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1 * UPLC-ESI-MS/MS 法测定八子补肾胶囊中 14 种成分含量 1, 宋更申 2, 周丽 3, 徐艳梅 2, 张西如 2 *1, 张兰桐 (1. 河北医科大学, 石家庄 517; 2. 河北省药品检验研究院, 石家庄 511; 3. 石药集团中奇制药技术 ( 石家庄 ) 有限公司, 石家庄 541) 摘要 : 建立 UPLC-ESI-MS/MS 法测定八子补肾胶囊中 14 种成分的含量 Waters ACQUITY BEH C 18 柱 (5mm 2.1mm,1.7mm), 柱温为 4 ; 流动相为 A( 乙腈 )-B(.1% 乙酸 ), 梯度洗脱 ; 电喷雾离子源 (ESI 源 ), 源温度为 15, 毛细管电压为 2. kv, 离子源补偿电压为 5 V, 脱溶剂气温度为 5, 脱溶剂气流量为 8 L h -1, 锥孔气流量为 15 L h -1, 雾化气压力为 7. Bar (1Bar=1kPa), 接口处加热, 采用多反应监测模式在本方法条件下,14 种成分的线性关系良好 (r ), 定量限为.11~4.52 ng ml -1 精密度为.8~ 2.1% 平均回收率范围为 97.89%~11.9% 该方法操作简便快速准确度高重现性好, 可用于八子补肾胶囊的质量控制关键词 : 八子补肾胶囊 ; 含量测定 ;UPLC-ESI-MS/MS 中图分类号 :R917 Determination of 14 components in Bazibushen capsule by UPLC-ESI-MS/MS SONG Geng-shen 1, 2, ZHOU Li 3, XU Yan-mei 2, ZHANG Xi-ru 2, ZHANG Lan-tong *1 (1. Hebei Medical University,Shijiazhuang 517, China; 2. Hebei Institute for Drug Control,Shijiazhuang 511, China; 3. CSPC Zhongqi Pharmaceutical Technology (Shijiazhuang) Co. Ltd., Shijiazhuang 541, China) Abstract: The study developed a method for the determination of 14 components in Bazibushen Capsule by UPLC-ESI-MS/MS. Waters ACQUITY BEH C 18 column (5mm 2.1mm,1.7mm) was used and the column temperature was 4. A linear gradient elution of eluents A (acetonitrile) and B (.1% acetic acid; v/v) was used for the separation. The source temp was set at 15. The capillary voltage was set at 2. kv. The source offset voltage was kept at 5 V. The desolvation temp was set at 5. The desolvation flow was 8 L Hr -1. The cone flow was 15 L Hr -1. The 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 河北省自然科学基金 (H ). * 通讯作者 Tel /Fax: , zhanglantong@263.net 1

2 nebuliser pressure was 7. Bar. Multiple reaction monitoring mode (MRM) is adopted. All the 14 components showed good linearity (r 2 >.9991) in the test ranges. The LOQs for the compounds ranged from ng ml -1, respectively. The RSDs were.8-2.1%. The overall recoveries were between and 11.9% for all compounds. The method is simple, rapid, accurate and highly reproducible, and can be used for the determination of 14 components in Bazibushen capsule. Key words: Bazibushen capsule; quantification; UPLC-ESI-MS/MS 八子补肾胶囊遵循中华传统养生文化, 以唐朝著名药剂五子衍宗丸为基础, 以菟丝子枸杞子五味子蛇床子金樱子覆盆子韭菜子川楝子淫羊藿巴戟天肉苁蓉地黄川牛膝人参鹿茸海马等中药材为主要药味, 以调肝理气补肾温阳为主要功效, 同时具有滋补强健抗疲劳等作用 [1-3] 八子补肾胶囊成分复杂, 质量较难控制, 目前文献报道仅对八子补肾胶囊中单一成分蛇床子素进行质量控制 [4,5], 不能较为全面地反映八子补肾胶囊的质量本研究采用超高效液相色谱 - 质谱联用法对八子补肾胶囊中花椒毒素异茴芹内酯佛手柑内酯欧前胡素蛇床子素异欧前胡素五味子甲素五味子醇甲金丝桃苷槲皮苷木犀草素山柰酚异鼠李素和熊果酸等 14 种主要成分进行定性及定量分析, 为更好地控制八子补肾胶囊的质量提供重要参考依据材料与方法仪器美国 Waters I-Class 超高效液相色谱仪 ( 在线脱气机, 二高压元泵, 自动进样器 ); 美国 Waters Xevo TQ-S 三重四极杆质谱仪,StepWave 离子源 Multifuge X1R 台式离心机 ( 美国 Thermo Fisher 公司 ); MS3 型涡旋混合器 ( 德国 IKA 公司 ); AB265-S/FACT 型电子分析天平 ( 瑞士梅特勒公司 ) 药品与试剂色谱纯乙腈 ( 德国 Merck 公司 ); 超纯水 (Milli-Q Reference Ultrapure Water System) 花椒毒素 (xanthotoxin, ) 购于上海同田生物科技有限公司 ( 纯度大于 98%); 异茴芹内酯 (isopimpinelline, 12123), 佛手柑内酯 (bergapten, 12816) 购于四川维克奇生物科技有限公司 ( 纯度均大于 98%); 欧前胡素 (imperatorin, ) 蛇床子素(osthole, ) 2

3 异欧前胡素 (isoimperatorin, ) 五味子甲素(deoxyschizandrin, ) 五味子醇甲(schisandrin, ) 金丝桃苷(hyperoside, ) 槲皮苷(quercitrin, ) 木犀草素(luteolin, ) 山柰酚(kaempferol, ) 异鼠李素(isorhamnetin, ) 熊果酸(ursolic acid, ) 购于中国食品药品检定研究院 ( 纯度均大于 98%) 八子补肾胶囊( 批号 : ) 由石家庄以岭药业股份有限公司生产色谱及色谱条件色谱条件采用 Waters ACQUITY BEH C 18 色谱柱 ( 5mm 2.1mm,1.7mm), 流动相为 A( 乙腈 )-B(.1% 乙酸 ), 采用梯度洗脱方式, 梯度洗脱程序如下 : ~1.3 min,3%~5%a;1.3~2.2 min,5%~8%a;2.2~3.5 min,8%a 等度洗脱 ;3.5~4. min,8%~3%a;4.~5. min,3%a 等度洗脱每次进样前预平衡 1 min 流速为.3 ml min -1 色谱柱后溶液无分流, 全部进入离子源, 分析时间 5 min, 进样量 2 μl 质谱条件电喷雾离子源 (ESI 源 ),StepWave 离子源, 离子源温度为 15, 毛细管电压为 2. KV, 离子源补偿电压 5 V, 脱溶剂气温度 5, 脱溶剂气流量 8 L h -1, 锥孔气流量 15 L h -1, 雾化气压力 7. Bar, 接口处加热, 采用多反应监测模式 (MRM) 花椒毒素异茴芹内酯佛手柑内酯欧前胡素蛇床子素异欧前胡素五味子甲素五味子醇甲等 8 种成分采用正离子模式检测 ; 金丝桃苷槲皮苷木犀草素山柰酚异鼠李素和熊果酸等 6 种成分采用负离子模式检测监测各成分离子对,14 个成分的解簇电压 (DP) 碰撞能量 (CE) 和二级主要裂解碎片见表 1 3

4 Table 1 UPLC-ESI-MS n Data of the fourteen components Component M w MS 1 m/z MS 2 DP/V CE/eV Xanthotoxin Isopimpinelline Bergapten Imperatorin Osthole Isoimperatorin Deoxyschizandrin Schisandrin Hyperoside Quercitrin Luteolin Kaempferol Isorhamnetin Ursolic acid 对照品溶液的制备分别取花椒毒素异茴芹内酯佛手柑内酯欧前胡素蛇床子素异欧前胡素五味子甲素五味子醇甲金丝桃苷槲皮苷木犀草素山柰酚异鼠李素和熊果酸对照品适量, 精密称定, 分别加甲醇溶解并稀释制成各约.2 mg ml -1 的对照品溶液样品溶液的制备取八子补肾胶囊 2 粒, 倾出内容物, 研细, 混匀, 取粉末约 4. g, 精密称定, 置锥形瓶中, 精密加入 7% 乙醇 8 ml, 精密称定, 超声 ( 功率 : 1W; 频率 : 25 khz) 处理 6 min, 放冷, 再精密称定, 用 7% 乙醇补充损失的重量, 摇匀, 离心, 用.2 μm 滤膜滤过, 续滤液作为供试品溶液方法学验证基质效应精密称取已知含量的八子补肾胶囊 ( 批号 : 1321) 内容物约 4. g, 共 15 份, 分别精密加入一倍含量的高中低 3 个浓度水平的对照品溶液, 每个浓度水平 5 份, 作为 A 样, 测得含量为 A 未添加对照品溶液的已知含量的八子补肾胶囊为 B 样, 测得含量为 B 一倍含量的对照品溶液为 C 样, 测得含量为 C 以(A-B)/C 1% 计算基质效应线性关系分别量取花椒毒素异茴芹内酯佛手柑内酯欧前胡素蛇床子素异欧前胡素五味子甲素和五味子醇甲对照品溶液适量, 加甲醇稀释制成 4

5 质量浓度分别为和 2. ng ml -1 的混合对照品溶液, 摇匀, 作为正离子模式线性系列标准溶液分别量取金丝桃苷槲皮苷木犀草素山柰酚异鼠李素和熊果酸对照品溶液适量, 加甲醇稀释制成质量浓度分别为和 5 ng ml -1 的混合对照品溶液, 摇匀, 作为负离子模式线性系列标准溶液分别精密量取正离子模式线性系列标准溶液和负离子模式线性系列标准溶液各 2 μl, 按上述方法对 14 种成分进行测定以质量浓度为横坐标 X(ng ml -1 ), 以峰面积为纵坐标 Y, 分别绘制标准曲线, 进行线性回归, 得回归方程, 线性范围及相关系数回收率与精密度精密称取已知含量的八子补肾胶囊 ( 批号 : 1321) 内容物约 4. g, 共 9 份, 分别精密加入高中低 3 个浓度水平的对照品溶液, 每个浓度水平 3 份, 按上述方法制备供试品溶液并测定, 计算回收率取同一批八子补肾胶囊 ( 批号 : 1321)6 份, 每份精密称取内容物约 4. g, 按上述方法制备供试品溶液并测定, 计算精密度含量测定取 3 批样品按上述方法配制样品溶液, 负离子模式直接进样 2 μl, 正离子模式稀释 4 倍后进样 2 μl, 以峰面积计算 14 种成分的含量结果 1 方法学验证 1.1 方法专属性与基质效应结果可见,14 种成分分离良好,14 种成分的基质效应为 98.5%~11.2%, 不存在明显的基质效应, 基质成分不干扰 14 种成分的测定见图线性关系及定量限结果可见,14 种成分的线性关系良好,r 种成分的定量限为.11~4.52 ng ml -1 线性和定量限结果见表方法回收率及精密度花椒毒素异茴芹内酯佛手柑内酯欧前胡素蛇床子素异欧前胡素五味子甲素五味子醇甲金丝桃苷槲皮苷木犀草素山柰酚异鼠李素和熊果酸的平均回收率分别为 99.56% 99.47% 99.69% 11.2% 99.89% 1.2% 99.86% 11.2% 98.69% 11.1% 98.65% 99.75% 11.9% 和 97.89% RSD 值分别为 1.1%.9% 1.3% 1.1% 1.5% 1.4% 1.4%.8% 1.7% 1.7% 1.9% 1.5% 1.6% 和 2.1% 结果表明该方法回收率良好八子补肾胶囊 ( 批号 : 1321) 中花椒毒素异茴芹内酯佛手柑内酯欧前 5

6 胡素蛇床子素异欧前胡素五味子甲素五味子醇甲金丝桃苷槲皮苷木犀草素山柰酚异鼠李素和熊果酸的平均含量 (n=6) 分别为 , μg g -1 ;RSD 值分别为.8% 1.2% 1.5% 2.1%.8% 2.8%.5%.6% 1.7% 2.3% 2.5% 1.7% 1.8% 和 1.9%, 均符合规定结果表明本方法精密度良好 2 实际样品的检测 3 批样品中,14 种待测组分的含量范围为 1.1~113.3 μg g -1,RSD 值范围为.3~2.9% 其中五味子醇甲含量最高, 异欧前胡素含量最低各待测组分在 3 批样品中的含量基本一致, 说明各批次制剂样品所用药材质量稳定, 制剂工艺成熟结果见表 3 6

7 A B C 1x1 7 3x x x x x1 7 Xanthotoxin (216.97/21.95) x x x1 7 5x x x Isopimpinelline (246.97/231.91) Intensity, cps 6x x x1 5 4x x x Bergapten (216.97/21.96) 8x x x1 5 2x x x Imperatorin (271.3/22.95) 3x x x x1 7 3x x1 8 Osthole (244.97/188.97)

8 8x1 6 4x1 6 Time, min x1 5 m/z, amu x x1 5 2x1 5 Time, min 2.56 Isoimperatorin (27.97/22.96) Intensity, cps 2x x x x1 5 A x1 5 9x1 4 4x1 5 2x x x x x Deoxyschizandrin (417.16/3.99) Schisandrin (433.16/384.1) 2x x1 6 6x1 5 3x x x1 7 Hyperoside (463.3/3.13) x x x1 5 4x x x Quercitrin (447.3/3.59) Time, min m/z, amu Time, min 8

9 3x x x1 5 2x x x Luteolin (284.97/15.94) 3x x x1 6 3x x x1 6 Kaempferol (285.3/187.44) Intensity, cps x x x x x x Isorhamnetin (315.3/299.97) 2x x x x Time, min 8x m/z, amu Figure 1 Representative extractions chromatograms (XIC) of MRM chromatograms of xanthotoxin, isopimpinelline, bergapten, imperatorin, osthole, isoimperatorin, deoxyschizandrin, schisandrin, hyperoside, quercitrin, luteolin, kaempferol, isorhamnetin and ursolic acid standards(a), product ion scan spectra (B) and sample (C) 8x Time, min Ursolic acid (455.29/47.21) 9

10 Table 2 Regression equations, correlation coefficients and linearity ranges of the Component fourteen components Regression equation Correlation coefficient Linear range/ng ml -1 LOQng ml -1 Xanthotoxin Y= X Isopimpinelline Y= X Bergapten Y= X Imperatorin Y= X Osthole Y= X Isoimperatorin Y= X Deoxyschizandrin Y= X Schisandrin Y= X Hyperoside Y= X Quercitrin Y= X Luteolin Y= X Kaempferol Y= X Isorhamnetin Y= X Ursolic acid Y= X Table 3 Contents of the fourteen compounds in Bazibushen capsules(n=6, μg g -1 ) Component Content(RSD) Batch 1 Batch 2 Batch 3 Xanthotoxin 274.5(.8%) 258.9(1.6%) 279.9(1.8%) Isopimpinelline 28.3(1.2%) 275.6(1.3%) 289.3(1.2%) Bergapten 187.3(1.5%) 187.4(.9%) 195.7(.7%) Imperatorin 84.9(2.1%) 8.2(1.5%) 9.3(1.5%) Osthole 987.3(.8%) 97.1(.4%) 997.(.6%) Isoimperatorin 1.1(2.8%) 1.1(2.8%) 1.2(2.9%) Deoxyschizandrin 295.6(.5%) 295.1(1.9%) 3.(.7%) Schisandrin 173.(.6%) 157.(1.1%) 113.3(.5%) Hyperoside 191.1(1.7%) 192.1(.9%) 197.8(.3%) Quercitrin 6.(2.3%) 6.(1.8%) 6.1(1.8%) Luteolin 7.(2.5%) 7.(2.2%) 7.(2.1%) Kaempferol 92.4(1.7%) 9.6(1.6%) 89.2(1.6%) Isorhamnetin 23.1(1.8%) 24.9(2.9%) 21.9(2.6%) Ursolic acid 87.6(1.9%) 85.7(2.%) 88.4(1.9%) 1

11 讨论八子补肾胶囊由多味药材组成, 其药效是多种化学成分产生的综合效果, 进行定性和定量分析是控制复方制剂质量的主要方法香豆素类木脂素类和黄酮类成分是八子补肾胶囊处方组成中的标志化合物, 不仅有较高的含量而且具有较强的明确的药理药效活性因此, 选择 14 种主要成分作为八子补肾胶囊的有效成分组进行质量控制八子补肾胶囊中的上述 14 种活性成分中,8 种成分在正离子模式下的响应值高, 另外 6 种成分在负离子模式下的响应值高, 采用正负离子同时切换方式和多次切换监测模式方式, 虽然方便, 但两组化合物灵敏度均有大幅下降, 故本实验采用正负离子分别测定的方法流动相的组成决定了分析物间的分离度和待测物的离子化程度, 故流动相的选择对于 UPLC-ESI-MS/MS 法定量测定待测化合物十分关键本实验对甲醇 - 水和乙腈 - 水两种流动相组成系统进行了考察, 结果表明乙腈 - 水系统优于甲醇 - 水系统为了提高各待测组分的分离度和检测灵敏度, 先后考察了包括醋酸铵甲酸乙酸在内的流动相添加剂来选择最佳的流动相条件, 结果表明, 乙酸铵对各待测组分有一定的离子抑制作用 ; 甲酸条件下各待测组分的离子化效果也不理想 ; 在流动相中加入.1% 乙酸可以改善各待测组分的峰形并提高各待测组分的灵敏度故最终选择在流动相的水相中加入.1% 乙酸, 以提高各待测组分的离子化效率另外由于等度洗脱分离能力差和消耗时间长的缺点, 最后选用了梯度洗脱的方法关于提取溶剂和提取方法, 实验过程中对不同浓度的甲醇溶液和乙醇溶液进行了比较, 结果显示 7% 乙醇溶液的提取率更高 ; 实验还对超声提取, 振摇提取和加热回流提取方法进行了比较, 结果显示超声的提取效率最高 ; 经对不同超声提取时间进行考察,6 min 时各主要成分的含量不再增加, 即能达到最高的提取率, 因此将样品超声处理时间确定为 6 min 本实验建立的 UPLC-ESI-MS/MS 方法可在短时间内快速定量检测八子补肾胶囊中的 14 种主要药理药效成分, 测定时, 制剂中各化学成分不需完全的色谱分离, 即可通过质谱的高选择性予以区别超高效液相色谱仪和 C 18 微经柱的采用明显缩短了分析时间并得到了良好的分离度 14 个待测化合物在 5 min 内实现 11

12 了快速分离分析本实验建立的超高效液相色谱 - 质谱联用法可为全面有效的控制八子补肾胶囊的质量提供重要参考依据 References [1] Xu HH, Zhang YF, Li XY, et al. Quality standard research of bazibushen capsule [J]. China Pharm ( 中国药业 ), 211, 2: [2] Zhao SH, Han GR, Xu HH, et al. Determination of osthole in bazibushen capsule by fluorescence scanning method[j]. Chin Tradit Pat Med ( 中成药 ), 25, 27: [3] Wang QR, Fang ZL, Zheng Y, et al. Chinese tonifying formula bazi bushen capsules benefits the performance of soccer players during preparation and competition period[j]. Chin J Sports Med( 中国运动医学杂志 ), 212, 31: [4] China Food and Drug Administration. National Drug Standards( 国家药品标准 ), WS-5565(B-565)-214. [5] China Food and Drug Administration. National Drug Standards( 国家药品标准 ), WS-5565(B-565)

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doc 792 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (5): 792 796 UPLC-ESI-MS/MS 法测定八子补肾胶囊中 14 种成分的含量 1, 宋更申 2, 周丽 3, 徐艳梅 2, 张西如 2, 张兰桐 1* (1. 河北医科大学, 河北石家庄 050017; 2. 河北省药品检验研究院, 河北石家庄 050011; 3. 石药集团中奇制药技术 (