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1 2016 生物工程学报 Chinese Journal of Biotechnology DOI: /j.cjb 医学与免疫生物技术陈云雨等 / 人源抗 ICAM-1 单链抗体的制备及其生物学活性鉴定 Dec. 25, 2018, 34(12): Chin J Biotech, All rights reserved ICAM-1 陈云雨 1,2, 孙红 2,3, 刘刚 1, 胡华波 1, 张国利 2, 刘晓平 1, 岳玉环 1 皖南医学院药学院新药筛选与评价中心, 安徽芜湖军事医学研究院军事兽医研究所, 吉林长春黑龙江生物科技职业学院生物制药系, 黑龙江哈尔滨陈云雨, 孙红, 刘刚, 等. 人源抗 ICAM-1 单链抗体的制备及其生物学活性鉴定. 生物工程学报, 2018, 34(12): Chen YY, Sun H, Liu G, et al. Preparation and identification of anti-human ICAM-1 scfv. Chin J Biotech, 2018, 34(12): 摘要 : 利用噬菌体展示技术筛选特异性人源抗 ICAM-1 单链抗体 (Anti-human ICAM-1 scfv) 并进行生物学活性鉴定应用 Tomlinson I+J 噬菌体抗体库, 以 P1 抗原肽为包被抗原, 经过 4 轮吸附 - 洗脱 - 扩增进行亲和富集筛选以 PCR 反应 ELISA 抗原交叉反应和 Dot blotting 实验进行阳性克隆的鉴定 scfv 经原核表达和分离纯化后, 以 Western blotting 实验竞争 ELISA 实验和细胞黏附抑制实验对其生物学活性进行初步鉴定 Tomlinson I+J 噬菌体抗体库经 4 轮亲和富集筛选, 利用 ELISA 方法成功筛出 4 株阳性克隆通过 PCR 鉴定反应 ELISA 抗原交叉反应和 Dot blotting 实验, 最终获得了 1 株既能与 P1 抗原肽特异结合又能与人 ICAM-1 抗原特异结合的阳性克隆 J-A1 对 scfv 进行原核表达和亲和层析后获得了高纯度的目的蛋白竞争 ELISA 实验和细胞黏附抑制实验证实纯化的 scfv 具有良好的亲和活性和抗细胞黏附活性文中成功利用噬菌体展示技术筛选到特异性人源抗 ICAM-1 scfv, 为进一步探索该抗体在炎症相关性疾病治疗中的应用奠定了基础 : 噬菌体展示技术, 细胞间黏附分子,ICAM-1, 单链抗体, 人源化抗体 Received: March 12, 2018; Accepted: May 2, 2018 Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos , ), Anhui Provincial Natural Science Foundation (No QH265), Jilin Province Science and Technology Development Program (No JH), The Doctoral Starting-up Fund of Wannan Medical College (No. RCQD201617), National Key Research and Development Program of China (No. 2016YFD ). Corresponding authors: Yuhuan Yue. Tel: ; yhyue2013@163.com Xiaoping Liu. Tel: ; liuxiaoping@wnmc.edu.cn 国家自然科学基金 (Nos , ), 安徽省自然科学基金 (No QH265), 吉林省科技发展计划 (No JH), 皖南医学院博士科研启动基金 (No. RCQD201617), 国家重点研发计划宠物病毒性传染病血液生物制品研究与产品创制 (No. 2016YFD ) 资助网络出版时间 : 网络出版地址 :

2 陈云雨等 / 人源抗 ICAM-1 单链抗体的制备及其生物学活性鉴定 2017 Preparation and identification of anti-human ICAM-1 scfv Yunyu Chen 1,2, Hong Sun 2,3, Gang Liu 1, Huabo Hu 1, Guoli Zhang 2, Xiaoping Liu 1, and Yuhuan Yue 2 1 Center for New Drug Screening & Evaluation, School of Pharmacy, Wannan Medical College, Wuhu , Anhui, China 2 Institute of Military Veterinary Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Changchun , Jilin, China 3 Department of Biomedicine, Heilongjiang Vocational College of Biology Science and Technology, Harbin , Heilongjiang, China Abstract: To screen the specific anti-human intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) single chain fragment variable (scfv) using phage display library technology and to identify its biological activity. P1 peptide was used as antigen, and the phage antibodies against human ICAM-1 antigen were panned by four binding-eluting-amplifying cycles using Tomlinson I+J phage display library. After four rounds of selective enrichment screening, the positive clones were determined by PCR, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)-based antigenic cross reaction and Dot blotting. Then the binding specificity and biological activity of purified scfv were identified by Western blotting, competitive ELISA and cell adhesion inhibition assay respectively. Furthermore, four positive clones were first panned through P1 peptide coated-elisa assay, and then J-A1 was obtained and identified by PCR, ELISA-based antigenic cross reaction and Dot blotting, which could show a specific binding between P1 peptide and human ICAM-1 protein antigen. Subsequently, the purified scfv showed a satisfactory specificity and anti-adhesive activity in competitive ELISA and the cell adhesion inhibition assay. The specific anti-human ICAM-1 scfv was prepared successfully from Tomlinson I+J phage display library, which pave the way for further application of anti-human ICAM-1 scfv for inflammation diseases therapeutics. Keywords: phage display technology, intercellular adhesion molecule, ICAM-1, scfv, humanized antibody 细胞间黏附分子 -1 (Intercellular adhesion molecule-1,icam-1) 广泛表达于多种细胞表面, 属于免疫球蛋白超家族成员, 是由膜外区跨膜区和胞浆区组成的跨膜糖蛋白在细胞生理状态时,ICAM-1 处于低水平表达 ; 当细胞受到致炎因子刺激后,ICAM-1 表达量明显增加通过与与传统的嵌合抗体相比, 单链抗体 (Single chain fragment variable,scfv) 不仅保持亲本抗体的特异性载体性和靶向性特点, 还具有分子量小免疫原性低组织穿透力强和易于改造等诸多优点, 已经成为重组抗体领域的研究热点 [8-9] 郝文波等利用抗 ICAM-1 单克隆抗体对噬菌体十淋巴细胞功能性相关抗原 (Lymphocyte functional 二肽库进行筛选, 证实保守序列 P1 短肽 antigen-1,lfa-1) 结合, 介导粒细胞淋巴细胞与血管内皮细胞的黏附, 促进白细胞游走和趋化于炎症病灶, 加重病理损伤, 在炎症性疾病的发生与发展中发挥重要作用, 已经成为炎症相关性疾病治疗的新靶标 [1-4] 利用重组抗体封闭 ICAM-1 生物学功能, 减轻并改善病理性炎症损伤已经成为抗炎治疗的重要策略目前, 应用抗 ICAM-1 单克隆抗体疗法对移植排斥反应自身免疫性疾病多发性骨髓瘤糖尿病肾病溃疡性结肠炎等多种疾病的治疗已经取得了较好的疗效 [5-7] (KLYLIAEGSVAA) 同样具有天然 ICAM-1 的生物学功能 [10] 本研究将 P1 短肽作为抗原, 利用 Tomlinson I+J 噬菌体抗体库, 经 4 轮吸附 - 洗脱 - 扩增亲和富集筛选人源抗 ICAM-1 scfv, 经分离纯化后, 对其生物学活性进行初步研究 1 材料与方法 1.1 材料小鼠抗 ICAM-1 单克隆抗体 (Monoclonal antibody,mcab) 2C5 由本实验室制备 ;P1 抗原肽 (KLYLIAEGSVAA) 由上海强耀生物科技有限 : :cjb@im.ac.cn

3 2018 ISSN CN /Q 生物工程学报 Chin J Biotech 公司合成 ;Tomlinson I+J 噬菌体抗体库辅助噬菌体 KM13 Escherichia coli TG1 和 E. coli HB2151 由中国科学院过程工程研究所刘瑞田教授惠赠 ;c-myc(9e10)-hrp 购自 Santa Cruz 公司 ; 脂多糖 (Lipopolysaccharide,LPS) 胰酶四甲基联苯胺溶液 (3,3ʹ,5,5ʹ-Tetramethylbenzidine,TMB) 和二氨基联苯胺溶液 (3,3ʹ-Diaminobenzidine, DAB) 购自 Sigma-Aldrich;2 Easy Taq 酶 DNA 标准分子量购自 TransGen 公司 ; 二辛可宁酸 (Bicinchoninic acid,bca) 蛋白浓度测定试剂盒购自 Thermo 公司 ;HisTrap 亲和层析柱购自 GE 公司 ; 人 ICAM-1 抗原购自 R/D 公司 ; 其他试剂为国产分析纯 1.2 方法抗 ICAM-1 scfv 的亲和富集筛选将 P1 抗原肽 (1 μg/ 孔 ) 包被 96 孔酶标板, 使用 Tomlinson I+J 噬菌体抗体库 (I 库库容 ;J 库库容 ;scfv 产物含有 c-myc 和 His 标签 ), 在 96 孔酶标板中实施 4 轮吸附 - 洗脱 - 扩增亲和富集筛选过程进行第 1 轮筛选时, 以含 0.1% Tween-20 的磷酸盐 (Phosphate buffered solution,pbs) 缓冲液 (PBST) 洗板 10 次, 第 2 轮及其以后的筛选中分别洗板 20 次, 充分洗去非特异性吸附的噬菌体洗涤后以胰酶室温消化 30 min, 洗脱噬菌体经过吸附 - 洗脱 - 扩增过程将每轮筛选所收集的噬菌体置于下一轮筛选条件中, 从而使阳性噬菌体得到富集并计算每轮筛选的富集倍数阳性克隆的 ELISA 检测将第 4 轮亲和富集筛选的阳性噬菌体感染 E. coli HB2151 后, 从所涂布的 TYE 平板上随机挑取单克隆菌落接种到 96 孔细胞培养板 ( 含 100 μg/ml Amp 和 1% 葡萄糖的 2 TY 培养基 ) 培养过夜次日从该板上转接 2 μl 菌液至第二块 96 孔细胞培养板 ( 含 100 μg/ml Amp 和 0.1% 葡萄糖的 2 TY 培养基 ),37 培养至 OD 600 约为 0.9 时加入 1 mmol/l IPTG 诱导,30 培养过夜次日离心取上清进行阳性克隆菌株的 ELISA 检测在 ELISA 检测中, 以 P1 抗原肽 (1 μg/ 孔 ) 包被 96 孔酶标板, 以包被 1 μg 牛血清白蛋白 (Bull serum albumin,bsa) 作为阴性对照酶标板经 2% 脱脂奶粉 (Skim milk) 封闭后, 每孔加入 50 μl 诱导上清, 室温孵育 1 h PBST 洗涤 3 次后, 每孔加入稀释的 c-myc(9e10)-hrp 抗体, 室温孵育 1 h 再以 PBST 洗板 3 次后, 每孔加入 TMB 底物溶液避光显色, 然后加入 2 mol/l H 2 SO 4 终止反应, 酶标仪测定 OD 450 值每份样品做双孔测定, 取 OD 平均值阳性克隆菌株确定标准 : OD 值为阴性对照值 3 倍以上 PCR 鉴定阳性克隆按照 pit-2 载体基因序列, 合成两条引物扩增 scfv 基因片段 P1:5ʹ-CAGGAAACAGCTATGA C-3ʹ;P2:5ʹ-CTATGCGGCCCCATTCA-3ʹ PCR 反应体系如下 : 引物 P1 (10 μmol/l) 和 P2 (10 μmol/l) 各 0.5 μl, 阳性克隆菌液 1 μl, 2 Easy Taq 10 μl, 再用无菌蒸馏水补足体积至 20 μl PCR 扩增条件 :94 预变性 5 min;94 30 s s s,30 个循环 ;72 延伸 10 min PCR 反应结束后, 用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增结果阳性克隆的 ELISA 抗原交叉反应实验分别以 P1 抗原肽 (1 μg/ 孔 ) 3% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 2% 脱脂奶粉 (Milk) 包被 96 孔酶标板,4 过夜次日, 每孔分别加入 PCR 鉴定含有完整 scfv 基因片段的阳性克隆诱导的上清进行 ELISA 抗原交叉反应实验, 实验步骤如所述 Dot blotting 实验鉴定阳性克隆将硝酸纤维素膜置于平皿中, 以 1 μl 人 ICAM-1 抗原 (1.0 mg/ml) 在硝酸纤维素膜中央

4 陈云雨等 / 人源抗 ICAM-1 单链抗体的制备及其生物学活性鉴定 2019 点样经 2% 脱脂奶粉封闭后, 加入 500 μl 经抗原交叉反应实验鉴定的阳性克隆诱导的上清, 以牛血清白蛋白 (BSA) 为阴性对照,37 孵育 2 h PBST 洗涤 3 次后, 每孔加入稀释的 c-myc(9e10)-hrp 抗体,37 孵育 1 h 再以 PBST 洗涤 3 次, 以 DAB 溶液显色抗 ICAM-1 scfv 的分离纯化与 Western blotting 鉴定将 J-A1 工程菌接种于 500 ml 2 TY 培养基 ( 含 100 μg/ml Amp+0.1% 葡萄糖 ) 中进行 scfv 的诱导表达 (1.0 mmol/l IPTG,30 诱导 16 h) 离心收集上清, 以 40% 饱和硫酸铵沉淀目的蛋白, 用 20 ml 平衡液 (25 mmol/l Tris,0.5 mol/l NaCl, ph 7.5) 稀释后, 制备粗提液将 HisTrap 亲和层析柱以平衡液进行平衡后以 0.5 ml/min 上样, 再以平衡液洗脱流穿峰至基线最后以洗脱液 (25 mmol/l Tris,0.5 mol/l NaCl,200 mmol/l 咪唑,pH 7.5) 进行梯度洗脱并收集目的蛋白峰纯化的目的蛋白以 10% SDS-PAGE 进行分析, 将其透析过夜后, 以 BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行定量将含人 ICAM-1 抗原的 SDS-PAGE 胶进行转膜, 进行 Western blotting 检测一抗为稀释的纯化 scfv, 二抗为稀释的 c-myc(9e10)- HRP 抗体, 用增强型 HRP (Horseradish peroxidase) 底物化学发光液显影成像抗 ICAM-1 scfv 的生物学活性鉴定 1) 竞争 ELISA 实验将 P1 抗原肽 (1 μg/ 孔 ) 包被 96 孔酶标板, 以牛血清白蛋白 (BSA) 封闭酶标板将 0.1 mg/ml McAb 2C5 与倍比稀释的 scfv 混合后,100 µl/ 孔依次加入酶标板,37 孵育 1 h PBST 洗板 3 次后, 加入 HRP 标记的羊抗小鼠 IgG,37 孵育 1 h 以 TMB 底物溶液避光显色,2 mol/l H 2 SO 4 终止反应, 酶标仪检测 OD 450 值 [11-12] 验 2) 人血管内皮细胞 - 单核细胞黏附抑制实将以 LPS 刺激后的人血管内皮细胞 ECV304 用 Hank s 液洗涤 2 次后, 前两组加入抗 ICAM-1 scfv (2 μg 5 μg), 后两组加入 McAb (2 μg 5 μg), 每组设置 8 孔, 以加入 PBS 孔作为对照组,37 培养 60 min 每孔加入单核细胞悬液 100 μl ( 约 / 孔 ),37 孵育 60 min, 用预温培养基轻轻洗去未黏附单核细胞充分洗涤后, 每孔加入 100 μl 0.25% Rose Bengal 溶液, 室温静止 5 min 弃除染料后, 以 PBS 洗涤 2 次, 每孔再加入 PBS- 乙醇 (V/V=1 1) 200 μl, 室温静置 30 min, 酶标仪检测 OD 570 值黏附率 (%)=(ECV304 细胞黏附单核细胞 OD 值 ECV304 细胞 OD 值 )/ 总单核细胞 OD 值 100% 统计学分析计量资料用 x ±s 表示, 两组均数比较采用 t 检验, 以 P<0.05 时为差异显著 2 结果与分析 2.1 抗 ICAM-1 scfv 的亲和富集筛选 Tomlinson I+J 噬菌体抗体库经 4 轮吸附 - 洗脱 - 扩增亲和富集筛选后, 噬菌体抗体收获率由第 1 轮的增加到第 4 轮的 , 富集倍数增加倍左右 ( 表 1) 亲和富集筛选过程中噬菌体抗体收获率的逐渐升高是特异性噬菌体抗体富集的表现, 是评价亲和富集筛选效果的一个核心指标 [13-15] 将第 4 轮亲和富集筛选的阳性噬菌体感染 E. coli HB2151 后, 从所涂布的 TYE 平板中随机挑取 400 个单克隆菌落接种于 96 孔板中进行培养并诱导表达 scfv, 利用 ELISA 实验进行初步筛选, 最后得到 4 株阳性克隆, 分别命名为 J-A1 J-H12 I-B7 和 I-B10 : :cjb@im.ac.cn

2020 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech 表 1 亲和富集筛选对抗 ICAM-1 scfv 的富集效应 Table 1 Selective enrichment of anti-human ICAM-1 phage antibodies from Tomlinson I+J phage display library Round

10 10 5 550 4 5.00 10 12 2.00 10 8 4.00 10 5 2 000 2.

blotting 实验表明,J-A1 菌株可以与人 ICAM-1 抗原发生特异性结合反应 ( 图 1C) 2.

5 2020 ISSN CN /Q 生物工程学报 Chin J Biotech 表 1 亲和富集筛选对抗 ICAM-1 scfv 的富集效应 Table 1 Selective enrichment of anti-human ICAM-1 phage antibodies from Tomlinson I+J phage display library Round Input phage (pfu) Output phage (pfu) Recovery rate (%) (output/input) Enrichment (rate (n) /rate (1) ) 阳性克隆的鉴定以 PCR 法对上述 4 株阳性克隆进行 PCR 扩增, 在约 930 bp 处均扩增出特异条带, 与预期大小一致, 说明其含有完整的 scfv 基因 ( 图 1A) 将 4 株阳性克隆用 ELISA 实验进行抗原交叉反应检测, 实验结果表明,J-A1 菌株特异性较好, 其他 3 株与牛血清白蛋白 (BSA) 或脱脂奶粉 (Milk) 均有较高的交叉反应 ( 图 1B) Dot blotting 实验表明,J-A1 菌株可以与人 ICAM-1 抗原发生特异性结合反应 ( 图 1C) 2.3 J-A1 序列测定与分析 J-A1 序列分析表明, 抗 ICAM-1 scfv 基因全长 720 bp, 其中重链可变区基因位于 Linker 的上游, 长 348 bp, 编码 116 个氨基酸 ; 轻链可变区基因位于 Linker 的下游, 长 327 bp, 编码 109 个氨基酸两者由含 15 个氨基酸的柔性短肽连接 ( 加粗序列 ), 构成了完整的抗 ICAM-1 scfv 基因序列 ( 图 2) Blast 分析表明, 该基因序列符合数据库中单链抗体所具有的特点, 重链可变区和轻链可变区具有完整的骨架区和互补决定区 ( 划线序列 ) 结构图 1 阳性克隆的鉴定 Fig. 1 Identification of four positive clones. (A) PCR products of four positive clones. 1: DNA marker; 2: J-A1; 3: J-H12; 4: I-B7; 5: I-B10. (B) ELISA-based antigenic cross reaction of four positive clones. (C) Dot blotting assay for J-A1 clone. 1: negative control; 2: J-A1 clone. 图 2 抗 ICAM-1 scfv 基因序列分析 Fig. 2 Sequence analysis of anti-icam-1 scfv gene. underline: complementary-determining region; bold: linker.

陈云雨等 / 人源抗 ICAM-1 单链抗体的制备及其生物学活性鉴定 2021 2.

亲和层析柱分离纯化后, 收集目的蛋白样品进行 SDS-PAGE, 经考马斯亮蓝染色后呈单一蛋白条带, 表明纯化的 scfv 具有较高的纯度蛋白样品分子量为 30 kda, 与 scfv

65 mg/ml Western blotting 实验表明, 以纯化的 scfv 作为一抗, 在相对分子量 55 kda 左右出现特异性条带, 其与 ICAM-1 抗原分子量大小一致,

组的黏附率分别为 30.39% 与 26.47%; 同剂量 McAb 组的黏附率分别为 27.45% 与 25.49%,PBS 对照组为 40.

抗原肽的结合作用是相互排斥的,scFv 能与 McAb 竞争结合 P1 抗原肽 ( 图 4) 图 4 竞争 ELISA 实验 Fig.

3 Purification and identification of anti-icam-1 scfv. (A) Purification of anti-icam-1 scfv.

6 陈云雨等 / 人源抗 ICAM-1 单链抗体的制备及其生物学活性鉴定抗 ICAM-1 scfv 的分离纯化与 Western blotting 鉴定 J-A1 工程菌经 IPTG 诱导培养后, 离心收集上清, 经 HisTrap 亲和层析柱分离纯化后, 收集目的蛋白样品进行 SDS-PAGE, 经考马斯亮蓝染色后呈单一蛋白条带, 表明纯化的 scfv 具有较高的纯度蛋白样品分子量为 30 kda, 与 scfv 理论分子量基本一致 ( 图 3A) scfv 经透析和 BCA 法定量后, 其浓度为 0.65 mg/ml Western blotting 实验表明, 以纯化的 scfv 作为一抗, 在相对分子量 55 kda 左右出现特异性条带, 其与 ICAM-1 抗原分子量大小一致, 证实了纯化的 scfv 可与人 ICAM-1 抗原发生特异性结合反应 ( 图 3B) 利用 Rose Bengal 对黏附细胞进行染色, 计算细胞黏附率 2 μg 和 5 μg scfv 组的黏附率分别为 30.39% 与 26.47%; 同剂量 McAb 组的黏附率分别为 27.45% 与 25.49%,PBS 对照组为 40.19% ( 图 5) 细胞黏附抑制实验表明,scFv 和 McAb 都能抑制单核细胞与人血管内皮细胞间的黏附, 黏附抑制作用与其浓度呈正相关, 与 PBS 对照组相比, 差异显著这表明所制备的抗 ICAM-1 scfv 具有较好的抗细胞黏附活性 2.5 抗 ICAM-1 scfv 生物学活性鉴定竞争 ELISA 实验表明, 伴随 scfv 的倍比稀释,OD 450 值逐渐升高, 说明 scfv 和 McAb 与 P1 抗原肽的结合作用是相互排斥的,scFv 能与 McAb 竞争结合 P1 抗原肽 ( 图 4) 图 4 竞争 ELISA 实验 Fig. 4 Competitive ELISA assay of anti-icam-1 scfv. 图 3 抗 ICAM-1 scfv 的分离纯化与鉴定 Fig. 3 Purification and identification of anti-icam-1 scfv. (A) Purification of anti-icam-1 scfv. 1: protein marker; 2: purified anti-icam-1 scfv. (B) Western blotting assay of anti-icam-1 scfv. 1: negative control; 2: human ICAM-1 antigen band (55 kda). 图 5 细胞黏附抑制实验 Fig. 5 Cell adhesion inhibition assay of anti-icam-1 scfv and McAb. *P<0.05 compared to PBS control. P values were calculated using t test. : :cjb@im.ac.cn

7 2022 ISSN CN /Q 生物工程学报 Chin J Biotech 3 讨论黏附分子介导的细胞黏附是机体生理和病理过程的基本现象和共同过程由细胞间黏附分子 -1 (ICAM-1) 和淋巴细胞功能性相关抗原 (LFA-1) 相互作用介导的炎症级联反应过程在炎症性疾病的发生与发展中发挥重要作用 [2,5] 应用新型抗黏附分子抗体特异性阻断上述作用已经成为炎症相关性疾病治疗的新热点, 并成功应用于烧伤移植排斥反应缺血再灌注损伤类风湿性关节炎等多种疾病的临床治疗 [5,16] 美国 FDA 已经批准 Enlimomab Efalizumab 等抗黏附分子抗体进入 Ⅱ 期临床研究 [17-19] 噬菌体展示技术是一种可以不经免疫动物和细胞融合等过程, 通过抗体片段的克隆选择, 可以快速制备出几乎所有抗原的人源化抗体的技术 [20-23] 因此, 为快速制备人源抗 ICAM-1 scfv, 本研究利用 Tomlinson I+J 噬菌体抗体库, 采用固相筛选法, 以 P1 抗原肽为包被抗原, 经过 4 轮亲和富集筛选使特异性噬菌体抗体得到了倍的富集通过 ELISA 方法对第 4 轮亲和富集后的部分单克隆菌落进行抗体活性的初步鉴定, 成功筛出 4 株阳性克隆通过 PCR 鉴定反应 ELISA 抗原交叉反应和 Dot blotting 实验, 最终获得了 1 株既能与 P1 抗原肽特异结合又能与人 ICAM-1 抗原特异结合的阳性克隆 J-A1 J-A1 工程菌经 IPTG 诱导表达, 成功进行了 scfv 的可溶性表达, 继而采用 HisTrap 亲和层析柱进行分离纯化采用 Western blotting 实验竞争 ELISA 实验和细胞黏附抑制实验进行了 scfv 生物学活性的初步鉴定上述实验表明, 纯化的 scfv 具有与人 ICAM-1 抗原特异性结合的特性且结合强度与 scfv 浓度呈正相关 ;scfv 能够明显抑制人血管内皮细胞和单核细胞间的黏附, 其抗黏附作用随 scfv 浓度的增高而增强, 但单链抗体的黏附抑制作用稍弱于单克隆抗体 BLAST 进行 J-A1 序列分析表明,J-A1 含有完整的单链抗体恒定区和可变区, 与已报道的抗 ICAM-1 scfv 氨基酸序列相比 [24],J-A1 的互补决定区 (Complementary-determining region,cdr) 序列与其差异较大, 尤其是重链可变区中的 CDR3 区和轻链可变区中的 CDR1 区由于抗原 - 抗体的特异性结合与抗体轻链和重链的 CDR 区环状结构的氨基酸序列密切相关 [25], 故此 CDR 区氨基酸序列差异可能是导致 scfv 亲和力差异的关键, 进一步优化 CDR 区氨基酸序列可能是提高抗 ICAM-1 scfv 生物学活性的重要策略与本室曾采用的以大肠杆菌原核表达系统制备抗 ICAM-1 scfv 相比 [24,26], 利用噬菌体展示技术制备 scfv 更加简便易行并具有更高的产量和生物学活性在后续的研究中, 我们将继续深入研究以提高抗 ICAM-1 scfv 的稳定性和亲和性, 使其具有更佳的生物学活性, 探索抗 ICAM-1 scfv 在炎症相关性疾病治疗中的应用前景致谢衷心感谢中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室生物药物工程研究部主任刘瑞田教授在噬菌体展示技术方面给予的悉心指导和无私帮助! REFERENCES [1] Hua SS. Targeting sites of inflammation: intercellular adhesion molecule-1 as a target for novel inflammatory therapies. Front Pharmacol, 2013, 4: 127. [2] Li JL, Zhai XH. The biological functions of integrin LFA-1 and its ligand ICAM-1 and the related diseases. Chin J Cell Biol, 2013, 35(8): (in Chinese). 李金丽, 翟心慧. 整合素 LFA-1 与其配体 ICAM-1 的生理功能及相关疾病. 中国细胞生物学学报, 2013, 35(8): [3] Lai ZH, Xie YL, Ma C, et al. The biological functions of cell adhesion molecules in monocyte migration. Chin J Cell Mol Immunol, 2015, 31(11): (in Chinese).

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<453A5CCAB3C6B7BFC6D1A73131C4EA3134C6DA5C3134C6DA5C3032B7D6CEF6> 227 ELISA 刘沙洲 1,2, 桑小雪 1, 欧阳华学 3, 雷绍荣 3, 白林含 1, * (1. 四川大学生命科学学院, 四川成都 610065;2. 成都市食品药品检测中心, 四川成都 610045; 3. 四川省农业科学院分析测试中心, 四川成都 610066) 目的 : 比较