.06,2016 绵羊血清里产生的羊种布菌 OMP31 抗体, 可以有效地抑制体内的绵羊附睾布菌, 证明羊种菌 OMP31 是一个保护性抗原, 因此 OMP31 被认为是适合大动物和人布病疫苗的候选抗原 [13] 前期研究发现, OMP31 多肽能刺激 B.melitensis 减毒活疫苗免疫绵羊产

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襄酆
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1 2016(06 上 ):7-11,282 羊布鲁氏杆菌 OMP31 的真核表达及其应用分析罗佩芳 1, 何作萍 1, 胡飞环 1, 黄建锋 1,2, 翁云层 1, 王文敬 1 1, 黎诚耀 (1. 南方医科大学输血医学系, 广州 ;2. 南方医科大学第一临床学院, 广州 ) 中图分类号 :S826;S 文献标识码 :A 文章编号 : (2016) 关键词 : 布鲁氏杆菌 ; 外膜蛋白 31(OMP31); 慢病毒系统 ; 真核表达 ; 细胞凋亡摘要 : 为了获得可在细胞内表达布鲁氏杆菌外膜蛋白 31(OMP31) 基因的表达载体和慢病毒, 试验从羊布鲁氏杆菌 M5-90 疫苗株 PCR 获得 OMP31 基因, 连接至 pzeroback/blunt 载体, 经双酶切鉴定测序鉴定正确的基因亚克隆到 phage-cmv-mcs-izsgreen 表达载体上, 双酶切鉴定, 构建含正确 OMP31 基因的表达载体 phage-omp31, 与包装质粒 pspax2 和包膜质粒 pmd2.g 共转染 293FT 细胞进行慢病毒 Lentivirus-OMP31 包装 ; 获得的 Lentivirus-OMP31 感染 293FT 细胞, 利用蛋白质印迹 (Western-blot) 和免疫荧光 (IFS) 鉴定 OMP31 蛋白的表达及其免疫原性 ;Lentivirus- OMP31 体外感染布鲁氏杆菌的宿主细胞模型单核细胞 THP-1 和人绒毛膜滋养层细胞 JEG-3, Western-blot 和 IFS 鉴定 OMP31 基因的表达, 并利用流式细胞 (FCM) 检测细胞凋亡情况结果表明 : 构建了能够在细胞内表达 OMP31 基因的真核表达载体 phage-omp31 和慢病毒 Lentivirus- OMP31, 二者感染细胞后表达的 OMP31 蛋白可与特异性抗体反应, 具有良好的抗原性经初步鉴定, OMP31 蛋白在 JEG -3 细胞内表达能引起细胞凋亡说明载体 phage-omp31 和慢病毒 Lentivirus-OMP31 可作为用于研究 OMP31 与布鲁氏杆菌感染相关性的试验材料布鲁氏菌病 ( 以下简称布病 ) 是由兼性胞内寄生的革兰氏阴性病原体布鲁氏杆菌 ( 以下简称布菌 ) 引起的人畜共患传染病, 是发展中国家和地区流行最广危害最大的人兽共患传染病之一 [1-3] 布菌优先在网状内皮系统巨噬细胞和怀孕动物的胚胎滋养层细胞中复制, 很难被宿主彻底清除 [4-5] 动物感染布病的主要表现为流产和睾丸炎, 人布病主要表现为波状热睾丸炎肝脾肿大心内膜炎关节炎以及脑膜炎等, 慢性感染可能对人体肝脏脾脏肾脏等重要器官重要关节神经系统甚至人体免疫系统都造成巨大损害 [2,6] 我国人间布病发病率早已超过十万分一, 成为布病重灾区中国疾病预防控制中心收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( ); 广东省科技计划项目 (2014A ); 大学生创新创业训练项目 ( ) 作者简介 : 罗佩芳 (1990- ), 女, 硕士研究生, 研究方向为布鲁氏杆菌感染机制, @qq.com. 通信作者 : 王文敬 (1977- ), 女, 教授, 博士, 硕士生导师, 研究方向为布鲁氏杆菌感染机制及其临床检测方法的建立, wenjingking77@126.com. : 本文英文题目摘要在参考文献后, 见第 11 页. (CDC) 公布,2014 年新增发病已达例, 死亡 2 例, 并以多且散的点状流行代替了大规模的爆发流行 (htp:// 因此, 必须更加重视我国人畜布病的防控工作布菌作为胞内病原菌, 其候选疫苗的主要标准是能够引起动物细胞免疫研究证实有效的 T 细胞免疫反应对布菌的清除有最重要作用, 因此大量的亚基 ( 重组蛋白 ) 疫苗和 DNA 疫苗研发出来, 但是事实证明这些疫苗的保护效果却远不如活减毒疫苗 [7] 发展安全有效的布菌疫苗的替代策略为使用转基因载体和非致病病原菌表达布菌抗原, 如大肠杆菌沙门氏菌苍白杆菌和塞姆利基森林病毒 (SFV) 均被用于体内表达布菌蛋白, 并能感染大部分的细胞且在胞内 + + 表达布菌蛋白, 使免疫动物产生了 Th1CD 4 和 CD 8 T 细胞抗布菌免疫反应 [7] 许多研究将外膜蛋白 (OMPs) 作为候选疫苗以及诊断抗原的研究重点外膜蛋白 OMP31 是布鲁氏杆菌高度保守的特异性蛋白, 并被证实为细胞外膜孔道蛋白 [8-10], 存在于除牛种之外其他所有的布菌种属, 且不同种间同源性高达 98% 以上 [11-12] OMP31 最初是从 B.melitensis 标准菌株 16M 中克隆表达的, 该蛋白能与所有感染布菌的人狗羊兔以及大鼠的血清发生反应在豚鼠或 7

2 .06,2016 绵羊血清里产生的羊种布菌 OMP31 抗体, 可以有效地抑制体内的绵羊附睾布菌, 证明羊种菌 OMP31 是一个保护性抗原, 因此 OMP31 被认为是适合大动物和人布病疫苗的候选抗原 [13] 前期研究发现, OMP31 多肽能刺激 B.melitensis 减毒活疫苗免疫绵羊产生特异性 T 细胞反应 [14] 本研究拟通过构建 OMP31 真核表达载体, 并获得能感染人宿主细胞并持续稳定表达 OMP31 蛋白的慢病毒, 初步研究布菌 OMP31 对细胞凋亡的作用, 以期为后续研究布菌蛋白在宿主细胞内作用机制及 OMP31 与布菌感染相关性研究提供试验材料 1 材料布菌 M5-90 疫苗株大肠杆菌 DH5α 质粒 phage-cmv-mcs-izsgreen 载体质粒 pspax2 质粒 pmd2.g, 南方医科大学输血医学系实验室保存 ;293FT 人外周血的单核细胞 THP-1 和人绒毛膜滋养层细胞 JEG-3, 南方医科大学输血医学系实验室冻存 ;OMP31 单克隆抗体 2C1, 南方医科大学输血医学系实验室制备 [13] ;T4DNA 连接酶快速连接试剂盒质粒提取试剂盒 dntp BestTaq 酶琼脂糖凝胶回收试剂盒 XbaⅠ BamH Ⅰ, 购自广州仪涛科学仪器有限公司 ;X-tremeGENEHPDNATransfec tionreagent, 购自上海罗氏制药有限公司 ; 蛋白质电泳分子质量标准 SM1811, 购自美国 Thermofisher 公司 ; 蛋白免疫印迹试验 (Western-blot) 显色液, 购自美国 Milipore 公司 ; 辣根过氧化物酶 (HRP) 羊抗鼠 IgG 抗体羊抗鼠 IgG+IgM 荧光抗体, 购自上海圣克鲁斯生物技术有限公司 ;DMEM 培养基胎牛血清, 购自美国康宁公司 ; 非必需氨基酸 L- 谷氨酰胺胰蛋白酶 Opti-MEM, 购自美国 Lifetechnologies 公司 2 方法 2.1 目的基因的扩增与克隆根据布菌 M5-90 菌株 OMP31 基因序列, 利用 PrimerPremier5.0 软件设计引物, 引入 XbaⅠ BamH Ⅰ 作为酶切位点, 由上海英骏生物技术有限公司合成以布鲁氏杆菌 M5-90 菌株基因组 DNA 为模板,BestTaq 聚合酶扩增 OMP31 基因, 序列为 : 上游引物 5 -GCTCTAGACGCCACCATGAAATCCGTAATT- 3, 下游引物 5 -CGGGATCCTTAGAACTTGTAGT TCAG-3 ( 下画线部分为酶切位点 ) PCR 反应体系为 (25μL):DNA1μL, 上下游引物 (10μmol/L) 各 1μL,dNTP(2.5mmol/l)2μL,10 BestTaqBuf er( 含 Mg 2+ )2.5μL,BestTaq 酶 (5U/μL)0.5μL, ddh 2 O17μL 扩增条件为 :95 预变性 4min; 94 变性 1min;56 退火 1min,72 延伸 1min, 共 30 个循环 ;72 延伸 10min 扩增产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定, 割胶纯化目的基因回收产物连至 pzeroback/blunt 载体上, 并转化 DH5α 感受态细 8 胞 PCR 鉴定阳性克隆 pzeroback/blunt-omp31 提取质粒, 进行 XbaⅠ 和 BamH Ⅰ 双酶切鉴定测序正确的质粒与 phage-cmv-mcs-izsgreen 载体一同进行 XbaⅠ 和 BamHⅠ 双酶切, 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定, 正确的酶切产物经割胶纯化, OMP31 目的片段被连接到 phage-cmv-mcs- IZsGreen 载体上, 命名为 phage-omp 含 OMP31 目的基因的重组慢病毒的包装取双酶切鉴定正确的 phage-omp31 质粒, 与包装质粒 pspax2 和包膜质粒 pmd2.g 共转染状态良好细胞密度为 80% ~90% 的 293FT 细胞转染时, 按一定比例往 Opti-MEM 中加入质粒 phage- OMP31 pspax2 以及 pmd2.g, 再加入 X-tremeGENE HPDNATransfectionReagent, 混匀后静置 20min, 然后把液体加到培养瓶中, 转染后 8~10h 更换为新鲜培养基 ; 转染 48~72h 后, 在倒置荧光显微镜下观察细胞发光情况, 并适时拍照确认转染成功后, 收集含病毒的细胞培养液,3000 g 离心 15min 去除细胞碎片 ; 取上清液, 即获得含 OMP31 目的基因的重组慢病毒 (Lentivirus-OMP31), 分装后于 -80 冻存, 备用 ; 同时用质粒 phage-cmv -MCS-IZsGreen pspax2 以及 pmd2.g, 制备携带报告基因而不含 OMP31 目的基因的对照病毒 (Lentivirus-IZsGreen), 分装于 -80 冻存, 备用 2.3 OMP31 基因在细胞中的表达 Lentivirus-OMP31 感染细胞后 OMP31 的表达, 感染前 16h 将 293FT THP-1 JEG-3 细胞分别接种于 6 孔板中, 然后以相同量的 Lentivirus-OMP31 和阴性对照 Lentivirus-IZsGreen 感染 293FT 细胞 phage-omp31 转染 293FT 细胞, 步骤同 2.2 分别在 72h 后提取感染和转染的细胞总蛋白, 以抗 OMP31 的单克隆抗体 2C1 进行 Western-blot 鉴定, 方法及步骤参见参考文献 [13] 同时以抗 OMP31 的单克隆抗体 2C1 进行免疫荧光技术 (IFS) 鉴定 OMP31 在 293FT JEG-3 细胞中的表达, 方法及步骤参见参考文献 [15] 2.4 OMP31 诱导细胞凋亡的检测胞内蛋白对 JEG-3 细胞凋亡作用的检测 : 铺板稳定表达 OMP31 的 JEG-3 细胞, 培养 48h 后使用 BDPEAnnexinⅤ ApoptosisDetectionKitⅠ 进行流式检测细胞凋亡情况 : 收集细胞, 加入 5μLPE AnnexinⅤ 和 5μL7-ADD, 室温孵育 15min, 在 1h 内上机检测胞外 OMP31 对细胞凋亡作用的检测 : 将 6μg 重组蛋白 romp31 与细胞共孵育 24,48,72h 后使用 BD PEAnnexinⅤ ApoptosisDetectionKitⅠ 进行流式检测细胞凋亡情况, 步骤同胞内蛋白 3 结果

3 总第 503 期 3.1 OMP31 基因的扩增及 pzeroback/blunt- OMP31 鉴定结果 PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定, 可见与预期 730bp 相符的清晰条带 ( 见图 1A) 提取 pzer oback/blunt-omp31 菌液经 PCR 鉴定为阳性, 经过测序发现其与 GenBank 中序列 ID 为 gi 序列一致用 XbaⅠ 和 BamHⅠ 双酶切 pzeroback/ blunt-omp31, 电泳鉴定正确 ( 见图 1B) 图 1 OMP31 基因扩增克隆质粒及重组表达载体的鉴定结果 Fig.1 IdentificationresultsoftheamplificationofOMP31gene,theclonedplasmidand recombinantexpresionvector 3.2 重组质粒 phage-omp31 的鉴定结果重组质粒 phage-omp31 用 XbaⅠ 和 BamH Ⅰ 双酶切后, 经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测, 结果表明产生 2 个片段, 分别为慢病毒载体片段和 OMP31 基因片段 ( 见图 1C), 表明 phage-omp31 构建成功 3.3 真核表达载体及慢病毒的包装和鉴定结果利用质粒转染试剂将慢病毒包装质粒表达系统共转染 293FT 细胞,60h 后通过荧光显微镜观察, 发现约 90% 的 293FT 细胞表达 GFP( 见 282 页彩图 2A); 收集细胞培养上清液, 可获得效价 μg/ml 以上的重组慢病毒 Lentivirus-OMP31 以重组慢病毒 Lentivirus-OMP31 感染 293FT 细胞 JEG-3 细胞和 THP-1 细胞,48h 后即可观察到约 80% 的 293FT 细胞,JEG-3 细胞和 THP-1 细胞也有 GFP 表达 ( 见 282 页彩图 2B) 质粒转染和慢病毒感染 72h 后的 293FT 细胞总蛋白进行 Western-blot, 结果表明在 31ku 附近处有特异性条带 ( 见 282 页彩图 2C) 慢病毒感染 96h 后的 293FT JEG-3 和 THP-1 细胞蛋白进行 Western-blot, 结果表明在 31ku 附近处均有特异性条带 ( 见 282 页彩图 2D) 同时对上述感染细胞进行免疫荧光检测, 结果都能和抗 OMP31 单克隆抗体反应呈阳性 ( 见 282 页彩图 2E) 3.4 细胞凋亡的检测结果 Lentivirus-OMP31 和 Lentivirus-IZsGreen 稳定感染 JEG-3 细胞铺板 48h 后, 进行流式细胞检测, 发现 OMP31 蛋白在 JEG-3 细胞内表达能诱导细胞凋亡 ( 见图 3A) OMP31 蛋白与 JEG-3 细胞分别共孵育 24,48,72h 后, 流式细胞检测结果表明,OMP31 蛋白在 JEG-3 细胞外刺激细胞并不能诱导细胞凋亡 ( 见图 3B) 图 3 JEG-3 细胞凋亡率检测 Fig.3 DetectionofJEG-3celapoptosisrate 9

4 .06, 讨论布菌引起的布病是一种严重威胁人类和动物生命健康的人畜共患慢性传染病在自然感染状态下, 由于巨噬细胞表达高丰度的布菌模式识别受体 TLRs, 因此成为布菌感染的主要靶细胞这种兼性胞内病原菌可以逃避中性粒细胞捕杀, 在巨噬细胞和吞噬细胞中复制, 并长期与宿主细胞相互作用, 引起人与动物的慢性感染 [16] 近几年, 中国人布病正以每年 10% 的比例增长据中国疾病预防控制中心公布,2014 年布病发病率与 2013 年同期相比增幅高达 31.48% 有研究结果表明, 屠宰场和食品加工厂的工人布病患病率明显高于其他职业者, 防治形势日益严峻 [17-18] 研究表明, 布菌的很多 OMPs 既有毒力因子的特性, 又担负免疫保护的抗原角色 OMP31 被认为适合大动物和人布病疫苗的获选抗原 [12-13] 在布菌感染机制研究方面, 王远志等运用酵母双杂交方法证明 OMP31 与巨噬细胞的趋化因子 (C-X-C) 配体 16 有相互作用, 并利用 RNA 感染技术发现布菌在胞内生存能力明显降低, 感染的巨噬细胞凋亡速度加快说明与 OMP31 相互作用的宿主因子在布菌的胞内寄生中起重要作用 [19] 目前, 研究者主要利用体外感染细胞模型的方式研究布菌感染机制, 如已报道的猪种布菌感染人单核细胞后, 能在细胞内存活并抑制细胞凋亡, 而脂多糖却并未参与凋亡调控, 说明在感染期间释放了可溶性介质并参与了凋亡调控, 但尚未清楚其他哪些布菌成分引起免疫耐受或抑制单核细胞凋亡 [20] 针对布菌某个蛋白成分在感染中所起的作用, 虽然可以通过原核表达布鲁氏杆菌蛋白基因获得纯度较高的蛋白, 但是将蛋白导入细胞或进行相互作用研究存在实际的操作瓶颈本研究通过使用真核表达载体和重组慢病毒系统进行羊种布菌 OMP31 基因的蛋白表达, 可以做到仅表达布菌 OMP31 一个外膜蛋白, 排除了其他如 OMP10 OMP19 等外膜蛋白的影响, 而且直接在细胞内表达目的蛋白, 解决了使蛋白进入细胞内的技术瓶颈 [21-22] 众所周知, 自然状态下布菌的宿主细胞主要是巨噬细胞和滋养层细胞, 本研究采用的 THP-1 和 JEG-3 分别是体外细胞试验常用的上述二者的模型, 构建的表达载体 phage -OMP31 和重组慢病毒 Lentivirus-OMP31 都能高效转染和感染这些细胞, 并成功在细胞内表达含量较高的 OMP31 蛋白, 并能特异性识别 OMP31 单克隆抗体, 具有良好的抗原性尤其重组慢病毒可以将目的基因重组到细胞基因组, 避免了质粒转染表达蛋白会随着细胞的传代进而逐渐丢失目的基因的问题对于布菌的宿主细胞模型 JEG-3,OMP31 在胞内表达诱导细胞凋亡, 提示胞内外的不同形式的蛋白表达, OMP31 发挥的功能是有差异的, 真核表达的蛋白由 10 于更接近于布菌感染后的真实情况, 更适合作为研究布菌感染宿主细胞与布菌蛋白相关性经试验证实, romp31 没有引起 JEG-3 的凋亡, 分析其原因, 一是原核表达会改变蛋白本身结构特点, 而真核表达的蛋白更接近于布菌感染后真实的蛋白表达情况 ; 二是由于原核表达的蛋白都经过纯化, 不同纯化方法影响蛋白的纯度, 含有的非目的蛋白的杂质也会对细胞凋亡的检测产生影响因此, 无论真核表达载体 phage- OMP31, 还是感染性良好的重组慢病毒系统 Lentivir us-omp31 都具有应用价值, 可为 OMP31 蛋白特性及其在布菌感染过程中毒力或免疫功能的相关研究提供良好的试验材料参考文献 : [1] HASANJANIROUSHANMR,EBRAHIMPOURS.Humanbrucel losis:anoverview[j].caspianjinternalmed,2015,6(1): [2] RAMIN B,MACPHERSON P.Humanbrucelosis[J].BMJ, 2010,341:c4545. [3] JIAP,JOYNERA.HumanbrucelosisoccurencesinInnerMongo lia,china:a spatio-temporaldistributionandecologicalniche modelingapproach[j].bmcinfectdis,2015(15):36. [4] MORENOE,MORIYONI.Brucelamelitensis:anastybugwith hiddencredentialsforvirulence[j].pnas,2002,99(1):1-3. [5] GODFROIDJ,CLOECKAERTA,LIAUTARDJP,etal.Fromthe discoveryofthemaltafever sagenttothediscoveryofamarine mammalreservoir,brucelosishascontinuouslybeenare-emerging zoonosis[j].vetres,2005,36(3): [6] MELTZER E,SIDIY,SMOLEN G,etal.Sexualytransmited brucelosisinhumans[j].clininfectdis,2010,51(2):e12- e15. [7] TABYNOVK,SANSYZBAYA,KYDYRBAYEVZ,etal.Influen zaviralvectorsexpresingthebrucelaomp16orl7/l12proteins asvaccinesagainstb.abortusinfection[j].virolj,2014,11 (7): [8] VIZCAINON,CLOECKAERTA,ZYGMUNTMS,etal.Cloning, nucleotidesequence, and expresion ofthe Brucela melitensis omp31genecodingforanimmunogenicmajoroutermembranepro tein[j].infectimmun,1996,64(9): [9] CLOECKAERTA,VERGERJM,GRAYONM,etal.Molecular andimmunologicalcharacterizationofthemajoroutermembranepro teinsofbrucela[j].femsmicrobiollet,1996,145(1):1-8. [10] GOLSHANIM,RAFATIS,DASHTIA,etal.Vaccinationwithre combinantl7/l12-truncatedomp31proteininducesprotectiona gainstbrucelainfectioninbalb/cmice[j].molimmunol,2015, 65(2): [11] GHASEMIA,JEDDI-TEHRANIM,MAUTNERJ,etal.Immu nizationofmicewithanovelrecombinantmolecularchaperonconfers protectionagainstbrucelamelitensisinfection[j].vaccine,2014, 32(49): [12] 骆利敏, 崔步云, 芮勇宇, 等. 布鲁菌脉冲场凝胶电泳图谱分型研究 [J]. 中华微生物学和免疫学杂志,2005,25(12): [13] 吴静波, 丘金浪, 逯光文, 等. 羊布鲁菌 OMP31 蛋白基因表达及抗原性分析 [J]. 中国公共卫生,2013,29(4): [14] WANGW,WUJ,QIAOJ,etal.Evaluationofhumoralandcelu

5 总第 503 期 larimmuneresponsestobp26andomp31epitopesintheatenuated Brucelamelitensisvaccinatedsheep[J].Vaccine,2014,32(7): [15] BIANY,ZHAOS,ZHUS,etal.Significanceofmonoclonalanti bodiesagainsttheconservedepitopeswithinnon-structuralprotein 3helicaseofhepatitisC virus[j].plosone,2013,8(7): e [16]PEIJW,DINGXH,FANYP,etal.Tol-likereceptorsarecriti calforclearanceofbrucelaandplaydiferentrolesindevelopment ofadaptiveimmunityfolowingaerosolchalengeinmice[j].front CelInfectMicrobiol,2012(2):115. [17]WANGW,LIAOQ,WUX,etal.Potentialriskofbloodtransfu sion-transmitedbrucelosisinanendemicareaofchina[j]. Transfusion,2015,55(3): [18]MORENOE.Retrospectiveandprospectiveperspectivesonzoonotic brucelosis[j].frontmicrobiol,2014(5):213. 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(009 ) 檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯 ( 上接第 6 页 ) CloningandexpresionanalysisofVEGF-Dgenefrom sheep ZHANGLichun 1,MAHuihai 1,CAOYang 1,SUNFuliang 2,ZHAIBo 1,ZHANGMingxin 1,JINHaiguo 1 (1.BranchofAnimalHusbandry,JilinAcademyofAgriculturalScience,Gongzhuling136100,China;2.ColegeofAgriculture, YanbianUniversity,Yanji133002,China) Keywords:vascularendothelialgrowthfactorD(VEGF-D);Xinjifine-woolsheep;smal-tailedHansheep;genecloning;expresiona nalysis [20] GROSSA,TERRAZAA,OUAHRANI-BETTACHES,etal.In vitrobrucelasuisinfectionpreventstheprogrammedceldeathof humanmonocyticcels[j].infectimmun,2000,68(1): Abstract:ToclonethevascularendothelialgrowthfactorD(VEGF-D)genesfromsmal-tailedHansheepandXinjifine-woolsheep,and detectthepolymorphism(snp)anddistributionlawoftisueexpresionpatern,andexplorewhethertherewasanecesaryconnectionbetween thevegf-dgenesanddiferenceinthewooltraitsofthetwovarietisofsheep,totalrnaswereextractedfromskinanddiferenttisuesin smal-tailedhansheepandxinjifine-woolsheep.thevegf-dgeneswereclonedbyrt-pcrandusedforbioinformaticsanalysis,and theexpresiondiferenceofvegf-dgenesbetweentwovarietiesofsheepwasanalyzedbyqrt-pcr.theresultsshowedthatthevegf- Dgenesfromsmal-tailedHansheepandXinjifinewoolsheepweresuccesfulycloned.TheVEGF-Dgeneswere1487bpinlength,and containedcompleteopenreadingframe(orf)of1065bp,encodingforaproteinof354aminoacids.thesheepvegf-dgenesharedhigh erhomologywithbovinevegf-dgenewithcloserkinshipatbothnucleotideacidandaminoacidlevels.thereweresomepolymorphicsites inthevegf-dgenesbetweensmal-tailedhansheepandxinjifine-woolsheep,andthecorespondingmutationsitescausedthevariation inaminoacids,suggestingthatsheepvegf-dgenesbetweentwovarietiesofsheepwereunderhighselectionpresureinevolution.above mutationsitesweremainlylocatedonbothsidesofpdgfdomains,suggestingthatthesemutationsitesmightregulatethevegf-dfunctionby influencingthehydrolysisprocesofvegf-dprotein.thevegf-dgeneswereexpresedinvarioustisuesinsheep,butwerehighlyex presedinlungandspleen.theexpresionpaternsofthevegf-dgenesfromskintisueofsheepindiferentseasonswerediferent,which mainlydisplayedhighlevelexpresionincoldseasonandgradualydecreasedexpresionwithrisingtemperature.theresultsindicatethatthere ishigherpolymorphisminthevegf-dgenebetweensmal-tailedhansheepandxinjifine-woolsheep,anddiferenttisuesandorgans havesimilarexpresiondistributionwithskintisuesindiferentseasons. (009) 11

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽