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1 第 56 卷第 1 期厦门大学学报 ( 自然科学版 ) Vol.56 No 年 1 月 JournalofXamenUnversty (NaturalScence) Jan.2017 do: /j.ssn 一株乙型肝炎病毒鼠单抗的人源化及生物学活性鉴定 徐灵杰 1, 罗文新 1*, 张娟 1, 周兵 2, 张天英 1, 胡耀凯 1, 袁权 2, 夏宁邵 1 (1. 厦门大学生命科学学院国家传染病诊断试剂及疫苗工程技术研究中心,2. 厦门大学公共卫生学院, 福建厦门 ) 摘要 : 乙型肝炎病毒 (HBV) 感染是全球最为重要的公共卫生问题之一, 目前临床上治疗 HBV 的药物在彻底清除病毒方面并没有取得满意的结果, 因此迫切需要发展能有效清除病毒, 尤其是能有效清除乙肝表面抗原 (HBsAg) 或大幅度降低 HBsAg 血清学水平的创新性治疗药物. 筛选到一株针对 HBV 和 HBsAg 上一个特定表位的鼠单抗, 它能持续有效地清除转基因小鼠体内的 HBV 及 HBsAg, 有发展为治疗性抗体药物的潜力. 为了降低 的免疫原性, 采用互补决定区 (CDR) 移植的方式, 利用噬菌体抗体库技术对这个鼠单抗进行了人源化, 最终得到人源化抗体. 人源化抗体与 HBsAg 的结合活性与嵌合抗体相当, 抗体质量浓度为 1.45μg/mL 时介导 THP-1 细胞吞噬率达到 50%. 在 HBV 转基因小鼠的实验中, 获得的 人源化抗体能持续有效地抑制血清中 HBV DNA 及清除 HBsAg. 关键词 : 乙型肝炎病毒 ; 噬菌体抗体库 ; 抗体人源化 ; 抗体药物中图分类号 : Q511 文献标志码 : A 文章编号 : (2017) 乙型肝炎病毒 (HBV) 感染是全球最为重要的公 共卫生问题之一, 据世界卫生组织统计数据显示, 全 球约有 20 亿人感染过 HBV, 约占世界总人口的 1/3, 且其中有 3.6 亿人最终发展成为慢性感染 [1-2], 每年有 将近 100 万人死于 HBV 感染及其所引发的肝脏疾 病 [3-4],HBV 的高流行区人群中乙肝表面抗原 (HBsAg) 阳性率通常在 8% ~20% [5]. 目前临床上治 疗 HBV 的药物主要包括干扰素类和核苷类似物. 干 扰素类药物包括普通干扰素及聚乙二醇干扰素, 使用 后仅有 7.8% 的患者达到 HBsAg 血清转换 [5], 同时因 为其可能引发明显的副作用而不能用于长期的治疗 ; 核苷类似物包括拉米夫定 替比夫定等, 但使用后 HBsAg 血清转换率极低, 用药 2 年后转换率不到 2%, 接近自然阴转率, 同时它的使用也存在长期治疗 [6] 过程中会增强病毒抗药性的问题. 治疗性单克隆抗体是近年快速发展起来的疾病 靶向治疗新手段, 由于其具有特异性高 均一性好 疗 效强 副作用小等优势, 已经成为对抗肿瘤 传染病 自身免疫病等疾病的重要工具. 在病毒入侵体内产生 体内免疫反应时,B 细胞应答产生的抗体通过中和 (neutralzaton) 和免疫清除 (mmuneclearance) 而起 [7] 到抗病毒作用.HBV 感染宿主后产生的抗体主要是 ant-hbs ant-hbe 和 ant-hbc, 其中 ant-hbs 属于 能够有效阻止病毒感染细胞的中和抗体, 这也表明针 对 HBsAg 的抗体可以作为有效治疗慢性乙肝的药 物. 目前高效价乙肝免疫球蛋白 (HBIG) 已广泛应用于 阻断 HBV 的母婴垂直传播等, 但 HBIG 直接用于治 疗慢性 HBV 感染并未见明显的疗效, 且其存在着血 浆来源有限 性质不稳定等潜在的安全问题. 本实验室 ( 第一单位, 下同 ) 获得一株鼠源单克隆 抗体, 它是针对 HBV 表面抗原一个特定表位 的抗体, 能有效清除转基因小鼠体内的 HBV 及 HBsAg. 为降低免疫源性, 采用互补决定区 (CDR) 移植的 方式 [8], 利用噬菌体抗体库技术对该鼠单抗进行了人 源化改造, 最终得到一株人源化抗体, 在 HBV 转基因 小鼠中能有效地抑制 HBV DNA 清除 HBsAg, 将来 可能为慢性乙肝的治疗提供一种新的手段. 1 材料与方法 1.1 材料 大肠杆菌 (Escherchacol) 菌株 DH5α 为本实验 收稿日期 : 录用日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( , ); 福建省自然科学基金 (2015J06018) * 通信作者 :wxluo@xmu.edu.cn 引文格式 : 徐灵杰, 罗文新, 张娟, 等. 一株乙型肝炎病毒鼠单抗的人源化及生物学活性鉴定 [J]. 厦门大学学报 ( 自然科学版 ), 2017,56(1): Ctaton:XU LJ,LUO W X,ZHANGJ,etal.HumanzatonoftherapeutcantbodyofonehepattsBvrusanddentfcatonof tsbologcalactvty[j].jxamenunvnatsc,2017,56(1):72-78.(nchnese)

2 第 1 期 徐灵杰等 : 一株乙型肝炎病毒鼠单抗的人源化及生物学活性鉴定 73 室保存.ER2738 菌株购自 New England BoLabs (NEB) 公司. 真核表达载体 PTT5 由本实验制备, 噬菌 体展示载体 PCGMT 由美国 Scrpps 研究所提供, 表 达细胞株 FlpInCHO 购自 Invtrogen 公司. 各种限制 性核酸内切酶 T4DNA 连接酶购自 NEB 公司,LA- Taq DNA 聚合酶购自 TaKaRa 公司, 辣根过氧化物 酶 (HRP) 标记的 ant-m13igg 购自 GE 公司,HRP 标记的鼠抗人 IgG 及 HRP 标记的羊抗人 IgG HBsAg 乙肝表面抗原定量试剂盒由北京万泰海沧公 司提供. 鼠 单抗 嵌合抗体 c- 由本实验室 研制和纯化. 1.2 方法 鼠单抗 表位鉴定 从 HBsAg 的第 1 位氨基酸开始, 每 15 个氨基酸 合成 1 条短肽, 短肽之间互相重叠, 重叠处为 7 个氨基 酸, 共计 27 条, 将合成的肽段命名为 s1~s27, 如表 1 所示. 合成的短肽以 20μg/mL 的质量浓度包被 96 孔 板, 每孔 100μL,4 包被过夜,37 封闭 2h, 加入 鼠单抗,37 孵育 1h, 再加入 HRP 标记的羊 抗人 IgG (1 5000),37 孵育 30 mn, 显色液 37 显色 15mn, 终止显色反应后, 酶标仪测定 450nm 下 的吸光度 (OD450) 鼠单抗 在 HBV 转基因小鼠中的实验 将鼠单抗 以 10mg/kg 的剂量用单剂尾静 脉注射的方式注入 HBV 转基因小鼠体内. 每组 2 只 HBV 转基因小鼠, 同时以磷酸盐缓冲液 (PBS) 作为对 照组. 通过眼眶后静脉丛取血的方式采集小鼠血液样 品, 检测血清中的 DNA 及 HBsAg 水平的变化. 检测血清中 HBsAg 的水平 : 鼠单抗 稀释 到 2μg/mL 包被化学发光板, 将采集的小鼠血样用 20%( 体积分数, 下同 ) 新生牛血清 (NBS) 稀释为 1 30 和 进行定量检测, 再将 15μL 稀释好的样品与 7.5μL 变性缓冲液 (15%( 质量分数 ) 十二烷基磺酸钠 (SDS) 和 20mmol/LpH7.4PBS) 充分混匀,37 孵 育 1h 后再加入 90μL 中和缓冲液 (4%( 质量分数 )3- [3-( 胆酰氨丙基 ) 二甲氨基 ] 丙磺酸内盐 (CHAPS) 和 20mmol/LpH7.4PBS 混合 ). 将混合样品取出 100 μl 加到化学发光板中,37 孵育 1h, 洗板 5 次, 每孔加入 HBs-A6A7-HRP(A6A7 为一种抗 HBsAg 的鼠 单抗 ) 反应液 100μL,37 孵育 1h. 同时使用已知浓 度的标准品做同样的实验, 绘制标准曲线从而计算出 待测样品的 HBsAg 浓度. 血清中 HBV DNA 的定量检测按实时荧光定量 检测试剂盒说明书进行 人源化模板的选择及突变点的确定 采用最适匹配原则选择框架区 (FR) 模板 [9], 登陆 NCBI(htp: ncb.nlm.nhġov/)blast 搜索基因数据 库, 在查找框中输入鼠单抗 重链可变区 (VH ) 和轻链可变区 (VL) 的氨基酸序列, 系统自动搜索与鼠 单抗 的 VH 和 VL 同源性最高的人源抗体可变 区的氨基酸序列, 从而确定了与鼠单抗 的 FR 同源性最高的人胚系基因的 VH 和 VL 序列. 表 1 合成的肽段氨基酸序列设计 Tab.1 Desgnofsyntheszedamnoacdsequenceofpeptdes 肽段名称 肽段位置 合成肽序列 肽段名称 肽段位置 合成肽序列 s1 1~15 MENITSGFLGPLLVL s15 113~127 TTTTSTGPCKTCTTP s2 9~23 LGPLLVLQAGFFLLT s16 121~135 CKTCTTPAQGNSMFP s3 17~31 AGFFLLTRILTIPQS s17 129~143 QGNSMFPSCCCTKPS s4 25~39 ILTIPQSLDSWWTSL s18 137~151 CCCTKPSDGNCTCIP s5 33~47 DSWWTSLNFLGGSPV s19 145~159 GNCTCIPIPSSWAFA s6 41~55 FLGGSPVCLGQNSQS s20 153~167 PSSWAFAKYLWEWAS s7 49~63 LGQNSQSPTSNHSPT s21 161~175 YLWEWASVRFSWLSL s8 57~71 TSNHSPTSCPPICPG s22 169~183 RFSWLSLLVPFVQWF s9 65~79 CPPICPGYRWMCLRR s23 177~191 VPFVQWFVGLSPTVW s10 73~87 RWMCLRRFIFLFIL s24 185~199 GLSPTVWLSAIWMMW s11 81~95 IFLFILLLCLIFLL s25 193~207 SAIWMMWYWGPSLYS s12 89~103 LCLIFLLVLLDYQGM s26 201~215 WGPSLYSIVSPFIPL s13 97~111 LLDYQGMLPVCPLIP s27 209~223 VSPFIPLLPIFFCLW s14 105~119 PVCPLIPGTTTTSTG

3 74 厦门大学学报 ( 自然科学版 ) 2017 年 将鼠单抗 的 6 个 CDR 插入选取的人胚系 基因的 FR 上, 采用多种方法逐个分析人 鼠抗体 FR 中的不同氨基酸, 对于不重要的氨基酸直接进行人源 替换, 对于一些靠近 CDR 的重要氨基酸及同一位点 性质不同的氨基酸可以选择人 鼠 2 株替换方式. 根据 抗体可变区序列中突变氨基酸的个数计算出构建的 人源化单链抗体 (ScFv) 库的库容量 : 抗体库容量 =2 N (N 为抗体可变区序列中突变点的个数 ) 噬菌体 ScFv 库的构建 筛选及检测 根据选取的人胚系基因 FR 碱基序列设计 PCR 引物, 并在突变位点设计简并引物,VL 和 VH 之间用短 肽 (GGGGS) 3 连接, 采用重叠延伸 PCR 的方法获得 人源化单链抗体库基因片段, 克隆到噬菌体展 示载体 pcgmt 中, 电转构建噬菌体 ScFv 库. 对于噬菌体抗体的筛选采用固相筛选的方法进 行重复的 3 轮 吸附 洗脱 感染 扩增 富集筛选, 筛选强度逐轮增强. 首先 HBsAg 以 6μg/mL( 第 2 轮 1μg/mL, 第 3 轮 0.6μg/mL) 的质量浓度包被酶联免 疫吸附实验 (ELISA) 板, 再向包被的板中加入噬菌体 ScFv 库 ( 投入噬菌体滴度在 以上 ),37 孵育 30 mn( 第 2 轮 20mn, 第 3 轮 10mn) 后,PBS 洗 5 次以 去除非特异性结合 ; 从第 2 轮起增加磷酸盐 - 吐温缓冲 液 (PBST) 洗 16 次 ( 第 3 轮洗 20 次 ), 第 3 轮最后 1 次 PBST 洗涤时在 37 浸泡 6h, 再用对数期的 ER2738 菌株感染 涂板. 挑取平板上的菌落进行噬菌体 ScFv 的表达, 用 HBsAg 包被 ELISA 板, 对其进行 ELISA 检测 嵌合抗体及人源化 IgG 抗体在 CHO 细胞中 的稳定表达 本研究采用双质粒共转染悬浮 CHO 细胞表达 IgG 抗体. 新复苏的 CHO 细胞传代 3~4 次后, 细胞密度达到 ml -1 左右时可用于转染. 将构建的分 别带有抗体轻 重链基因片段的 PTT5 质粒和 1 μg/ μ L 聚乙烯亚胺 (PEI) 按 1 2 的质量比分别加到占转染总体积 5% 的 150 mmol/l NaCl 溶液中, 混匀, 再立即把 PEI-NaCl 混合液加入到质粒 -NaCl 混合液 中, 振荡混匀 8s 后静置 8 mn. 把已配好的混合物缓 慢加入处理后的细胞上清中, 混匀后在 CO2 培养箱中 37 培养 4h, 再补加等体积的无血清培养基 SFM Ⅳ,32 摇床连续表达 7d, 收集细胞上清, 进行 proten-a 纯化 嵌合抗体及人源化 IgG 抗体与抗原结合活性 检测 用 3μg/mL HBsAg 包被化学发光板. 将纯化后 的待测抗体用 PBS 稀释到 200μg/mL, 在血凝板中用 20%NBS 以 3 倍比例共稀释为 12 个梯度 ( 首孔稀释 为 20μg/mL), 再加入到包被好的化学发光板中,37 孵育 1h 后洗板 5 次, 甩干后加入 100μL 的羊抗人 IgG (IgG-HRP)(1 5000),37 孵育 30 mn, 洗板 5 次甩干后加入显色液, 读值 嵌合抗体及人源化 IgG 抗体介导 THP-1 细胞 吞噬实验 THP-1 细胞株在体积分数为 90% RPMI % 胎牛血清 (FBS) 的培养基中长至 ml -1, 将其转移到 24 孔板培养. 同时将经 CHO 细胞 表达的 100μg/mL HBsAg 与梯度稀释的待测抗体混 合 37 孵育 30mn, 再将 200μL 的抗原抗体混合液 加入到培养的 THP-1 细胞中,CO2 培养箱中 37 培 养 60mn, 离心吸取 100μL 上清进行 HBsAg 定量. HBsAg 浓度测定使用由北京万泰海沧公司提供的 HBsAg 定量试剂盒, 以已知浓度的标准品做同样的 实验, 基于标准品的测定结果绘制标准曲线, 再根据 标准曲线计算出待测样品的 HBsAg 浓度 嵌合抗体及人源化 IgG 抗体在 HBV 转基因 小鼠中的实验 将待测抗体以 10 mg/kg 的剂量用单剂尾静脉注 射的方式注入 HBV 转基因小鼠体内, 每组 2 只 HBV 转基因小鼠, 通过眼眶后静脉丛取血的方式采集小鼠血 液样品, 检测血清中 HBVDNA 及 HBsAg 水平的变化. 血清中 HBVDNA 及 HBsAg 水平的测定方法同 实验结果 2.1 鼠单抗 的治疗效果评估及其抗原表位鉴定 以 HBsAg 蛋白免疫 BALB/c 小鼠, 用常规杂交 瘤技术筛选出具有特异结合活性的单克隆抗体, 并在 HBV 转基因小鼠中评估治疗效果. 鼠单抗以 10 mg/kg 的剂量注射到小鼠体内,PBS 作为对照组, 每 天采集小鼠血清样品, 监测其中 HBsAg 和 DNA 水平 的变化情况. 图 1 的检测结果显示 : 鼠单抗 注射 小鼠体内后, 小鼠血清中的 HBV DNA 及 HBsAg 水 平均会明显下降, 说明 在小鼠体内具有清除病 毒 抑制病毒扩增的生物学活性 ; 同时, 单剂量注射鼠 单抗 能有效抑制血清中 HBsAg 达 3d, 持续有 效抑制血清中的 HBV DNA 达 10d 左右, 说明这株 鼠单抗 在 HBV 转基因小鼠体内有良好的病毒

4 第 1 期 徐灵杰等 : 一株乙型肝炎病毒鼠单抗的人源化及生物学活性鉴定 75 图 1 鼠单抗 在动物体内的治疗效果评估 Fġ1 Evaluatonofmonoclonalantbody(mAb)therapeutcefectsnvvo 及 HBsAg 清除能力. 进一步用合成肽来鉴定鼠单抗 的抗原识 别表位. 将合成的 27 条短肽分别包被 ELISA 板, 再用 鼠单抗 进行 ELISA 检测, 结果如表 2 所示 : 在 合成的 27 条短肽中仅有 s18 与鼠单抗 有结合 反应 (OD450=2.853), 其他肽段的反应结果均为阴性. 该结果证明鼠单抗 与 HBsAg 的表位结合序列 为 CCCTKPSDGNCTCIP, 位于 HBsAg 氨基酸序列 的第 137~151 位. 表 2 与肽段 ELISA 检测 Tab.2 Detectonofreacton wthpeptdesbyndrectelisa 肽段名称 OD450 肽段名称 OD450 s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s 鼠单抗 的人源化 提取 杂交瘤细胞株的总 RNA 并反转录为 cdna, 再 PCR 扩增出鼠单抗 的 VH 和 VL 的 DNA 片段并测序, 用 IMGT 抗体分析数据库分析得 到抗体的 CDR 序列 ( 表 3). 接下来通过 CDR 移植和噬菌体展示相结合的方法对鼠单抗 进行人源化. 首先通过 NCBIBlast 搜索基因数据库, 得到与鼠单抗 FR 同源性最高的人抗胚系基因的 VH 和 VL 序列. 最终确定以 Human 及 Human 胚系基因序列分别作为鼠单抗 人源化改造的重链和轻链 FR 模板. 表 3 鼠单抗 的 CDR 序列 Tab.3 CDRsequencesofmAb CDR 序列 HCDR1 DYWMH HCDR2 MIDPSDSETRLNQDFKD HCDR3 NYRYDHFALDS LCDR1 SASSSVNYVH LCDR2 DTSKLAS LCDR3 QQWTSFPYT 首先将 的 CDR 序列移植到这 2 条人抗胚系基因的 FR 中, 再分析人抗胚系基因的 FR 与鼠单抗 FR 中氨基酸的差异. 性质差异大的氨基酸替换容易影响到人源化抗体的活性, 因此针对这些位点的氨基酸差异设计一个多样化重组的抗体序列库. 具体而言, 通过简并引物在这些氨基酸位点引入鼠源及人源氨基酸 2 种替换, 采用重叠延伸 PCR 的方式获得重组抗体 DNA 片段库, 将其克隆至噬菌体载体中, 从而获得噬菌体 ScFv 库. 在 FR 有 33 个位点设计了 2 种氨基酸的替换, 其中重链 18 个, 轻链 15 个, 因此 人源化 ScFv 库的氨基酸序列多样性理论上为 构建的噬菌体 ScFv 库针对 HBsAg 经过多轮固相富集筛选, 检测噬菌体单链抗体与 HBsAg 的结合活性. 在 ELISA 检测结果中, 有 5 株人源

5 76 厦门大学学报(自然科学版) 2017 年 化噬 菌 体 单 链 抗 体 ( 36, 45, 59, 75, 81)显示与 HBsAg 有很强的结合活 性,与 鼠 单 抗 的 噬 菌 体 单 链 抗 体 结 合 活 性 相当. 2.3 人源化抗 体 与 HBsAg 抗 原 的 结 合 活性检测 上 述 5 株 人 源 化 抗 体 在 FR 的 氨 基 酸 差 别 如 图 2 所 示,其 中 有 7 个 位 点 的 氨 基 酸 全 部 保 留 为 鼠 单 抗 的 氨 基 酸,说 明 这 些 氨 基 酸 对 保 持 CDR 的 正 确 构 象 非常重要. 将这5株人源化抗体和人鼠嵌合抗体的基 因 克 隆 至 真 核 表 达 载 体 中,瞬 间 转 染 至 F l ncho pi 细胞表达并 纯 化 出 完 整I gg 抗 体,纯 化 后 I gg 抗 体 的 SDS -聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 ( SDS -PAGE)结 果 如 图 同 时 通 过 化 学 发 光 法 检 测 人 源 化 抗 体 3所示. 与 HBsAg 的 结 合 活 性. 结果显示这5株人源化抗体 与 HBsAg 抗 原 均 有 结 合 活 性 (图 4),从 曲 线 拟 合 计 算出半 数 最 大 效 应 浓 度 ( EC50 )来 看, 5株抗体的 /ml 之 间, EC50 在 0.78~5.02μg 人 源 化 抗 体 与 HBsAg 的 结 合 活 性 要 稍 好 于 嵌 合 抗 体c,其 中 45 的 结 合 活 性 最 好, EC50 /ml. 约为0 而.78μg 36 和 59 的 EC50 与嵌合抗体c 相 比 分 别 相 差 约 2 倍 和 4 倍. 2.4 人源化 抗 体 介 导 THP 1细胞吞噬 实验 通过本实 验 评 价 人 源 化 抗 体 在 体 外 介 导 THP 1 细胞 的 吞 噬 能 力,以 人 鼠 嵌 合 抗 体 作 为 对 照,将 纯 化 后的抗体从起始浓度 32μg/mL 开始进行 2 倍梯度稀 释,共稀释 12 个梯度. 结果如图 5 所示:这些人源化抗 蛋白质分子质量标准; M. 1~6 依次为 36, 45, 59, 75, 81, c. 图 3 人源化抗体的 SDS -PAGE 分析 F.3 SDS -PAGEana l s so fpu r f edhuman z ed g y 需要的抗体质量浓 度 分 别 约 为 1.45 与 2.77μg/mL, 剩余 3 株人源化抗体介导的吞噬率达 50% 时,所需的 抗体浓度约为嵌合抗体的 2~8 倍. 2.5 人源化抗体在 HBV 转基因小鼠中 的实验 通过 HBV 转基因小鼠评价 人源化抗体在 动物体内的病毒清 除 能 力,从 而 间 接 反 映 人 源 化 抗 体 作为治疗药物 的 潜 力. 5株与抗原结合能力强弱不同 的人源化抗体与嵌合抗体以 10 mg/kg 的剂量注射 到 小鼠 体 内,每 天 采 集 的 小 鼠 血 清 样 品 中 DNA 和 HBsAg 水平的变化情况如图 6 所示. 检测结果 显 示,这 5 株 人 源 化 抗 体 注 射 HBV 转 基因小鼠体内后,小鼠血清中的 DNA 及 HBsAg 水平 均有不同程度的下 降,说 明 这 些 人 源 化 抗 体 在 动 物 体 内具 有 清 除 病 毒 抑 制 病 毒 扩 增 的 生 物 学 活 性. 同时 体均能在 体 外 介 导 THP 1 细 胞 进 行 吞 噬 作 用,嵌 合 81 这株与抗原结合活性较好的抗体,在动物体 内也表现出最好的 治 疗 效 果,单 剂 量 注 射 能 有 效 抑 制 为1.92 μg/ml,人 源 化 抗 体 81 与 45 因此,动物实验结果与抗 原 结 HBV 及 HBsAg 达 3d. 合实 验 结 果 细 胞 吞 噬 实 验 结 果 基 本 呈 正 相 关, 抗体介导的吞噬率达 50% 时,使用的抗体质量浓度约 介导的吞噬效率与嵌合抗体相当,当吞噬率达 50% 时 图 2 人源化抗体的 FR 氨基酸序列 F.2 Al to ffram noa c ds e e so fhuman z edan t bod e s g gnmen quenc h t t xmu. xmu. edu. cn p: j

6 第 1 期 徐灵杰等 : 一株乙型肝炎病毒鼠单抗的人源化及生物学活性鉴定 77 RLU: 相对单位, 下同. 图 4 人源化抗体与抗原的结合活性 Fġ4 ReactvtyofhumanzedaganstHBsAg 图 5 人源化抗体介导 THP-1 细胞吞噬 Fġ5 HumanzedmedatedphagocytossbyTHP-1-81 这株人源化抗体在小鼠体内表现出了良好的有效抑制小鼠血清中 HBVDNA 及 HBsAg 水平的能力. 3 讨论 截至 2015 年 7 月, 已有 40 余种抗体药物获得美 [10] 国食品药品监督管理局批准在美国上市, 其中新批准的治疗性抗体药物多以人源化抗体及全人源抗体 为主, 这是治疗性抗体药物发展的趋势. 大量的临床实验证明鼠源单克隆抗体具有比较高的免疫原性, 因此在临床试验中屡受失败. 为了减轻人抗鼠抗体免疫排 [11] 斥反应, 动物源单克隆抗体药物应用于人体前必须要进行人源化改造, 同时也可以更加有效地激活人体免疫系统, 降低抗体类药物的清除速度, 并延长半衰期. 但是单纯的 CDR 移植很难完全达到亲本鼠抗的特异性及亲和力, 因为 FR 的某些氨基酸是维持抗体 [12-13] CDR 同抗原结合所不可替代的, 所以本研究又对 CDR 移植后的抗体 FR 氨基酸进行了回复突变的设计. 采用噬菌体抗体库的技术进行筛选, 能得到亲和力较高的特异性抗体的多样性集合, 有利于后续生物活性的分析. 本研究主要从三方面评价改造后的 人源化抗体的生物学活性, 即与抗原的反应性 在体外介导的 THP-1 细胞吞噬作用以及在小鼠体内的病毒清除能力. 人源化抗体和 HBsAg 的结合活性是通过灵敏度高于 ELISA 检测的化学发光法进行测定的, 通过 EC50 值进行最终抗体与抗原结合活性的比较. 不同的人源化抗体与 HBsAg 结合形成不同的复合物, 根据它们介导 THP-1 细胞吞噬程度的不同, 用来评价 人源化抗体体外清除 HBsAg 的效果. 利用 HBV 转基因小鼠评价 人源化抗体在小鼠体内的 HBV 清除能力, 可以直观反映不同抗体作为治疗性药物的潜力. 最终挑选了 5 株人源化抗体进行评估, 综合 3 项评估的结果,-81 这株抗体表现最优. 在结合实验中,-81 的结合能力要稍好于嵌合抗体 ; 介导 THP-1 细胞吞噬作用的实验中, 当吞噬率达 50% 时需要的抗体质量浓度约为 1.45μg/mL;HBV 转基因小鼠实验中,-81 能有效抑制小鼠血清中 HBV DNA 及 HBsAg 水平达 3d, 但并没有形成持久的清除效果, 可能需要重复多次注射抗体才能达到持续有效的清除效果. 总之,-81 人源化抗体可能 图 6 人源化抗体在 HBV 转基因小鼠体内的治疗效果评估 Fġ6 EvaluatonofhumanzedtherapeutcefectsnHBVtransgencmce

7 78 厦门大学学报 ( 自然科学版 ) 2017 年 会成为慢性乙肝治疗的候选抗体药物之一. 参考文献 : [1] PANC Q,ZHANGJX.NaturalhstoryandclncalconsequencesofhepattsBvrusnfecton[J].IntJMedSc, 2005,2(1): [2] HOOFNAGLEJH,DOO E.ManagementofhepattsB: summaryofaclncalresearchworkshop[j].hepatology, 2007,45(4): [3] OTTJJ,STEVENSG A,GROEGERJ,etal.GlobalepdemologyofhepattsBvrusnfecton:newestmatesof age-specfc HBsAgseroprevalenceandendemcty[J]. Vaccne,2012,30(12): [4] STELMA F,NIET A D,MARJANJ.Naturalklercel characterstcsnpatents wthchronchepattsbvrus (HBV)nfectonareassocatedwthHBVsurfaceantgen clearanceaftercombnatontreatmentwthpegylatednterferonalfa-2aandadefovr[j].journalofinvestgatve Dermatology,2015,212 (1): [5] PAPATHEODORIDISGV,HADZIYANNISSJ.Revew artcle:currentmanagementofchronchepattsb[j].almentpharmacolther,2004,19(1): [6] MANZOORS,SAALIM M,IMRAN M,etal.HepattsB vrustherapy:what sthefutureholdngforus? [J]. WorldJGastroenterology,2015,21(44): [7] MARASCO W A,SUIJ.Thegrowthandpotentalofhuman antvral monoclonal antbody therapeutcs [J]. NatureBotechnology,2007,25: [8] SONJH,LEE U N,LEEJJ,etal.Humanzatonofagonstcant-human 4-1BB monoclonalantbody usng a phage-dsplayedcombnatorallbrary[j].journalofimmunologcalmethods,2004,286(1/2): [9] ECKER D,JONESS D,LEVINE H L.Thetherapeutc monoclonalantbodymarket[j].mabs,2015,7(1):9-14. [10] 杨扬, 张大鹏, 吴兰. 抗 CD20 人源化抗体的制备及生物学活性鉴定 [J]. 现代免疫学,2009,29(6): [11] LOBK C.AntbodyhumanzatonbyCDRgraftng[J]. Methodsn MolecularBology,2004,248: [12] IWAHASHIM,DIANEDE,PADLAN E A,etal.CDR substtutons of a humanzed monoclonal antbody (CC49):contrbutons ofndvdual CDRsto antgen bndng and mmunogen-cty [J ]. Molecular Immunology,1999,36(15/16): HumanzatonofTherapeutcAntbodyofOneHepattsB VrusandIdentfcatonofItsBologcalActvty XU Lngje 1,LUO Wenxn 1*,ZHANGJuan 1,ZHOU Bng 2,ZHANG Tanyng 1, HU Yaoka 1,YUAN Quan 2,XIA Nngshao 1 (1.NatonalInsttuteofDagnostcsandVaccneDevelopmentnInfectousDsease, SchoolofLfeScences,XamenUnversty,2.SchoolofPublcHealth,XamenUnversty,Xamen361102,Chna) Abstract: HepattsBvrus (HBV)nfectonsamajorglobalhealthproblem.However,currenttreatmentsarenotsatsfactoryn removngvrusthoroughlyfrom patents,thusweneednnovatvetreatmentstrategestoremovevruscontnuously,especalyn suppressngthelevelsofhbsagandhbvdnanvvoprofoundlyandpersstently.inthsstudywedscoveredmab,whch samousemonoclonalantbodybndngtoaspecaleptopeonthehepattsbsurface(hbsag).mabcansuppressthelevels ofhbsagandhbv DNAnvvoprofoundlyandpersstently,thushasthepotentaltobeusedndrugsoftherapeutcantbodes.In ordertoreducethemmunogenctyofmab,weaccomplshedthehumanzatonofusngcomplementartydetermnng regon(cdr)ḡraftngandframeworkregonoptmzatontokeeptheorgnalbologcalfuncton wthphagedsplaytechnology. humanzedantbodes'bndngactvtywthhbsagssmlartocab.itmakesthephagocytossrateofthp-1celsup to50% atconcentratonof1.45μg/ml.in HBVtransgencmce,thehumanzedexhbtedcontnuousabltynsuppressng thehbv DNAnserumandclearngHBsAg. Keywords: hepattsbvrus (HBV);phagedsplayantbodylbrary;antbodyhumanzaton;antbodȳbaseddrug

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新 城 疫 是 家 禽 最 普 遍 的 传 染 病 之 一 它 在 全 球 范 围 内 流 行, 并 可 能 给 家 禽 养 殖 者 带 来 巨 大 的 经 济 损 失 本 病 由 新 城 疫 病 毒 引 起, 可 感 染 超 过 240 余 种 鸟 类, 主 要 通 过 感 染 鸡 只 和 健 康 总 第 18 期 /2014 年 12 月 如 何 克 服 母 源 抗 体 消 失 与 自 身 抗 体 产 生 之 间 存 在 的 免 疫 空 档 期 Roni Yosipovicha,1, Elina Aizenshteina,1, Roy Shadmona, Simcha Krispela,Efrat Shustera, Jacob Pitcovskia,b, 摘 要 在 雏 鸡 出 生 后 的

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