂 浓 度, 另 取 部 分 标 本 制 作 HE 染 色 切 片, 显 微 镜 下 观 察 C C &Fe N 在 各 组 织 中 的 聚 集 情 况 1.6 组 织 药 物 浓 度 测 定 石 墨 炉 原 子 分 光 光 度 计 工 作 条 件 波 长 = 265.9nm, 狭 缝 宽 度 0.2nm, 灯 电 流 10mA, 背 景 扣 除 D2, 进 样 量 15μL 标 本 处 理 精 密 称 取 组 织 标 本 0.4g, 加 入 70% HNO 30.5mL 和 30% H 2O 21mL, 再 加 入 正 庚 醇 1 滴, 放 置 在 80 水 浴 消 化 2.5h, 放 冷 后 加 入 25% 氨 水 调 ph 值 为 6, 用 蒸 馏 水 定 容 至 2.5mL 取

10 郭跃华 等 卡铂碳铁纳米球对大鼠移植性肝癌的靶向性研究 ８３ ｍｌ 组 织 消 化 液 加 入 Ｔ Ｘ 溶 液 ｍｌ 混匀形成进样溶液 上机测定 ＳＤ 幼鼠腹腔接种 肿 瘤 细 胞 后 第 ５ 天 腹 水 呈 淡 黄 色 每只可抽取 ３ｍＬ 皮下接种肿瘤细胞后第 ７ 天 ６ ３ 拟 合 标 准 曲 线 方 程 精 密 称 取 卡 铂 标 准 品 ｍ 置于 ｍｌ 容 量 瓶 中 用 ＨＮＯ３ 定 容 至 ９ 的接种部位长出皮下实体肿瘤 大鼠肝脏种植瘤 块后第 ４ 天 ７ 种 植 大 鼠 肝 脏 可 见 直 径 约 ８ｍ 刻度 配 成 ｍ Ｌ 的 标 准 贮 备 液 Ａ 精 密 吸 取 ６ ５ｍＬ标 准 贮 备 液 Ａ 至 ５ ｍｌ 容 量 瓶 用 肿瘤 切除称 重 约 ３ ｍ图 Ａ 病 理 切 片 证 实 为 ５ ｍ Ｌ 的 标 准 贮 备 液 Ｂ 按 组 ＨＮＯ３ 定容 配成 织标本处理方法消化空白组织 精密吸取空白组织消 化液 ９９ ９８４ ９６８ ９３６ ９８４ ９７６ ９６８ ９５ 和 ９３６μＬ 于 只试管中 依次加入标准贮备液 Ｂ ８ ６ ３ 和 ６４ Ａ ６ ４ ３ ４８ 和 ６４μＬ 再各加入 Ｔ Ｘ 溶 液 ｍｌ 混 匀 配 成 卡 铂 浓 度 为 恶性肿瘤组织图 Ｂ Ｃ Ｃ Ｆ Ｎ 的组织分布情况 Ａ 组肿瘤组织横切面亦可见 Ｃ Ｃ Ｆ Ｎ 聚 集 图 Ｃ Ａ 组 各 时 间 点 肿 瘤 细 胞 间 隙 内 均 可 见 ＣＣ Ｆ Ｎ 聚集图 Ｄ 箭 头 所 示 Ｂ 组各时间点在磁靶 区肝 窦 中 和 肝 细 胞 间 均 见 Ｃ Ｃ Ｆ Ｎ 聚 集 图 Ｅ 箭头所示 但是 两组非靶区肝窦中和肝细胞间未见 ５ ４ ８ ６ ４ 和 ３ ｍ Ｌ 的 组织标准曲线进 样 溶 液 按 工 作 条 件 测 定 组 织 标 准 Ｃ Ｃ Ｆ Ｎ聚集 各时间点 两组肾 脾 肺和 心组 织 中均未见 Ｃ Ｃ Ｆ Ｎ 聚集 曲线进样溶液 以吸 收 峰 高 值 Ａ 为 纵 坐 标 浓 度 Ｃ ３ 组织药物浓度测定的标准曲线方程 以吸收峰 高 值 Ａ 为 纵 坐 标 浓 度 Ｃ 为 横 坐 标 为横坐标 拟合标准曲线方程 ７ 统计学方法 应用 ＳＰＳＳ 数据以 狓 采 ５ 统计软件分析 ±狊表示 拟合标准曲线方程 见表 组织 进样 溶 液 中 卡 铂 质 量 浓度在 ３ ｍ Ｌ 内线 性关系 良好 以 空 白 肝 用单因素方差分析或成组检验 检验水准 α ５ 组织重复测定 次 以其标准偏差的 ３ 倍作为最低检 出限 卡铂的最低检出限为 ５ｍ Ｌ 组织进样溶 结果 液浓度测定值的 ５倍即为每克该组织的卡铂含量 大鼠移植性肝癌模型 即组织卡铂浓度 图 大鼠移植性肝癌大体标本及组织学表现 Ａ 大鼠移植性肝癌大体标本 Ｂ 大鼠移植性肝癌组织学表现 ４ Ｃ 肿瘤剖面 Ｄ 肿瘤组织 Ｅ 靶区肝组织学 表 组织药物浓度的标准曲线方程 组别 肿瘤 肝 肾 脾 肺 心 标准曲线方程 Ａ ４７６Ｃ ８ Ａ ４５８Ｃ ３５ Ａ ５５Ｃ ５３ Ａ ５Ｃ ４６ Ａ ４４Ｃ ９ Ａ ５Ｃ ６７ 狉值 ９９７ ９９７ ９９６ ９９６ ９９８ ９９８ ４ 肿瘤组织和肝组织药物浓度 Ａ 组肿瘤组 织 卡 铂 峰 浓 度 Ｃｍｘ６５ μ 为 Ｂ 组靶区肝组织 Ｃｍｘ３８ ４７μ 的 ７ 倍 为 Ａ 组 非靶区肝组织 Ｃｍｘ４ ３６μ 的 ４ ５ 倍 ４８ 时 Ａ 组肿瘤组织 药 物 浓 度 ７ ７μ 为 Ｂ 组 靶 区 肝 组 织 ３ μ 的 ３ 倍 为 Ａ 组 非 靶 区 肝 组 织

11 中华肿瘤防治杂志 ９ 年 月第 ６ 卷第 ３ 期 ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶ ＴＲＥＡＴ Ｄ ｍｂ ９ Ｖ ６ Ｎ ３ ８３ ３μ 的 ７ 倍 各 时 间 点 Ａ 组肿瘤组织药物 浓度均成倍高 于 Ｂ 组 靶 区 肝 组 织 和 两 组 非 靶 区 肝 组 Ｃ Ｆ Ｎ 为纳米级 在光镜下是无 单个分散的 Ｃ 法辨认的 只有聚集的 Ｃ Ｃ Ｆ Ｎ 才可辨认 Ａ 组肿 织 差异具有统计学意义 犘 ５表 瘤大体标本和病理切片显 示 Ｃ Ｃ Ｆ Ｎ 选 择性 聚集 表 肿瘤组织和肝组织药物浓度时间数据 μ 时间 Ａ 组肿瘤组织 Ｂ组 Ａ 组肝组织 靶区肝 非靶区肝 在肿瘤组织间隙中 Ｂ 组靶区肝细胞间和肝窦中 有 Ｃ Ｃ 聚集 而两组非靶区肝窦中和肝细胞间未见 Ｃ Ｃ Ｆ Ｎ Ｆ Ｎ 聚集 同时 Ａ 组和 Ｂ 组磁靶区各时间点组织 卡铂浓 度 均 显 著 性 高 于 非 靶 区 肝 组 织 磁 靶 区 卡 铂 ５ ６５ ±６ ４ ４ ３６± ３８ ４７±３ ４ ７９± ９ ５ ６ ６５±６ ７４ ８± ６７ ３５ ４５±３ ４９ ６５± ９７ ５ ４４±５ ４５ ９ ４± ６３ ３ ４±３ ９ ７９± ３ ３ ４ ８±５ ５ ６ ５± ７ ９ ６± ８３ ５ ７６± ８８ ６ ３ ７７±４ ９ ３ ６６± ５ ５ ７８± ４ ３ ３± ６５ ６±３ ３ ５± ３ ± ８７ ３± ９ ４ ３ ６８± ８ ９４± ６ ± ９９ ９５± ５ 恶性肿瘤组织的 血 管 生 长 迅 速 但 血 管 内 皮 细 胞 ４８ ７ ７± ３ ３± ３ ± ５ ３５± ７ 缺乏 基底膜变形 结 合 大 量 血 管 通 透 剂 的 生 成 导 致 狊 Ａ 组肿瘤组织 犘 ５ 狏 狊Ｂ 组靶区肝组织 犘 ５ 狏 ＡＵＣ 成倍高 于 非 靶 区 肝 组 织 这 些 数 据 表 明 Ｃ Ｃ 利用自身较 强的 磁性 和良 好的 药 物 控 制 力 可选 Ｆ Ｎ 择性聚集于靶区 提高靶区组织中 药物 浓度 延长 维持 时间 显示出良好的体内磁靶向性和药物缓释性 了肿瘤血管渗透性的 增 加 加 之 淋 巴 管 道 回 流 系 统 缺 损 形成 了 肿 瘤 组 织 的 渗 透 滞 留 效 应 ｄ 按统计矩方法计算 ４８ 肿 瘤 和 肝 组 织 卡 铂 浓 度 时间曲线下面积 ｄ ＡＵＣ Ａ 组肿瘤 ｍ ｂ ＥＰＲ ６ 有 利 于 迅 ｄ 速增长的肿瘤组织获取更多营养物质和氧气 粒径在 为 Ｂ 组 靶 区 肝 组 织 组织卡铂 ＡＵＣ９６ μ 的 ４ ３４ 倍 为 Ａ 组 非 靶 区 肝 组 织 μ ４ ７８ｍ 的 颗 粒 可 以 穿 透 缺 损 的 毛 细 血 管 进 入肿瘤细胞间隙 并且由于淋巴回流障碍而高浓度 长 的 ８６ ４７ ５ 倍 μ ５ 其他组织药物浓度 时间蓄积 在 其 间 有 的 可 长 达 ７ Ａ 组 肿 瘤 组 织各时间点卡铂浓度和卡铂 ＡＵＣ 均 成倍 高于 Ｂ 组 磁 两组肾 脾和肺组织各时间点的药物浓度相近 差 异无统计学意义表 ３ 靶区肝组织 表明 Ｃ Ｃ Ｆ Ｎ 在 体 内 不 仅 可 聚 集 于 磁靶区 而 且 借 助 肿 瘤 组 织 的 ＥＰＲ 效 应 能 产 生 更 强 的肿瘤组织靶向性 ８ 表 ３ 其他组织药物浓度时间数据 μ 肾 时间 ５ ５ ３ ６ ４ ４８ Ａ组 ５ ４ ７ ８６ ６ ３４ ８ ４ ３ ６ 脾 参考文献 肺 Ｂ组 Ａ组 Ｂ组 Ａ组 Ｂ组 ５ ８４ ７ ４４ ３ ６ ５９ ７６ ７ ８３ ４ ３ ３ ７ ８ ４９ ３ ７８ ３ ３ ５４ ３４ ８ ３ ３５ ７３ ５７ ６８ ４ ３３ ７６ ５９ ６７ ４ 注 低于检测限 ３ 讨论 ＣＣ Ｆ Ｎ 以 碳 包 铁 纳 米 笼 Ｆ Ｃ Ｎ Ｆ ＣＮ 为磁性内核 Ｆ ＣＮ 由活性炭和纯 铁成分组成 呈中 空 的 笼 状 结 构 纯 铁 的 比 饱 和 磁 强 ＲｄｄＬ Ｈ Ｄ ｄ ｍ Ｊ Ｊ ３ ４ Ｐ ｍｐ ｍ ５ ５７ 郭跃华 李富荣 韩涛 等 卡铂碳铁纳米球的制备和特征 Ｊ 中国药学杂志 ７ ４ ４３ ４７ ３ 严德辉 严律南 ＳＤ 大鼠移植性肝癌模型建 立 的 几 个 问 题 探 讨 Ｊ 中国普外基础与临床杂志 ３ ８ ３ ４ 张利 王晓娜 丁学伟 等 纳米炭吸附丝裂霉素 Ｃ 腹腔化疗的 实验研究 Ｊ 中华肿瘤防治杂志 ８ ５ ４ ５３ ５６ ５ ＧＹ Ｈ Ｌ ＦＲ ＢＳＹ Ｐ ｄ ｄｄ ｗ ｄ ｂ Ｆ Ｃ Ｊ Ｃ Ａ ｄｐ ｄ ｄｄ ｍ ｍ ７ ７Ｓ ９７ ６ Ｎｍ Ｈ Ｙ ＫｗＳＭ ＣＨ Ｃ ｋ ｍ ｍ ｄ ｄ ｂ ｄ ｄ ｍ 度是 Ｆ３Ｏ４ 的 ６ 倍 使 ＣＣ Ｆ Ｎ 具 有 较 强 的 磁 Ｊ ＪＣ Ｒ ９ ３５ ３ ５９ ６７ 性 活性炭能吸 附 药 物 ４ 中 空 的 笼 状 结 构 又 能 增 强 ７ Ｍ ｄｈ ＷＪ ＳｗＴ Ｔｍ ｍ ｂ ｄ 这种吸附作用 Ｆ ＣＮ 自身对药物 具有了 一定 的吸 附能力 结 合 壳 聚 糖 对 药 物 的 包 裹 作 用 提 高 了 Ｃ Ｃ Ｆ Ｎ对药物的负载能力 药物释放时 首先 释放出 外层壳聚糖包裹的药物 其次 Ｆ ＣＮ 释放其吸附药 ＥＰＲ ｍ ｍ ｗ Ｊ ＪＣ ７ ８４ Ｒ ６５ ８ 易军 陈江浩 凌 瑞 等 丝 裂 霉 素 纳 米 微 粒碘 油 乳 剂 经 动 脉 给药对 兔 肝 肿 瘤 的 疗 效 观 察 Ｊ 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 ６ ３ ４ ６３ ６５ 物 使药物释放平 稳 持 久 双 重 物 理 载 药 机 制 的 有 机 结合 使 Ｃ Ｃ Ｆ Ｎ 对药物具有良好的控制能力 ５ 收稿日期 ９ ８ 修回日期 ９ ５ 编辑 史本玲

12 杜雪莲 等 αβ ６ 整合素 ＲＮＡ 抑制人卵巢癌细胞体外及体内侵袭作用的研究 ８３ 实验研究 ＲＮＡ 抑制人卵巢癌细胞体外 αβ６ 整合素 及体内侵袭作用的研究 杜雪莲 盛修贵 宋趣清 魏萍 张小玲 路春华 山东省肿瘤医院妇科 山东 济南 ５７ Ｉ ｂ αβ６ ＲＮＡ ｍ 狀狏 狉 狅 ｄ 狀狏 狏狅 犇犝犡狌 狀 犛犎犈犖犌犡 狌 犵狌 犛犗犖犌犙狌 狀犵 犠犈犐犘 狀犵 犣犎犃犖犌犡 狅 狀犵 犔犝狌狀 犺狌 狇 犇狆狉 犿狀 狅犳 犌狔狀 犮 狅 狅犵 犮犗狀犮 狅 狅犵狔 犛犺狀犱狅狀犵犆狀犮 狉犎狅 狊狆 犑 狀狀５７ 犘 犚 狀 摘要 目 的 研 究 整 合 素 αβ ６小干扰 犃犅犛犜犚犃犆犜 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 Ｔ ｂ ＲＮＡ 对人卵巢癌 ＨＯ ８９ＰＭ 细胞侵 袭 生 ６ ＲＮＡ ｍ αβ ＨＯ ８９ＰＭ 犕犈犜犎犗犇犛 Ｗ ｍ 长的抑 制 作 用 方 法 以 脂 质 体 法 将 整 合 素 αβ ６ ＲＮＡ ＲＮＡ 组 及 无 义 寡 核 苷 酸质粒 组 转染人卵 巢 癌 ＨＯ Ｎ ８９ＰＭ ６ ＲＮＡ ｄ ｄ ｗ ｄ ｂ 细胞 通过实时 定 量 ＰＣＲ 及 蛋 白 质 印 迹 试 Ｎ ｄ Ｔｘ αβ ６ｍＲ ＨＯ ８９ＰＭ ｗ ｗ ｄｍ ｚ ｄ ＲＮＡ 验 分别测定 ＲＮＡ 组 Ｎ 组和 空 白 对 照 ＮＡｄ ｗ ｄ ｍ ｄｂｑ ＲＴＰＣＲｄ Ｗ 组 αβ ６ 整 合 素 ｍｒｎａ 和 蛋 白 的 表 达 Ｂ ｄ ｄ ｗ ｍ ｄｂｍｔｔ ＭＴＴ 法和 Ｔ ｗ 小 室 法 分 别 测 定 其 体 ｄｔ ｗ Ｔ ｗ ｄｂ 外增殖能力和 侵 袭 力 将 各 组 细 胞 接 种 于 ｋ ｄｍ Ｔ ｗ ｗ ｍ ｄｄ 裸小鼠皮下 观 察 移 植 瘤 生 长 速 度 并 用 免 ｘ αβ ６ ｄ ｍ ｄ ｍ 疫组化法 检 测 整 合 素 αβ ６ 的 表 达 结 果 ｗ ｄ ｄｂｍｍ ｍ ｍ ｄ 犚犈犛犝犔犜犛 Ｃｍ 与 Ｎ 组和空白对照组相比较 ＲＮＡ 组 中 ｘ ｄｗ Ｎ ｄｂ ｋ ６ 整合素 ｍｒｎａ 和 蛋 白 表 达 强 度 明 显 降 α β 低 转染的 卵 巢 癌 ＨＯ ８９ＰＭ 细 胞 侵 袭 力 ｗ ｍ ｄｂ 明显下降 犘 各 组 细 胞 体 外 增 殖 能 αβ ６ ＲＮＡ ｗ ｂ ｄ 犘 Ｔ ｄ 力差异 无 统 计 学 意 义 犘 ５ 但 ＲＮＡ ＨＯ ８９ＰＭ ｗ ｄｂ 组细胞裸 鼠 皮 下 移 植 瘤 生 长 速 度 明 显 低 于 ｗ ６ ＲＮＡ 犘 ５ Ｉ ｂ ｂ 其 他 两 组 免 疫 组 化 显 示 转 染 整 合 素 ６ｘ ＨＯ ８９ＰＭ ｄ ｄ Ｆ αβ ６ ＲＮＡ的 移 植 瘤 中 整 合 素 α ６为阴性 α β β 表 达 结 论 α 整 合 素 ６ ＲＮＡ 转 染 β ｍ ｄｗ αβ ６ ＲＮＡ ｍｄｍ ｍ ｄ ｍ ｄ ｍ Ｎ ｄ ＨＯ ８９ＰＭ细胞 后 通 过 降 低 α ６整合素 β 犆犗犖犆犔犝犛 犐犗犖 Ｉ ６ ＲＮＡ ｂ ｂ ｍｒｎａ 和蛋白表达水平 抑制其对细胞外基 ｍ ｄｍｂ ｂ 质的侵袭 进而抑制裸鼠移植瘤的生长 ｄ αβ ６ｍＲＮＡｄ ＲＮＡ ｗ ｂ 中华肿瘤防治杂志 ９ ６ ３ ８３ ８３５ 狀犑犆狀犮 狉犘狉 狏犜狉 ９ ６ ３ ８３ ８３５ 关键词 卵巢肿瘤 病理学 整合素 αβ ６ 侵袭 ＲＮＡ 转染 免疫组织化学 犓犈犢犠犗犚犇犛 ｍ ｂ ６ ＲＮＡ ｍｍ ｍ 中图分类号 Ｒ７３７ ３ 文献标识码 Ａ 文章编号 ６７３ ５６９ ９ ３ ８３ ４ 基金项目 山东省自然科学基金 Ｙ６Ｃ９３ 第一作者简介 杜雪莲 女 山东烟台人 博士 主治医师 主要从事妇科肿瘤治疗的研究工作 Ｔ ８６ ５３ ６７６６９７６ 通讯作者简介 盛修贵 男 山东临沂人 博士 研究员 主要从事妇科肿瘤治疗的研究工作 Ｔ ８６ ５３ ６７６６９７６ Ｅ ｍ ｘ ｍ ｍ ｊ

13 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2009 年 12 月 第 16 卷 第 23 期 CHINJCANCERPREV TREAT,December2009,Vol.16 No 卵 巢 癌 是 女 性 生 殖 器 官 常 见 的 恶 性 肿 瘤, 恶 性 度 高, 易 于 盆 腹 腔 广 泛 种 植 转 移 卵 巢 上 皮 癌 的 侵 袭 和 转 移 是 一 个 多 步 骤 多 因 素 参 与 的 连 续 复 杂 过 程, 主 要 涉 及 黏 附 降 解 移 动 和 血 管 生 成 等 方 面, 每 一 阶 段 都 有 多 种 生 物 活 性 物 质 参 与, 这 些 物 质 在 卵 巢 癌 侵 袭 和 转 移 中 的 作 用 机 制 仍 有 待 进 一 步 研 究 人 卵 巢 癌 细 胞 株 HO 8910PM 为 高 侵 袭 性 卵 巢 癌 细 胞, 高 表 达 整 合 素 αvβ6 本 研 究 将 整 合 素 αvβ6 特 异 性 小 干 扰 RNA 转 染 人 卵 巢 癌 细 胞 株 HO 8910PM, 观 察 其 对 细 胞 增 殖 侵 袭 能 力 的 影 响, 并 进 行 裸 鼠 体 内 成 瘤 实 验, 为 靶 向 应 用 整 合 素 αvβ6 蛋 白 治 疗 肿 瘤 提 供 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 来 源 及 分 组 人 卵 巢 癌 HO 8910PM 细 胞 株 由 山 东 省 肿 瘤 医 院 基 础 研 究 中 心 提 供 实 验 细 胞 随 机 分 成 RNA 干 扰 组 (sirna 组 ) 无 义 寡 核 苷 酸 (Neo 组 ) 组 和 空 白 对 照 组 (Control 组 )3 组 BALB/c nu/nu 小 鼠 30 只, 购 自 北 京 中 国 协 和 医 科 大 学 实 验 动 物 中 心,5~6 周 龄, 雌 性, 体 质 量 19.0~22.0g, 动 物 合 格 证 号 :SCXK( 京 ) ,SPF 层 流 柜 分 笼 饲 养 1.2 主 要 试 剂 特 异 性 沉 默 整 合 素 β6 的 sirnai 试 剂 SMART pool 购 自 美 国 Dharmacon 公 司 无 义 寡 核 苷 酸 序 列 (5 CTTAGGCTGTTACATCTCTCC 3 ) 由 大 连 宝 生 物 公 司 合 成 整 合 素 αvβ6 的 羊 抗 人 多 克 隆 抗 体 购 自 SantaCruz 公 司 ;BCA 蛋 白 分 析 试 剂 盒 购 自 美 国 Pierce 公 司 ;DMEM 培 养 液 胎 牛 血 清 Lipofectami ne TM 2000 TRIzol 试 剂 及 实 时 定 量 PCR 试 剂 盒 均 购 自 Invitrogen 公 司,Transwel 小 室 为 COSTER 公 司 产 品 1.3 人 卵 巢 癌 细 胞 悬 液 的 制 备 将 HO 8910PM 细 胞 株 接 种 于 含 10% 胎 牛 血 清 的 DMEM 培 养 液 中, 置 于 37 5% CO 2 及 95% 湿 度 培 养 箱 中 培 养, 细 胞 融 合 达 80% 时 用 含 0.2g/L 乙 二 胺 四 乙 酸 (EDTA) 的 胰 蛋 白 酶 消 化 传 代 一 次, 取 对 数 生 长 期 的 细 胞 进 行 转 染 1.4 sirna 干 扰 将 细 胞 接 种 于 6 孔 板,24h 后 达 到 40% 融 合 度, 脂 质 体 包 裹 整 合 素 β6 sirna, 转 染 HO 8910PM 细 胞 按 照 Lipofectamine TM 2000 操 作 说 明 进 行,72h 后 用 G418 (400 μg/ml) 筛 选 稳 定 转 染 的 细 胞 株 HO 8910/Neo 细 胞 是 采 用 无 义 寡 核 苷 酸 质 粒 转 染 HO 8910PM, 并 在 G418 中 筛 选 获 得 1.5 实 时 定 量 PCR 检 测 αvβ6 整 合 素 mrna 的 表 达 转 染 后 的 HO 8910PM 细 胞 继 续 培 养, 当 生 长 至 80% 融 合 度 度 时 按 照 Trizol 试 剂 盒 的 说 明 提 取 细 胞 总 RNA, 以 β actin 为 内 参 照, 检 测 αvβ6 整 合 素 mr NA 的 表 达 情 况 具 体 实 验 步 骤 按 说 明 书 进 行 1.6 蛋 白 印 迹 法 检 测 αvβ6 整 合 素 蛋 白 的 表 达 取 转 染 后 处 于 对 数 生 长 期 的 HO 8910PM 细 胞, 进 行 蛋 白 印 迹 实 验, 方 法 参 照 文 献 1.7 MTT 法 检 测 细 胞 体 外 增 殖 能 力 细 胞 接 种 于 96 孔 板,6000 个 / 孔, 分 别 于 培 养 和 72h 后 行 MTT 法 检 测 将 已 培 养 好 的 96 孔 板 细 胞 的 培 养 液 吸 出, 然 后 每 孔 加 入 10μL MTT (5mg/mL),37 培 养 4h, 弃 上 清, 每 孔 加 DMSO 150μL 以 溶 解 所 产 生 的 formazan, 振 荡 后 用 酶 标 仪 测 定 570nm 波 长 各 孔 的 吸 光 度 (OD 值 ), 取 每 组 6 孔 的 均 值 上 述 实 验 重 复 3 次 1.8 Transwen 肿 瘤 细 胞 侵 袭 实 验 制 备 条 件 培 养 液 : 小 鼠 成 纤 维 细 胞 系 NIH 3T 3 细 胞 (ATCC 公 司, 美 国 ) 用 含 10% 胎 牛 血 清 的 即 RP MI1640 培 养 液 在 37 5% CO 2 条 件 下 培 养 换 无 血 清 培 养 液 继 续 培 养 24h, 然 后 收 集 上 清 液, 过 滤 除 菌, 冷 冻 保 存 备 用 Transwel 小 室 的 上 下 室 间 置 8μm 微 孔 滤 膜, 膜 上 铺 Matrigel,37 放 置 30 min, 上 室 加 入 癌 细 胞 悬 液 (HO 8910/Control,HO 8910/Neo,HO 8910/siR NA), 下 室 加 400μL 按 1 1 混 合 的 NIH 3T 3 条 件 培 养 液 和 完 全 培 养 液 (NIH 3T 3 作 为 趋 化 剂 ), 入 培 养 箱 中 放 置 24h, 用 棉 签 擦 去 微 孔 膜 上 层 的 细 胞,95% 的 乙 醇 固 定, 苏 木 精 伊 红 染 色, 光 镜 下 计 数 穿 过 微 孔 滤 膜 的 5 个 视 野 癌 细 胞 数, 并 取 均 值, 每 组 重 复 3 个 样 本 1.9 裸 鼠 移 植 瘤 实 验 分 别 取 指 数 生 长 期 HO 8910/Control HO 8910/ Neo HO 8910/siRNA 组 细 胞, 胰 酶 消 化,2000r/min, 离 心 2min, 离 心 半 径 16.1cm, 收 集 细 胞 用 0.9% 生 理 盐 水 悬 浮, 显 微 镜 下 计 数 细 胞 浓 度, 生 理 盐 水 定 容 至 ml -1 取 裸 鼠 右 后 肢 大 腿 外 侧 皮 下 为 种 植 点, 取 0.2mL 细 胞 悬 液 ( 含 个 细 胞 ) 注 入 种 植 点 皮 下 成 瘤 后 隔 日 用 游 标 卡 尺 测 量 肿 块 长 径 a 及 横 径 b, 体 积 公 式 V=a b 2 /2 种 瘤 后 28d 处 死 动 物, 分 离 肿 块 周 边 皮 肤 及 非 肿 瘤 组 织,10% 中 性 甲 醛 固 定, 脱 水 石 蜡 包 埋 切 片 行 免 疫 组 化 染 色 1.10 整 合 素 αvβ6 免 疫 组 化 结 果 判 定 标 准 整 合 素 αvβ6 阳 性 定 位 于 细 胞 质 和 细 胞 膜, 呈 棕 黄 色 颗 粒 沉 着 定 性 结 果 判 断 : 全 面 观 察 每 张 切 片 以 及 芯 片 上 的 每 个 点, 以 细 胞 膜 或 者 细 胞 质 内 出 现 棕 黄 色 颗 粒 视 为 阳 性 细 胞 随 机 选 择 5 个 具 有 代 表 意 义 的 高 倍 视 野 ( 200), 每 个 视 野 计 数 100 个 细 胞, 计 算 其 中 的 阳 性 细 胞 数, 取 平 均 数,<5% 为 (-),5% ~25% 为 (+),25%~75% 为 (++),>75% 为 (+++) 1.11 统 计 学 方 法 连 续 变 量 用 狓 - ± 狊 表 示, 两 样 本 均 数 比 较 采 用 检

14 1834 杜 雪 莲, 等 αvβ6 整 合 素 sirna 抑 制 人 卵 巢 癌 细 胞 体 外 及 体 内 侵 袭 作 用 的 研 究 验, 多 样 本 均 数 的 比 较 以 及 组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析 分 类 变 量 以 及 样 本 率 的 比 较 采 用 χ 2 检 验 采 用 SPSS13.0 进 行 统 计 学 分 析 检 验 水 准 α= 结 果 2.1 转 染 前 后 各 组 细 胞 整 合 素 αvβ6mrna 及 蛋 白 质 表 达 荧 光 实 时 定 量 PCR 结 果 显 示, 空 白 对 照 组 与 转 染 无 义 序 列 质 粒 的 HO 8910/Neo 组 αvβ6 mrna 的 表 达 差 异 无 统 计 学 意 义 ( 犘 >0.05), 而 αvβ6 sirna 组 mrna 的 表 达 下 降 差 异 有 统 计 学 意 义 ( 犘 <0.01), 见 图 1A 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 显 示,HO 8910/Neo 组 整 合 素 αvβ6 蛋 白 质 表 达 与 空 白 对 照 组 相 比 无 统 计 学 差 异 ( 犘 >0.05), 而 sirna 组 该 蛋 白 表 达 明 显 下 降 ( 犘 < 0.01, 图 1B) 图 1 细 胞 转 染 后 整 合 素 αvβ6mrna 及 蛋 白 质 表 达 A: 荧 光 实 时 定 量 PCR 检 测 各 组 αvβ6mrna 的 表 达 ;B: 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 各 组 整 合 素 αvβ6 蛋 白 质 表 达 ; HO 8910/siRNA 狏 狊 对 照 组, 犘 < 转 染 对 细 胞 增 殖 能 力 的 影 响 MTT 检 测 结 果 显 示, 各 组 细 胞 体 外 培 养 和 72h, 细 胞 增 殖 能 力 各 组 间 比 较 差 异 无 统 计 学 意 义 2.3 侵 袭 实 验 结 果 与 空 白 对 照 组 比 较, 转 染 sirna 后 细 胞 的 侵 袭 力 明 显 下 降 ( 犘 <0.01), 而 HO 8910/Neo 组 无 显 著 改 变 ( 犘 >0.05), 见 图 整 合 素 αvβ6 sirna 对 移 植 瘤 生 长 的 影 响 与 空 白 对 照 组 比 较, 转 染 sirna 后 HO 8910PM 细 图 2 HO 8910/Control 组 HO 8910/Neo 组 及 HO 8910/siRNA 组 细 胞 侵 袭 能 力 A: 空 白 对 照 组 ;B:HO 8910/Neo 组 ;C:HO 8910/siRNA 组 ;D: 各 组 侵 入 下 室 的 细 胞 数 HO 8910/siRNA 狏 狊 对 照 组, 犘 <0.01 胞 在 裸 鼠 体 内 生 长 明 显 延 缓 ( 犘 <0.05), 而 HO 8910/Neo 组 细 胞 生 长 速 度 变 化 差 异 无 统 计 学 意 义, 犘 >0.05( 图 3) 2.5 整 合 素 αvβ6 在 裸 鼠 移 植 瘤 中 的 表 达 空 白 对 照 组 中 整 合 素 αvβ6 在 裸 鼠 移 植 瘤 中 为 阳 性 表 达, 主 要 表 达 于 肿 瘤 细 胞 的 胞 膜 及 胞 质 ;HO 8910/Neo 组 移 植 瘤 中 αvβ6 蛋 白 同 样 是 阳 性 表 达, 而 HO 8910/siRNA 组 蛋 白 表 达 均 为 阴 性 ( 图 4) 图 3 HO 8910 组 细 胞 裸 鼠 移 植 瘤 生 长 曲 线

15 中华肿瘤防治杂志 ９ 年 月第 ６ 卷第 ３ 期 ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶ ＴＲＥＡＴ Ｄ ｍｂ ９ Ｖ ６ Ｎ ３ ８３５ 图 ４ 整合素 αβ６ 在卵巢癌细胞 ＨＯ ８９ 裸鼠移植瘤中的表达苏木精染色 Ａ 空白对照组 Ｂ ＨＯ ８９ Ｎ 组 Ｃ ＨＯ ８９ ＲＮＡ 组 无明显下降 而裸鼠 体 内 移 植 瘤 实 验 发 现 肿 瘤 生 长 速 ３ 讨论 度受到明显抑制 由此认为 整合素 αβ ６ 在卵 巢癌 细 整合素 Ｉ 作为一类分布广泛的跨膜 受体 属于细胞黏附分子大家族 整合素通过识别胞外基质 胞向周围侵袭过程中 是 必 不 可 少 的 它 参 与 了 癌 细 胞 和细胞骨架 介导细 胞 间 及 细 胞 与 细 胞 外 基 质 的 黏 附 癌细胞的侵袭力 从而抑制抑制肿瘤的生长 同时 最 反应而起作用 并接受和传递特定信号 调节细胞的生 近的研究发现 整合素 αβ ６ 与血管内皮细胞生 长因子 物学特性 参与细胞多种生理功能和病理变化 如细胞 ＶＥＧＦ 密切相关 当 肿 瘤 细 胞 周 围 ＶＥＧＦ 水 平 升 高 时 ６ 的表达也会上调 ７ 当 αβ ６ 被β ６ Ｓ ＲＮＡ 或 αβ 分化 增殖 伸展和迁移以及肿瘤的侵袭和 转移等 整合 素 αβ ６是迄今为止发现的唯一仅存于恶性上皮 在正常组织中的浸润性生长 抑制 αβ ６ 的表达 可降 低 性肿瘤组织 而在正常上皮组织 上皮良性肿瘤组织和 ６ 抗体阻断时 由 ＶＥＧＦ 介导的肿瘤转移就会被显 αβ 著地抑制 因此推测 沉默整合素 αβ ６ 基因抑 制裸 鼠 其他类型恶性肿瘤 中 不 表 达 的 一 类 特 殊 整 合 素 亚 型 移植瘤生长可能与肿 瘤 周 围 的 血 管 生 成 减 少 有 关 这 与肿瘤侵袭转移关系密切 ３ 在体内实验和体外实验 一点尚需进一步实验验证 中均 已 经 证 明 缺 少 αβ ６ 表 达 的 结 肠 癌 细 胞 经 转 基 因诱 导 表 达 αβ ６后可以促进结肠癌细胞的侵袭生长 总之 整合素 α ６在卵巢癌的侵袭生长过程中具有 β 整合素 α 重要作用 ６ ＲＮＡ 能有效抑制卵巢癌细胞的 β 能力 ４ 但对 于 其 在 卵 巢 癌 细 胞 侵 袭 和 转 移 中 的 作 侵袭能力 减慢 裸鼠 体内 移植 瘤生 长速 度 调节 整合 素 用 目前尚无报道 ６活性或表达可能成为治疗卵巢癌的一种新策略 α β 目前 卵巢癌治 疗 过 程 中 的 最 大 障 碍 是 肿 瘤 的 浸 润 转移 绝 大 多 数 患 者 虽 然 经 手 术 切 除 和 积 极 的 化 参考文献 疗 但最终仍难免 死 于 肿 瘤 复 发 和 转 移 卵 巢 癌 的 转 Ｘ ｘｌ Ｂ Ｌ Ｓ ｍ ｄ Ａｍ α ６ Ｆ ｍ β 移是一个多阶段的复 杂 过 程 其 中 肿 瘤 细 胞 的 侵 袭 性 是一个重要的前提条件 整合素 αβ ６ 可能在其中 起到 重要作用 ５ 本 研 究 针 对 整 合 素 β ６ 的 ＲＮＡ 干 扰 技 术以阻断 αβ ６ 基 因 的 表 达 结 果 证 实 与 对 照 组 相 比 ＲＮＡ 组 ｍｒｎａ 表达明 显 受 到 抑 制 细 胞 αβ ６整合 素蛋白表达水平显著 下 降 这 为 本 实 验 中 增 殖 和 侵 袭 能力的测定提供了可靠的依据 体外侵袭抑制实验结 果表明 沉默整合素 αβ ６ 基因的表达可明显抑 制癌细 胞侵袭的过程 研究表明 整合 素 介 导 的 细 胞 凋 亡 在 调 控 肿 瘤 细 胞的凋亡过程中也可能发挥一定的作用 汤艳等 ６ 研 究表明 卵巢 癌 细 胞 凋 亡 与 α 整 合 素 受 体 有 密 切 关 系 且 α 整合素与其配体纤维粘连蛋白的相互作用能 促进细胞生存 当两者被阻断 也阻断了来自细胞外的 Ｊ ＪＢ Ｃ ｍ ３ ７ ８ ４ ６ ４ ６ ４ ６ ５ ３ α Ｂ ｄ ｄ Ｓ Ｄ Ａ Ｒ ｂ ６ Ｊ Ｃ Ｄ Ｔ ９ ７ ６４５ ６５ ３ Ｄ Ｃ Ｌ ｚｋｊｃ Ｍ Ｍ Ｐ ５ ｂ ６ ｂ ｄ ｍ ｂ ｄｄ ｍ ＰＩ ３Ｋ Ａｋ ｂ Ｊ ＥｘＣ Ｒ ９ ３５ ８４ ８４９ ４ Ａ ｚｍ Ｖ ＧＸ Ｔ Ｊ Ｔ α ６ ｄ β Ｂ Ｊ Ｉ ＪＣ ９ ９ ９ ８ ９ ９ ７ ５ Ｚ ＹＺ Ｋ ＳＸ Ｑ Ｓ Ｈ Ｓ ｄ ｍ ６ ｍ ｂ Ｊ Ｃ Ｌ ８ ６６ ９ ５ ６ 汤艳 张爽 α 整合素与卵巢癌细胞增殖及凋亡关系的研究 Ｊ 辽宁医学院学报 ７ ８ ３８ ４ ７ Ｚ Ｒ Ｌ Ｘ Ｑ ＷＸＰ Ｖ ｄ ｗ ＶＥＧＦ ｍ ｂ ６ Ｊ Ｃ Ｌ ９ Ｊ Ｅｂ ｄ ４ 生存信号的传导 抑制细胞增殖 导致细胞死亡 但在 本实验中 应 用 ＲＮＡ 沉 默 卵 巢 癌 细 胞 ＨＯ ８９ＰＭ 的 αβ 基 因 体 外 增 殖 实 验 结 果 显 示 细 胞 增 殖能力 ６ 收稿日期 ９ 修回日期 ９ ３ 编辑 王秀华

16 ８３６ 冯亚东 等 ＹＣ 诱导的 Ｓ 表达抑制对食管癌胃癌细胞凋亡和增殖影响的研究 实验研究 ＹＣ 诱导的 Ｓ 表达抑制对食管癌胃癌 细胞凋亡和增殖影响的研究 冯亚东 朱宏 郝波 施瑞华 南京医科大学第一附属医院消化科 江苏 南京 ９ Ｅ Ｓ Ｓ ｂｙｃ ｄ Ｅ９ ｄｓｇｃ ７９ 犉犈犖犌犢 犱狅狀犵 犣犎犝 犎狅狀犵 犎犃犗犅狅 犛犎犐犚狌 犺狌 犇狆狉 犿狀 狅犳 犌 狊 狉 狅 狀 狉 狅 狅犵狔 犉 狉 狊 犃犳犳 犱 犎狅 狊狆 狅犳 犖狀犼 狀犵 犕犱 犮 犝狀 狏 狉 狊 狀犵９ 犘 犚 狀 狔 犖狀犼 摘要 目的 观 察 ＹＣ 对 食 管 癌 Ｅ ９ 和 犃犅犛犜犚犃犆犜 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 Ｔ 胃癌 ＳＧＣ ７９ 细 胞 中 Ｓ 表 达 的 影 响 ５ ｄ ｘｍ ｂ ｚ ｄ ｚ ＹＣ ３ 探讨 ＹＣ 对食管癌和胃 癌 细 胞 生 长 的 抑 制 作 ｘ Ｓ ｍ ｑｍ 用 方法 Ｅ ９ 和 ＳＧＣ ７９ 细 胞 分 为 对 照 Ｅ ９ ｄ ｍ ＳＧＣ ７９ 组和 ＹＣ 实 验 组 细 胞 免 疫 组 化 和 蛋 白 质 印 犕犈犜犎犗犇犛 Ｔ ｘ Ｓ Ｅ ９ ｄｓｇｃ ７９ 迹法检测 ＹＣ 对 Ｓ 表 达 的 影 响 流 式 ｗ ｘ ｍ ｄｂｍｍ ｍ ｄ Ｗ 细胞仪检测 ＹＣ 对细胞 凋 亡 和 细 胞 周 期 的 影 ｂ Ｔ ＹＣ ｄ ｗ ｄ 响 ＭＴＴ 法检测 ＹＣ 对 细 胞 增 殖 的 影 响 结 ｄｂ ｗ ｍ Ｔ ＹＣ 果 ＹＣ 抑 制 Ｅ ９ 和 ＳＧＣ ７９ 细 胞 Ｓ ｗ ｄ ｂ ｗ ｄ ｄｂ ＭＴＴ 犚犈犛犝犔犜犛 ＹＣ ＬＹＣ 的 表 达 ５ ３ 和 ４ μｍ ｘ Ｓ Ｓ ５ ３ 对 Ｅ ９ 细 胞 ４８ 增 殖 抑 制 率 分 别 为 Ｌ ｄ４μｍ ＹＣ ｗ ｄｄ ｄ ｍ ｄ Ｔ ｂ ９５± ５ ３ ６９± ５９ ５ ９± Ｅ ９ ｗ ９５± ５ ７ ± ９ 和 ６７ ５ ± ８ ６ ３ ６９± ５９ ５ ９± ８ ６ ７± ９ ｄ ９９ 对 ＳＧＣ ７９细 胞 的 抑 制 率 分 别 为 ６７ ５ ± ９９ ｄ ｗ ９ ３ ± ６ ９ ３± ６ ７ ８６± ３３ ３６ ９５± ７ ８６ ± ３３ ３６ ９５± ４７ ５５± ６８ ｄ ４７ ５５± ６８ 和 ５６ ± ５６ ± ＳＧＣ ７９ 犘 ５ Ｔ Ｌ ＹＣ 和 ３μｍ 作 用 于 Ｅ ９ 细 胞 ＬＹＣ ３μｍ ｗ ４ ± ８ 凋亡率分别为 ４ ± ８ ± ７ ± ７ ｄ ４ ６± Ｅ ９ 和 ４ ６± 作用于 ＳＧＣ ７９ 细胞 凋亡 ｄｗ ５ ９± ７５ ９ ± ６８ ｄ ５ ４± ９５ 率为 ５ ９± ７５ ９ ± ６８ ５ ４± Ｌ ＹＣ ＳＧＣ ７９ 犘 ５ Ｔｗ μｍ Ｌ ＹＣ ９５ 犘 ５ μｍ 作用于 ｄ ｄ Ｓ Ｅ ９ ｄｓｇｃ ７９ Ｔ Ｅ ９ 和 ＳＧＣ ７９ 细 胞 Ｓ期 比 例 为 ４５± Ｓ ｗ ５ ９±３ ５３ ｄ ５４ ６±４ ９ ５ ９±３ ５３ ４ ４± 和 Ｅ ９ ｄｓｇｃ ７９ ｗ ｗ ４５± ５４ ６±４ 犘 ５ 结 论 ＹＣ 下调 ｄ ４ ４± ９ Ｓ 的 表 达 诱 导 食 管 癌 Ｅ ９ 和 胃 癌 犘 ５ 犆犗犖犆犔犝犛 犐犗犖 ＹＣ ｘ ＳＧＣ ７９ 细胞凋亡 的 发 生 并 抑 制 细 胞 增 殖 有 Ｓ ｄ ｄ ｂ 可能对食管癌和胃癌具有潜在的治疗价值 Ｅ ９ ｄｓｇｃ ７９ 中华肿瘤防治杂志 ９ ６ ３ ８３６ ８３９ 狀犑犆狀犮 狉犘狉 狏犜狉 ９ ６ ３ ８３６ ８３９ 关键词 胃肠肿瘤 ＹＣ Ｓ 细胞凋亡 增殖 ｍ ＹＣ 犓犈犢犠犗犚犇犛 Ｓ 中图分类号 Ｒ７３５ 文献标识码 Ａ 文章编号 ６７３ ５６９ ９ ３ ８３６ ４ 基金项目 江苏省科技厅基础研究计划资助项目 ＢＫ５５３ 第一作者简介 冯亚东 男 江苏靖江人 硕士 主治医师 主要从事消化道肿瘤的临床和基础研究工作 Ｅ ｍ ｄ ｄ ６ ｍ 通讯作者简介 施瑞华 男 江苏扬中人 博士生导师 教授 主任医师 主要从事消化道肿瘤的临床和基础研究工作 Ｅ ｍ ６ ｍ

17 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2009 年 12 月 第 16 卷 第 23 期 CHINJCANCERPREV TREAT,December2009,Vol.16 No Survivin 是 凋 亡 抑 制 蛋 白 (inhibitorofapoptosis protein,iap) 家 族 的 一 员, 在 肿 瘤 的 增 殖 凋 亡 调 控 中 起 重 要 作 用 研 究 表 明,Survivin 在 食 管 癌 和 胃 癌 的 发 病 [1 2] 中 起 重 要 作 用, 抑 制 Survivin 表 达 能 够 抑 制 食 管 癌 [3 5] 和 胃 癌 细 胞 增 殖 YC 1 3 (5 hydroxymethyl 2 fu ryl) 1 benzylindazole 是 能 抑 制 肿 瘤 生 长 及 血 管 生 成 的 有 效 物 质, 研 究 发 现 YC 1 能 抑 制 肝 癌 肺 癌 等 恶 性 肿 瘤 [6] 增 殖 并 诱 导 凋 亡 发 生, 提 示 YC 1 可 能 通 过 诱 导 肿 瘤 细 胞 凋 亡 对 消 化 道 肿 瘤 具 有 治 疗 价 值 本 研 究 应 用 YC 1 作 用 于 食 管 癌 Eca109 和 胃 癌 SGC 7901 细 胞 株, 观 察 Survivin 表 达 的 变 化 以 及 对 细 胞 增 殖 凋 亡 的 影 响, 初 步 探 讨 YC 1 对 食 管 癌 胃 癌 的 潜 在 治 疗 价 值 1 材 料 与 方 法 1.1 细 胞 株 人 食 管 癌 细 胞 Eca109 和 人 胃 癌 细 胞 SGC 7901 均 购 买 自 上 海 细 胞 所 1.2 主 要 试 剂 YC 1 购 自 Cayman 公 司,DMSO 稀 释 为 1mmol/L 保 存 液,-20 保 存,DMEM 高 糖 培 养 基 购 自 Hyclone 公 司, 兔 抗 人 Survivin 抗 体 购 自 SantaCruz 公 司, 细 胞 周 期 和 细 胞 凋 亡 检 测 试 剂 盒 为 凯 基 公 司 产 品 1.3 细 胞 培 养 和 分 组 Eca109 和 SGC 7901 细 胞 培 养 于 含 10% 胎 牛 血 清 DMEM 培 养 液 中, 在 37 5%CO 2 95%N 2 饱 和 湿 度 的 培 养 箱 中 培 养, 分 为 对 照 组 和 YC 1 实 验 组 待 细 胞 生 长 至 50% 融 合, 进 行 实 验 1.4 细 胞 免 疫 组 化 对 照 组 和 YC 1 实 验 组 Eca109 和 SGC 7901 细 胞 培 养 24h, 细 胞 以 冰 甲 醇 固 定, 兔 抗 人 Survivin 抗 体 工 作 浓 度 1 50, 以 PBS 代 替 一 抗 作 阴 性 对 照 DAB 染 色, 光 镜 下 观 察 细 胞 胞 质 或 胞 核 内 出 现 棕 褐 色 颗 粒 为 阳 性 1.5 蛋 白 质 印 迹 法 对 照 组 和 YC 1 实 验 组 Eca109 和 SGC 7901 细 胞 分 别 提 取 总 蛋 白, 取 40μg 蛋 白 上 样 以 5% 浓 缩 胶 15% 分 离 胶 进 行 SDS PAGE 电 泳, 电 转 蛋 白 至 PVDF 膜,5% 脱 脂 奶 粉 37 封 闭 1h, 与 兔 抗 人 Survivin 一 抗 4 孵 育 过 夜,PBST 洗 膜 3 次 后 与 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 鼠 抗 兔 二 抗 37 孵 育 1h ECL 孵 育 3min, 暗 室 曝 光 并 洗 片 1.6 细 胞 凋 亡 检 测 对 照 组 和 YC 1 实 验 组 Eca109 和 SGC 7901 无 血 清 培 养 24h 后 加 入 YC 1, 取 个 细 胞 以 500μL LoadingBufer 悬 浮,AnnexinV FITC PI 双 染, 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 凋 亡 率 1.7 细 胞 增 殖 实 验 Eca109 SGC 7901 细 胞 铺 96 孔 板, 每 孔 加 入 2000 个 细 胞, 分 别 加 入 YC 1 终 浓 度 为 μmol/LDMEM 培 养 液, 培 养 h, 以 空 白 培 养 液 为 对 照, 加 入 5mg/mL MTT20μL37 培 养 4h, 弃 去 培 养 液, 加 入 200μLDMSO 振 荡 15min, 在 550nm 波 长 用 酶 标 仪 测 定 吸 光 度 A, 计 算 细 胞 增 殖 抑 制 率 吸 光 度 细 胞 增 殖 抑 制 率 A (%)=(1- 对 照 吸 光 度 A ) 100% 1.8 细 胞 周 期 检 测 实 验 组 Eca109 和 SGC 7901 细 胞 YC 1 浓 度 取 20μmol/L, 对 照 组 和 实 验 组 培 养 48h 后 收 取 细 胞, 以 -20 冰 乙 醇 固 定 PBS 洗 涤 后 取 细 胞 加 100μLRNA 酶 37 水 浴 30 min, 加 入 PI400μL 4 孵 育 30min,488nm 波 长 检 测 细 胞 周 期 1.9 统 计 学 方 法 采 用 SPSS11.0 分 析 软 件, 细 胞 凋 亡 和 MTT 实 验 采 用 方 差 分 析, 细 胞 周 期 采 用 成 组 均 数 的 检 验, 检 验 水 准 α= 结 果 2.1 YC 1 抑 制 Survivin 表 达 免 疫 组 化 结 果 显 示, 对 照 组 和 实 验 组 Eca109 和 SGC 7901 细 胞 均 在 细 胞 核 中 出 现 棕 褐 色 颗 粒 沉 着, 提 示 Survivin 主 要 在 Eca109 和 SGC 7901 细 胞 核 中 表 达 YC 1 抑 制 Survivin 的 表 达, 随 着 YC 1 浓 度 的 加 大,Eca109 和 SGC 7901 细 胞 核 内 棕 褐 色 颗 粒 逐 渐 减 少 ( 图 1) 2.2 YC 1 对 Survivin 蛋 白 表 达 水 平 的 影 响 蛋 白 质 印 迹 结 果 显 示, 对 照 组 Eca109 和 SGC 7901 细 胞 Survivin 蛋 白 表 达 较 高,YC 1 实 验 组 Survivin 蛋 白 表 达 降 低,Survivin 的 蛋 白 表 达 随 YC 1 浓 度 增 大 逐 渐 减 少 ( 图 2) 2.3 YC 1 对 细 胞 凋 亡 的 影 响 与 对 照 组 相 比 较,YC 1 作 用 于 Eca109 和 SGC 7901 细 胞 诱 导 细 胞 凋 亡 的 发 生 ( 图 3) YC 1 实 验 组 较 对 照 组 细 胞 凋 亡 率 增 高, 与 对 照 组 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义, 犘 < 0.05 在 YC 1 实 验 组 中 随 着 YC 1 浓 度 的 加 大, 细 胞 逐 渐 凋 亡 率 上 升, 差 异 有 统 计 学 意 义, 犘 <0.05( 表 1) 2.4 YC 1 对 细 胞 增 殖 的 影 响 YC 1 抑 制 Eca109 和 SGC 7901 细 胞 的 增 殖, 细 胞 增 殖 抑 制 率 随 YC 1 浓 度 增 大 逐 渐 升 高, 相 同 浓 度 YC 1 对 细 胞 增 殖 抑 制 率 依 赖 于 作 用 时 间 ( 图 4) YC 1 实 验 组 作 用 于 Eca109 细 胞 48h 的 抑 制 率 分 别 为 (21.95 ± 2.05)% (30.69 ± 2.59)% (50.19 ± 2.28)% (61.17±2.09)% 和 (67.50±1.99)%, 对 SGC 7901 细 胞 的 抑 制 率 分 别 为 (9.32±0.61)% (17.86 ± 1.33)% (36.95 ± 2.01)% (47.55 ± 1.68)% 和 (56.01±1.12)%, 犘 <0.05

18 冯亚东 等 ＹＣ 诱导的 Ｓ 表达抑制对食管癌胃癌细胞凋亡和增殖影响的研究 ８３８ 图 ＹＣ 对 Ｅ９ 和 ＳＧＣ ７９ 细胞 Ｓ 表达的影响 ＤＡＢ ４ Ｌ Ａ Ｅ ９ Ｂ ＳＧＣ ７９ ４ ＹＣ 浓度分别为 和 ３μｍ ５ 阴性对照 过度表达 Ｓ 的肿瘤患者常预后不良而且肿瘤 细胞易耐 药 ７９ 研 究 Ｓ 并 设 计 针 对 Ｓ 的药物有可能对于肿瘤防治具有重要意义 诱导肿瘤细胞凋亡已经成为治疗肿瘤的一个研究 ６ ＹＣ 能诱导 细 胞 凋 亡 的 发 生 显 示 出 良 好 的 抗肿瘤效应 研 究 发 现 在 肝 癌 细 胞 中 ＹＣ 诱导细 方向 图 ＹＣ 对 Ｅ ９和 ＳＧＣ ７ ９ 细胞 Ｓ 蛋白表达的影响 Ｌ Ａ Ｅ ９ Ｂ ＳＧＣ ７ ９ ４ ＹＣ 浓度分别为 和 ３ μｍ 胞凋 亡 的 发 生 并 抑 制 Ｓ 的 表 达 可 能 与 ＹＣ 抑制 Ｓ ３ 的转录活性有关 而 ＹＣ 抑制 Ｓ 表达的具体机制仍未阐明 ５ ＹＣ 对细胞周期的影响 Ｌ ＹＣ μｍ 作用 于 Ｅ ９ 和 ＳＧＣ ７９ 细 Ｓ 主 要 有 Ｓ Ｓ Ｂ 和 Ｓ Ｄ Ｅｘ３３ 种 异 构 体 形 式 Ｓ 和 Ｓ Ｂ 在细胞质中表达 Ｓ Ｄ Ｅｘ３ 细胞核 胞 ４８ 流式细胞仪检测结果提示 Ｇ Ｇ 期比 例明 显 中表达 研究 表 明 Ｓ Ｄ Ｅｘ３ 在 肿 瘤 细 胞 中 下降 Ｓ 期比例明显上升图５ 与对照组相比较 差异 有统 计 学 意 义 犘 ５表 提 示 ＹＣ 诱导 显示出更强的 抗 凋 亡 活 性 目 前 认 为 Ｓ 抗 Ｅ ９ 和 ＳＧＣ ７９ 细胞产生 Ｓ 期阻滞 和 Ｃ ７ 的活化从而抑 制 细 胞 凋 亡 的 发 生 本 实 凋亡的机制主 要 是 通 过 抑 制 末 端 效 应 蛋 白 Ｃ ３ 验中 免疫组 化 结 果 表 明 Ｓ 主 要 在 Ｅ ９ 和 ３ 讨论 Ｓ 在分化 成 熟 的 组 织 中 很 少 表 达 而 在 肿 瘤组织中几乎都过表达 Ｓ 能够抑制 Ｆ Ｂｘ ＳＧＣ ７９ 细 胞 胞 核 中 阳 性 表 达 推 测 Ｓ 在 Ｅ ９ 和 ＳＧＣ ７９ 细 胞 株 中 表 达 主 要 为 Ｓ 抗肿瘤药物等多种因 素 所 诱 导 的 细 胞 凋 亡 在 调 节 细 Ｄ Ｅｘ３ 异构体形式 本 实 验 结 果 提 示 当 ＹＣ 浓 Ｌ 时 Ｓ 度为 μｍ 在 Ｅ ９ 和 ＳＧＣ ７９ 胞有丝分裂促进细 胞 增 殖 等 方 面 有 重 要 作 用 在 很 多 细胞中呈高表达 细 胞 凋 亡 率 较 低 ＹＣ 实 验 组 Ｓ 恶性肿瘤中 Ｓ 可 以 作 为 判 断 预 后 的 标 志 之 一 的表达减弱 细胞凋亡率增加 图 ３ ＹＣ 对 Ｅ９ 和 ＳＧＣ ７９ 细胞凋亡的影响 Ｌ Ａ Ｅ ９ Ｂ ＳＧＣ ７９ ４ ＹＣ 浓度分别为 和 ３μｍ

19 中华肿瘤防治杂志 ９ 年 月第 ６ 卷第 ３ 期 ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶ ＴＲＥＡＴ Ｄ ｍｂ ９ Ｖ ６ Ｎ ３ 表 ＹＣ 对 Ｅ９ 和 ＳＧＣ ７９ 细胞 凋亡率的影响 狓 ±狊 Ｌ ＹＣ 浓度 μｍ Ｅ ９ ８３９ 增高 能作用于 ｄ ｄｋ４ 和 Ｃ Ｄ 等细胞周期调 控蛋白 开启细胞周 期 Ｇ Ｍ 检 查 点 加 快 细 胞 的 Ｓ 期 ＳＧＣ ７９ 转 化 从 而 促 进 细 胞 有 丝 分 裂 的 发 生 在 恶 性 肿 瘤 中 Ｓ 的过高表达可以消除 Ｇ Ｍ 检查 点而 通过 有 ６ ７± ７ ８± ３ ４ ± ８ ５ ９± ７５ ± ７ ９ ± ６８ ３ ４ ６± ５ ４± ９５ 犘 ５ 注 各组之间比较采用方差分析 差异有统计学意义 丝分裂保护转化 细 胞 的 畸 变 生 长 引 起 恶 性 增 殖 ３ 本 实 验 中 ＭＴＴ 结 果 提 示 ＹＣ 抑 制 Ｅ ９ 和 细胞 的 增 殖 细 胞 周 期 检 测 表 明 ＳＧＣ ７９ ＹＣ 诱 导 Ｅ ９ 和 ＳＧＣ ７９ 细胞出现 Ｓ 期阻滞 与文献报 道一致 ４ 这与 Ｓ 在细胞周期 调控 中的 作 用 相 关 Ｓ 表达下调后细胞周期阻 滞于 Ｓ 期 细胞 有 丝分裂受阻进而抑制细胞增殖 表 ＹＣ 对 Ｅ ９ 和 ＳＧＣ ７９ 细胞周期的影响 ｘ± Ｌ ＹＣ 浓度 μｍ Ｇ Ｇ Ｇ Ｍ Ｓ Ｅ ９ ６６ ４９±５ ３６ ８±４ ６ ５ ９±３ ５３ ９± ４５± ９ ９ ３６± ３ ＳＧＣ ７９ ６６ ７６±５ ３ ９± ５６ ５４ ６±４ ４ ± ４ ４± ８ ８３± ９ 狊 对照组 差异有统计学意义 狏 狊 对照组 差异无统计学意义 狏 对 Ｓ 表 达 的 抑 制 作 用 及 对 增 殖 凋 亡 ＹＣ 的影响呈剂 量 依 赖 随 着 ＹＣ 浓 度 的 增 加 Ｓ 表达逐渐减弱 细胞凋亡率逐渐增加 对细胞的增殖抑 图 ４ ＹＣ 对 Ｅ９ 和 ＳＧＣ ７９ 细胞增殖的影响 Ａ Ｅ ９ Ｂ ＳＧＣ ７９ 制作 用 逐 渐 增 强 并 呈 时 间 依 赖 ＹＣ 对 Ｅ ９ 和 ＳＧＣ ７９ 细胞增殖凋 亡 等 方 面 的 抑 制 作 用 与 文 献 报 道相符 ５ 可以认为 ＹＣ 对食管癌和胃癌 Ｓ 表达的抑制及对细胞增殖凋亡的效应决定了它可能成 为治疗食管癌和胃癌的有效药物 参考文献 Ｇ ｂｗｋ Ｐ Ｋ Ｔ Ｍ Ｗ ｋ Ｆ Ｐ ｘ ｑｍ ｍ Ｊ ＢＪＣ ３ ８８ ５ ９ Ｍ Ｋ Ｓ ｋ Ｋ Ｏｄ Ｓ Ｃ ｂ ｗ ｍｒｎａ ｘ ｄ ｍｄｍ Ｊ Ｇ Ｃ ３ ６ ４ ７ ４ ３ ＷＹ Ｚ Ｈ ＱＬ Ｄｗ ｂ ＲＮＡ ｂ ｗ ｍ Ｊ Ｃ Ｂ Ｔ ５ ４ ９ ９７４ ９７８ ４ ＣＴ ＤＣ Ｉ ｂ ＲＮＡ ＭＧＣ ８３ Ｊ Ｉ Ｉｍｍ ｍ ８ ８ ７ ６ ５ 卢启明 缪国英 张岫兰 应用 ＲＮＡ 技 术 下 调 Ｓ 抑制胃 图 ５ ＹＣ 对 Ｅ９ 和 ＳＧＣ ７９ 细胞周期的影响 Ｌ 组 Ａ Ｅ ９ Ｂ ＳＧＣ ７９ 对照组 ＹＣ 浓度 μｍ 癌细胞 ＳＧＣ７９ 生 长 的 研 究 Ｊ 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 ８ ５ ３ ８ ８４ ６ Ｅ Ｊ Ｙ Ｙ ＳｋＣ Ｙ ＳｋＣ ＹＣ Ａ ｄ ｘ ｄ ｂ Ｊ Ｊ 在 细 胞 中 的 表 达 与 细 胞 周 期 密 切 相 关 Ｓ Ｓ 在 Ｓ 期开始出现表达增高而 在 Ｇ Ｍ 期 明显 Ｎ Ｃ Ｉ ３ ９５ ７ ５６ ５５ 下转第 ８４３ 页

20 张继贤 等 多柔比星诱导肺腺癌细胞凋亡机制的探讨 ８４ 实验研究 多柔比星诱导肺腺癌细胞凋亡机制的探讨 张继贤 赵莺 张启昆 余姚市人民医院呼吸科 浙江 余姚 ３５４ 兰州大学第二医院呼吸科 甘肃 兰州 ７３３ Ｍ ｍ ｄ ｍ ｄｄｂｄｘ ｂ 犣犎犃犖犌犑 狓 狀 犣犎犃犗犢 狀犵 犣犎犃犖犌犙 犽狌狀 犇狆狉 犿狀 狅犳 犚 狊狆 狉 狅 狉狔 犢狌狔狅犘 狅狆 狊犎狅 狊狆 犢狌狔狅３５４ 犘 犚 狀 犇狆狉 犿狀 狅犳 犚 狊狆 狉 狅 狉狔 犛 犮 狅狀犱犎狅 狊狆 狅犳 犔狀狕犺狅狌犝狀 狏 狉 狊 犚 狀 狔 犔狀狕犺狅狌７３３ 犘 摘要 目的 探 讨 多 柔 比 星 ＡＤＭ 诱 犃犅犛犜犚犃犆犜 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 Ｔ ｄ ｍ ｍ 导肺腺 癌 细 胞 系 Ａ５４９ 细 胞 凋 亡 机 制 Ａ５４９ ｄ ｄｂｄｘ ｂ ｄ ｘ ｂ ｍ ｍ 方法 应 用 噻 唑 蓝 ＭＴＴ 比 色 法 检 测 犕犈犜犎犗犇犛 ＭＴＴ ｄｗ Ｇ ｍ ｗ ｄ ｘ ｍ ＡＤＭ 对 Ａ５４９ 细胞 增 殖 抑 制 作 用 透 射 Ａ５４９ Ｔ ｗ ｂ ｄ 电镜观察细 胞 形 态 学 改 变 细 胞 电 泳 仪 ｂ ｍｂ ｘ Ｆ ｄｂ Ｔ 测定 Ａ５４９ 细 胞 表 面 电 荷 的 变 化 流 式 ｗ ｍ ｗ ＦＣＭ Ｃ ｍ ｍ ｄ ｄ ｗ 细 胞仪 ＦＣＭ 测定 Ａ５４９ 细胞 Ｆ Ｂ ｂ ｄ Ｃ ３ 犚犈犛犝犔犜犛 ＡＤＭ 蛋白水平变化 比色法检测 Ｃ ３活 Ｌ Ａ５４９ ｄｉｃ５ ４ ４８ ｄ７ｗ ５ ４ ８ ｄ４ ｍ 性 的 变 化 结 果 ＡＤＭ 可 抑 制 细 胞 增 ｄ ｍ Ａ５４９ ｗ ｂ 殖 作用 ４ ４８ 及 ７ 的 ＩＣ５ 值 分 别 为 ｄ ｍ ｍ ｍ ｂ ５ ４ ８ 和 ４ ｍ Ｌ 电 镜 下 见 到 明 显 ＡＤＭ Ｔ ｍｂ ｄｗ ｍ ｄ 的凋亡细 胞 细 胞 表 面 电 位 在 ４ 开 始 Ｔ ｄ ｄ ｂ ４ ｄ ｄ ４ ４ ｗ 下降 ４ ４ 期 间 下 降 最 明 显 ４ ｄｂ ｍ Ａ 下降趋势降低 Ｆ 蛋 白 表 达 明 显 上 调 ４ ｗ ｄ ｍｂ ｘ Ｔ Ｂ 蛋 白 表 达 下 降 Ｃ ３活性明 Ｆ ｄ ｄｂ ｄ ｄ Ｃ ３ｗ 显增强 结论 ＡＤＭ 能抑制并诱导 Ａ５４９ 犐犗犖犛 Ｄｘ ｂ ｂ ｄｂａｄｍ 犆犗犖犆犔犝犛 细胞 凋 亡 细 胞 表 面 电 荷 下 降 可 能 是 ｄ ｄ Ａ５４９ Ｔ ＡＤＭ 诱导细胞 凋 亡 的 早 期 事 件 其 作 用 ｍ Ｉ 可能与上 调 Ｆ 蛋 白 下 调 Ｂ 蛋白表 Ａ５４９ Ｔ ｘ Ｆ ｄｂ 达有关 ｍ ｂ 中华肿瘤防治杂志 ９ ６ ３ ８ ４ ８ ４ ３ 狀犑犆狀犮 狉犘狉 狏犜狉 ９ ６ ３ ８４ ８４３ 关键词 肺肿瘤 多柔比星 细胞凋亡 细胞表面电荷 细胞电泳率 犓犈犢犠犗犚犇犛 ｍ ｄｘ ｂ ｍｂ 中图分类号 Ｒ７３４ 文献标识码 Ａ 文章编号 ６７３ ５６９ ９ ３ ８４ ４ 研究证明 细胞 凋 亡 的 发 生 除 受 内 部 基 因 的 调 控 外 还受到 细 胞 内 外 环 境 因 素 的 影 响 环 境 因 素 主 要 通过信号传导影响基因的表达 间接调节细胞凋亡４ 诱导细胞凋亡是化疗药物发挥抗肿瘤作用的重要机制 化疗药物作为细胞凋亡的外部因素 与 细胞 接触 后 对 第一作者简介 张 继 贤 男 甘 肃 庆 阳 人 硕 士 主 治 医 师 细胞膜表面的分子结构产生很大的影响 导致一系列生 主要从事呼吸肿瘤的研究工作 化和生理变化 激活各种途径诱导凋亡 为观察多柔比 Ｔ ８６ ５７４ ６６９５４ Ｅ ｍ ｊ ｘ ｚ８ ｍ 星 ＡＤＭ 诱 导 Ａ５４９ 细 胞 凋 亡 过 程 中 表 面 电 荷 的 变 化 本研究采用电镜观察形态学变 化 细 胞电 泳的 方法 通讯作者 简 介 张 启 昆 男 辽 宁 沈 阳 人 主 任 医 师 副 教 观察表面电 荷 的 变 化 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 Ｆ Ｂ 授 硕士生导师 主要从事肺癌的中西医治疗及研究工作 蛋白的表达以及比色法检测 Ｃ ３ 等凋亡关键分子 Ｔ ８６ ９３ ８９４４８８ 的变化 探讨 ＡＤＭ 诱导细胞凋亡的机制

21 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2009 年 12 月 第 16 卷 第 23 期 CHINJCANCERPREV TREAT,December2009,Vol.16 No 材 料 与 方 法 2 结 果 1.1 药 品 和 试 剂 盐 酸 多 柔 比 星 (ADM, 浙 江 海 正 药 业 股 份 有 限 公 司,10mg/ 支, 批 号 :040204B); 鼠 抗 人 Fas 单 抗 鼠 抗 人 Bcl 2 单 抗 为 美 国 Oncogene 公 司 出 品 ;Caspase 3 活 性 检 测 试 剂 盒 购 自 美 国 BD 公 司 1.2 细 胞 株 及 细 胞 培 养 人 肺 腺 癌 细 胞 株 (A549) 细 胞 购 自 中 科 院 上 海 细 胞 研 究 所,10% 的 小 牛 血 清 的 RPMI 常 规 培 养 传 代 1.3 细 胞 增 殖 检 测 及 形 态 学 观 察 取 对 数 生 长 期 细 胞, 以 ml -1 浓 度 接 种 于 96 孔 的 培 养 板 中, 在 0.50~16.0mL -1 的 ADM 作 用 下 培 养 和 72h, 离 培 养 终 点 4h 加 入 MTT, 继 续 培 养 4h, 加 二 甲 基 亚 砜 (DMSO), 充 分 震 荡, 酶 标 仪 于 570nm, 测 吸 光 度 值 (A) 收 集 作 用 48h 细 胞 ml -1 个, 按 常 规 程 序 固 定 处 理, 经 醋 酸 铀 及 柠 檬 酸 铅 双 染 色 后, 投 射 电 镜 观 察 细 胞 超 微 结 构 的 特 征 1.4 细 胞 电 泳 率 的 测 定 收 集 各 组 细 胞,0.1 mol/l PBS 液 清 洗 2 次, 用 9%(w/v) 蔗 糖 溶 液 将 细 胞 配 成 ml -1 的 悬 液, 在 细 胞 电 泳 仪 上 (LIAN 100, 上 海 医 科 大 学 生 产 ) 测 定 电 泳 率 ( 电 压 40V,30 ), 每 组 选 用 10 个 细 胞 进 行 测 定 并 取 平 均 值 1.5 FCM 测 定 Fas 和 Bcl 2 蛋 白 表 达 水 平 收 集 不 同 浓 度 的 ADM 作 用 和 72h 后 的 细 胞 ( ml -1 [5] ),PBS 洗 涤 1 遍 加 入 FITC 标 记 的 鼠 抗 人 Fas 单 抗 及 鼠 IgG 1 同 型 对 照 后,FCM 检 测 Fas 蛋 白 的 表 达 阳 性 率 及 平 均 荧 光 强 度 同 样 方 法 加 入 FITC 标 记 的 鼠 抗 人 Bcl 2 单 抗, 以 及 FITC 标 记 的 鼠 IgG 1 同 型 对 照,FCM 检 测 Bcl 2 的 阳 性 率 1.6 Caspase 3 酶 活 性 检 测 不 同 浓 度 ADM 作 用 和 48h 后 分 别 收 集 ml -1 [6] 细 胞, 同 时 设 对 照 组 和 调 零 组 加 入 冷 细 胞 裂 解 缓 冲 液 后 置 冰 上 10 min,4 离 心, 1500r/min,10min, 向 上 清 液 中 加 2 反 应 缓 冲 液 / DTT 混 合 液, 再 加 入 Caspase 3 底 物 DEVD PNA, 37 浴 1h 后 在 405nm 波 长 处 读 取 A 值 用 不 同 浓 度 的 标 准 PNA 浓 度 的 标 准 曲 线, 计 算 其 斜 率 各 组 Caspase 3 活 性 单 位 A 值 - 调 零 A 值 (u)= 标 准 曲 线 斜 率 1.7 统 计 学 方 法 所 有 资 料 用 SPSS13.0 统 计 软 件 包 统 计 处 理 结 果 用 狓 - ± 狊 表 示, 各 组 间 比 较 用 单 因 素 方 差 分 析 检 验 水 准 α= ADM 抑 制 A549 细 胞 增 殖 和 诱 导 凋 亡 不 同 浓 度 ADM 对 A549 细 胞 增 殖 均 有 抑 制 作 用, 且 存 在 时 间 浓 度 依 赖 性 培 养 和 72h 半 数 生 长 抑 制 浓 度 (IC 50 ) 分 别 为 和 4.2mg/L 作 用 24h 后, 部 分 细 胞 即 发 生 皱 缩 起 泡 和 固 缩 等 凋 亡 早 期 改 变, 随 浓 度 和 时 间 逐 渐 的 增 加, 上 述 改 变 逐 渐 明 显, 可 见 核 碎 裂, 细 胞 碎 片 和 凋 亡 小 体 的 出 现 以 2.0mg/L 的 ADM 作 用 48h 明 显 ;>8.0mg/L 组 主 要 以 坏 死 细 胞 为 主 ( 图 1) 2.2 细 胞 电 泳 率 不 同 浓 度 ADM 作 用 下 的 A549 细 胞, 其 表 面 电 荷 均 在 4h 开 始 下 降,4~24h 下 降 最 明 显,24h 后 下 降 幅 度 明 显 下 降, 与 对 照 组 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义, 犘 <0.01( 表 1 和 图 2) 2.3 Fas Bcl 2 的 蛋 白 表 达 水 平 的 测 定 ADM 作 用 24h 后 Fas 蛋 白 表 达 阳 性 率 即 升 高, 随 着 浓 度 时 间 增 加 而 逐 渐 明 显 ( 图 1 和 表 2);Bcl 2 蛋 白 表 达 在 24h 开 始 下 降, 随 着 时 间 和 浓 度 的 增 加 下 降 明 显 ( 图 3 和 表 2) 2.4 Caspase 3 活 性 测 定 ADM 作 用 12h 后,Caspase 3 活 性 即 增 强,24h 48h 活 性 增 强 更 明 显 与 对 照 组 比 较 各 组 间 在 时 间 浓 度 差 异 均 有 统 计 学 意 义, 犘 <0.01( 见 表 3) 图 1 透 射 电 镜 观 察 A549 细 胞 凋 亡 A: 对 照 组 细 胞 ( 3000);B:ADM 化 疗 48h 超 微 结 构 ( 35000)

22 张继贤 等 多柔比星诱导肺腺癌细胞凋亡机制的探讨 ８４ 表 不同时间 Ａ５４９ 细胞电泳率 ｍ 狓 ±狊 狀 μｍ 浓度 ｍ Ｌ 对照组 ４ ４ ８ ４ ３６ ８± ８± ５ ６４± ４ ６± ３ ５３± ３８± ４８ ７９± ７８± ３ ８± ４ ７９± ５± ４ ４５± ４３± ５ ４± ４ ５± ３ ４± ４ ３± ３±７ ９± ４ ３５± ９± ３ ４± ３± ± ３ 狏 狊 对照组 犘 注 亡基因 Ｆ 与 Ｆ 配 体 结 合 后 主 要 通 过 死 亡 受 体 信 号转导途径 调 控 细 胞 凋 亡 而 Ｂ 属 原 癌 基 因 是 一种重要的凋亡抑制 基 因 可 抑 制 多 种 因 素 诱 导 细 胞 凋亡 其高表达能够阻抑细胞的凋亡 主要是通过调节 线粒体功能而制约着 细 胞 凋 亡 的 发 生 是 线 粒 体 途 径 调控细胞凋亡主要基因 细胞凋亡时往往 表现 为 Ｂ 蛋白表达下 降 ７ 研 究 证 实 细 胞 凋 亡 依 赖 于 凋 亡 促 进基因与凋亡抑 制 基 因 表 达 产 物 的 比 值 ８ 两 种 途 径 最终都可能 通 过 激 活 Ｃ ３共同通道而调节细胞 凋亡 ９ 本研究结果显示 ＡＤＭ 能 抑制 Ａ５４９ 细胞 增 图 不同浓度 Ａ５４９ 细胞电泳率 殖并诱导凋亡 流式 细 胞 仪 检 测 显 示 Ｆ 蛋 白 表 达 上 调 Ｂ 蛋白表达下调 Ｃ ３ 表 达升 高 在 ４ ｍ Ｌ 浓度范围 内 存 在 时 间 依 赖 性 由 此 可 以 推 测 ＡＤＭ 诱导 细 胞 凋 亡 可 能 通 过 调 节 细 胞 膜 表 面 的 Ｆ 蛋白的表达 并激活 Ｆ 后 将 凋 亡 信 号 传 递 到 胞 质内 同 时 使 Ｂ 蛋 白 表 达 下 调 最 终 经 过 激 活 Ｃ ３ 而诱导细胞凋亡 表 ３ ＡＤＭ 对 Ａ５４９ 细胞 Ｃ ３ 活性的影响 狓 ±狊 狀 ３ ＡＤＭ 浓度 ｍ Ｌ Ｃ ３ 活性 ４ ４８ 对照组 ± ３ ４± ３ ６± ４ ８ ± ６ ３９ ４±４ ５ ±３ ７ ４ ４８ ３± ６ ±３ ５ ７ ３±４ ３ 狊 对 照 组 犘 与 同 时 间 段 的 组 比 较 各 时 间 段 狏 犘 ４ ９ 细胞凋亡过程中是否存在 为探讨 ＡＤＭ 诱导 Ａ５ 细胞表面电荷变化 通过检测细胞电泳率来观察 结果 显示 ＡＤＭ 作用４ 后出现细胞表面电荷的下降 ８ ４ 下降趋势减弱 表面电荷的下降存 下降最明显 ４ 图 ３ ＡＤＭ 化疗 ４８ 后对 Ａ５４９ 细胞 Ｆ和 Ｂ 蛋白表达的影响 在浓度 时间依赖性 超过一定的浓度 时间范围 细胞表 表 ＡＤＭ 对 Ａ５ ４ ９细胞 Ｆ 和 Ｂ 蛋白表达水平的影响 Ｆ 表达率 Ｂ 表达率 面电荷下降趋势趋向无限大 说明表面电荷变化主要发 生在 细 胞 出 现 典 型 形 态 学 改 变 之 前 与 文 献 报 道 一 ＡＤＭ 浓度 ｍ Ｌ ４ ４８ ７ ４ ４８ ７ ４ ５ ３ ４ ３６ ５ ３ ５６ ５ ４ ６ ４ ４ ３ ４９ ３ ３７ ７ ８ ６ ３ 胞 细胞膜表面电荷数量的多少与其生长 浸润 转移 凋 ４ ３４ ５ ５ ６ ５ ３ ８ ３ 亡及恶性程度等有关 因此检测肿瘤细胞表面电荷的 致 由于肿瘤 细胞 膜表 面的 电 荷 往 往 高 于 正 常 细 变化可以直接或者间接反应肿瘤细胞表面分子的结构变 ３ 讨论 Ｆ 是一种传 递 凋 亡 信 号 的 跨 膜 蛋 白 属 于 促 凋 化和生理代谢活动 研究发现 细胞表面电荷的变化与 细胞膜受外界各种信号的刺激有关 细胞膜接受外界刺 激后改变了细胞膜表面的蛋白分布 有利于细胞表面受

23 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2009 年 12 月 第 16 卷 第 23 期 CHINJCANCERPREV TREAT,December2009,Vol.16 No 体 与 配 体 结 合, 开 通 某 种 凋 亡 途 径, 诱 导 细 胞 凋 亡, 从 形 态 学 上 出 现 胞 膜 皱 缩 凹 陷, 染 色 质 变 得 致 密, 最 后 核 断 [13] 裂 成 碎 片, 凋 亡 小 体 出 现, 细 胞 表 面 绒 毛 消 失 李 丹 [14] [15] 等 和 钟 兴 来 等 研 究 证 实, 在 细 胞 凋 亡 过 程 中, 细 胞 膜 表 面 的 分 子 结 构 和 功 能 发 生 了 很 大 变 化, 尤 其 是 糖 蛋 白 的 构 象 会 受 到 很 大 影 响, 最 终 影 响 到 细 胞 表 面 电 荷 减 少, 从 而 促 进 细 胞 凋 亡 本 实 验 中 ADM 诱 导 细 胞 凋 亡 过 程 中 同 样 出 现 细 胞 表 面 电 荷 下 降, 流 式 细 胞 仪 检 测 Fas 蛋 白 表 达 上 调,Bcl 2 蛋 白 表 达 下 调,caspse 3 活 性 增 强, 至 于 ADM 诱 导 细 胞 凋 亡 过 程 中 出 现 细 胞 表 面 电 荷 的 下 降 是 否 与 Fas Bcl 2 基 因 蛋 白 的 表 达 之 间 存 在 普 遍 性 或 者 有 某 种 必 然 的 联 系, 还 需 要 深 入 广 泛 的 研 究 参 考 文 献 [1] 王 侠, 时 京, 刘 奔, 等.Bcl 2 基 因 对 细 胞 色 素 C 诱 导 的 膀 胱 癌 细 胞 凋 亡 抑 制 及 其 机 制 的 研 究 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,2008, 15(5): [2] 何 贵 金, 吴 荣, 高 沁 怡, 等.103pd 诱 导 犬 胆 管 增 值 平 滑 肌 细 胞 凋 亡 及 相 关 基 因 的 影 响 [J]. 世 界 华 人 消 化 杂 志,2005,13(14): [3] 张 卫 东, 赵 惠 儒, 阎 影, 等. 斑 蝥 素 诱 导 人 肺 癌 A549 细 胞 凋 亡 及 其 分 子 机 制 的 研 究 [J]. 中 华 肿 瘤 杂 志,2005,27(6): [4] 宋 岚, 徐 朝 军, 黄 春 林, 等. 雷 公 藤 甲 素 诱 导 人 肺 腺 癌 A549 细 胞 凋 亡 机 制 的 研 究 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,2008,15(16): [5] AggarwalS,GuptaS.IncreasedapoptosisofTcelsubsetsin aginghumans:alteredexpressionoffas (CD95),Fasligand, Bcl 2,andBax[J].JImmunol,1998,160(4): [6] 陶 敏 慧, 王 文 文, 关 燕 清. 细 胞 程 序 式 死 亡 途 径 的 新 进 展 [J]. 细 胞 生 物 学 杂 志,2008,30(5): [7] 孙 晓 丽, 王 仁 生. 热 疗 和 热 放 疗 对 鼻 咽 癌 细 胞 Bcl 2 基 因 表 达 的 影 响 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,2008,15(8): [8] DjebailiM,DeBockF,BaileV,etal.Implicationofp53and caspase 3inkainicacidbutnotin N methyl D asparticacid in ducedculture[j].neuroscilet,2002,327(1):1 4. [9] 谭 曾 鲁, 周 柔 丽. 医 学 细 胞 生 物 [M]. 北 京 : 北 京 医 科 大 学 中 国 协 和 医 科 大 学 联 合 出 版 社,1992: [10] 苏 永 宏, 彭 晓, 焦 宁 超, 等.As2O3 诱 导 K562 细 胞 凋 亡 过 程 中 细 胞 表 面 电 荷 变 化 的 研 究 [J]. 中 国 临 床 药 理 学 与 治 疗 学,2004,9 (3): [11] 任 新 萍, 王 德 炳, 李 怀 娜, 等. 足 叶 乙 甙 诱 导 HL 60 细 胞 凋 亡 过 程 中 电 化 学 行 为 的 研 究 [J]. 中 华 血 液 学 杂 志,1999,20(2): [12] JayanthiS,DengX,Bordelon M PcauseS.Methamphetamine causediferentialregulationpro deathandanti deathbcl 2genes inthemouseneocortex1752[j].pasebj,2001,15(10): [13] 成 军. 程 序 性 细 胞 死 亡 与 疾 病 [M]. 北 京 : 北 京 医 科 大 学 中 国 协 和 医 科 大 学 联 合 出 版 社,1997:1 2. [14] 李 丹, 周 淑 佩, 陈 凯, 等.TRAIL 基 因 对 人 白 血 病 Jurkat 细 胞 生 物 力 学 特 性 的 影 响 [J]. 中 国 生 物 医 学 工 程 学 报,2002,21(3): [15] 钟 兴 来, 王 新 娟, 姚 伟 娟, 等. 金 雀 异 黄 素 对 小 鼠 红 白 血 病 细 胞 系 MEL 的 抑 制 作 用 [J]. 中 国 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 报,2003,19 (1): 收 稿 日 期 : 修 回 日 期 : ( 编 辑 : 杨 靖 ) 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 檸 ( 上 接 第 1839 页 ) [7] BremerE,vanDam G,KroesenBJ,etal.Targetedinduction ofapoptosisforcancertherapy:currentprogressandprospects [J].TrendsMolMed,2006,12(8): [8] RosatoA,Piveta M,ParentiA,etal.Survivininesophageal cancer:anaccurateprognosticmarkerforsquamouscelcarci nomabutnotadenocarcinoma[j].intjcancer,2006,119(7): [9] ZafaroniN,PennatiM,DaidoneM G.Survivinasatargetfor newanticancerinterventions[j].jcelmolmed,2005,9(2): [10] LauCK,YangZF,LamSP,etal.InhibitionofStat3activity byyc 1enhanceschemo sensitivityinhepatocelularcarcinoma [J].CancerBiolTher,2007,6(12): [11] MahotkaC,KriegT,KriegA,etal.Distinctinvivoexpression paternsofsurvivingsplicevariantsinrenalcelcarcinomas[j]. IntJCancer,2002,100(1): [12] O ConnorDS,GrossmanD,PlesciaJ,etal.Regulationofap optosisatceldivisionbyp34cdc2phosphorylationofsurvivin [J].ProcNatlAcadSciUSA,2000,97(24): [13] SuzukiA,HayashidaM,ItoT,etal.Survivininitiatescelcy cleentrybythecompetitiveinteractionwithcdk4/p16(ink4a) andcdk2/cyclinecomplexactivation[j].oncogene,2000,19 (29): [14] Eun JinY,Ji HyeR,Yang SookC,etal.YC 1inducesScel cyclearrestandapoptosisbyactivatingcheckpointkinases[j]. CancerRes,2006,66(12): [15] Chun JenChen,Mei HuaHsu,Li Jiau Huang,etal.Antican cermechanismsofyc 1inhumanlungcancer NCI H226cel line[j].biochempharmacol,2008,75(2): 收 稿 日 期 : 修 回 日 期 : ( 编 辑 : 杨 靖 )