- 西安交通大学学报 医学版 第 卷 舌鳞状细胞癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一 占全身癌的 占头颈部癌的 + ++ 占口腔癌的 + 居口腔癌之首 近年来舌癌的发病率越来越高 患者的生存率却无明显改善 人们对其关注度也随之增加 基因治疗已经成为对放化疗效果不满意的肿瘤患者的一种新的治疗探索 白细胞介

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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'&!& 基础研究 基因联合二萜生物碱对舌鳞癌细胞的增殖抑制与促凋亡作用 胡雅琳 侯美玲 郑文娇 张泽南 何韶衡 李志刚 锦州医科大学 研究生院 附属第一医院变态反应与临床免疫研究中心 附属第二医院口腔修复科 辽宁锦州 摘要 目的 探讨人 #$% 基因联合二萜生物碱对舌鳞癌细胞 &' 的增殖抑制与促凋亡作用 方法 构建 % %#$% 质粒 转染舌鳞癌细胞 &' 荧光显微镜下观察质粒的转染效率 && 检测 %#$% 联合二萜生物碱对舌鳞癌细胞 &' 生长的影响 流式细胞术检测细胞凋亡情况 蛋白质免疫印迹法检测细胞信号调节激酶 )*%)* 的蛋白水平 结果 转染 %#$% 的舌鳞癌细胞 &' 较未转染细胞凋亡数增加 差异有统计学意义 +,-./.$ 二萜生物碱培养舌鳞癌细胞 随浓度增加 细胞凋亡数增多 差异有统计学意义 +#$% 与二萜生物碱联合对 &' 细胞作用, 后 较单独使用二萜生物碱的增殖抑制作用明显 且呈浓度依赖性 差异有统计学意义 +#$% 联合二萜生物碱还可剂量依赖性地降低 %)* 的蛋白水平 结论 %#$% 联合二萜生物碱对舌鳞癌细胞 &' 有协同抑制作用 关键词 白细胞介素 #$% 二萜生物碱 联合用药 舌鳞状细胞癌 增殖抑制 凋亡中图分类号 0- 文献标志码 ) -+!"#!$"!%&!"''!"!!"!&%!%'!'"&%!'&&! ''%!' % "%/ 2 3"% 2)2"% 5%"/ $#2%// 6!"5)"6/7#..! /0"'"67""6" 6')8"'9"6."86''"5" )8" ':;! " "6':;!7 )*+)##")"*"+" *""#**,#####& - ##"#*"*./0'"#",#####& "### #)"#" ###* ### )"*"+" ## )"#"! "**)"#" ) # & -)*"*#"++ *+&,###)##"*./0'"# #"**#*" )#"#&+&##,##")"*"+" ##&&,"&- "# #"**""*" &+& #" ) "*" +", "# ## ##"*"#*")"*"+" &+&)# #""#**+""*" & #*./0' ""*"+"##),#####&,-.* + "*"+"#*,### *** 收稿日期 -%% 修回日期 %%- 基金项目 辽宁医学院校长基金 % 奥鸿博泽研究生科技创新基金 )+ &"6"'"! 8$/ "7"/"%)/2"6!"&" /#! )+ 通讯作者 何韶衡 %.'"/".. 李志刚 %.2:$-. 优先出版 *"*.'"-0.%%!"!

2 - 西安交通大学学报 医学版 第 卷 舌鳞状细胞癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一 占全身癌的 占头颈部癌的 + ++ 占口腔癌的 + 居口腔癌之首 近年来舌癌的发病率越来越高 患者的生存率却无明显改善 人们对其关注度也随之增加 基因治疗已经成为对放化疗效果不满意的肿瘤患者的一种新的治疗探索 白细胞介素 "6"!*%#$% 又名 #% 诱导因子 是近年来发现的一种细胞因子 主要由激活的单核细胞和巨噬细胞产生 #$% 是一种多效的致炎细胞因子 因其多效的生物学活性 在多种动物模型中 如肺癌 乳腺癌 肉瘤 黑色素瘤中 均表现出显著的抗瘤效果 体内外研究表明 一些中药及其活性成分可抑制肿瘤细胞的生长与增殖 且 其抑制作用较安全 高效 乌头属二萜生物碱对采用化疗的病例能增加其化疗药物的敏感性 在抗耐药, 肿瘤方面具有潜在的研究价值 本实验将 #$% 与二萜生物碱联合作用于舌癌细胞 &' 旨在探究基因与药物联合对肿瘤的抑制作用 材料与方法 材料 质粒 &' 舌癌细胞株 乌头属二萜生物碱由本实验室提供 0#-, 培养基购自美国 76/ 胎牛血清购自美国 9+ 购自北京天根科技有限公司 0)'!' 反转录试剂盒 70 试剂 质粒提取试剂盒 9) 胶回收试剂盒 9$9).6*"6 限制性核酸内切酶 &,9) 连接酶 蛋白标记物均购自大连宝生物公司 引物由上海杰李生物有限公司合成 凋亡试剂盒购自美国 9 公司 噻唑兰 && 及 7) 蛋白定量试剂盒购自北京索莱宝公司 0#) 裂解液购自南京诺维赞生物科技有限公司 )*%)* 的多克隆 抗及辣根过氧化酶标记的 抗购自美国 576!; 公司 / 方法 / 引物设计与合成 根据 " * 中 #$% 9) 序列 使用 6."6+ 软件设计并合成 #$% 基因特异性引物 上游引物 + 端设计 酶切位点 上游引物序列 +%777&7)77)77)&% 7&7&))77)))7))&% 下游引物的 + 端设计 酶切位点 下游引物序列 +% 77)&777))&&&&&&7&&)&7% //#$% 基因的扩增和重组表达质粒的构建 提取新鲜血液中单个核淋巴细胞 提取总 0) 依照 &0 逆转录试剂盒说明将其反转录成 9) 反 应条件为 < +. + < +' 以 9) 作为模板 70 扩增 #$% 基因 9)$ 上下游引物各 $=70 +$ 去离子水补齐 +$ 反应条件,< 预变性 +.,< 变性 '+< 退火,+'< 延伸,+'+ 个循环后 < 延伸. 70 产物经 /$ 琼脂糖凝胶电泳检测正确后 用 9) 凝胶回收试剂盒对目的片段纯化回收 70 回收产物与 空载体分别进行双酶切反应 各 $=!8"6+$ 目的片段 +$ 去离子水补齐 +$< 反应, 酶切产物经 /$ 琼脂糖凝胶电泳检测回收后 以目的片段和 载体按照 > 进行连接 % 载体 +$ 目的基因产物 $=&, 连接酶!8"6+$&, 连接酶 $ 去离子水补齐 +$- < 连接过夜 连接产物转化入 9+ 感受态细胞 涂于 的固体 $ 琼脂培养板上 < 培养过夜 次日挑取单克隆扩大培养后抽提质粒 经 双酶切鉴定正确后 9) 测序再次验证其准确性 /0 细胞转染 &' 细胞分别以 += + 个 孔 += 个 孔的密度接种于 - 孔板与 - 孔板中 使用无血清培养基稀释 %#$% 与 $% 8"." 试剂 室温孵育 +. 混合稀释的 9) 和 $8"." 室温孵育. 后直接加入到每个孔中 并在 <+.$$ 7 + 湿度条件下进行培养 荧光显微镜观察转染效率 /&& 实验检测细胞增殖抑制率 将对数期的 &' 细胞按 += 个 孔接种于 - 孔板 设立阴性对照组 未处理 &' 细胞 单独二萜生物碱组,-./.$ 组 #$% 组及联合组 #$% 转染, 后加二萜生物碱 分为 #$%./.$#$%,./.$#$%-./.$ 组 每组设 个复孔 转染, 后加药 +.$$7 < 继续培养, 每孔加入 $ 血清培养液和 $ && 溶液 +./$ 继续培养, 吸去上清液 每孔加入 +$ 二甲基亚砜 95 振荡. 待甲 结晶完全溶解后 用酶标仪在,. 波长下测定各孔吸光度 ) 值 计算细胞生长增殖抑制率 增殖率?@ 实验组 ), 值 空白对照组 ), 值 = / 流式细胞术检测药物对细胞的凋亡作用 调整对数生长期的 &' 细胞 以 += + 个 孔的密度接种于 - 孔培养板 分组同 && 转染, 加药 +.$$7 < 继续培养, 分别收集每孔上清!"!

3 期 胡雅琳 侯美玲 郑文娇 等 #$% 基因联合二萜生物碱对舌鳞癌细胞的增殖抑制与促凋亡作用 中的细胞并用胰酶消化下所有贴壁细胞 6. 离心 -. 弃去培养液 染色缓冲液洗涤 次 $= 染色缓冲液重悬细胞 每管加入 +$) % " A% 和 +$%))9 抗体 混匀后室温下避光孵育 离心 +. 洗去非特异性结合抗体,$= 染色缓冲液重悬细胞 流式细胞仪检测 采用 8 软件分析细胞凋亡率 /3"'"6 实验检测 )*%)* 的表达 调整对数生长期的 &' 细胞 以 += + 个 孔的密度接种于 - 孔培养板 分组同 && 细胞以预冷 5 洗 遍 加入 0#) 细胞裂解液提取细胞总蛋白 7) 法测定蛋白浓度 取 / 总蛋白 行 595% 聚丙烯酰胺凝胶电泳 待电泳完成后电转移至 A9 膜 /$5) 封闭 加 )*%)* 的 抗,< 孵育过夜 &5& 充分洗膜后 以 0 标记的 抗室温孵育 &5& 洗膜后 7$ 发光法显色后 #5 凝胶图像分析系统拍照并分析处理 0 统计学处理 以上实验均至少重复 次 采用 555 统计软件处理数据 计量资料以均数 B 标准差表示 两组间比较采用 检验 多组间比较采用方差分析 以 + 为差异有统计学意义 / 结 果 /+* 扩增目的片段及鉴定 70 扩增产物经 /$ 的琼脂糖凝胶电泳检测 #$% 基因在, 处有特异性条带 大小与预期相符 图 图 的 +* 扩增结果 /70.8 6"'!8#$%/"" 9$ 6*"6#$%"" %#$% 重组质粒酶切鉴定及测序 重组质粒经 双酶切 /$ 的琼脂糖凝胶电泳检测在, 处可见 #$% 条带 经酶切鉴定及测序 结果正确无误 得到成功构建的 % %#$% 重组质粒 图 图 / 重组质粒的双酶切鉴定 /#"8 86".'.6"'6 ";."/"' 9$ 6*"6%#$%%#$% // 转染及各组细胞形态学的变化 荧光显微镜下观察 转染, 后约 + 的细胞发出绿色荧光 空载质粒对细胞凋亡几乎无影响 加入二萜生物碱后可以看到,./.$ 浓度下细胞形态有所改变 密度变小 其中,./.$ 浓度下的细胞变形更为严重 -./.$ 细胞明显减少 且加入 #$% 组的细胞比单独二萜生物碱组细胞减少明显 图 /0 流式细胞术检测细胞的凋亡情况 药物作用 &' 细胞, 后 与空白对照组相比 二萜生物碱组,-./.$#$% 组及联合用药组 #$%./.$#$%,./.$#$%-./.$ 细胞凋亡均明显 图, 当药物浓度增加到 -./.$ 时 细胞凋亡率较对照组增加明显 联合组对诱导 &' 细胞凋亡的作用明显强于单独二萜生物碱组 和 #$% 组 + 图 + /)) 法检测细胞增殖抑制率结果 处理后各时段实验组细胞的生长增殖出现不同程度的抑制 空白对照组舌癌细胞增殖活跃 不同浓度的 #$% 联合二萜生物碱组与同时间点的未转染 #$% 组比较差异均有统计学意义 均 联合组与单独 #$% 组比较 差异有统计学意义 且不同浓度二萜生物碱联合 #$% 各组间比较 差异也有统计学意义 均 结果表明 #$% 联合二萜生物碱能明显抑制舌癌细胞生长 图 - /.% 检测 & 的表达结果 结果显示 在舌癌细胞 &' 中可以看到空白对照组的细胞条带最清晰 在二萜生物碱组内 随浓度增大,-./.$%)* 的表达降低 且在联合用药组内 随药物浓度增大 %)* 的表达较单独使用二萜生物碱表达更低 而在所有组内总 )* 的水平未见明显变化 图!"!

4 西 安 交 通 大 学 学 报!医 学 版 " # %" " 第!" 卷 图 H"!" # $% 转染 A+ + 9并加入不同浓度二萜生物碱后的细胞图像 =!U M MF:G: 56 7 %" :29-89 ::2-2 R2 2 : R29R -: M B: M R -9!a#$" G+ )2R 图 I" 各组药物对 A+ + 9细胞的促凋亡作用 = D; 9R : 'G R3)R 3G9 2) RFR 2G:)R) R 9 9R 89 : G+ 效果'与此同时&化疗药物多种毒副作用又很大程度 H" 讨 "" 论 上限制了临床上对舌癌的治疗 )E*'因此&多渠道探 索 舌癌是口腔颌面部最为常见的恶性肿瘤&目前尽 管采用了扩大根治性手术和辅助放射治疗&但治疗效 果欠佳且患者预后较差 ) C* '近些年&肿瘤治疗在 以手 术和放疗的基础上&逐 步 引 入 化 学 治 疗&取 得 了 一 定 治疗癌症的新方法十分必要' 567 %" 是一种 复 杂 的 多 功 能 细 胞 因 子& 567 %" 既 能促进 8 细 胞 和?_ 细 胞 产 生 5?= 7# 56 7 # 和 <@7 同时能增强 8' US= 等细胞因子& %细胞和?_ 细胞表达 $$***+ $$.//0+ ' -./0+ 2%' / )#, )#,

5 期 胡雅琳 侯美玲 郑文娇 等 #$% 基因联合二萜生物碱对舌鳞癌细胞的增殖抑制与促凋亡作用 图 流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率 /+ )''6""""8."6 " /6! 图 不同浓度二萜生物碱联合 对 )' 细胞增殖的影响 /-8"'8. 8%#$%"6% "*' "68"6 8&' 图 蛋白免疫印迹检测实验各组蛋白的表达 /&"6" "6"'' """ 3"'"6 "/6! ' 配体 从而介导细胞毒作用 而且它还能促进 & 细胞的发育 有研究表明 将编码细胞因子的基因导入肿瘤细胞构建肿瘤疫苗 经过处理后失去致癌性 而保存分泌细胞因子的能力 并且能在局部产 生大量细胞因子 从而诱导细胞毒性细胞 7&$ 等的活性 显著增强机体的抗肿瘤免疫 本实验将 #$% 转染入舌癌细胞 &' 中 流式细胞术结果显示舌癌细胞的凋亡率较未转染 #$% 的细胞有所增高 && 结果提示 #$% 有一定抑制舌癌增殖 活性 本结果与刘玮玮等关于 #$% 可通过多种途径发挥抗舌癌细胞研究相符 体内外研究表明 一些中药及其活性成分可抑制肿瘤细胞的生长与增殖 且其抑制作用较安全 高 效 二萜生物碱种类多 来源广 生物活性较强 具有多种药理作用 其中 77% 二萜生物碱主要通过抑制肿瘤细胞增殖 促进细胞凋亡 干扰细胞周期 逆转耐药等多种途径抑制肿瘤细胞生长 有良好 % 的抗肿瘤活性 有研究显示 二萜生物碱对人结肠癌细胞株 7&%+ 人肺癌细胞株 )+, 和人乳腺 %, 癌细胞株 7% 表现出较强的增殖抑制作用 并且其可作为制备抗宫颈癌 结肠癌和黑色素瘤的化 + 疗药物的良好候选化合物 以免疫组化法测定乌头碱作用后 细胞 %/ 蛋白阳性表达率 可见 %/ 蛋白表达显著降低 验证乌头碱逆转肿瘤多药 - 耐药效应 本研究通过预实验探索出乌头属二萜生物碱对舌癌细胞的有效作用浓度在./.$ 间 将二萜生物碱配制成,-./.$ 并作用于舌癌细胞 &' 流式细胞术及 && 结果分析显示 细胞凋亡率随二萜生物碱浓度增高而增大 提示二萜生物碱具有体外抗舌鳞癌细胞生长的作用 其中在,./.$ 浓度时细胞凋亡率较平缓 -./.$ 时凋亡率幅度突然增大 据此 我们推测细胞在低浓度二萜生物碱时细胞可耐受 浓度增高时达到舌癌细胞最大耐受能力后细胞凋亡率增大 #)*.&0 通路具有调节细胞生长 增殖 促进细胞周期进展以及参与血管形成等多种功 能 是抑制细胞凋亡的主要信号途径 该通路调节肿瘤细胞的增殖和存活 其活性异常不仅能导致细胞恶性转化 而且与肿瘤细胞的迁移 粘附 肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关 细胞内活化的 # 的一种重要的功能就是抑制程序性细胞死亡 而 )* 就是介导 # 依赖细胞存活的一个重要代 表 目前以 )* 信号通路关键分子为靶点的肿瘤治疗策略正在发展中 本研究将 #$% 与二萜生物碱联合作用于舌癌细胞 其作用效果比单独 #$% 和单独二萜生物碱作用均增大 且呈剂量依赖性 3"'"6 实验发现 磷酸化 )* 的水平随着药物浓度的增加而逐渐减弱 而总 )* 水平没有明显变化 对 &' 细胞的表达及活化均呈现剂量依赖性的!"!

6 西安交通大学学报 医学版 第 卷 抑制作用 我们推测 #$% 联合二萜生物碱可能在抑制 %)* 表达及活化这条信号通路上发挥一定作用 从而抑制舌癌细胞 &' 的增殖 综上所述 #$% 联合二萜生物碱对舌鳞癌细胞 &' 存在增殖抑制与促凋亡作用 且联合作用比单独使用 #$% 或单独使用二萜生物碱效果均理想 二萜生物碱达到一定剂量后舌鳞癌细胞的死亡率接近最大 本研究将基因治疗与药物治疗联合抑制舌癌增殖活性 其抗癌机制可能与其抑制信号通路的活化有关 其他机制有待进一步研究 本研究为临床上尝试使用该方法进行舌癌治疗提供了一定的实验和理论依据 参考文献 彭勇泉 蔡捷 苏承武 & 舌癌基因治疗的研究进展 & 蛇志,& -//''!..-&$ ##" *""#0'"0""*" "# #""" &-,,-,,,& 梁欣娜 张兴遷 滕红丽 & 中药及其有效成分抗肿瘤作用研究 & 时珍国医国药,&, 李峨 陈信义 & 乌头碱抗耐药性人口腔鳞状上皮癌细胞作用的体外研究 & 中国中医药信息杂志,+& +$23'/$'0&!#',+ * " 5##&#---- -,& --'/ !&$# # ) +#**,###)"& $!""-,+,& $' /-'/.22'/ 6&$ #,###& 5# $,-& 倪晓辰 刘爽 张爱莉 等 & 基因转染人膀胱癌, 细胞及其表达的研究 & 中国肿瘤临床 & 刘炜炜 高尚 王战鑫 等 & 转染人舌癌 5- 细胞及抗瘤作用的初步探讨 & 口腔医学研究 & 徐秋萍 刘静涵 刘宝瑞 &55 二萜生物碱抗肿瘤活性研究进展 & 药学进展 -,& 刘芳 杨春华 梁敬钰 等 &5 型二萜生物碱药理活性和毒性研究进展 & 海峡药学,,+& 李瑞阳 冯锋 刘静涵 &5 型二萜生物碱的构效关系研究进展 & 海峡药学 +,& 56.% 7$5/'&8,8#)+"# +## *# " * #& 7!"5+-,-+&,-6 3-!$$# # *"###"* "+""+,## #&'!"-+,,& +6.'9$5.'!/%:'&## "*"+"&3 '#5-- & - 田劭丹 刘雪强 王笑民 等 & 乌头碱影响 7% 细胞 * 蛋白表达的组化实验 & 中医药学刊 -,+++-& 张丹丹 李庆林 &+ 信号通路与肿瘤 & 安徽医药 -& 刘田田 毕经旺 &+ 信号通路与结直肠恶性肿瘤 & 实用医药杂志 -,-& 编辑 卓选鹏 上接第 页 )#"*### ' 55'5'$C7.'&6# "#" '""##*&.* #*###"**##,+& "*#&$ -5.' -!;!!&. " +& ##### 3'/ '&!##" 8 #'&$,, #**# +,& ####*##& $./$7'/..5!.5&.#,& 6"##" 7.7-2!5!7.$%...&!#* ##*#*!50## # " #* " #&75,& ###&+-,-,&.%5.'!. 7!' &# 2$$&."#" #* "#," " ##+,##*&$, ##&# '#"$#$+ +,& -& -.22$&.#.//'.'533.0&! ##*.*### "!6 # &75#,,,,& &#-,-&,5.' -52;!!&."# $$ 6! %$5'5.$!&# #### " ##"# ##& #'&7,+-,-+& "!!"+++-& +!..!'$'-&!## 编辑 韩维栋!"!

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