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遛阴宦
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1 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2017,39(16) 1625 DOI: /j HIF1α 特异性人源喉癌噬菌体单链抗体的制备及其对放疗增敏的实验研究周寒静 1,2, 刘静姝 1,2, 隆姝孜 1,2, 唐翠萍 1 1,3, 张涛 ( 重庆, 重庆医科大学附属第一医院肿瘤科 1, 分子肿瘤及表观遗传学重庆市重点实验室 2, 放射医学与肿瘤研究室 3 ) [ 摘要 ] 目的利用噬菌体肽库技术, 构建 HIF1α 人源喉癌单链抗体 (singlechainvariable fragment,scfv), 研究其对放疗敏感性的影响方法提取喉癌患者癌旁阳性淋巴结总 RNA, 通过 RT PCR 和重叠延伸 PCR 扩增得到可变区基因 scfv, 将其重组到载体 pcantab5e 中, 转化至 TG1 大肠杆菌, 以制备初级抗体库以 HEP2 细胞及 HIF1α 纯化抗原对抗体库进行淘选 SDSPAGE 电泳检测 scfv 的可溶性表达,Westernblot 检测其对 HIF1α 蛋白表达的影响,ELISA 和细胞免疫化学鉴定其特异性,CCK8 检测 scfv 联合 X 线照射后 HEP2 细胞的存活率, 克隆形成实验分析 scfv 处理后 HEP2 细胞放疗存活曲线结果成功制备 HIF1α 人源喉癌单链抗体 scfv,sdspage 电泳证实其可溶性表达且相对分子质量约为 ,Westernblot 表明其能下调 HIF1α 蛋白的表达 ELISA 检测到该抗体对 HIF1α 抗原的识别率高达 79%, 细胞免疫化学显示该抗体与 HEP2 细胞特异性结合 CCK8 检测结果显示 scfv 联合 X 线照射后, 较单纯 X 线照射组明显降低了 HEP2 细胞的存活率 (P<0.05), 克隆形成实验结果显示 scfv 对放射的增敏比为 1.89 结论成功构建了 HIF1α 人源喉癌单链抗体, 且其能增加 HEP2 细胞对放疗的敏感性 [ 关键词 ] 噬菌体单链抗体 scfv; 喉癌 ;HIF1α; 放疗增敏 [ 中图法分类号 ] R39233;R392.11;R [ 文献标志码 ] A Preparation ofhuman phage displayed singlechain antibody againsthypoxia induciblefactor1 alpha oflaryngealcarcinoma and itsefecton radiotherapy sensitization ZHOUHanjing 1,2,LIU Jingshu 1,2,LONG Shuzi 1,2,TANG Cuiping 1,ZHANG Tao 1,3 ( 1 DepartmentofOncology, 2 ChongqingKeyLaboratoryofMolecularOncologyandEpigenetics, 3 DepartmentofRadiationMedicineandOncology, thefirstafiliatedhospitalofchongqingmedicaluniversity,chongqing,400016,china) [Abstract] Objective Toconstructaphagedisplayedlibraryandidentifyphagedisplayedsingle chainvariablefragment(scfv)antibodyagainsthypoxiainduciblefactor1alpha(hif1α)oflaryngeal carcinoma.methods TotalRNA ofpositivelymph nodetisuesadjacenttolaryngealcarcinomawas extracted.scfvgenefragmentswereamplifiedbyrtpcrandsplicingoverlapextension(soe)pcr,then linkedintothepcantab5ephagemidvector.therecombinantplasmidsweretransformedintoe.colitg1 celsinordertocreatetheprimaryphagedisplayedscfvlibrary.theprimaryscfvlibrarywasperformedby biopanningagainsthep2celsandhif1αantigen.thepropertiesoftheproductwereidentifiedbywestern bloting,anditsspecificitywasdetectedbyelisaandimmunocytochemicalasay.cck8asaywasusedto detectitsefectoncelviability,andcelcloneasaywasusedtodetectitsefectonsurvivalfraction. Results A phagedisplayed scfv library targeting HIF1α antigen and HEP2 celswas succesfuly constructed.thepreparedscfvantibodyhadanapparentmolecularweightof anddownregulatedthe expresionofhif1αproteininhep2cels.elisa showedthattheobtainedscfvantibodyhadapositive recognitionrateof79% tohif1αantigen.immunocytochemicalasayindicatedthatitcouldspecificalybind [ 基金项目 ] 重庆市卫生和计生委中医药科技项目 (ZY ); 肿瘤科国家临床重点专科建设项目 [ 国卫办医函 (2013)544 号 ] [ 通信作者 ] 张涛, tumorzt@163.com [ 优先出版 ] htp://kns.cnki.net/kcms/detail/ r html

2 1626 第三军医大学学报,2017,39(16) htp://aammt.tmmu.edu.cn tohep2cels.theobtainedscfvantibodydecreasedtheviabilityofhep2celsafterxrayradiationwhen comparedwiththecelstreatedbyradiationalone(p<0.05).colonyformationtestshowedthatthe sensitizationenhancementratio(ser)oftheantibodytoradiationwas1.89.conclusion Ahumananti HIF1αscFvantibodyoflaryngealcarcinomaissuccesfulyprepared,anditcanincreasetheradiation sensitivityofhep2cels. [Keywords] phagedisplayedsinglechainvariablefragmentantibody;laryngealcarcinoma;hypoxia induciblefactor1alpha;radiotherapysensitization SupportedbytheProjectsofTraditionalChineseMedicineScienceand TechnologyofChongqingMunicipalHealth and FamilyPlanningCommision 163.com 喉癌 (laryngealcarcinoma) 是头颈部常见的恶性肿瘤, 占全身所有肿瘤的 3% ~5%, 其治疗方式主要有手术治疗放疗和化疗 [1] 近年来, 提高喉癌患者生活质量越来越受到关注, 保留喉的结构和功能是一个必要条件因为放疗不会破坏正常的组织结构, 所以在喉癌治疗中占有重要地位 [2] 然而, 放疗在治疗剂量内仍然会产生正常组织的放射损伤和肿瘤放射抵抗的情况, 因此提高放疗敏感性是其关键环节 [3] 目前研究表明, 缺氧诱导因子 1α(hypoxiainduciblefactor 1alpha,HIF1α) 在多种肿瘤组织中高表达, 调控不同信号通路, 抑制肿瘤细胞凋亡, 与肿瘤的生长转移及放疗不敏感密切相关 [4-5] 本研究利用噬菌体肽库技术, 构建天然单链抗体库, 并利用喉癌 HEP2 细胞和 HIF1α 纯化抗原对其进行联合筛选, 成功获得具有喉癌靶向的抗 HIF1α 特异性单链抗体 (singlechainvari ablefragment,scfv), 初步证实其增加 HEP2 细胞对放疗的敏感性, 旨在为实现喉癌靶向治疗和放疗增敏作用奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料组织标本 8 例喉癌患者癌旁淋巴结组织来源于重庆医科大学附属第一医院耳鼻喉科科 2015 年 3-7 月的手术患者, 患者均知情同意, 病理报告证实为癌转移阳性淋巴结主要材料与试剂 TRIzol 试剂购自 Invitro gen 公司 ; 反转录试剂盒购自 Promega 公司 ;PCR 相关试剂限制性内切酶 NotⅠ 和 SfiⅠ 购自 TaKaRa 公司 ; 噬菌体展示系统 ( 辅助噬菌体 M13KO7 载体 pcant AB5E E.coliTG1 E.coliHB2151) 为本实验室保存 ; 质粒小提试剂盒 DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根公司 ;HRP 标记的鼠抗 M13 单抗兔抗 Etag 多抗和鼠抗 HIF1α 单抗购自 Abcam 公司 ;HRP 标记的羊抗兔二抗购自 CST 公司 ;HRP 标记的羊抗鼠二抗购自 Abgent 公司 ;HIF1α 纯化抗原购自 Abnova 公司 ; 胰蛋白酶胎牛血清 DMEM 培养基购自 Gibco 公司 ; 人喉癌细胞 HEP2 鼻咽癌细胞系 CNE1 和人结肠癌细胞 SW480 均由本实验室保存引物包括 6 条重链 (VH) 5 条 Vκ 和 6 条 Vλ 上下游序列,1 条可重叠的互补 Linker 序列和相应的合成 scfv 的上下游序列, 所有 PCR 和重叠延伸 PCR(splicingoverlappingextend PCR,SOEPCR) 引物为本实验室保存 1.2 方法 VH 和轻链 (VL) 基因的扩增及 scfv 基因的合成 TRIzol 提取淋巴结总 RNA,2% 琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性 RNA 反转录合成 cdna,pcr 扩增 VH 和 VL 基因片段, 以 VH 和 VL 基因片段扩增, 分别在其上下游连接 Linker 序列 PCR 条件 :95 5min; 94 35s,55 35s,72 50s,32 个循环 ;72 5 min 产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳鉴定和胶回收试剂盒回收基因片段 VHLinker 和 VLLinker 片段经 SOEPCR 拼接成 scfv 片段反应条件 :95 5min; 94 50s,57 50s,72 65s,5 个循环 ; 补加合成 scfv 的上下游引物各 1μL 继续 PCR 反应, 反应条件 : 95 5min;94 40s,55 40s,72 60s,28 个循环 ;72 10min 2% 琼脂糖凝胶电泳检测并回收 scfv 片段 scfv 噬菌体初级抗体库的制备 scfv 片段经 SfiⅠ 和 NotⅠ 双酶切后与 pcantab5e 载体连接, 电转化至感受态 E.coliTG1, 铺 SOBAG 平板后孵育过夜, 次日随机挑单克隆摇菌过夜取 5mL 菌液提取质粒, 进行质粒 PCR 鉴定, 鉴定阳性的克隆送测序检测阳性克隆的菌液涂 SOBAG 平板孵育过夜, 次日用 2YT 培养基洗下菌苔后加入 M13KO7 振摇 2h, 离心, 2YTAK( 含 100μg/mL 氨苄青霉素和 50μg/mL 卡那霉素 ) 培养基重悬, 振摇 12h, 离心, 加入上清体积 1/5 的 PEG/NaCl 溶液, 冰置 50min, 离心, 沉淀重悬于 2YT 液, 再次离心后取上清, 即为 scfv 噬菌体初级抗

htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2017,39(16) 1627 体库,0.25μm 滤器过滤,4 保存 1.2.3 噬菌体 scfv 的生物淘选以喉癌 HEP2 细胞进行 3 轮细胞淘选, 然后用 HIF1α 抗原进行 3 轮抗原淘选 [6-7] 用 1%BSA 溶液重悬 HEP2 细胞, 冰置 40min, 离心, 加入初级抗体库液孵育 1.

3 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2017,39(16) 1627 体库,0.25μm 滤器过滤,4 保存噬菌体 scfv 的生物淘选以喉癌 HEP2 细胞进行 3 轮细胞淘选, 然后用 HIF1α 抗原进行 3 轮抗原淘选 [6-7] 用 1%BSA 溶液重悬 HEP2 细胞, 冰置 40min, 离心, 加入初级抗体库液孵育 1.5h, 离心,PBS 洗涤细胞沉淀, 加入 1mL 洗脱液 (0.1mol/LTrisHCl, ph=2.2), 冰浴 5min, 加入 60μL 中和液 (2mol/L TrisHCl,pH=7.4), 离心后取上清, 加入新鲜培养的 TG1 菌液振摇 2h, 加入 M13KO7 氨苄青霉素葡萄糖溶液, 振摇 2h, 离心, 加入 2YTAK 液继续振摇 16h, 加入 PEG/NaCl 溶液, 冰置 50min, 离心, 重悬于 2YT 液, 再次离心后取上清, 用于下一轮富集, 共进行 3 轮细胞淘选, 估算每轮筛选后的抗体滴度 HIF1α 抗原 (3μg/mL) 包被免疫管,4 过夜, 加入 2% BSA 溶液封闭 1.5h, 加入淘选后的抗体库液, 后续步骤同细胞淘选一致噬菌体 ELISA 及噬菌体单链抗体的可溶性表达将上述最后 1 轮筛选涂的 SOBAG 平板随机挑取单菌落, 加入 2YTAK 液振摇过夜, 次日加入 M13KO7 振摇 2h, 离心, 加入 2YTAK 液振摇过夜, 离心, 上清为单克隆的噬菌体抗体 scfv 96 孔板加入 HIF1α 抗原 (2μg/mL,100μL/ 孔 ) 包被, 经过洗涤和封闭, 加入制备的 scfv 噬菌体抗体 100μL/ 孔, 以 PBS 液为对照组, 行噬菌体 ELISA 检测, 加入 HRP 标记的抗 M13 单抗,TMB 避光反应 30min, 酶标仪测定波长 450nm 处光密度值 [D(450)], 以 scfv 组 /PBS 组 >4 为阳性将强阳性噬菌体抗体感染新鲜培养的 E.coli HB2151 菌液, 稀释后涂 SOBAG 平板, 次日挑单克隆于 2YT 液过夜培养, 加入 IPTG(1mmol/L) 诱导可溶性表达, 离心, 沉淀重悬于 Hepes 缓冲液, 超声碎菌后离心取上清, 即制备得到可溶性 scfv,0.25μm 滤器过滤, 保存于 -80 备用可溶性 scfv 的鉴定细胞免疫化学法 (ICC) 检测抗体的特异性, 将喉癌 HEP2 细胞鼻咽癌 CNE1 细胞和人结肠癌细胞 SW480 分别接种于 96 孔板, 经过固定封闭后, 加入 scfv(150μg/ml,100μl/ 孔 ) 4 孵育过夜, 次日分别加入兔抗 Etag 一抗和 HRP 标记的兔二抗,DAB 和苏木精染色后, 显微镜观察拍照可溶性 scfv 经 SDSPAGE 电泳后, 将凝胶用考马斯亮蓝染色 2h, 脱色后拍照, 同时用兔抗 Etag 为一抗鉴定相对分子质量将 HEP2 细胞接种于培养皿中, 待细胞贴壁后, 实验组加入 scfv(50μg/ml 和 150μg/mL) 处理 24h 后, 给予 4Gy 的 X 线照射,24h 后提取细胞总蛋白,Westernblot 检测其 HIF1α 蛋白的表达情况 scfv 对 HEP2 细胞放疗增敏作用 CCK8 实验检测细胞的存活率, 将 HEP2 细胞均匀接种于 96 孔板 (10000/ 孔 ), 贴壁后 scfv 处理组加入 scfv (150μg/mL,100μL/ 孔 ) 孵育 24h, 未加 scfv 为单纯照射组, 经过 Gy 的 X 线照射后, 继续培养 12h 后加入 CCK8 试剂, 酶标仪测定 D(450) 克隆形成实验分析细胞的存活分数, 将 HEP2 细胞均匀接种于孔板 (1000/ 孔 ), 贴壁后实验组加入 scfv (150μg/mL), 未加 scfv 为单纯照射组, 然后给予 Gy 的 X 线照射, 细胞培养 2 周后, 用 4% 多聚甲醛固定和结晶紫染色并计数克隆数, 细胞克隆形成率 (platingeficiency,pe)=( 细胞克隆数 / 接种细胞数 ) 100%, 细胞存活分数 (survivingfraction,sf)=pe ( 受照射细胞 )/PE( 对照细胞 ), 利用 GraphPad5 软件, 以单击多靶模型 SF=1-(1-e -kd ) N 拟合放疗存活曲线,k=1/D 0 ;lnn=dq/d 0, 增敏比 =D 0 ( 单纯照射组 )/D 0 (scfv 处理组 ) 1.3 统计学方法数据以 x±s 珋表示, 采用 SPSS19.0 统计软件进行两独立样本 t 检验, 计数资料用 χ 2 检验检验水准 : α= 结果 2.1 scfv 基因组装合成和重组质粒的鉴定 TRIzol 提取组织总 RNA, 凝胶电泳可见完整 28S 18S 5S3 根条带,D(260)/D(280) 比值为 1.8, 说明 RNA 无降解且纯度较高 ( 图 1) VH VL 扩增产物经凝胶电泳分析在 bp 处有特异性条带 ( 图 2), SOEPCR 组装拼接产物 scfv 经电泳鉴定其大小为 750bp( 图 3) 随机挑选 12 个克隆质粒行 PCR 鉴定, 其中 11 个质粒扩增出大小 750bp 的片段, 插入率达 91.7%( 图 4) 质粒的测序报告显示, 阳性质粒比对结果与整码的 scfv 编码序列的一致率达 99% 1 2: 分别为 2 例喉癌患者图 1 喉癌患者癌旁淋巴结组织 RNA 电泳

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1 轮的 115 倍, 说明人源喉癌相关抗 HIF1α 抗体库得到了有效富集噬菌体 ELISA 检测随机挑选的 14 个噬菌体抗体, 有 11

3 可溶性 scfv 的表达及鉴定 scfv 结合 HEP2 细胞 CNE1 细胞和 SW480 细胞的免疫细胞化学检测结果显示, 制备的

结果显示蛋白相对分子质量约为 34 10 3 ( 图 6) scfv 处理 HEP2 细胞 24h 后, 经 X 线照射,HIF1α

M:DNA 标准 ;1~12: 随机挑选初级抗体库 12 个克隆图 4 随机挑选质粒 PCR 鉴定 A:SDSPAGE 电泳 M:

4 1628 第三军医大学学报,2017,39(16) htp://aammt.tmmu.edu.cn M: 标准 ;1:VH(360bp);2:Vκ(340bp);3:Vλ(340bp) 图 2 PCR 扩增 VH 和 Vκ Vλ 基因的凝胶电泳分析 2.2 噬菌体 scfv 的淘选和噬菌体 ELISA 经过 3 轮细胞淘选和 3 轮 HIF1α 抗原筛选, 抗体的收获率逐轮提高, 第 6 轮是第 1 轮的 115 倍, 说明人源喉癌相关抗 HIF1α 抗体库得到了有效富集噬菌体 ELISA 检测随机挑选的 14 个噬菌体抗体, 有 11 个与 HIF1α 抗原呈阳性反应, 阳性展示率达 79% 2.3 可溶性 scfv 的表达及鉴定 scfv 结合 HEP2 细胞 CNE1 细胞和 SW480 细胞的免疫细胞化学检测结果显示, 制备的 scfv 与 HEP2 细胞特异性结合 ( 图 5) 可溶性 scfv 经 SDSPAGE 电泳和 Westernblot 结果显示蛋白相对分子质量约为 ( 图 6) scfv 处理 HEP2 细胞 24h 后, 经 X 线照射,HIF1α 蛋白表达降低 ( 图 7) M: 标准 ;1~4:scFv 基因片段 (750bp) 图 3 PCR 扩增 scfv 基因的凝胶电泳分析 M:DNA 标准 ;1~12: 随机挑选初级抗体库 12 个克隆图 4 随机挑选质粒 PCR 鉴定 A:SDSPAGE 电泳 M: 蛋白标准,1: 可溶性 scfv;b:westernblot 检测 scfv 的表达图 6 scfv 可溶性表达和 Westernblot 检测其相对分子质量 1: 空白对照组 ;2:50μg/mLscFv 处理组 ;3:150μg/mL scfv 处理组图 7 不同浓度 scfv 处理 HEP2 细胞对 HIF1α 蛋白表达的影响 A:HEP2 细胞 ;B:CNE1 细胞 ;C:SW480 细胞图 5 细胞免疫化学检测单链抗体 scfv 的特异性 (ICC 100)

5 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2017,39(16) scfv 对 HEP2 细胞的放疗增敏作用 CCK8 结果显示,scFv 处理组的细胞相对存活率明显低于单纯照射组 (P<0.05, 图 8) 克隆形成实验结果显示, 经过 0 2 4Gy 和 8Gy 的 X 线照射后,scFv 处理组细胞克隆形成率分别为 (28.07±0.91)% (2337±0.31)% (17.27±0.61)% (6.33±0.21)%, 单纯照射组细胞克隆形成率分别为 (34.77±1.44)% (30.87±1.20)% (24.67±0.55)% (16.13±0.40)% 同时, 通过计算得出 2 组的细胞存活分数,scFv 处理组细胞存活分数较单纯照射组相比明显降低 (P< 005) 利用单击多靶模型拟合细胞生存率曲线,scFv 处理组的效应曲线参数 N D 0 Dq 分别为 , 单纯照射组的效应曲线参数 N D 0 Dq 分别为 , 增敏比为 1.89 a:p<0.05, 与 scfv 处理组比较图 8 CCK8 检测单纯照射组和 scfv 处理组的细胞存活率 3 讨论喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤, 其治疗方式已从单一的手术治疗, 发展为手术治疗与放化疗相结合的多种治疗模式其治疗原则应在保证患者疗效的前提下, 尽可能保留喉功能从而提高患者的生活质量放疗的优势在于不破坏正常的组织结构而对肿瘤细胞产生杀伤效应, 然而放疗在治疗剂量内仍然会导致正常组织放射损伤和发生肿瘤放射抵抗目前研究表明 HIF1α 在多种肿瘤组织中表达升高, 调控肿瘤的侵袭转移 [1,8] HIF1α 可诱导 p21 和 p27 表达增高, 从而抑制细胞周期的 G 1 /S 期转换, 使细胞停滞在对放疗不敏感的 G 1 期, 产生放疗抵抗 [9-10] 同时, 有研究证实放疗可以提高肿瘤细胞 HIF1α 的表达水平, 加重放疗抵抗 [11] 由此可见,HIF1α 可能为影响肿瘤放疗敏感性的潜力靶点 [12-13] 目前针对 HIF1α 的一些基因治疗技术在导入基因的安全性方面存在风险, 以及如何保持基因稳定高效表达存在一定不足, 制约了其发展和推广 [14] 而 scfv 具有相对分子质量小特异性强人源性的特点和良好的药代动力学特征, 是极佳的肿瘤治疗手段 [15] 本研究利用噬菌体肽库技术, 制备人源喉癌相关抗 HIF1α 单链抗体, 为肿瘤的靶向治疗和提高放疗敏感性提供新的思路本研究基于前期课题组的研究成果 [6-7], 从喉癌癌旁淋巴结组织提取总 RNA 作为抗体库来源, 制备得到人源化的抗体, 克服了异源抗体的弊端, 减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应通过 RTPCR 扩增 VH 和 VL 可变区基因, 经 SOEPCR 拼接扩增目的 scfv 片段与载体 pcantab5e 重组后, 电转化至大肠杆菌表达, 构建初级抗体库克隆质粒 PCR 鉴定结果显示基因插入率为 91.7%, 阳性质粒测序报告比对结果与整码的 scfv 编码序列的一致率达 99%, 说明成功构建了抗体库以及保证了抗体库库容较大随后本研究利用 HEP2 细胞和 HIF1α 对初级抗体库一共进行 6 轮筛选, 抗体的收获率逐轮提高, 第 6 轮是第 1 轮的 115 倍, 说明本方法极大地提高了富集效率这是获得高亲和力的抗体关键环节之一我们将强阳性的噬菌体抗体感染大肠杆菌并诱导可溶性 scfv 的表达, SDSPAGE 证实其相对分子质量约为通过 ELISA 和细胞免疫化学检测表明, 筛选得到的抗体与 HIF1α 抗原和 HEP2 细胞特异性结合, 具有免疫活性基于 scfv 人源化和相对分子质量小的特点, 本研究将制备得到的 scfv 直接作用于 HEP2 人喉癌细胞, 经 X 线照射后, 发现制备的 scfv 可以降低 HEP2 细胞中 HIF1α 的表达这一现象与本课题组前期实验研究中发现 scfvabcg2 能明显抑制 ABCG2 的表达相似 [15], 同时许多研究只是发现 scfv 能明显抑制靶蛋白的功能 [16-18], 但未对 scfv 如何影响靶蛋白功能或 [19] 表达进行阐述 HAN 等研究发现,scFv 与靶蛋白结合后, 会导致结合后的蛋白向溶酶体转移, 可能促进了靶蛋白的降解, 从而在蛋白层面抑制了蛋白的表达至于在本研究中是否存在此途径或者其他的途径抑制蛋白表达, 还需进一步探讨在克隆形成实验中,scFv 处理组克隆形成率比单纯照射组细胞克隆形成率明显降低,scFv 处理组的细胞存活分数较单纯照射组相比均降低, 通过单机多靶模型拟合存活曲线发现,scFv 处理组的剂量效应曲线的参数 D 0 及 Dq 值均低于单纯照射组, 增敏比为 1.89>1, 说明制备得到的 scfv 有放疗增敏作用然而, 我们在前期的体外实验中发现抗体浓度不够, 在后续实验中我们将研究优化筛选策略, 提高蛋白表达浓度, 进一步通过动物实验论证其放疗

6 1630 第三军医大学学报,2017,39(16) htp://aammt.tmmu.edu.cn 增敏的作用, 探讨其放疗增敏的具体机制, 为临床研究 scfv 靶向治疗提供支持参考文献 : [1] SUZUKIG,YAMAZAKIH,OGO E,etal.Predisposing FactorsforLarynxPreservationStrategieswithNonsurgical MultimodalityTreatmentforLocalyAdvanced(T34)Lar ynx,hypopharynxandcervicalesophagealdisease[j].an ticancerres,2014,34(9): [2] SPIELMANNPM,MAJUMDARS,MORTONRP.Quality oflifeandfunctionaloutcomesinthemanagementofearly gloticcarcinoma:asystematicreviewofstudiescomparing radiotherapyandtransorallasermicrosurgery[j].clinoto laryngol,2010,35(5): doi: /j x. [3]LAISZ,LIW F,CHENL,etal.Howdoesintensitymodu latedradiotherapyversusconventionaltwodimensionalradio therapyinfluencethetreatmentresultsinnasopharyngealcar cinomapatients?[j].intjradiatoncolbiolphys,2011, 80(3): DOI: /j.ijrobp [4] KIM DH,GONGEJ,JUNGH Y,etal.Clinicalsignifi canceofintensive endoscopic screening forsynchronous esophagealneoplasm inpatientswithheadandnecksqua mouscelcarcinoma[j].scandjgastroenterol,2014,49 (12): DOI: / [5] SEMENZA G L.Hypoxiainduciblefactors:mediatorsof cancerprogresionandtargetsforcancertherapy[j].trends PharmacolSci,2012,33(4): DOI: / j.tips [6] 罗弋, 庞华, 李淑杰, 等. 人源抗 PeroxiredoxinⅠ 肺腺癌噬菌体抗体的制备及鉴定 [J]. 南方医科大学学报, 2010,36(5): DOI: /j x LUOY,PANGH,LISJ,etal.Preparationandcharacter izationofhumanphagedisplayantibodyagainstperoxiredoxin Ioflungadenocarcinoma[J].JSouthernMedUniv,2010, 36(5): DOI: /j x [7]ZHAOW S,LUOY,LIBY,etal.AntiABCG2scFvanti bodyoflungadenocarcinomaincreaseschemosensitivityand inducesapoptosisthrough the activation ofmitochondrial pathway[j].amjcancerres,2016,6(5): [8] OVERGAARD J.Hypoxicmodificationofradiotherapyin squamouscelcarcinomaoftheheadandneckasystematic reviewandmetaanalysis[j].radiotheroncol,2011,100 (1):22-32.DOI: /j.radonc [9]GODAN,RYANHE,KHADIVIB,etal.Hypoxiainduc iblefactor1αisesentialforcelcyclearestduringhypoxia [J].MolCelBiol,2003,23(1): DOI: /MCB [10]HANSX,ZHUQ,MAJL,etal.Apoptinsensitizesradia tioninducedceldeathviaclasicmitochondrial,caspase andp53dependentsignalinginhepg2cels[j].molmed Rep,2011,4(1):59-63.DOI: /mmr [11] OUG,ITASAKAS,ZENGL,etal.UsefulnesofHIF1 imagingfordeterminingoptimaltimingofcombiningbevaci zumabandradiotherapy[j].intjradiatoncolbiolphys, 2009,75(2): DOI: /j.ijrobp [12] CHENG,LIX,YANGJ,etal.Prognosticsignificanceof cyclooxygenase2expresioninpatientswithhepatocelular carcinoma:ametaanalysis[j].archmedsci,2016,12 (5): DOI: /aoms [13] DECECCOL,BOSSIP,LOCATIL,etal.Comprehensive geneexpresionmetaanalysisofheadandnecksquamous celcarcinomamicroaraydatadefinesarobustsurvivalpre dictor[j].annoncol,2014,25(8): doi: /annonc/mdu173. [14]NELSONAL,DHIMOLEAE,REICHERTJM.Develop menttrendsforhuman monoclonalantibodytherapeutics [J].NatRevDrugDiscov,2010,9(10): DOI: /nrd3229. [15] FARAJNIAS,AHMADZADEHV,TANOMANDA,etal. Developmenttrendsforgenerationofsinglechainantibody fragments[j].immunopharmacolimmunotoxicol,2014,36 (5): DOI: / [16] QIUQ,WANGQ,DENGC,etal.Smalmolecularpep tidescfvαvβ3conjugatesspecificalyinhibitlungcancer celgrowthinvitroandinvivo[j].am JCancerRes, 2016,6(12):2846. [17] PANXY,LIUXJ,LIJ,etal.TheANTITUMOReficacy ofantip21rasscfvmediatedbythedualpromoterregulated recombinantadenoviruskghv300[j].genether,2017, 24(1):40-48.DOI: /gt [18] MOHAMMADIM,NEJATOLLAHIF,GHASEMIY,etal. AntiMetastaticandAntiInvasionEfectsofaSpecificAnti MUC18scFvAntibodyonBreastCancerCels[J].Appl BiochemBiotechnol,2017,181(1): DOI: /s [19]HAND,WUJ,HANY,etal.AnovelantiPSMAhuman scfvhasthepotentialtobeusedasadiagnostictoolinpros tatecancer[j].oncotarget,2016,7(37): DOI: /oncotarget ( 收稿 : ; 修回 : ) ( 编辑汪勤俭 )

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽