10 期 王 雪 莹 等 : 双 峰 骆 奶 对 2 型 糖 尿 病 大 鼠 肝 细 胞 凋 亡 的 影 响 材 料 与 方 法 1.1 材 料 试 验 动 物 选 用 健 康 6 周 龄 雄 性 Wistar 大 鼠 60 只, 体 重 120~150g, 购 自 兰 州

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1 动 物 营 养 学 报 2013,25(10): ChineseJournalofAnimalNutrition doi: /j.issn x 双 峰 骆 奶 对 2 型 糖 尿 病 大 鼠 肝 细 胞 凋 亡 的 影 响 1 王 雪 莹 1 张 全 伟 张 1 勇 2 张 泉 龙 2 姬 菩 忠 1 李 亚 兰 (1. 甘 肃 农 业 大 学 动 物 医 学 院, 兰 州 ;2. 兰 州 军 区 总 医 院, 兰 州 ) 1 赵 兴 绪 摘 要 : 本 试 验 旨 在 研 究 双 峰 驼 奶 对 2 型 糖 尿 病 大 鼠 肝 细 胞 凋 亡 的 保 护 作 用 60 只 月 龄 接 近 的 雄 性 成 年 大 鼠 随 机 分 5 组, 阴 性 对 照 (C) 组 采 用 基 础 饲 粮, 其 他 4 组 均 通 过 链 脲 佐 菌 素 结 合 高 糖 高 脂 饮 食 诱 导 建 立 2 型 糖 尿 病 大 鼠 模 型, 各 组 分 别 为 糖 尿 病 模 型 对 照 (DMC) 组 低 剂 量 骆 奶 (LCM) 组 (2mL/d) 高 剂 量 骆 奶 (HCM) 组 (5mL/d) 和 盐 酸 二 甲 双 胍 (MTH) 组 (200mg/kg) 试 验 期 4 周 结 果 表 明 : 与 C 组 和 DMC 组 相 比,MTH 组 和 HCM 组 大 鼠 血 糖 浓 度 显 著 下 降 (P<0.01);DMC 组 肝 细 胞 水 肿, 部 分 肝 细 胞 核 皱 缩 碎 裂 溶 解, 而 LCM 组 HCM 组 和 MTH 组 肝 细 胞 形 态 正 常, 胞 核 结 构 清 晰 ; 与 DMC 组 相 比,HCM 组 和 MTH 组 大 鼠 肝 细 胞 B 细 胞 淋 巴 瘤 因 子 2(BCL 2) 蛋 白 合 成 增 强,BCL 2 相 关 蛋 白 X(BAX) 合 成 减 弱 ;BCL 2mRNA 相 对 表 达 量 在 MTH 组 中 最 高,BAXmRNA 相 对 表 达 量 在 LCM 组 和 MTH 组 中 最 高 ;DMC 组 MTH 组 LCM 组 和 HCM 组 均 可 检 测 出 BCL 2 和 BAX 蛋 白 综 合 以 上, 双 峰 骆 奶 能 抑 制 BAX 蛋 白 的 合 成 而 促 进 BCL 2 蛋 白 合 成, 揭 示 双 峰 骆 奶 能 抑 制 细 胞 凋 亡, 促 进 细 胞 增 殖 双 峰 骆 奶 具 有 明 显 的 降 低 2 型 糖 尿 病 大 鼠 的 血 糖 及 肝 细 胞 损 伤 的 作 用, 可 起 到 辅 助 治 疗 的 作 用 关 键 词 : 双 峰 骆 奶 ;2 型 糖 尿 病 ; 肝 脏 ; 细 胞 凋 亡 中 图 分 类 号 :S852.2 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 : X(2013) 随 着 社 会 经 济 发 展, 饮 食 结 构 改 变, 糖 尿 病 已 成 为 在 世 界 范 围 内 广 泛 存 在 常 见 的 慢 性 疾 病 伴 胰 岛 素 抵 抗 (insulinresistance,ir) 的 2 型 糖 尿 病 (type2diabetesmelitus,t2dm) 是 严 重 危 害 人 类 健 康 的 疾 病, 其 发 病 率 占 糖 尿 病 的 90% 以 上, 而 肝 脏 是 参 与 体 内 糖 代 谢 最 重 要 的 器 官, 糖 尿 病 与 肝 脏 疾 病 相 互 影 响 因 此,T2DM 的 研 究 受 到 人 们 的 广 泛 重 视 目 前 对 糖 尿 病 的 治 疗 主 要 以 西 药 为 主, 但 西 药 治 疗 存 在 继 发 性 失 效 和 严 重 的 不 良 反 [1] 应 等 缺 点 因 此, 寻 找 对 机 体 无 损 伤 或 损 伤 较 小 的 药 物, 是 当 前 糖 尿 病 亟 待 解 决 的 问 题 骆 奶 曾 被 用 于 治 疗 各 种 肝 炎 结 核 过 敏 性 疾 病 胃 溃 疡 和 肿 瘤 [2-4], 曾 有 报 道 指 出 骆 奶 用 于 1 型 糖 尿 患 者 可 以 降 低 患 者 的 胰 岛 素 (INS) 用 量, Rogers [5] [6] 和 Agrawal 等 报 道 骆 奶 能 降 低 1 型 糖 尿 患 者 血 糖, 减 少 患 者 INS 用 量, 骆 奶 中 含 有 一 种 具 有 类 似 INS 许 多 特 性 的 蛋 白 质, 能 安 全 有 效 地 控 制 糖 尿 病 患 者 血 糖, 对 骆 奶 中 INS 进 行 成 分 和 结 构 分 析 发 现, 骆 奶 中 这 种 蛋 白 质 在 酸 性 环 境 下 不 形 成 凝 固 结 构, 不 易 被 酸 性 物 质 破 坏, 使 其 可 经 过 胃 被 小 肠 吸 收, 从 而 降 低 血 糖, 克 服 了 口 服 INS 存 在 的 问 题 [7] 此 外, 骆 奶 中 维 生 素 C 含 量 是 牛 奶 3 倍 多 [8] 维 生 素 C 单 独 或 联 合 其 他 药 物 亦 可 用 于 糖 尿 病 及 并 发 症 预 防 治 疗 [9-10] 骆 奶 对 T2DM 的 作 用 的 研 究 很 少, 尤 其 尚 未 见 对 T2DM 动 物 的 肝 细 胞 凋 亡 的 保 护 作 用 的 研 究 本 试 验 采 用 链 脲 佐 菌 素 (streptozotocin,stz) 建 立 T2DM 大 鼠 模 型, 研 究 双 峰 驼 奶 对 T2DM 大 鼠 肝 细 胞 凋 亡 的 保 护 作 用, 为 临 床 治 疗 糖 尿 病 及 其 并 发 症 提 供 新 思 路 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 863 计 划 项 目 (2013AA ) 作 者 简 介 : 王 雪 莹 (1988 ), 女, 河 南 三 门 峡 人, 硕 士 研 究 生, 从 事 临 床 兽 医 学 研 究 E mail: @qq.com 通 讯 作 者 : 赵 兴 绪, 教 授, 博 士 生 导 师,E mail:zhaoxx@gsau.edu.cn

2 10 期 王 雪 莹 等 : 双 峰 骆 奶 对 2 型 糖 尿 病 大 鼠 肝 细 胞 凋 亡 的 影 响 材 料 与 方 法 1.1 材 料 试 验 动 物 选 用 健 康 6 周 龄 雄 性 Wistar 大 鼠 60 只, 体 重 120~150g, 购 自 兰 州 大 学 动 物 实 验 中 心, 动 物 合 格 证 号 :SCXK 甘 双 峰 骆 奶 的 采 集 双 峰 骆 奶 采 自 甘 肃 酒 泉 瓜 州 县 锁 阳 镇 新 沟 村, 参 照 文 献 [11] 报 道 的 方 法 处 理 采 驼 奶 前, 用 干 净 的 毛 巾 擦 洗 骆 驼 乳 头, 用 75% 酒 精 消 毒, 双 峰 骆 奶 收 集 于 灭 菌 处 理 的 不 锈 钢 容 器 中, 尽 快 运 回 实 验 室 (8h 内 ), 置 于 -80 的 冰 箱 保 存 备 用 药 品 与 试 剂 盐 酸 二 甲 双 胍 (metformin hydrochloride, MTH, 上 海 施 贵 宝 制 药 有 限 公 司 );CX4Pro 全 自 动 生 化 分 析 仪 ( 美 国 Beckman);OnetouchUltraⅡ 快 速 血 糖 仪 ( 美 国 强 生 ); 兔 抗 大 鼠 B 细 胞 淋 巴 瘤 因 子 2(Bcellymphoma/lewkmia 2,BCL 2) 兔 抗 大 鼠 BCL 2 相 关 蛋 白 X(BCL 2 asociatedx pro tein,bax) 山 羊 抗 兔 免 疫 球 蛋 白 G(IgG, 二 抗 ) 山 羊 抗 兔 IgG 免 疫 组 织 化 学 试 剂 盒 以 及 二 氨 基 联 苯 胺 (DAB) 显 色 试 剂 盒 ( 武 汉 博 士 德 生 物 公 司 ); RNA Plus 试 剂 PrimeScript TM RT PCR 试 剂 盒 SYBR PremixExTaq TM PCR 试 剂 盒 ( 大 连 宝 生 物 公 司 ); 焦 炭 酸 二 乙 酯 (DEPC, 美 国 Sigma); 聚 偏 氟 乙 烯 (PVDF) 膜 ( 美 国 Milipore); 其 他 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 仪 器 电 子 天 平 (BP210S, 德 国 Sartorius); 紫 外 分 光 光 度 计 (HP8453, 美 国 HP); 离 心 机 (IEC Mi cromax, 美 国 ThermoElectron);PCR 仪 (Mx3005P qpcrsystem, 美 国 Stratagene); 电 泳 仪 电 转 移 仪 和 酶 标 仪 ( 美 国 Bio Rad) 1.2 方 法 模 型 建 立 分 组 与 给 药 T2DM 大 鼠 模 型 : 用 高 脂 饲 粮 ( 蛋 黄 2.5% 蔗 糖 20.0% 猪 油 10.0% 基 础 饲 料 67.5%) 饲 养 2 个 月 后, 单 次 注 射 STZ30mg/kg, 诱 发 T2DM 注 射 STZ 前 大 鼠 禁 食 16h; 注 射 STZ 后 3~7d, 检 测 血 糖, 血 糖 值 大 于 14mmol/L 的 大 鼠 纳 入 试 验 60 只 大 鼠 随 机 分 5 组, 每 组 12 只, 阴 性 对 照 (C) 组 采 用 基 础 饲 粮, 其 他 4 组 均 为 建 立 T2DM 模 型 后 的 大 鼠, 分 别 为 糖 尿 病 模 型 对 照 (DMC) 组 低 剂 量 骆 奶 (LCM) 组 (2mL/d) 高 剂 量 骆 奶 (HCM) 组 (5mL/d) 和 MTH 组 (200mg/kg) 各 试 验 组 均 采 用 灌 胃 给 药, 连 续 4 周,C 组 和 DMC 组 给 予 等 量 生 理 盐 水 糖 耐 量 检 测 试 验 前 大 鼠 禁 食 不 禁 水 16h, 以 50% 葡 萄 糖 溶 液 灌 胃 (5g/kg), 给 予 葡 萄 糖 前 先 测 定 空 腹 血 糖, 给 予 葡 萄 糖 后 和 120min, 分 别 检 测 大 鼠 血 糖 浓 度 的 变 化 血 液 INS 浓 度 检 测 末 次 给 药 后, 大 鼠 注 射 戊 巴 比 妥 钠 (50mg/kg), 麻 醉 后, 打 开 腹 腔, 分 离 腹 主 动 脉 并 取 血 液 0.5mL 加 入 抗 凝 管 中,3000 g 离 心 15min, 取 上 清 检 测 INS 浓 度 肝 脏 组 织 苏 木 精 - 伊 红 (HE) 染 色 末 次 给 药 后 大 鼠 禁 食 不 禁 水 6h, 颈 椎 脱 臼 处 死, 立 即 取 新 鲜 肝 脏 组 织, 于 4% 多 聚 甲 醛 溶 液 固 定, 常 规 脱 水, 石 蜡 包 埋, 切 片, 经 HE 染 色 后, 中 性 树 胶 封 片, 光 镜 下 观 察 肝 脏 病 变 肝 脏 组 织 免 疫 组 织 化 学 染 色 4% 多 聚 甲 醛 固 定 的 肝 脏 组 织 常 规 脱 水, 石 蜡 包 埋, 切 片, 制 成 4μm 厚 的 组 织 切 片 经 抗 原 修 复, 非 离 子 表 面 活 性 剂 (Triton) 作 用 10min;3% 过 氧 化 氢 作 用 20min; 羊 血 清 封 闭 30min; 滴 加 一 抗 ( 兔 抗 大 鼠 BCL 2 和 兔 抗 大 鼠 BAX,1 150), 阴 性 对 照 用 磷 酸 盐 缓 冲 液 (PBS) 代 替 一 抗, 置 湿 盒 中 4 过 夜 ;PBS 洗 涤 3 次, 滴 加 羊 抗 兔 二 抗,37 孵 育 30min;PBS 洗 涤 3 次, 滴 加 链 霉 亲 和 素 - 生 物 素 复 合 物 (SABC) 室 温 孵 育 20min;PBS 洗 涤 3 次, 滴 加 DAB 显 色 终 止 ;PBS 洗 涤 3 次, 苏 木 素 轻 度 复 染 脱 水 透 明, 中 性 树 胶 封 片 显 微 镜 下 观 察, 采 用 MinVnt 图 像 分 析 系 统 在 400 倍 显 微 镜 下 对 免 疫 组 织 化 学 阳 性 结 果 进 行 分 析 实 时 定 量 PCR(RT qpcr) 检 测 肝 脏 组 织 凋 亡 相 关 基 因 mrna 的 表 达 末 次 给 药 后 大 鼠 禁 食 不 禁 水 6h, 颈 椎 脱 臼 处 死, 立 即 取 肝 脏, 液 氮 中 冷 冻 保 存 备 用 提 取 总 RNA,-80 保 存 备 用 总 RNA 纯 度 鉴 定 : 取 2.5μL 总 RNA 提 取 液 在 紫 外 分 光 光 度 计 测 定 260nm 吸 光 度 值 (A 260nm ) 280 nm 吸 光 度 值 (A 280nm ), 计 算 A 260nm /A 280nm, 在 1.8~2.0 之 间 为 纯 度 合 格 逆 转 录 : 取 200ng 总 RNA, 根 据 试 剂

3 2424 动 物 营 养 学 报 25 卷 盒 说 明 书 配 制 逆 转 录 PCR 反 应 液 反 应 条 件 : min;70 10min; 反 应 得 到 cdna, -20 保 存 备 用 RT qpcr 两 步 法 扩 增 :SYBR PremixEX Tap TM Ⅱ (2 )12.5μL 上 下 游 引 物 (10μmol/ L) 各 1μL cdna2μl 双 蒸 水 8.5μL, 反 应 为 体 系 25μL; 反 应 程 序 :95 30s;95 5s 60 30s,40 个 循 环 ;95 15s 60 30s 95 15s ( 离 解 程 序 ) 分 别 检 测 BAX BCL 2 细 胞 凋 亡 蛋 白 酶 3 (cysteinylaspartatespecificproteinase3,caspase3) 和 核 转 录 因 子 B(nuclearfactor kappab,nf κb) 的 mrna 相 对 表 达 量 产 物 经 2% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 拍 照, 用 凝 胶 成 像 系 统 进 行 分 析 采 用 2 - Ct 方 法 进 行 数 据 处 理 根 据 GenBank 公 布 的 大 鼠 mrna 序 列, 使 用 PrimerPremier5.0 设 计 引 物 ( 表 1), 由 上 海 生 工 生 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司 合 成 表 1 RT qpcr 引 物 序 列 及 参 数 Table1 SequencesandparametersofprimersforRT qpcr 基 因 引 物 序 列 产 物 大 小 GenBank 登 录 号 Genes Primersequences(5 3 ) Productsize/bp GenBankaccesionNo. B 细 胞 淋 巴 瘤 因 子 2 相 关 蛋 白 X BAX B 细 胞 淋 巴 瘤 因 子 2 BCL 2 核 转 录 因 子 B NF κb 细 胞 凋 亡 蛋 白 酶 3 Caspase3 甘 油 醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶 GAPDH 上 游 :ACAGGGTTTCATCCAGG 下 游 :GCCTTGAGCACCAGTTT 上 游 :CGGGAGAACAGGGTATGA 下 游 :CAGGCTGGAAGGAGAAGAT 上 游 :TCAGAGCCAGGACCACA 下 游 :CAGCCTCCAATCTTCATCAC 上 游 :GGAGCAGTTTTGTGTGTGTGAT 下 游 :ATGATGAAGAGTTTCGGCTTTC 上 游 :GCAAGTTCAACGGCACAG 下 游 :GCCAGTAGACTCCACGACAT 291 NM_ NM_ NM_ NM_ NM 免 疫 印 记 分 析 (westernblot) 检 测 BCL 2 和 BAX 蛋 白 的 相 对 含 量 将 液 氮 冻 存 的 肝 脏 组 织 取 出 提 取 总 蛋 白, 称 取 50mg 于 研 钵 研 磨, 加 入 细 胞 裂 解 液 800μL, 在 冰 上 裂 解 30min, 反 复 吹 打 使 其 充 分 裂 解 后, 移 入 1.5mL 离 心 管, g 离 心 15min, 收 集 上 清, 测 定 总 蛋 白 浓 度 每 组 取 50μg 总 蛋 白 上 样,15% 十 二 烷 基 四 乙 酸 二 钠 - 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 (SDS PAGE) 分 离 蛋 白, 运 用 电 转 移 法 将 蛋 白 转 移 至 PVDF 膜 5% 脱 脂 奶 粉 室 温 封 闭 2h, 加 兔 抗 大 鼠 β 肌 动 蛋 白 (β actin,1 1000, 一 抗 ) 兔 抗 大 鼠 BCL 2(1 1000, 一 抗 ), 加 兔 抗 大 鼠 BAX (1 1000, 一 抗 )4 孵 育 过 夜, 洗 膜 后 加 辣 根 过 氧 化 物 酶 (HRP) 标 记 的 羊 抗 兔 二 抗 (1 5000),37 孵 育 2h, 化 学 发 光 法 ECL 显 影 试 验 重 复 3 次 1.3 数 据 统 计 与 分 析 采 用 IPP6.0 软 件 对 Westernblot 结 果 特 异 性 产 物 条 带 进 行 累 计 吸 光 度 检 测 (IOD), 试 验 数 据 输 入 SPSS17.0 统 计 软 件, 采 用 单 因 素 的 方 差 分 析 进 行 统 计 学 检 验 组 内 采 用 独 立 样 本 t 检 验 组 间 采 用 配 对 样 本 t 检 验, 数 据 均 用 平 均 值 ± 标 准 误 表 示,P<0.01 判 定 为 差 异 显 著 2 结 果 2.1 双 峰 驼 奶 对 T2DM 大 鼠 糖 耐 量 的 影 响 由 表 2 可 知, 与 C 组 相 比, 其 他 组 血 糖 浓 度 均 升 高 DMC 组 LCM 组 HCM 组 和 MTH 组 均 呈 先 升 高 后 降 低 的 趋 势 给 予 葡 萄 糖 和 120min 时,LCM 组 大 鼠 血 糖 浓 度 显 著 低 于 DMC 组 (P<0.01); 给 予 葡 萄 糖 0 30 和 120min 时, HCM 组 大 鼠 血 糖 浓 度 显 著 低 于 DMC 组 (P< 0.01);MTH 组 血 糖 浓 度 与 DMC 组 在 各 时 间 点 均 差 异 不 显 著 (P>0.05) 结 果 提 示, 双 峰 骆 奶 能 发 挥 降 血 糖 作 用 ; 双 峰 骆 奶 对 糖 耐 量 异 常 具 有 一 定 的 改 善 作 用

4 10 期 王 雪 莹 等 : 双 峰 骆 奶 对 2 型 糖 尿 病 大 鼠 肝 细 胞 凋 亡 的 影 响 2425 表 2 双 峰 驼 奶 对 T2DM 大 鼠 血 糖 浓 度 的 影 响 Table2 EfectsofBactriancamelmilkonbloodglucoseconcentrationofT2DM rats mmol/l 组 别 时 间 Time/min Groups C 5.08± ± ± ±0.88 DMC 26.08± ± ± ±2.97 LCM 26.82± ±2.75 # 31.00±5.19 # 26.78±3.63 # HCM 25.92±1.06 # 30.49±1.52 # 32.42± ±3.53 # MTH 26.89± ± ± ±1.88 同 列 数 据 肩 标 表 示 与 C 组 相 比 差 异 显 著 (P<0.01),# 表 示 与 DMC 组 相 比 差 异 显 著 (P<0.01) 下 表 同 Valuesinthesamecolumnwith superscriptaresignificantlydiferentfrom thoseingroupc(p<0.01),andwith# superscriptaresignificantlydiferentfrom thoseingroupdmc(p<0.01).thesameasbelow. 2.2 双 峰 驼 奶 对 T2DM 大 鼠 血 液 INS 浓 度 的 影 响 由 表 3 可 知, 与 C 组 相 比,DMC 组 INS 浓 度 显 著 上 升 (P<0.01),LCM 组 和 MTH 组 INS 浓 度 显 著 下 降 (P<0.01); 与 DMC 组 相 比,LCM 组 HCM 组 和 MTH 组 INS 浓 度 均 显 著 下 降 (P< 0.01), 其 中 LCM 组 最 低 表 3 双 峰 骆 奶 对 T2DM 大 鼠 血 液 INS 浓 度 的 影 响 Table3 EfectsofBactriancamelmilkon bloodinsconcentrationoft2dm rats mu/l 组 别 Groups 胰 岛 素 INS C 12.39±0.24 DMC 11.41±2.71 LCM 7.60±0.50 # HCM 10.56±1.52 # MTH 9.50±0.18 # 2.3 肝 脏 组 织 HE 染 色 结 果 由 图 1 可 知,C 组 肝 小 叶 结 构 清 晰 完 整, 肝 细 胞 核 结 构 清 晰, 肝 细 胞 形 态 正 常 肝 窦 正 常, 连 接 成 网 状 DMC 组 肝 细 胞 失 去 正 常 的 索 状 结 构, 脂 肪 变 性, 肝 细 胞 水 肿, 肝 窦 变 窄, 部 分 肝 细 胞 核 表 缩 碎 裂 溶 解 肝 细 胞 索 之 间 纤 维 细 胞 增 生 LMC 组 和 HMC 组 肝 细 胞 形 态 正 常, 胞 核 结 构 清 晰, 部 分 肝 细 胞 浆 内 可 见 小 脂 滴 形 成, 局 部 细 胞 界 限 不 清, 肝 小 叶 结 构 清 晰, 肝 细 胞 索 排 列 整 齐 呈 放 射 状, 肝 窦 正 常, 部 分 肝 索 排 列 紊 乱, 与 DMC 组 比 较, 肝 脏 脂 肪 变 性 及 损 伤 减 轻 2.4 肝 脏 组 织 免 疫 组 织 化 学 染 色 结 果 由 图 2 可 知,BCL 2 蛋 白 免 疫 阳 性 反 应 呈 棕 黄 色 颗 粒 状, 定 位 于 胞 浆, 与 DMC 组 相 比,MTH 组 和 HCM 组 肝 细 胞 BCL 2 蛋 白 合 成 量 明 显 升 高, LCM 组 肝 细 胞 BCL 2 蛋 白 合 成 量 变 化 不 大 提 示, 驼 奶 可 提 高 肝 细 胞 BCL 2 蛋 白 合 成 量 由 图 3 可 知,BAX 蛋 白 免 疫 阳 性 反 应 呈 棕 黄 色 颗 粒 状, 定 位 于 胞 浆 ; 与 其 他 组 相 比,DMC 组 肝 细 胞 BAX 蛋 白 合 成 量 明 显 升 高,LCM 组 肝 细 胞 BAX 蛋 白 合 成 量 变 化 不 大 结 果 提 示,T2DM 大 鼠 肝 细 胞 BAX 蛋 白 合 成 量 较 高, 而 双 驼 峰 奶 降 低 了 肝 细 胞 BAX 蛋 白 的 合 成 2.5 双 峰 驼 奶 对 T2DM 大 鼠 肝 脏 组 织 凋 亡 相 关 基 因 表 达 的 影 响 由 图 4 可 知, 肝 脏 组 织 中 BAX BCL 2 caspase3 和 NF κb mrna 在 各 组 均 有 表 达 caspase3mrna 在 LCM 组 中 表 达 最 高, 与 DMC 组 和 MTH 组 相 比 差 异 显 著 (P<0.01);BCL 2 mrna 在 MTH 组 中 表 达 最 高, 与 DMC 组 相 比 差 异 显 著 (P<0.01);BAX mrna 在 LCM 组 和 MTH 组 中 表 达 高 于 DMC 组 和 HCM 组, 与 DMC 组 相 比 差 异 显 著 (P<0.01);NF κb mrna 在 MTH 组 中 表 达 最 高, 与 其 他 各 组 相 比, 差 异 显 著 (P<0.01) 2.6 双 峰 骆 奶 对 T2DM 大 鼠 肝 脏 组 织 BAX 和 BCL 2 蛋 白 相 对 含 量 的 影 响 由 图 5 可 知,T2DM 大 鼠 模 型 建 立 成 功 后, DMC 组 MTH 组 LCM 组 和 HCM 组 均 可 检 测 到 BAX 和 BCL 2 蛋 白 与 DMC 组 相 比,LCM 组 和 MTH 组 BCL 2 蛋 白 相 对 含 量 显 著 下 调 (P< 0.01),HCM 表 现 为 显 著 上 调 (P<0.01) HCM 组 和 LCM 组 BCL 2 蛋 白 相 对 含 量 高 于 MTH 组, 其 中 HCM 组 显 著 高 于 MTH 组 (P<0.01) 与 DMC 组 相 比,LCM 组 HCM 组 和 MTH 组 中 BAX 蛋 白 相 对 含 量 均 提 高,BAX 蛋 白 在 MTH 组 表 达 最 高, 显 著 高 于 HCM 组 和 MTH 组 (P<0.01) 结 果 显 示, 双 峰 骆 奶 能 有 效 地 抑 制 细 胞 凋 亡, 与 MTH 具 有 类 似 的 作 用

5 2426 动 物 营 养 学 报 25卷 A C组 B DMC组 C LCM 组 D HCM 组 E MTH组 图 2 图 3同 A Cg oup B DMCg oup C LCM g oup D HCM g oup E MTHg oup Th m F 2 ndf 3 图 1 T2DM 大鼠肝脏组织 HE染色结果 F 1 ThHE n ng u n v uot2dm 400 图 2 T2DM 大鼠肝脏组织 BCL 2蛋白免疫组织化学染色结果 F 2 Th mmunoh o n ng u obcl 2p o n n v uot2dm 400 图 3 T2DM 大鼠肝脏组织 BAX蛋白免疫组织化学染色结果 F 3 Th mmunoh o n ng u obaxp o n n v uot2dm 400

6 10期 王雪莹等 双峰骆奶对 2型糖尿病大鼠肝细胞凋亡的影响 2427 过程 中 控 制 血 糖 是 治 疗 糖 尿 病 的 首 要 目 标 T2DM 患者除了高血糖外 常表现为糖耐量异常 I NS敏感性下降等 同时存在着代谢紊乱 现代研 究证明双峰骆奶能促进新陈代谢 增强肝脾功能 改善胰腺 功 能 补 肝 益 肾 清 肺 消 暑 养 阴 解 毒 清除 坏 死 组 织 肉 芽 促 生 加 速 疾 病 痊 愈 等 作 用 12 通过双峰骆奶喂养 T2DM 大鼠 其结果揭 示驼奶能够显著改善大鼠糖耐量和 I NS浓度 BAX 为 促 凋 亡 蛋 白 BCL 2为 抗 凋 亡 蛋 白 13 多项研究表明 BCL 2mRNA高表达时 细 胞增殖大于细胞凋亡 而 BAXmRNA高表达时 表 数据柱形标注 表 示 与 DMC组 相 比 差 异 显 著 P 现为细胞凋亡 14 HE染色结果和免疫组织化学 0 01 表 示 与 MTH 组 相 比 差 异 显 著 P 0 01 染色结果显 示 驼 奶 能 够 促 进 细 胞 增 殖 抑 制 细 胞 图 5同 的凋亡 有 效 地 预 防 T2DM 大 鼠 的 病 变 从 而 对 D w h gn n yd n om ho n T2DM 发挥辅助治疗的效果 g oupdmc P 0 01 ndw h gn n yd 糖尿病 导 致 肝 细 胞 凋 亡 的 机 制 复 杂 细 胞 凋 n om ho ng oupmth P 0 01 Th m 亡的具体机制涉及一系列基因的复杂调控 目前 F g5 认为细胞 p 3是凋亡信号转导的共同通路 该 图 4 双峰驼奶对 T2DM 大鼠肝脏组织 酶是否被激活也是鉴别细胞凋亡与坏死的主要依 凋亡相关基因表达的影响 据 15 以前 的 研 究 证 实 胰 岛 B细 胞 凋 亡 是 与 F 4 E ob n m m kon pop o dg n xp on n v uot2dm NF κb的活化有关 抑制 NF κb的活化可以保护 16 胰岛 B细胞 抑制 NF κb信号通路可减少 B细 胞凋亡 由此可见 NF κb通路的炎症反应可能在 T2DM 的发生 发 展 及 肝 脏 组 织 的 脂 肪 变 性 中 起 到重要作用 RT qpcr 结 果 显 示 双 峰 骆 奶 能 引 起 p 3 NF 2mRNA 的 表 达 κb BAX和 BCL 驼奶 剂 量 的 不 同 BAX mrna 表 达 显 著 下 调 BCL 2mRNA表 达 上 调 同 时 激 活 NF κb mrna 的表达 从而可 能 激 活 肿 瘤 坏 死 因 子 TNF 家 族 相关基因的表达 最终引起胰岛 B细胞分泌 I NS 保护肝 脏 和 胰 腺 W nb o结 果 揭 示 BCL 2 蛋白 相 对 含 量 在 LCM 组 和 HCM 组 显 著 高 于 MTH组 BAX 蛋 白 相 对 含 量 MTH 组 显 著 高 于 图 5 双峰骆奶对 T2DM 大鼠肝脏组织 BAX和 BCL 2蛋白质相对 含量的影响 F 5 E ob n m m kon vp o n on n obax ndbcl 2 n v uot2dm LCM 组和 HCM 组 然 而 BCL 2 BAX增 高 表 明 驼奶抑制肝细胞的凋亡 其效果优于 MTH 骆驼是荒漠 半荒漠地带的重要的畜种资源 其分布具有较强的地域性 仅存在于蒙古 中东的 某些地区和 中 国 的 新 疆 和 内 蒙 古 由 于 其 数 量 的 减少 产奶量 较 少 以 及 鲜 奶 不 易 于 保 存 等 而 不 被 众 人 所 了 解 其 医 用 价 值 开 发 更 少 Ag w 3 讨 论 等 17 报道 每天饮用 0 5L驼奶 使糖尿病患者的 糖尿病 的 发 病 机 制 较 复 杂 在 糖 尿 病 的 治 疗 I NS需求量相对降低 血糖稳定 他们对 2099人

7 2428 动 物 营 养 学 报 25 卷 进 行 了 调 查 [18], 结 果 说 明, 日 常 生 活 中 饮 用 驼 奶 对 糖 尿 病 的 发 病 率 有 明 确 的 影 响, 驼 奶 对 糖 尿 病 有 拮 抗 作 用 驼 奶 的 营 养 丰 富, 保 健 治 疗 价 值 也 很 高, 但 就 驼 奶 的 研 究 以 及 驼 奶 产 业 的 发 展 并 不 乐 观, 尤 其 是 在 我 国 鲜 有 几 个 产 业 链 来 开 发 和 利 用 通 过 驼 奶 对 疾 病 的 辅 助 治 疗 作 用 机 理, 特 别 是 对 糖 尿 病 和 肺 结 核 治 疗 作 用 的 研 究, 将 促 进 养 驼 业 的 发 展, 并 为 临 床 治 疗 提 供 有 效 的 参 考 依 据 4 结 论 双 峰 骆 奶 能 抑 制 BAX 蛋 白 的 合 成, 而 促 进 BCL 2 蛋 白 合 成, 揭 示 双 峰 骆 奶 能 抑 制 细 胞 凋 亡, 促 进 细 胞 增 殖 双 峰 骆 奶 具 有 明 显 的 降 低 T2DM 大 鼠 的 血 糖 及 肝 细 胞 损 伤 的 作 用, 可 起 到 辅 助 治 疗 的 作 用 参 考 文 献 : [1] 贺 星, 田 红, 徐 颂, 等. 糖 尿 病 治 疗 药 物 的 研 究 进 展 [J]. 现 代 药 物 与 临 床,2009,24(3): [2] 林 佳, 潘 竞 锵, 李 博 薄, 等. 黄 连 对 D- 半 乳 糖 诱 导 大 鼠 血 糖 和 糖 耐 量 减 退 影 响 的 实 验 研 究 [J]. 中 国 临 床 医 药 研 究 杂 志,2005,139: [3] 俞 河 松, 竹 剑 平. 茶 多 酚 对 2 型 糖 尿 病 大 鼠 胰 岛 素 抵 抗 的 影 响 [J]. 海 峡 药 学,2009,21(5): [4] 沙 丽 塔 娜 提 贺 纳 亚 提, 李 辉, 许 晏, 等. 骆 驼 奶 对 慢 性 乙 型 肝 炎 患 者 免 疫 应 答 的 影 响 [J]. 细 胞 与 分 子 免 疫 学 杂 志,2009,25(5): [5] ROGERSA.MemoriesofJahangir[M].New Delhi: AlanticPublishersandDistributor,1989:315. [6] AGRAWALR P,BENIWALR,SHARMA S,etal. Efectofrawcamelmilkintype1diabeticpatients:1 yearrandomisedstudy[j].journalofcamelpractice andresearch,2005,12(1): [7] WERNERYU,NAGYP,BHAII,etal.Theefectof heattreatment,pasteurization and diferentstorage temperaturesoninsulinconcentrationsincamelmilk [J].Milchwisenschaft,2006,61(1): [8] FARAH Z.Compositionandcharacteristicsofcamel milk[j].journalofdairyresearch,1993,60(4): [9] 郑 芳. 维 生 素 C 联 合 参 芪 复 方 治 疗 糖 尿 病 视 网 膜 病 变 的 临 床 疗 效 观 察 [J]. 数 理 医 药 学 杂 志,2009,22 (3): [10] 盛 小 刚, 宋 卉, 仇 烨, 等. 维 生 素 C 改 善 糖 尿 病 兔 内 皮 依 赖 血 管 扩 张 功 能 [J]. 中 国 临 床 药 学 杂 志, 2000,9(6): [11] KORASHYH M,MAAYAH ZH,ABD ALLAH A R,etal.Camelmilktriggersapoptoticsignalingpath waysinhumanhepatomahepg2andbreastcancer MCF7 cellinesthrough transcriptionalmechanism [J].JournalofBiomedicine and Biotechnology, 2012,2012: [12] 沙 丽 塔 娜 提 贺 纳 亚 提, 姜 莹, 李 辉, 等. 骆 驼 奶 对 促 进 慢 性 乙 型 肝 炎 患 者 康 复 的 临 床 研 究 [J]. 新 疆 医 科 大 学 学 报,2009,32(7): [13] HSUSY,HSUEH A J.Tisue specificbcl 2protein partnersinapoptosis:anovarianparadigm[j].physio logicalreviews,200,80(2): [14] 玉 洪 荣, 王 薇, 郭 灵, 等. 褪 黑 素 对 1 型 糖 尿 病 脑 病 大 鼠 学 习 记 忆 和 海 马 齿 状 回 细 胞 凋 亡 及 Bax 与 Bcl 2 蛋 白 表 达 的 影 响 [J]. 解 剖 学 研 究,2009,31 (2): [15] COHENG M.Caspase:theexecutionersofapoptosis [J].BiochemicalJournal,1997,326:1-16. [16] ELDORR,YEFFETA,BAUM K,etal.Conditional andspecifienf κbblockadeprotectspancreaticbeta celsfrom diabetogenicagents[j].proceedingofthe NationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesof America,2006,103(13): [17] AGRAWALPP,SWAMISC,BENIWALR,etal. Efectofcamelmilkonglycemiccontrol,riskfactors anddiabetesqualityoflifeintype 1diabetes:aran domisedprospectivecontroledstudy[j].journalof CamelPracticeandResearch,2003,10(1): [18] AGRAWALRP,SWAMISC,BENIWALR,etal. Efectofcamelmilkonglycemiccontrol,lipidprofile anddiabetesqualityoflifeintype1diabetes:aran domizedprospectivecontroledcrosoverstudy[j]. IndianJournalofAnimalSciences,2003,73(10):

8 10 期 王 雪 莹 等 : 双 峰 骆 奶 对 2 型 糖 尿 病 大 鼠 肝 细 胞 凋 亡 的 影 响 2429 EfectsofBactrianCamelMilkonHepatocyteApoptosisof Type2DiabetesMelitusRats WANGXueying 1 ZHANGQuanwei 1 ZHANGYong 1 ZHANGQuanlong 2 JIPeizhong 2 LIYalan 1 ZHAOXingxu 1 (1.ColegeofVeterinaryMedicine,GansuAgricultureUniversity,Lanzhou730070,China;2.Hospitalof MedicineBranch,LanzhouMilitaryRegionHospital,Lanzhou730040,China) Abstract:ThisstudywasconductedtoinvestigatetheprotectiveefectsofBactriancamelmilkonhepatocyte apoptosisoftype2diabetesmelitus(t2dm)rats.sixtyadultmaleratswithsimilarmonthofagewereran domlydividedintofivegroups,whichwerenegativecontrol(c)group(healthyrats,basaldiet),diabetes modelcontrol(dmc)group(t2dm rats),low concentrationcamelmilk(lcm)group(2ml/d,t2dm rats),highconcentrationcamelmilk(hcm)group(5ml/d,t2dm rats)andmetforminhydrochloride (MTH)group(200mg/kg,T2DM rats),respectively.theexperimentlastedfor4weeks.theresults showedasfolows:comparedwithc anddmc groups,thebloodglucoseconcentrationinmth andhcm groupswassignificantlydecreased(p<0.01).thehepatocytewasswolen,partialnuclearfragmentation, shrinkageanddisolutionindmc group,whilethemorphologywasnormal,andthenuclearwasclearin LCM,HCM andmth groups.comparedwithdmc group,thesynthesisofb cellymphoma/lewkmia 2 (BCL 2)wasincreasedinHCM andmthgroups,whilethatinbcl 2 asociatedxprotein(bax)wasde creasedinhcm andmthgroups.therelativeexpresionlevelofbcl 2mRNAwasthehighestintheMTH group,whiletherelativeexpresionlevelofbaxmrnareacheditspeakinlcm andmthgroups.therela tiveexpresionlevelofbcl 2mRNAwasthehighestinMTHgroup,andthatofBAXwashigherinLCM and HCM groupsthanthatintheothertwogroups.bcl 2andBAX proteinscouldbedetectedindmc,lcm, HCM andmth groups.theresultsindicatethatbactrianmilkcansupprescelapoptosisandpromotecel proliferationthroughinhibitingbax proteinsynthesis,butencouragingbcl 2proteinsynthesis,thusreduce thehepatocyteinjuryanddecreasethebloodglucoseconcentrationoft2dm rats,whichprovidesanew ad junctivetreatmentfordiabetesmelitus.[chinesejournalofanimalnutrition,2013,25(10): ] Keywords:camelmilk;type2diabetes;hepatocyte;apoptosis Corespondingauthor,profesor,E mail:zhaoxx@gsau.edu.cn ( 编 辑 王 智 航 )

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