需要大量的有机溶剂, 并且处理时间也很长固相微萃取技术 (solid phase microextraction, SPME) 是由加拿大 Waterloo 大学 Arthur 和 Pawl iszyn 等人开发的一种新型无溶剂样品前处理技术, 它几乎解决了以往传统样品前处理过程中的所有缺点, 其

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晏舍茅
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1 生物技术进展 2011 年第 1 卷第 5 期 352 ~ 356 Current Biotechnology ISSN 櫅櫅研究论文 Articles 黄酒中挥发性和半挥发性成分检测固相微萃取条件的优化朱潘炜 1, 舒杰 1, 刘东红 1, 周建弟 2 1. 浙江大学生物系统工程与食品学院, 杭州 ; 2. 浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司, 浙江绍兴摘要 : 采用固相微萃取 - 气相色谱联用质谱法分析黄酒中的挥发性和半挥发性成分, 对萃取时间萃取温度预热时间酒样添加量盐添加量解析时间等条件参数进行了优化, 最终确定最佳条件为采用 50 / 30 μm DVB / CAR / PDMS 萃取头, 在 20 ml 顶空瓶中, 加入 6 ml 黄酒样和 2. 0 g NaCl, 萃取温度 60, 预热时间 15 min, 萃取时间 30 min, 解析温度 250, 解析时间 6 min 本方法简单快速, 干扰少, 灵敏度高关键词 : 固相微萃取 ; 香味成分 ; 挥发性和半挥发性 ; 黄酒 DOI: / j. issn Optimization of Determination Condition for Volatile and Semi Volatile Compounds in Rice Wine by SPME GC MS ZHU Pan wei 1,SHU Jie 1,LIU Dong hong 1,ZHOU Jian di 2 1. School of Biosystem Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou ,China; 2. Zhejing Guyuelongshan Shaoxing Wine Co. Ltd,Zhejing Shaoxing ,China Abstract:A method for detection of volatile and semi volatile compounds in rice wine by SPME GC MS was developed. The analysis parameters of extraction time,sample temperature,warm up time,content of rice wine,content of sodium chloride, desorption time were optimized. The optimized method was as follows:6 ml rice wine sample was put into 20 ml bottle and dissolved with 2. 0 g NaCl. With 15 min warm up time,the sample was extracted by 50 / 30 μm DVB / CAR / PDMS fiber for 30 min at the temperature of 60,then the volatiles and semi volatiles were desorbed from the fiber at temperature of 250 for 6 min. It is a simple,quick methed,with less interference and high sensitivity. Key words:spme;flavor compounds;volatile and semi volatile;rice wine 黄酒是是一种营养丰富的低度酿造酒, 是我国历史上最古老的酒种之一, 与啤酒葡萄酒并列为世界三大古酒 [1] 黄酒主要是以稻米黍米玉米和小麦为原料, 经蒸煮加曲糖化发酵压榨过滤煎酒贮存勾兑等工序而成的酿造酒浙江绍兴黄酒为其中的代表黄酒含极其丰富的成分, 除乙醇和水外, 还含有氨基酸低聚糖维生素葡萄糖有机酸糊精微量芳香成分和矿物质等 [2] 黄酒在陈酿的过程中, 主要是醇醛酸酯櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅氨基酸及固形物的变化, 一些醇醛类物质被催化氧化成有机酸, 酸的增加促进了酯化反应 ; 醇类氨基酸态氮类物质含量呈逐年减少趋势总酸酯类固形物金属盐类物质含量逐年增加 ; 所以检测黄酒中的风味物质可以比较全面的测定黄酒在陈酿过程中的变化, 本文选定对黄酒风味物质的分析来鉴别黄酒的品质和酒龄对于黄酒中种类繁多的风味成分, 它们的萃取和富集一直是一大难题目前常用的萃取法是液 - 液萃取法 (liquid liquid extractin,lle), 但其收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 浙江省黄酒技术与装备重点实验室项目 (2009E10007) 资助作者简介 : 朱潘炜, 硕士研究生, 主要从事食品加工研究通讯作者 : 刘东红, 教授, 博士生导师, 主要从事食品工程与食品安全研究 Tel: ;E mail:dhliu@ zju. edu. cn

2 需要大量的有机溶剂, 并且处理时间也很长固相微萃取技术 (solid phase microextraction, SPME) 是由加拿大 Waterloo 大学 Arthur 和 Pawl iszyn 等人开发的一种新型无溶剂样品前处理技术, 它几乎解决了以往传统样品前处理过程中的所有缺点, 其包含采样萃取浓缩进样等工序, 已经广泛应用于化工制药临床药理农药残留食品分析环境污染物和公安案件分析等领域 [3 ~ 5] 该方法现在已经应用于苹果酒 [6 ~ 8] 葡萄酒 [9] 白酒等的挥发性香气成分的分析罗涛等 [10] 采用过该技术用于黄酒中挥发性和半挥发性成分的检测, 但并未对固相微萃取方法的影响因素进行分析本文目的在于探索影响 SPME 灵敏度的因素, 以便在优化的条件下, 高效灵敏快捷完成分析任务 1 材料与方法 1. 1 材料与仪器 NaCl Na 2 CO 4 为分析纯, 宁波市化学试剂厂 ; Na 2 SO 4 分析纯, 浙江省兰溪市二轻试剂厂 ; 千分之一天平,JA5003,HangPing; 黄酒, 古越龙山集团 Agilent GC6890 MS5973 气相色谱串联质谱仪 ;SPME 手动进样装置 50 / 30 μm DVB / CAR / PDMS 萃取头, 美国 SUPELCO 公司 ; 顶空瓶 20 ml,agilent;501 型超级恒温水浴锅, 上海市实验仪器厂 1. 2 实验方法萃取头的老化根据 SUPELCO 公司推荐的老化条件 : 在 270 条件下, 将 50 / 30 μm DVB / CAR / PDMS 萃取头老化 1 h, 老化至无干扰峰出现为止色谱条件色谱柱是 DB INNOWax 石英毛细管柱, 内径 mm, 柱长 30 m, 初始柱温设为 50, 以 4 / min 升温至 70, 再以 6 / min 升温至 150, 再以 40 / min 升温至 230, 保持 3 min 载气为高纯氦气, 流量为 1 ml / min, 保持 4 分钟, 以 10 ml / min 2 升至 1. 5 ml / min, 进样口温度均为 250, 不分流模式进样质谱条件接口温度 280,EI 电子原, 扫描范围 (M / Z)33 ~ 550amu, 电子能量 70ev, 离子源温度 :230, 采集方式为全扫描模式朱潘炜, 等 : 黄酒中挥发性和半挥发性成分检测固相微萃取条件的优化样品检测将 6 ml 的黄酒样品加入到 20 ml 顶空进样瓶中, 并加入 2 g NaCl, 用密封垫和铝帽进行密封, 然后在 60 水浴锅中预热 15 min, 通过固相萃取装置将老化过的萃取头插入顶空进样瓶中, 萃取头距样液 5 mm, 并在 60 恒温锅中保温 30 min, 将萃取头插入气相色谱仪进样口进行脱附 6 min, 重复做 2 次 2 结果与分析 2. 1 固相微萃取头的选择用于固相微萃取的萃取头有很多种, 如 PA, PDMS,PDMS DVB,CAR PDMS,CW DVB,DVB CAR PDMS 等, 而对酯类醛类醇类酮类酸类醚类芳香族化合物脂环烃类化合物杂环化合物和碳氢化合物等挥发性和半挥发性的香味成分的萃取, 较多研究者发现 DVB CAR PDMS 萃取头的萃取效果最好 [11 ~ 13] 本文就是对黄酒中的香味物质的研究, 所以就选用 DVB CAR PDMS 萃取头来进行分析, 不对各种萃取头进行比较分析 2. 2 萃取温度的选择 SPME 中样品的提取和富集是一个动力学过程, 样品中各相的分配系数决定着样品的萃取效率而样品的分配系数是一个热力学常数, 温度是其重要的影响参数升高温度会加快黄酒中风味物质吸附到萃取纤维表面, 但是 SPME 的表面吸附则是一个放热过程, 低温有利于反应的进行因此, 在选择萃取温度上, 不宜过高和过低, 本实验分别选择了和 70, 结果见图 1 色谱峰面积在 60 之前, 随着萃取温度的升高而增大, 但是超过 60 后, 呈下降趋势因此, 可以看出 60 为最佳的萃取温度 Fig. 1 图 1 萃取温度对萃取效果的影响 Effect of temperature on the extraction

3 354 生物技术进展 Current Biotechnology 2. 3 预热时间的选择在将萃取头置于顶空瓶前, 先将样品瓶置于 60 的超恒温水浴锅中, 预热不同的时间 5 min 10 min 15 min 和 20 min 在其他条件一定的情况下, 如下图 2 所示, 在 15 min 之前, 随着预热时间的升高, 色谱峰面积增加非常明显, 之后略有下降因此, 确定 15 min 为最佳预热时间 Fig. 4 图 4 酒添加量对萃取效果的影响 Effect of adding amount of rice wine on the Fig. 2 图 2 预热时间对萃取效果的影响 Effect of warm up time on the extraction 2. 4 萃取时间的选择影响萃取平衡时间的因素众多, 如样品溶质分配系数样品体积萃取头膜厚度以及风味物质的扩散速度等本实验在 60 恒温水浴条件下, 分别对样品萃取 25 min 30 min 35 min 和 40 min, 结果如图 3 在前 30 min, 萃取量随时间延长而有所增加 ; 而后则呈下降趋势因此本实验以 30min 作为萃取平衡时间 extraction 2. 6 盐种类的选择比较 3 种不同的盐对黄酒挥发性和半挥发性成分萃取效果的影响, 选取的 3 种盐分别是氯化钠 (NaCl) 碳酸钠 (Na 2 CO 3 ) 无水硫酸钠 (Na 2 SO 4 ) 结果显示, 氯化钠和无水硫酸钠对萃取效果的影响比较接近, 而碳酸钠的作用明显不如氯化钠和无水硫酸钠, 但是无水硫酸钠的成本比氯化钠的成本高出几倍, 所以选用氯化钠作为盐稀的盐 2. 7 盐添加量的选择加入无机盐的目的是为了提高溶液的离子强度, 从而增大涂层的萃取量本实验分别向 6 ml 黄酒样品中加入 1. 5 g 2. 0 g 2. 5 g 和 3 g NaCl 结果如图 5 所示, 样品峰面积先随着 NaCl 量的增加而增大, 当达到 2. 0 g 时达到最大值, 而后呈递减趋势这是因为当无机盐浓度过高时, 会降低风味物质的扩散速度, 延长平衡时间, 从而使峰面积降低因此, 本实验以 2. 0 g NaCl 作为盐的添加量, 来调节溶液的离子强度 Fig. 3 图 3 萃取时间对萃取效率的影响 Effect of time on the extraction 2. 5 酒添加量的选择样品含量对萃取效果的影响, 在 20 ml 顶空瓶中分别加入 4 ml 6 ml 8 ml 和 10 ml 酒样, 结果如图 4 所示, 酒添加量对萃取效果的影响不是非常的明显, 但添加 6 ml 时, 相对比较高, 所以选用 6 ml 作为实验的添加量图 5 离子强度对萃取效果的影响 Fig. 5 Effect of adding amount of salt on the extraction

4 2. 8 解析温度的选择按最优条件进行萃取之后, 依据厂商规定的 DVB / CAR / PDMS 萃取头温度范围 (230 ~ 270 ), 将气相色谱串联质谱的进样口温度依次设置成和 260 进行比较, 解析相同的时间, 结果如图 6 所示在 250 以下, 峰面积随着解析温度的升高而增加,250 时达到最大值, 之后又略有下降, 所以选用 250 作为解析温度 Fig. 6 图 6 解析温度对萃取效果的影响 Effect of desorption temperature on extraction 2. 9 解析温度的选择按照上述的最佳条件进行萃取, 而后在气相色谱串联质谱仪进样口进行解析考虑到萃取头的使用寿命及节约时间等因素, 本次实验选择的解析时间分别为 1 min 2 min 3 min 4 min 5 min 和 6 min, 其结果如图 7 所示当解析时间为 6 min 时, 色谱峰的面积最大, 其萃取头纤维上的挥发性成分解析最充分因此, 本次实验以 6 min 作为最佳的解析时间 Fig. 7 图 7 解析时间对萃取效果的影响 Effect of desorption time on the extraction of 朱潘炜, 等 : 黄酒中挥发性和半挥发性成分检测固相微萃取条件的优化最优条件的重复性各种化合物的重复性检验结果如下 : 醇类 8 8%, 醛类 5. 5%, 酯类 2. 6%, 酸类 2. 1%, 芳香族化合物 10. 4%, 总峰面积相对标准偏差为 5 7% 与其他研究者用不同的纤维萃取头涂料分析酒类挥发物得到的结论相似 3 讨论综上所述, 相对液 - 液萃取法等一些常用方法, 顶空固相微萃取 - 气相色谱 - 质谱联用法 (HS SPME GC MS) 在测定黄酒中挥发性和半挥发性成分方面, 具有分离效果好结果稳定检测成分多操作简单省时等优点, 特别是在色谱峰面积检测成分数量上具有较大优势, 是一种较适合黄酒成分检测的研究方法通过对影响萃取的各个因素分析, 得到 HS SPME GC MS 萃取黄酒香味成分的最佳条件 : 在 20 ml 顶空瓶中加入 2 0 g 固体 NaCl,6 ml 酒样, 萃取温度 60, 预热时间 15 min, 萃取时间 30 min, 进样口温度 250, 解析 6 min 为最佳分析条件参考文献 [1] 汪建国, 徐亮. 我国黄酒的特征及展望 [J]. 江苏调味副食品,2005,22(6):5-9. [2] 汪建国. 黄酒中色香味体的构成和来源浅析 [J]. 中国酿造,2004,4:6-11. [3] Pinho O,Ferreira I M,Santos L H. Method optimization by solid phase microextraction in combination with gas chromatog raphy with mass spectrometry for analysis of beer volatile frac tion[j]. J. Chromatogr. A,2006,1102(1-2):1-9. [4] Liu M,Zeng Z,Xiong B. Preparation of novel solid phase microextraction fibers by sol gel technology for headspace solid phase microextraction gas chromatographic analysis of aroma compounds in beer[j]. J. Chromatogr. A,2005,1065(1-2): [5] Zhao D,Tang J,Ding X. Analysis of volatile components during potherb mustard (Brassica juncea Coss. )pickle fermen tation using SPME GC MS[J]. LWT Food Sci. Technol., 2007,40:1-9. [6] 于爱梅, 徐岩, 王栋, 等. 发酵原料对苹果酒挥发性香气物质影响的分析 [J]. 中国农业科学,2006,39(4): [7] Wang L,Xu Y,Zhao G,et al.. Rapid analysis of flavor vola tiles in apple wine using headspace solid phase microextraction [J]. J. Inst. Brew.,2004,110(1):57-65.

5 356 生物技术进展 Current Biotechnology [8] Fan W,Xu Y,Yu A. Influence of oak chips geographical origin,toast Level,dosage and aging time on volatile com pounds of apple cider [J]. J. Inst. Brew,2006,112(3): [9] Martia M P,Mestres M,Sala C,et al.. Solid phase microex traction and gas chromatography olfactometry analysis of succes sively diluted samples. A new approach of the aroma extract dilution analysis applied to the characterization of wine aroma [J]. J. Agric. Food Chem.,2003,51: [10] 罗涛, 范文来, 郭翔, 等. 顶空固相微萃取 (HS SPME) 和气相色谱 - 质谱 (GC MS) 联用分析黄酒中挥发性和半挥发性微量成分 [J]. 酿酒科技,2007,6: [11] Saison D,De Schutter D P,Delvaux F,et al.. Optimisation of a complete method for the analysis of volatiles involved in the favour stability of beer by solid phase microextraction in combi nation with gas chromatography and mass spectrometry[j]. J. Chromatogr. A,2008,1190: [12] Mirhosseini H,Salmah Y,Nazimah S A H,et al.. Solid phase microextraction for headspace analysis of key volatile compounds in orange beverage emulsion[j]. Food Chem., 2007,105: [13] Luo T, Fan W, Xu Y. Characterization of volatile and semi volatile compounds in Chinese rice wines by headspace solid phase microextraction followed by gas chromatography mass spectrometry[j]. J. Inst. Brew.,2008,114(2):

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Microsoft Word 唐莹莹（白） 5 8 Vol. 5 No. 8 2014 8 Journal of Food Safety and Quality Aug., 2014 - 唐莹莹, 刘婷婷, 袁 * 建 (, 210046) 摘要 : 目的 - (GC-MS) 方法 (HS-SPME),, - (GC-MS) 结果 30/50 μm DVB/CAR/PDMS 60 60 min 3 min, GC-MS, ; 3- 结论关键词