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1 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (10): 应用核糖体展示技术高效筛选人源抗 IgE 单链抗体张勇侠 1, 王保成 1, 余馨 2, 代云见 1, 何勇智 1, 丛聪 1, 夏永 1, 王明蓉 1* (1. 成都生物制品研究所有限责任公司, 四川成都 ; 2. 中山大学药学院, 广东广州 ) 摘要 : 本研究从哮喘患者外周血分离淋巴细胞提取总 mrna, 采用 RT-PCR 技术分别构建重链可变区 VH (variable region of heavy chain) 和轻链可变区 VL (variable region of light chain) cdna 库, 然后通过连接肽 (Gly 4 Ser) 3 和特定引物将 VH 和 VL cdna 基因组装成人源单链抗体 (scfv) 核糖体展示模板基因库应用兔网织红细胞核糖体展示技术, 单引物原位反转录技术, 经 3 轮展示富集并回收针对人源 IgE 蛋白 ( 免疫球蛋白 E) 的目的单链抗体基因 ; 回收的抗体基因经双酶切后与 pet22b (+) 载体连接, 转化至 E. coli Rosseta (DE3) 宿主细胞, 应用菌落 PCR 结合 Dot blotting 技术快速鉴定阳性克隆, 抗原 ELISA 法进一步鉴定阳性克隆 VH 和 VL 基因库得到正确的构建, 长度分别为 400 和 710 bp, 库容为核糖体展示模板构建正确, 长度为 bp 该基因库经过 3 轮针对 IgE 蛋白的核糖体展示, 目的基因得到了有效富集和回收经过高效克隆表达和鉴定, 确定 1 株针对人 IgE 蛋白显示最强亲和力的阳性克隆菌 pet-ige-6 经测序和序列分析证实该单链抗体为人源抗体, 序列未见国内外报道结果表明, 采用患者外周血构建人源抗体基因库, 结合核糖体展示技术, 可以成功获得高亲和力的人源单链抗体分子该技术路线为快速获得具有药用价值的人源抗体提供了参考关键词 : 免疫球蛋白 E; 人源抗体 ; 核糖体展示技术 ; 过敏性疾病中图分类号 : R963 文献标识码 : A 文章编号 : (2012) Ribosome display screening of a novel human anti-ige scfv fragment ZHANG Yong-xia 1, WANG Bao-cheng 1, YU Xin 2, DAI Yun-jian 1, HE Yong-zhi 1, CONG Cong 1, XIA Yong 1, WANG Ming-rong 1* (1. Chengdu Institute of Biological Products Co., Ltd., Chengdu , China; 2. College of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou , China) Abstract: Total mrna was extracted from lymphocytes separated from the peripheral blood of allergic patients, and then variable region of heavy chain (VH) and variable region of light chain (VL) cdna library were constructed by RT-PCR. Human scfv templates for rabbit reticulocyte lysate ribosome display were assembled by primers and linker peptide (Gly 4 Ser) 3. mrna bound in antibody-ribosome-mrna complexes was recovered using in-situ single primer RT-PCR, and three rounds of anti-ige scfv DNA were enriched. The target DNA fragments were double enzyme digested and ligated into plasmid pet22b (+), followed by transformation in E. coli Rosseta (DE3). Positive clones were screened using clone PCR, Dot blotting and antigen ELISA. The correct lengths of VH (400 bp) and VL (710 bp) PCR products were obtained. The expected bp ribosome display templates were also observed in agarose gel electrophoresis. After three rounds of ribosome display target sequences were effectively enriched, leading to a library of members. Antibodies with the highest ELISA value for IgE were generated in the strain pet-ige-6. A human anti-ige scfv library was successfully constructed as described herein. Ribosome display using single primer in-situ RT-PCR as the recovery procedure 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家重大新药创制科技重大专项 (2011ZX ); 中国医药集团新产品基金资助项目 (2011SW12-1). * 通讯作者 Tel: , Fax: , mignrongw2007@163.com

2 1330 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (10): effectively enriched target sequences. Anti-IgE scfv with high affinity and specificity were identified. The prepared human anti-ige scfv fragment might be self-developed to a lead drug for treating asthma. Our study provides an alternative method for rapid discovery of human antibodies of therapeutic importance. Key words: IgE; human antibody; ribosome display; allergy disease 世界人口中大约 25% 患有过敏性疾病, 如过敏性鼻炎哮喘等 [1], 其中 Ⅰ 型过敏反应由免疫球蛋白 E (IgE) 介导 IgE 介导过敏感应的机制 : IgE 的恒定区与肥大细胞和嗜碱性粒细胞的受体 FcsRI 结合触发一系列的生化反应, 释放组胺白三烯等过敏物质, 从而引起黏膜或皮肤等部位嗜酸性粒细胞浸润和炎症反应由于 IgE 处于过敏级联反应的最上游, 利用抑制剂中和血液中的 IgE 含量或阻断 IgE 与受体 [2, FcsRI 之间的相互作用可用来治疗过敏性疾病 3] 为此, Genentech Novartis Pharma AG 和 Tanox 合作研制的重组人源化 IgG1 单克隆抗 IgE 抗体 omalizumab, 于 2003 年 6 月获得美国 FDA 批准用于治疗哮喘等过 [4, 敏性疾病 5] 当前, 抗 IgE 抗体的研制多采用鼠单克隆抗体的人源化策略, 残留的鼠源残基仍可诱发人抗鼠抗体反应 (HAMA) 人 IgE 蛋白作为有效的药物靶标, 目前未见上市的全人源抗体 ; 同时, 从 IgE 致敏机制分析, 采用小分子抗体能够实现全抗体的治病功效, 而小分子抗体可以采用比哺乳动物细胞更为廉价的大肠杆菌生产技术制备因此, 筛选特异性人源抗 IgE 小分子抗体具有非常重要的应用价值患者外周血是目前制备人源抗体的途径之一核糖体展示技术作为一种针对大容量基因库高效筛选功能基因的生物文库技术, 具有库容量大易于达到多样化操作简便利于筛选可进行蛋白体外进化等特点 [6] 本研究采用哮喘患者外周血构建抗体基因库, 应用核糖体展示技术 DNA 测序竞争性 ELISA 等方法筛选鉴定人源抗 IgE 单链抗体材料与方法实验材料 Human IgE purified ( 货号 : AG30P) 购自 Chemicon International, INC 淋巴细胞分离液 Ficoll-paque plus Quickprep mrna 提取试剂盒购自 GE lifescience RNA 反转录试剂盒 DNA 回收试剂盒 TNT T7 Quick for PCR 无细胞表达试剂盒均购自 Promega 公司 PCR 扩增试剂盒购自 Qiagen 公司 Topyield 反应孔购自 Nunc 公司 Msc I EcoR I 内切酶购自 EBI 公司 DNA Marker 购自天根生物公司引物由上海英骏公司合成 TMB 底物显色试剂及抗 - His HRP 抗体偶联物购自 Sigma 公司 Bugbuster 蛋白抽提试剂购自 Novagen 公司 PVDF 膜 ( 孔径 0.22 µm) 购自 Millipore 公司其他试剂为国产分析纯试剂 N 端 6 个组氨酸标签的抗 CEA 单链抗体由成都金惠康公司惠赠纯化的抗 IgE scfv 由本实验室制备 [7] 淋巴细胞分离和 mrna 提取用 5 ml 的 Na 2 EDTA 真空采血管抽取临床诊断为哮喘的 2 例患者外周血各 5 ml ( 患者已签署知情同意书 ) 按照淋巴细胞分离至 Ficoll-paque plus 说明书进行淋巴细胞分离在采集的 5 ml 血样中加入等体积的平衡液 ( 平衡液由平衡液 A 和平衡液 B 按 1 9 混合 ), 用巴斯德吸管混匀抽取 4.5 ml 的 Ficoll-paque plus 加到离心管中, 将稀释的血样缓缓加至 Ficoll-paque plus 上层 g 离心 30 min 用 1 个干净的巴斯德吸管轻轻吸取淋巴细胞层, 转入 1 个新的离心管中在淋巴细胞中加入平衡缓冲液 9 ml, 用巴斯德吸管吹打数次以重悬淋巴细胞, g 离心 10 min, 弃上清液重复洗涤 2 次, 收集沉淀即为淋巴细胞总 mrna 的提取按照 Quickprep mrna 提取试剂盒说明书进行人源 cdna 的合成取 4 µl 上述制备的总 mrna 加入 PCR 管中并于 70 温育 10 min, 变性 mrna, 短暂离心后迅速置于冰上反转录体系加入引物 HuIgG 1 /F HuCk/F 分别合成 VH 和 VL cdna 反转录反应体系 : 10 RT buffer, 2 µl; MgCl 2 (25 mmol L 1 ), 4 µl; dntp mixture (10 mmol L 1 ), 2 µl; RNasin (25 U µl 1 ), 0.5 µl; AMV reverse transcriptase (22 U µl 1 ), 0.5 µl; 加入无 RNase 的水至 20 µl 将 PCR 管置于 PCR 仪上, 42 孵育 1 h, 95 加热 5 min 使酶失活, 即得到 cdna 产物合成 cdna 的引物序列如下, HuIgG 1 /F 根据人源抗体 IgG 1 重链连接基因 JH 设计而成 : GTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCT; HuCk/F 来源于人源抗体 IgG 1 轻链可变区的下游基因 : CTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT 人源抗体 VH 和 VL 基因库的构建取上述合成的 cdna 2 µl 为模板, 分别加入上下游引物扩增人抗体 VH VL 基因库, 反应体系为 : 10 PCR buffer ( 含 15 mmol L 1 乙酸镁 ), 2.5 µl; 5 Q solution, 5 µl; dntps (2.5 mmol L 1 ), 1 µl; Taq (5 U µl 1 ), 0.2 µl;

3 张勇侠等 : 应用核糖体展示技术高效筛选人源抗 IgE 单链抗体 1331 加入 H 2 O 至 25 µl PCR 反应条件 : 94 4 min; 94 1 min, 54 1 min, min, 扩增 25 个循环 ; 72 延伸 7 min 扩增 VH 基因库采用的引物序列为 HuVH/B:CAGGT(C/G)CAGCTGG(T/A)G(C/G)A GTC(T/C)GG, HuJH-Linker/F: gagccaccaccgccagaac cgccgccaccggatgaggagacggtgacca(t/g)gg TCCC 扩增 VL 基因库采用的引物序列为 HuCk/F, LinkerHuVk/B: tctggcggtggtggctctggcggtggcggttccg A(A/C)AT(C/T)(G/A)TG(A/C)TGAC(C/G/T)CAGTCT CC 扩增人 VH 和 VL 基因的引物根据免疫球蛋白基因不同家族的可变区基因序列设计而成上述引物来源于人源抗体 IgG 1 相对保守的框架区 [6] 引物 HuJH-Linker/F 和 LinkerHuVk/B 序列中, 小写字母表示通过 VH 和 VL 基因组装引入连接肽 (Gly 4 Ser) 3 序列, 黑体部分表示反向互补序列用 Promega 胶回收试剂盒分别回收 VH 和 VL 扩增产物并测定核酸浓度人源抗体展示模板的构建将纯化的 VH 和 VL 基因库产物等摩尔比例混合, 组装展示模板 VH 基因库 20 ng, VL 基因库 35 ng, 10 PCR buffer ( 含 15 mmol L 1 乙酸镁 ), 2.5 µl; 5 Q solution, 5 µl; dntps (2.5 mmol L 1 ), 1 µl; Taq (5 U µl 1 ), 0.2 µl; 加 H 2 O 至 25 µl PCR 反应条件为 : 94 4 min; 94 1 min, 54 1 min, min, 扩增 8 个循环 ; 72 延伸 7 min 取上述组装产物 2 µl, 以 HuT7Ab 和 HuCk/F 为上下游引物, 构建展示模板反应体系同上, PCR 反应体系退火温度为 60, 其余条件不变琼脂糖凝胶测定构建模板的浓度引物 HuT7Ab: GGATCC TAATACGACTCACTATAGGGAACAGACCACCATG (C/G)AGGT(G/C)CA(G/C)CTCGAG(C/G)AGTCTG [8, 9] 单引物原位反转录核糖体展示包被抗原孔的处理以 PBS 溶解的 IgE 蛋白 (2 µg) 包被 Topyield 反应孔 4 过夜在进行核糖体展示反应之前, 将过夜包被的 IgE 蛋白先用含 0.05% Tween-20 的 PBS 洗涤 1 次, 再用含 1% BSA 的 PBS 100 µl 在常温下封闭 1 h, 最后用 PBS 洗涤 3 次实验过程中的溶液以及操作按照无 RNase 的体系进行核糖体展示体系的建立核糖体展示采用 TNT T7 Quick for PCR 无细胞表达试剂盒, TNT T7 Quick for PCR 40 µl, 人源抗体展示模板 1 µg, 甲硫氨酸 (1 mmol L 1 ) 1 µl, 乙酸镁 (50 mmol L 1 ) 1 µl, 加入无 RNase 的水至 50 µl 30 孵育 1 h 之后, 在上述反应体系中加入 : 10 DNase I 缓冲液 8 µl, 无 RNase 的 DNase I (5 U µl 1 ) 24 µl 30 孵育 20 min 将包被了 IgE 蛋白的孔用冰冷的含 0.05% Tween-20 和 5 mmol L 1 乙酸镁的 PBS 洗涤 1 次, 加入上述混合液 (50~100 µl), 4 轻微振荡孵育 2 h 将孔中的核糖体展示反应体系用力甩干, 用 200 µl 冰冷的含 0.05% Tween-20 和 5 mmol L 1 乙酸镁的 PBS 洗涤 5 次, 迅速用水 (DEPC) 洗涤 2 次原位反转录反应体系反转录体系采用 Promega 反转录试剂盒在洗涤过的孔中加入水 9.5 µl, PCR 仪上 70 加热 10 min, 迅速置于冰盒上 1 min 在上述反应体系中加入 10 RT 缓冲液 2 µl, MgCl 2 4 µl, RT Kz1 (10 µmol L 1 ) 1.5 µl, dntp mixture (10 mmol L 1 ) 2 µl, RNase 抑制剂 (40 U µl 1 ) 0.5 µl, AMV 反转录酶 (15 U µl 1 ) 0.6 µl, 42 孵育 1 h, 95 加热 5 min, 反转录产物置于 20 保存引物 RT Kz1: GAACAGACCACCATGACTTCGCAGGCG TAGAC 单引物 PCR 扩增及下轮展示模板制备取上述核糖体展示的反转录产物 cdna 1 µl 构建单引物 PCR 反应体系 10 PCR 缓冲液 2 µl, dntp (2.5 mmol L 1 ) 1.5 µl, 引物 Kz1 (10 µmol L 1 ) 1 µl, Taq 酶 (5 U µl 1 ) 0.2 µl, 补足水至 25 µl 扩增条件为 : 94 4 min; 94 1 min, 54 1 min, min, 扩增 30 个循环 ; 72 延伸 7 min 上样 10 µl 电泳检测单引物 PCR 产物利用引物 HuT7Ab 和 Kc/for 扩增进行下一轮展示模板的构建共进行 3 轮筛选引物 Kz1: GAACAGACCACCATG; Kc/for: CTCTAGAA CACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGC GAGCTCAGGCCCTGATGGGTGACTTCGCAGGCG TAGACTTTG 核糖体展示基因库的克隆将筛选回收的第 3 轮单引物扩增的基因产物两端通过 PCR 技术插入 Msc I 和 EcoR I 两个酶切位点, 双酶切后与经同样双酶切的表达载体 pet22b (+) 用 T4 连接酶连接, 1 µl 的连接产物与 50 µl 的 E. coli Rosseta (DE3) 感受态细胞混合后加入 0.1 cm 电转杯中, V 电击 5 ms 转化, 迅速加入 SOC 培养基 250 µl, r min 1 振荡培养 1 h, 涂布细胞于含 50 ng L 1 氨苄青霉素的 LB 琼脂培养平板上, 37 过夜培养阳性重组克隆 PCR 鉴定菌落 PCR 鉴定转化后生长的克隆菌落方法如下 : 无菌操作下, 用无菌牙签挑取菌落, 插入含无菌去离子水 5 µl 的 PCR 管内充分混匀同时标记菌落加入 Taq DNA Polymerase 及适当上下游引物的 PCR 反应体系 15 µl 扩增条

1332 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (10): 1329 1335 件 : 94 5 min; 94 1 min, 54 1 min, 72 1.

培养过夜 5% 接种量接种于新鲜 2 YT ( 含 50 ng L 1 氨苄青霉素 ) 培养基, 37 振荡培养至对数生长期, 加 IPTG 诱导 ( 终浓度为 0.

5 µl 抽提的可溶性抗体, 每个样品重复 2 次以抗 CEA 单链抗体抽提物作为阳性对照, E. coli Rosseta (DE3) 抽提物作为阴性对照含 3% BSA 的 PBS 溶液封闭该膜, 含 0.05% Tween-20 的 PBS 缓冲液洗涤 3 次, 含 1% BSA 的 PBS 溶液按 1 4 000 比例稀释抗 -His HRP 抗体偶联物, 孵育 1 h 含 0.

05% Tween-20 的 PBS 缓冲液洗板, 抗原包被孔中加入 100 µl 抽提的可溶性抗体, 37 孵育 1 h 用含 0.05% Tween-20 的 PBS 缓冲液洗板 3 次, 然后加入含 0.05% Tween-20 的 PBS 稀释的抗 -His HRP 抗体偶联物 (1 4 000) 100 µl, 37 孵育 1 h 用含 0.

4 1332 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (10): 件 : 94 5 min; 94 1 min, 54 1 min, min, 扩增 30 个循环, 电泳鉴定将鉴定正确的克隆用无菌牙签接入 1 ml 的 2YT 液体培养基 ( 含 50 ng L 1 氨苄青霉素 ), r min 1 摇动培养过夜加入 50% 甘油至终浓度 10% 标注编号后, 80 保存阳性菌鉴定阳性菌的培养表达接种阳性克隆于 10 ml 的含 50 ng L 1 氨苄青霉素的 LB 培养基中, 37 振荡培养过夜 5% 接种量接种于新鲜 2 YT ( 含 50 ng L 1 氨苄青霉素 ) 培养基, 37 振荡培养至对数生长期, 加 IPTG 诱导 ( 终浓度为 0.3~1 mmol L 1 ), 37 振荡培养 6 h, g 离心 10 min 收集菌体 Bugbuster 抽提可溶性抗体用于 Dot blotting 及 ELISA 活性检测 Dot blotting 检测 His 阳性菌甲醇处理 PVDF 膜 5 s, PBS 溶液浸泡 2 min 取出待膜半干, 每个样品点上 0.5 µl 抽提的可溶性抗体, 每个样品重复 2 次以抗 CEA 单链抗体抽提物作为阳性对照, E. coli Rosseta (DE3) 抽提物作为阴性对照含 3% BSA 的 PBS 溶液封闭该膜, 含 0.05% Tween-20 的 PBS 缓冲液洗涤 3 次, 含 1% BSA 的 PBS 溶液按比例稀释抗 -His HRP 抗体偶联物, 孵育 1 h 含 0.05% Tween-20 的 PBS 缓冲液洗涤 3 次, TMB 底物显色试剂显色 ELISA 法分析克隆菌落功能 10 µg ml 1 IgE 100 µl 包被 ELISA 检测孔, 4 过夜含 0.05% Tween-20 的 PBS 缓冲液洗板, 含 3% BSA 的 PBS 溶液封闭, 37 孵育 1 h 含 0.05% Tween-20 的 PBS 缓冲液洗板, 抗原包被孔中加入 100 µl 抽提的可溶性抗体, 37 孵育 1 h 用含 0.05% Tween-20 的 PBS 缓冲液洗板 3 次, 然后加入含 0.05% Tween-20 的 PBS 稀释的抗 -His HRP 抗体偶联物 ( ) 100 µl, 37 孵育 1 h 用含 0.05% Tween-20 的 PBS 缓冲液洗孔 3 次, 向孔内加入 TMB 显影试剂 100 µl, 1 mol L 1 HCl 100 µl 终止显色反应, ELISA 酶标仪于 450 nm 波长读数 DNA 测序 [7, 10] 竞争性 ELISA 测定阳性克隆送 Invitrogen 公司测序稀释 IgE 蛋白 ( 浓度范围为 1.28~167 nmol L 1 ) 后与 0.16 ng L 1 纯化的抗 IgE scfv 预混合, 孵育 30 min 混合物加到 IgE 包被 ELISA 检测孔, 4 过夜竞争性 ELISA 检测同上 ELISA 法结果 1 人源 VH/VL 抗体基因库的构建以从患者外周血淋巴细胞中提取的 mrna 为模板, 反转录合成 cdna, 分别扩增了全套抗体 VH 和 VL 基因 ; 然后将 VH 和 VL 基因组装, 由此成功构建了 VH/VL 抗体基因库本实验在构建核糖体展示模板时, 其产物为 30.2 μg, 片段长度为 bp, 根据 1 μg of bp DNA = 1.52 pmol = molecules 进行计算 [11], 库容为图 1 显示为构建的单链抗体基因库 Figure 1 PCR products of VH, VL & display template gene library. 1: VH gene; 2: VL gene; M: DNA marker; 3: DNA display template gene 2 核糖体展示产物的富集筛选用人 IgE 蛋白进行筛选将每轮富集到的 cdna 作为模板进行同样条件的单引物扩增, 共进行 3 轮筛选为了检测筛选效率, 从基因富集水平对富集效果进行监控图 2 所示每次筛选富集所得基因库产物结果显示 : 通过捕获, 扩增到了单一的 DNA 条带以 IgE 作为筛选靶标, 以未加 DNA 模板的 TNT 反应体 Figure 2 Human IgE ribosome display screening. 1: PCR product of 1st in-situ single primer ribosome display in IgE well; 2: PCR product of 2nd in-situ single primer ribosome display in IgE well; 3: PCR product of 3rd in-situ single primer ribosome display in IgE well; M: DNA marker; 4: PCR products of in-situ single primer no DNA ribosome display in IgE well; 5: PCR products of in-situ single primer ribosome display in BSA control well

张勇侠等 : 应用核糖体展示技术高效筛选人源抗 IgE 单链抗体 1333 系为体系对照, 未显示扩增条带, 排除无细胞体系对展示的干扰经过 3 轮筛选获得的目的基因亮度呈增加趋势 ; 以 BSA 作为阴性对照, 扩增得到的基因条带明显弱于目的基因, 表明通过 3 轮展示针对 IgE 的目的基因得到了有效富集 3 阳性重组克隆的菌落 PCR 及 Dot

代表阳性对照, 代表阴性对照从图 4 可以看出, 共 66 个样品, 每个样品两个重复, 与阴性可溶性抽提物相比较, 共 23 个阳性克隆可溶性抽提物显示灰色斑点 His 检测阳性率为 35% Figure 5 ELISA screening positive clones.

蛋白浓度的增加, 与包被孔中 IgE 蛋白结合的抗 IgE scfv 浓度呈指数级减少, 证实抗 IgE scfv 能特异性识别 IgE 蛋白 Figure 3 Analyzing transformants by PCR.

coli Rosseta (DE3) 可溶性提取物作阴性对照图 5 显示了 15 株复筛阳性克隆抗体抗原结合活性的 ELISA 数值结果显示 : pet-ige-6 阳性克隆菌针对抗原 IgE 显示最强结合活性 5 DNA 测序及竞争性 ELISA 测定筛选到的人源抗 IgE 阳性克隆菌 pet-ige-6 DNA 测序结果见图 6 IgBlast

可针对大容量基因库 ( 如库容高达 1 10 12 ~1 10 13 ) 进行富集筛选其次, 在 3 轮循环筛选中利用 PT-PCR 进行 cdna 回收, 在 PCR 过程中可引入点突变改变功能蛋白的专一性与亲和性, 同时通过核糖体蛋白质 -mrna 三联体的配体结合反应选择功能蛋白 [8, 9] 本实验核糖体展示筛选中用原位 RT-PCR 以

5 张勇侠等 : 应用核糖体展示技术高效筛选人源抗 IgE 单链抗体 1333 系为体系对照, 未显示扩增条带, 排除无细胞体系对展示的干扰经过 3 轮筛选获得的目的基因亮度呈增加趋势 ; 以 BSA 作为阴性对照, 扩增得到的基因条带明显弱于目的基因, 表明通过 3 轮展示针对 IgE 的目的基因得到了有效富集 3 阳性重组克隆的菌落 PCR 及 Dot blotting 鉴定菌落 PCR 检测结果 ( 图 3) 显示, 克隆阳性率 90%, 由于 PCR 检测只能证明基因组中含有目的基因, 但无法确定目的基因是否能够得到高效表达, 仍需进一步用其他方法进行筛选通过 Dot blotting 进行杂交反应后, 可溶性抽提物在抗 -His HRP 抗体偶联物的检测背景中显出灰色的阳性信号, 结果如图 4, + 代表阳性对照, 代表阴性对照从图 4 可以看出, 共 66 个样品, 每个样品两个重复, 与阴性可溶性抽提物相比较, 共 23 个阳性克隆可溶性抽提物显示灰色斑点 His 检测阳性率为 35% Figure 5 ELISA screening positive clones. 1 15: 15 ELISA values of positive colony antigen-antibody reactions; NC: Negative control 克隆造成的以结合的抗 IgE scfv 为横坐标, 结合的抗 IgE scfv 与游离抗 IgE scfv 比值为纵坐标作图 ( 图 7), 结果显示随着 IgE 蛋白浓度的增加, 与包被孔中 IgE 蛋白结合的抗 IgE scfv 浓度呈指数级减少, 证实抗 IgE scfv 能特异性识别 IgE 蛋白 Figure 3 Analyzing transformants by PCR. 1 20: Colony PCR products of 20 colonies Figure 4 Dot blotting screening positive clones 4 阳性克隆的 ELISA 鉴定结果将筛选到的阳性克隆培养表达提取可溶性蛋白与包被抗原孔进行 ELISA 反应 BSA 作空白对照, 无质粒的空 E.coli Rosseta (DE3) 可溶性提取物作阴性对照图 5 显示了 15 株复筛阳性克隆抗体抗原结合活性的 ELISA 数值结果显示 : pet-ige-6 阳性克隆菌针对抗原 IgE 显示最强结合活性 5 DNA 测序及竞争性 ELISA 测定筛选到的人源抗 IgE 阳性克隆菌 pet-ige-6 DNA 测序结果见图 6 IgBlast 序列分析显示 : 该序列为全新的 DNA 序列, 该 DNA 序列在框架区引入了许多点突变, 这可能是由于体内体细胞突变或者体外 PCR 讨论核糖体展示技术是针对大容量基因库高效筛选功能基因的有效方法之一, 核糖体展示技术相比于目前的体内展示技术 ( 噬菌体展示技术酵母表面展示技术 ) 有两个关键的特性首先, 筛选不受转化效率的限制, 可针对大容量基因库 ( 如库容高达 ~ ) 进行富集筛选其次, 在 3 轮循环筛选中利用 PT-PCR 进行 cdna 回收, 在 PCR 过程中可引入点突变改变功能蛋白的专一性与亲和性, 同时通过核糖体蛋白质 -mrna 三联体的配体结合反应选择功能蛋白 [8, 9] 本实验核糖体展示筛选中用原位 RT-PCR 以 mrna 为模板直接回收 cdna, 该方法不需要将 mrna 从核糖体上解离, 一方面减少样品在解离过程中造成的损失, 另一方面提高了样品回收的效率 [8, 9] 目前无细胞表达系统包括 E. coli S30 提取物 [12] 兔网织红细胞裂解液 [13] 麦芽胚提取物 [14] 人肾细 [15] 胞裂解提取物等真核系统较原核系统有一定的优越性, 原核系统受内源 RNase 的影响较大, 生成的 mrna 容易降解, 而真核系统受内源 RNase 的影响较小本研究采用了转录翻译偶联的 TNT 兔网织红细胞表达体系, 持续转录使 mrna 水平更为稳定, 真核系统有利于提高某些蛋白质的翻译和折叠效率 [16]

6 1334 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (10): Figure 6 DNA and amino acid sequence of the positive clone pet-ige-6. underlined. (G4S)3 linker is highlighted and the C-terminal (His)6-tag is in bold Complementarity determining regions (CDRs) are 检测体内外血清中的 IgE 分子水平, 也可以直接或者连接一个化学药物基团中和体内可溶性和细胞膜上的 IgE, 降低致敏原 IgE 的水平 References [1] Tripathi P, Sigh BP, Arron N. Recombinant allergens-gateway to efficient diagnosis and therapy for atopic asthma and rhinitis [J]. [2] [7] Figure 7 ELISA analysis. Competitive inhibition assay. b/f is the ratio of bound anti IgE scfv concentration to free anti IgE scfv concentration ScFv 以其不含 Fc 段, 免疫源性低; 相对分子质 The pharmacological basis of anti-ige therapy Nat Biotechnol, 2000, 18: Sutton BJ, Beavil RL, Beavil AJ. interactions [J]. [4] Nowak D. Inhibition of IgE-receptor Br Med Bull, 2000, 56: Management of asthma with anti-immunoglobulin E: a review of clinical trials of omalizumab [J]. 量小, 穿透力强以及可在大肠杆菌等原核体系表达, 易于进一步基因工程改造等优点而受到重视 [17] 大 Chang TW. [J]. [3] Indian J Allergy Immunol, 2006, 20: Respir Med, 2006, 100: [5] D Amato G, Salzillo A, Piccolo A, et al. A review of anti-ige 肠杆菌表达 scfv 为抗体分子进化提供一种有用的筛 monoclonal antibody (omalizumab) as add on therapy for 选系统本实验获得的人源抗 IgE 抗体有望进一步开 severe allergic (IgE mediated) asthma [J]. 发为具有自主知识产权的哮喘治疗用新药, 可用于 Manag, 2007, 3: Ther Clin Risk

7 张勇侠等 : 应用核糖体展示技术高效筛选人源抗 IgE 单链抗体 1335 [6] Shen BF. Recombinant Antibody ( 重组抗体 ) [M]. Beijing: Science Press, 2005: [7] Wang MR, Zhang YX, Du TF, et al. Bacterial expression and characterisation of a novel human anti-ige scfv fragment [J]. MAbs, 2011, 3: [8] He MY, Taussig MJ. Eukaryotic ribosome display with in situ DNA recovery [J]. Nat Methods, 2007, 4: [9] He MY. Eukaryotic ribosome display with in situ DNA recovery [M] // Bryan M. Methods in Molecular Biology. New Jersey: Humana Press, 2012, 805: [10] Wang MR, Zhang YX, Gao Q, et al. A fully human recombinant anti-ige antibody: CN, [P] [11] Lamlat E, Rdmann VA. Searching sequence space for high affinity binding peptides using ribosome display [J]. J Mol Biol, 2003, 329: [12] Zhao XL, Chen WQ, Li JM, et al. Preparation of human antibodies to TNF2α using ribosome display technology [J]. Chin J Cell Mol Immunol ( 细胞与分子免疫学杂志 ), 2009, 25: [13] Liu YC, Song J. Construction and verification of a highcapacity human single chain Fv antibody library by ribosome display [J]. J Fujian Med Univ ( 福建医科大学学报 ), 2009, 43: [14] Zhang J, Liu QM, Xu DK, et al. In situ fabrication and application of protein microarray with cell-free system [J]. Prog Biochem Biophys ( 生物化学与生物物理进展 ), 2009, 36: [15] Loughran G, Firth AE, Atkins JF. Ribosomal frameshifting into an overlapping gene in the 2B-encoding region of the cardiovirus genome [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108: E [16] Levin AM, Weiss GA. Optimizing the affinity and specificity of proteins with molecular display [J]. Mol Biosyst, 2006, 2: [17] Dong ZW. Antibody Engineering ( 抗体工程 ) [M]. Beijing: Peking Union Medical College Press, 1997: 欢迎订阅 2013 年中国化学快报中国化学快报 (Chinese Chemical Letters) (CN: /O6, ISSN: ) 是由中国化学会主办中国医学科学院药物研究所承办国内外公开发行的化学综合性学术期刊中国化学快报的办刊宗旨是新快准, 自 1990 年创刊以来, 以报道覆盖化学各领域的原创性研究成果为特色, 旨在促进国内外学术交流中国化学快报为我国自然科学核心期刊, 本刊已被 SCI 收录, 2011 年的影响因子为 0.978, 总被引频次为 2566, 居我国化学刊物前列, 在国际上享有一定知名度本刊荣获中国科协 2012~2014 年学会能力提升专项 : 优秀国际科技期刊奖二等奖, 为中国化学类期刊唯一获奖期刊本刊为 126 页, 月刊, 16 开本每期定价 33 元, 全年定价 396 元国内邮发代码 : 欢迎广大作者踊跃投稿, 欢迎广大读者订阅可采用的订阅方式如下 : 通过当地邮局 : 通过本刊编辑部, 联系人 : 刘秀荣电话 : 地址 : 北京市先农坛街 1 号中国化学快报编辑部邮编 :

Syngene GBOXHR Retsch MM400 KQ DE Eppendorf Table 1 The sources of Astragali Radix and Hedysarum Radix No. 1 AMM2011_NMGTY Astr

Syngene GBOXHR Retsch MM400 KQ DE Eppendorf Table 1 The sources of Astragali Radix and Hedysarum Radix No. 1 AMM2011_NMGTY Astr PCR 龙平, 崔占虎, 李虔全, 徐建平, 张春红, 周立社 * *, 李旻辉 ( 包头医学院, 内蒙古包头 014060) DNA 30 28 DNA trnl-trnf PCR PCR 136 bp 323 bp 10% PCR PCR Astragalus membranaceus Fisch. Bge. var. mongho- licus Bge. Hsiao A. membranaceus