中国中西医结合杂志 年 月第 卷第 期!"# $!,! "* ' 6 7' '*,'* ( 7' 7 7 *!' 282 8! 9 7! (, " * 66' '(,' 7'(,! 9 '* 7 7' '( <'9 "! 9 (* 7' "! *!' 282 8! & 3 4 #!(,"

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1 养肝益水颗粒对自发性高血压大鼠肾脏 型胶原蛋白和 1$ 的影响 戴小华 王 波 杨 帆 董 梅 许祖建 邵正斌 顾健霞 周宜轩 摘要 目的 观察养肝益水颗粒对自发性高血压大鼠 肾脏 型胶原蛋白和纤维连接蛋白 1$ 的影响 探讨养肝益水颗粒保护肾脏的作用机制 方法 将 只 大鼠随机分为模型组 贝拉普利组 简称西药组 养肝益水颗粒低剂量组 简称中药低剂量组 养肝益水颗粒高剂量组 简称中药高剂量组 各 只 并与!! 2 大鼠作对照 简称正常组 灌胃 周后通过免疫组化法检测各组大鼠肾脏 型胶原蛋白和 1$ 的表达 利用 ' 3! 3" & 图像分析系统进行图像分析 结果 在正常组的间质区 基底膜或系膜区中仅有少量棕黄色颗粒 而模型组有密集的棕黄色颗粒 模型组大鼠肾脏 型胶原蛋白和 1$ 的表达较正常组明显增高 3 4 治疗各组大鼠肾脏 型胶原蛋白和 1$ 的表达与模型组比较均明显降低 3 4 且中药低剂量组和西药组在降低肾脏 型胶原的程度相似 3 5& 中药高剂量组能进一步降低肾脏 型胶原的表达 且与中药低剂量组和西药组比较有明显差异 3 4& 3 4 结论 养肝益水颗粒通过减少肾脏 型胶原蛋白和 1$ 的合成 增加肾脏 型胶原蛋白和 1$ 的降解 从而减少肾脏胞外基质 过度沉积以发挥肾脏保护作用 关键词 养肝益水颗粒 自发性高血压大鼠 型胶原蛋白 型胶原蛋白 型胶原蛋白 纤维连接蛋白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基金项目 安徽省自然科学基金资助项目 $!# %& 作者单位 安徽中医药大学第一附属医院心内科 合肥 通讯作者 戴小华 '"& " ()*%+ #,! -. / 0

2 中国中西医结合杂志 年 月第 卷第 期!"# $!,! "* ' 6 7' '*,'* ( 7' 7 7 *!' 282 8! 9 7! (, " * 66' '(,' 7'(,! 9 '* 7 7' '( <'9 "! 9 (* 7' "! *!' 282 8! & 3 4 #!(,"!( " ( 9! (!"' ( 7' '( " 9!', :' '66', 7! 7 '*, ( 7' (7'!6 '( ",!"" '( (* '"" 1$ (, ' ( 7' *' *!(!6 '( ",!"" '( (* '"" 1$ 7' ' '*, ( ',' :' *'9!!(!6 '( " ','"" " # ( ( ( "' 9!( ('! " 7 9' '( :',!"" '(,!"" '(,!"" '( 6!(', ( 高血压早期肾损害确切机制尚不明确 血流动力学因素和非血流动力学因素被认为是高血压早期肾损害的主要机制 研究表明实质细胞和间质细胞向表达肌成纤维细胞的转分化是器官纤维化的重要标志 而这种转分化是受纤维化因子调控的 促纤维化因子的过度表达和抑纤维化因子的低表达都可导致实质细胞和间质细胞向肌成纤维细胞的转分化 并最终导致肾脏硬化 本实验旨在通过观察养肝益水颗粒对自发性高血压大鼠 肾脏胶原蛋白 型 纤维连接蛋白 1$ 等指标的影响 以进一步从非血流动力学方面探讨高血压早期肾损害的发病机制以及养肝益水颗粒发挥肾脏保护作用的机制及作用环节 材料与方法 动物 周龄雄性 大鼠 只 体重 周龄雄性!! 2 大鼠 只 体重 所有动物均购自上海斯莱克生物责任有限公司 动物合格证号 ; 沪 药物 养肝益水颗粒 由黄芪 菟丝子 益母草 芡实 怀牛膝 丹参等组成 由安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供 贝拉普利 购自北京诺华制药公司 主要试剂和仪器 型胶原蛋白及 1$ 免疫组化试剂盒均购自上海活乐生物公司 / 恒温箱 8$3% 型隔水式恒温培养箱 上海三发科学仪器有限公司产品 干燥箱 - 8% 型鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限责任公司产品 石蜡切片机 >', & 型切片机 德国徕卡仪器有限公司产品 型病理组织包埋机 安徽省电子科学研究所 3 生物组织脱水机 湖北亚光?3 切片漂烘温控仪 湖北亚光 $ =!( 荧光显微镜 新飞达光学仪器公司 稳压稳流电泳仪 -22 型 北京六一仪器厂 冷冻离心机 8> 珠海黑马仪器公司 紫外观察灯 型 珠海黑马医学仪器有限公 司 8 凝胶图像分析管理系统 电子天平 2 1 上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂 离心机 上海百典仪器设备有限公司 超低温冰箱 $2. -1 / 日本三洋电器集团 方法 分组及给药 只雄性 大鼠编号后随机分为 组 即养肝益水颗粒高剂量治疗组 简称中药高剂量组 养肝益水颗粒低剂量治疗组 简称中药低剂量组 贝拉普利组 简称西药组 模型组 每组均 只 2 大鼠 只作为正常对照组 简称正常组 中药高 低剂量组分别以相当于成人每天口服剂量的 倍量即 /& 生药 0 = * 的养肝益水颗粒混悬液灌胃 西药组以贝拉普利混悬液 0= * 相当于成人常规剂量的 倍量浓度灌胃 西药组配成浓度为 0 > 中药低剂量组配成浓度 & 0 > 灌胃体积均为 > 每天 次 中药高剂量组配成浓度 0 > 早上 灌胃 > 晚上 灌胃 > 模型组 正常组均每天 次灌胃 > 的生理盐水 共 周 7 人工光照清洁的饲养室内 实验期间给予标准大鼠饲料喂养 每周另喂 次鸡蛋白 每次 & 个 0 只 自由饮水 肾脏病理 治疗 周后处死大鼠 取肾脏组织 以 A 中性福尔马林固定 7 后 常规脱水 浸蜡 包埋 制成 切片 常规脱蜡 脱苯 水化 3 缓冲液 9 / 冲洗 次 染色 光镜下观察肾组织的病理学改变 免疫组织化学检测 胶原蛋白 1$ 的检测采用 3 法 3 液替代一抗作阴性对照 3 法具体操作如下 肾组织标本经 的中性福尔马林固定 石蜡包埋 切成 厚的切片 常规脱蜡和水化后 将组织芯片置于二甲苯中浸泡 ( 脱蜡 更换二甲苯后再浸泡 ( 分级酒精水化 即置于无水乙醇浸泡 & (%& 乙醇中再浸泡 & ( 最后置于 /& 乙醇中浸泡 & ( 用 3 9 /

3 冲洗 次 每次 ( 微波修复 将切片浸入!>0> 枸橼酸盐缓冲液 9 微波炉加热至沸腾后断电 间隔 & ( 后 重复 次 冷却至室温 3 洗 次 每次 ( 滴加 A 双氧水 室温静置 ( & 3 洗 次 每次 ( 滴加正常山羊血清封闭液 室温 ( / 滴加 抗 稀释 & >0 片 过夜 过夜后需在室温复温 ( %3 洗 次 每次 & ( 滴加 抗工作液 & >0 片 / ( 3 洗 次 每次 & ( 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液 & >0 片 3 洗 次 每次 & ( - 显色 ( 在显微镜下掌握染色程度 & 自来水冲洗 苏木精复染 ( 盐酸酒精分化数秒 / ( 梯度酒精脱水 二甲苯透明 中性树胶封片 烤片 显微镜拍照 $ =!( % > 图像采集卡采集图像 利用 ' 3! 3" & 图像分析系统进行图像分析 以色彩直方图方式设定统一参数 以保持图像分析基线一致 计算切片各视野阳性点面积总和及光密度均值 由于光密度值与免疫组化阳性表达强度呈反比 故以 阳性点面积总和 阳性点光密度均值 表示该视野.- 值 & 统计学方法 采用 3 / 软件包进行统计学处理 实验数据结果以 表示 多组间比较先进行方差齐性检验 后采用单因素方差分析 两两比较采用 $ 检验 # 方差不齐者采用 - ((' 检验 3 4& 为差异有统计学意义 结 果 各组大鼠一般情况 灌胃前各组大鼠反应灵敏 且模型组 在提尾 捉颈时剧烈抵抗 时常尖叫 暴跳 以及与同笼大鼠频繁打斗 咬人的攻击行为 灌胃后中药低剂量组大鼠相对情绪稳定 皮毛光滑柔顺 行为较温顺平和 固定和灌胃时抵抗不剧烈 接近于正常组大鼠 而西药组和模型组比较 无太大改善 中药高剂量组大鼠逐渐出现活动减少 反应不灵敏 从本实验结果可发现 养肝益水颗粒除能改善 高血压症状外 并具有一定的镇静的作用 在实验过程中 模型组和西药组各死亡大鼠 只 模型组在眼眶后采集血液的过程中死亡大鼠 只 西药组 只大鼠死因不明 中药低剂量组死亡大鼠 只 在灌胃的过程中死亡大鼠 只 另 只死因不明 中药高剂量组死亡大鼠 只 在灌胃的过程中死亡大鼠 只 另 只死因不明 最后共剩余大鼠 只 各组大鼠 型胶原和 1$ 在肾脏表达的比较 表 图 型胶原蛋白免疫组化图片显示在正常组的肾小球 肾小管间质中仅有少量棕黄色颗粒 而模型组肾脏的肾小球 肾小管间质中有密集的棕黄色颗粒 但在中药低剂量组和西药组与模型组比较棕黄色颗粒明显减少 而中药高剂量组与模型组 中药低剂量组和西药组比较棕黄色颗粒明显减少 型胶原蛋白免疫组化图片显示 在正常组的肾小球及肾小管的基底膜中仅有少量棕黄色颗粒 而模型组肾脏的肾小球及肾小管的基底膜中有密集的棕黄色颗粒 但在中药低剂量组和西药组与模型组比较棕黄色颗粒明显减少 而中药高剂量组与模型组 中药低剂量组和西药组比较棕黄色颗粒明显减少 1$ 免疫组化图片显示 在正常组的肾小球的基底膜 系膜区及肾小管的基底膜及间质区中仅有少量棕黄色颗粒 而模型组肾脏的基底膜 系膜区及肾小管的基底膜及间质区中有密集的棕黄色颗粒 但中药低剂量组和西药组与模型组比较棕黄色颗粒明显减少 而中药高剂量组与模型组 中药低剂量组和西药组比较棕黄色颗粒明显减少 模型组大鼠肾脏 型胶原蛋白及 1$ 的表达较正常组明显增高 3 4 治疗后各组大鼠肾脏 型胶原蛋白及 1$ 的表达与模型组比较均明显降低 3 4 且中药低剂量组和西药组在降低肾脏 型胶原蛋白及 1$ 的程度相似 3 5& 中药高剂量组能进一步降低肾脏 型胶原蛋白及 1$ 的表达 且与中药低剂量组和西药组比较有明显差异 3 4& 3 4 表 各组大鼠 型胶原和 1$ 表达比较.- 值 组别 ( 型胶原 型胶原 型胶原 1$ 正常 // && % & & && 模型 % % %& %% / / % / %/ / 西药 % / / & / % & && & / & % / 中药低剂量 % %&& % % / % % / % 中药高剂量 / %/ & & // & % % / / 注 与正常组比较 3 4 & 3 4 与模型组比较 3 4 & 3 4 与西药组比较 3 4 & 与中药低剂量组比较 3 4 & 3 4

4 "!" $" "' 中国中西医结合杂志!"#$ 年 % 月第 &$ 卷第 % 期 '()*+,!-./.01!"#$! 2345 &$! 63!% ##& #各组肾组织病理表现 $ 图 8 % # 正常组肾脏的 肾小球& 叶间动脉结构正常! 肾小管排列整齐! 无任何 组与模型组比较!差异明显!肾小球仅见轻度间质细胞 增生!未见明显的肾小球增大和萎缩!肾小管周围仅见 异常病变( 与正常组比较!模型组可见肾小球萎缩&代 轻度的间质细胞增生及炎性细胞渗出! 肾组织内弓形 偿性肥大明显增多' 肾小管浑浊肿胀! 基底膜增厚! 时 动脉&叶间小动脉&入球小动脉管壁仅见轻度的胶原纤 见蛋白或红细胞管型'肾间质可见淋巴细胞&单核细胞 维增生!未见明显的管腔狭窄及闭塞( 等炎性细胞浸润及间质轻度纤维化' 肾组织内弓形动 讨##论 脉&叶间小动脉& 入球小动脉管壁的肌层肥厚& 内膜纤 维组织增生! 管腔狭小甚至闭锁! 可见玻璃样变! 动脉 胞外基质$ ;', % 是由多种成分形成的高度有序 周围可见到胶原纤维增多( 中药低& 高剂量组和西药 列的网络结构!主要包括胶原蛋白&糖蛋白及蛋白多糖 ##注#- 为正常组' Z 为模型组'' 为中药低剂量组' E 为西药组'; 为中药高剂量组'图! %8 同 图 ##各组大鼠!型胶原免疫组化结果#$ JQ 染色! )!""% 图!#各组大鼠"型胶原免疫组化结果#$ JQ 染色! )!""% 图 &#各组大鼠肾脏#型胶原蛋白免疫组化结果#$ JQ 染色! )!""% 图 $#各组大鼠肾脏 I6 免疫组化结果#$ JQ 染色! )!""% 图 8$各组大鼠肾组织病理结果$$ K; 染色! )!""%

5 三类大分子物质 其中胶原蛋白包括 前三种胶原呈纤维束状分布 主要分布于皮肤 肌腱等组织 它们为间质胶原 而 型胶原主要分布在基底膜上 糖蛋白起将细胞黏着于细胞外基质的作用 主要包括 1$ 和层粘连蛋白 >$ 的过度沉积是导致肾间质纤维化主要原因 而肾脏 型胶原蛋白合成增多和降解减少是引起 的过度沉积的重要因素 型胶原和 1$ 作为 中的重要成分 被用作反映肾间质纤维化的常用指标 1$ 是一种十分主要的细胞外基质糖蛋白 可以与细胞外基质成分相结合 促进细胞外基质 和蛋白多糖成分沉积 1$ 在肾脏病变中出现最早最明显 1$ 不仅是细胞外基质蛋白的主要成分 也是细胞外其他蛋白沉积的支架 同时还是成纤维细胞的化学趋化剂 因此减少 1$ 的合成和增加 1$ 的降解对于防治肾间质纤维化的形成至关重要 对于高血压早期肾损害的患者 通过 型胶原和 1$ 检测可以直接反映肾脏硬化的程度 从而可作为评估高血压早期肾损害的较好指标 高血压早期肾损害病位主要在肝 肾两脏 或病位在肝 根源在肾 尤其针对高血压早期肾损害提出了肝肾阴虚 瘀阻肾络的病机观点 认为肝肾阴虚 肾之封藏失司 精微外漏 出现微量蛋白尿 阴虚生内热可煎熬津液致瘀血生成 久病入络 久病致瘀 因此血脉瘀阻是高血压病情发展的必然转归 肾之血脉瘀阻则肾失封藏 精关不固 精微外泄 出现微量蛋白尿 & 以此确立补益肝肾 活血固精治疗大法 针对此病机和治法 研制出养肝益水颗粒 该方由枸杞子 菟丝子 黄芪 怀牛膝 丹参 芡实 益母草等药物组成 共奏养肝阴 滋肾水 活血脉 固精微之效 既往的研究证实 养肝益水颗粒可明显降低 大鼠血压及尿微量白蛋白 微球蛋白 8 持久降低 大鼠血压 降低 大鼠肾脏组织内皮素 浓度 升高 大鼠肾脏组织一氧化氮 $. 浓度 能调节高血压病早期肾损害患者动态血压昼夜节律 并对原发性高血压早期肾损害患者肾叶 / 间动脉血流有积极影响 本实验发现模型组大鼠肾脏 型胶原蛋白及 1$ 的表达较正常组明显增高 治疗后各组大鼠肾 脏 型胶原蛋白及 1$ 的表达较模型组明显降低 且中药低剂量组和西药组在降低肾脏 型胶原蛋白及 1$ 的程度相似 高剂量养肝益水颗粒能进一步降低肾脏 型胶原蛋白及 1$ 的表达 作用优于中药低剂量养肝益水颗粒组和西药组 提示高血压早期肾脏 型胶原蛋白及 1$ 高度表达 养肝益水颗粒通过减少肾脏 型胶原蛋白及 1$ 合成 增加肾脏 型胶原蛋白及 1$ 的降解 从而减少肾脏 的过度沉积 防治肾间质纤维化 达到肾脏保护作用 参考文献 罗继壮 邵婧 苗俊英 # 心血管系统中内皮细胞向间充质细胞转分化的研究进展 生物医学工程研究 & % 王轩 袁伟杰 # 肾小管上皮细胞转分化类型及其在肾脏疾病进展中的作用 中国病理生理杂志 % %% 赵伟 孙国志 # 不同种实验动物间用药量换算 实验动物 && & 2!=! =! ( ' "#!"'!6,!((', :' '! 7 6,! ( 6!(',!( ' 9 '!( (* "! (' " 6! 37!" '( " 37!" & % % & 郑林 戴小华 # 养肝益水颗粒防治高血压病早期肾损害理论探讨 中国中医急症 / % 杨帆 戴小华 王建彬 # 原发性高血压早期肾损害中医证候学观察 安徽中医学院学报 / / 戴小华 郑林 杨帆 等 # 养肝益水颗粒对自发性高血压大鼠血压及尿 8 的影响 中国中医急症 % & 戴小华 郑林 杨帆 # 养肝益水颗粒对 大鼠血压及 $. 的影响 安徽医药 % / % 王建彬 戴小华 杨帆 等 # 养肝益水颗粒对高血压病早期肾损害动态血压的影响 中西医结合心脑血管病杂志 陶永 杨帆 戴小华 # 养肝益水颗粒对原发性高血压早期肾损害患者肾叶间动脉的影响 安徽中医学院学报 / # 收稿 修回

高 云 钟良军 张源明 周晓欢 梁 平 徐 隽 探讨兔牙周炎对动脉粥样硬化炎性因子的影响及抗生素对其的作用 将 只雄性新西兰大白兔随机分为 组 组为对照组 组为牙周炎组 组为动脉粥样硬化组 组为牙周炎 动脉粥样硬化组 组为干预组 牙周炎 动脉粥样硬化 替硝唑组 各组分别按照实验设计进行相应干预处理 周末处死动物 检测牙周指标 血清中总胆固醇 三酰甘油 高密度脂蛋白胆固醇 低密度脂蛋白胆固醇 反应蛋白

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