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1 第 10 卷第 8 期食品安全质量检测学报 Vol. 10 No 年 4 月 Journal of Food Safety and Quality Apr., 2019 * 张彬彬, 蒋佳希, 张明明, 梁美丹, 陈楷, 肖剑 ( 广州市食品检验所, 广州 ) 摘要 : 目的验证国标法和实时荧光定量 PCR 法 2 种方法对能力验证中的沙门氏菌双相亚利桑那亚种分离与鉴定的效果方法按照作业指导书要求及 GB 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验中的方法分离菌株, 以实时荧光定量 PCR 仪对分离菌株进行快速筛查, 再将生化鉴定结果符合沙门氏菌特征的菌株进行血清学鉴定结果样品 CODE 0575 在沙门氏菌显色平板上分离得到蓝绿色圆形菌落, 在 BS 平板上分离得到灰绿色圆形菌落, 经实时荧光定量 PCR 仪快速筛查, 结果为阳性 ; 再通过 VITEK 2 compact 鉴定为肠道沙门菌双相亚利桑那亚种 ; 该菌不产硫化氢, ONPG 为阳性, 确定血清型为 60: r: e, n, x, z 15 结论以国标法为基准, 借助实时荧光定量 PCR 仪和 VITEK 2 全自动鉴定系统进行检测, 可确保沙门氏菌双相亚利桑那亚种不被漏检 ; 应特别注意沙门氏菌双相亚利桑那亚种在显色培养基上与常见沙门菌表型不一致 ; 建议扩大对沙门氏菌双相亚利桑那亚种的监测范围关键词 : 肠道沙门菌双相亚利桑那亚种 ; 能力验证 ; 菌株鉴定 ; 血清分型 Isolation and identification of Salmonella enterica subspecies diarizonae from chocolate in the capability test ZHANG Bin-Bin, JIANG Jia-Xi, ZHANG Ming-Ming, LIANG Mei-Dan, CHEN Kai, XIAO Jian * (Guangzhou Institute of Food Inspection, Guangzhou , China) ABSTRACT: Objective To verify the effect of 2 methods of national standard method and real-time PCR on the isolation and identification of Salmonella enterica subspecies diarizonae in the capacity validation. Methods The strains were isolated, according to the requirements of operation instructions and GB National food safety standard-food microbiological testing-salmonella testing, and the isolates were quickly screened by real-time PCR. Meanwhile, the strains conforming to the biochemical identification were identified by antigen serology assay. Results The CODE 0575 sample showed blue-green circular colonies on Salmonella chromogenic medium and gray-green circular colonies on BS medium. A positive result was obtained by real-time PCR, which was identified as Salmonella enterica subspecies diarizonae by VITEK 2 compact. The biochemical identification showed no production of hydrogen sulfide and positive of ONPG, and the serotype was 60: r: e, n, x, z 15. Conclusion The detection of Salmonella enterica subspecies diarizonae can be ensured by the national standard method, real-time PCR and VITEK-2 automatic identification system at the same time. The special attention should be paid to the inconsistent phenotypes of Salmonella enterica subspecies diarizonae on chromogenic medium, and the monitoring * 通讯作者 : 肖剑, 硕士, 高级工程师, 主要研究方向为食品微生物检测技术 xjhq521@163.com *Corresponding author: XIAO Jian, Master, Senior Engineer, Guangzhou Institute for Food Inspection, Guangzhou , China. xjhq521@163.com

2 第 8 期张彬彬, 等 : 能力验证巧克力样品中肠道沙门氏菌双相亚利桑那亚种的分离鉴定 2385 of Salmonella enterica subspecies diarizonae should be expanded as a suggestion. KEY WORDS: Salmonella enterica subspecies diarizonae; capability verification; identification of strains; serotyping 1 引言沙门氏菌属于肠杆菌科中一群无芽胞革兰氏阴性菌, 是一种常见的食源性致病菌, 广泛存在于自然界中 [1] 研究发现, 一半以上的食品安全问题都是由食源性致病菌污染导致的, 而沙门氏菌仍是主要原因之一 [2] 沙门氏菌主要通过病患者或健康带菌的人和动物的排泄物污染环境和食品当菌体溶解时, 其细胞壁释放出脂多糖, 形成内毒素, 能引起人和动物伤寒副伤寒败血症以及急性肠胃炎等疾病 [3] 沙门氏菌属目前被分为 2 个种, 即肠道沙门氏菌种和邦戈尔沙门氏菌种, 其中肠道沙门氏菌种又被分为肠道亚种 (Ⅰ) 萨拉姆亚种(Ⅱ) 亚利桑那亚种(Ⅲa) 双相亚利桑那亚种 (Ⅲb) 浩敦亚种(Ⅳ) 和因迪卡亚种 (Ⅵ)6 个亚种, 邦戈尔沙门菌种即为邦戈尔沙门菌亚种 (Ⅴ) [4,5] 双相亚利桑那亚种 (Salmonella enterica subspecies diarizonae) 为肠道沙门菌 Ⅲb 亚种, 最早是在冷血动物中发现的, 广泛存在于禽类家养哺乳类动物中, 偶可感染人类, 但国内外均少有报道 [6] 国内虽有感染双相亚利桑那亚种沙门菌的报道, 但都由于其表型和生化反应极不稳定, 血清学鉴定也存在诊断试剂型别有限等诸多问题, 为明确诊断带来了很大难度 [7-10] 因此, 在检测双相亚利桑那沙门氏菌和亚利桑那沙门氏菌时, 往往会因检测人员经验不足出现漏检的情况 [11], 在能力验证样品中添加双相亚利桑那沙门氏菌, 一定程度上增加了考核难度巧克力中含有碳水化合物脂肪蛋白质以及各种微量营养素等丰富营养成分 [12], 易被微生物污染, 同时其大量脂肪成分给检验操作带来一定的影响目前, 沙门氏菌的检测方法以传统培养和生化鉴定为主, 其他快速检测方法有酶联免疫吸附法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) PCR 法环介导等温扩增 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法等 [13] 本研究在总结近几年微生物检验的经验基础上, 采用了国标法和实时荧光定量 PCR 法 2 种方法对能力验证中的沙门氏菌双相亚利桑那亚种进行分离与鉴定, 弥补了国标法检验周期较长, 以及实时荧光定量 PCR 法易出现假阳性结果的不足, 保证结果准确快速, 且不漏检, 为今后沙门氏菌的相关检测提供参考依据 2 材料与方法 2.1 材料巧克力样品, 装量约为 10 g, 采用玻璃瓶包装, 编号为 CODE 0575, 由中国食品药品检定研究院提供 2.2 试剂与仪器大肠埃希氏菌 (ATCC 25922) 伤寒沙门氏菌 [CMCC(B)50071]( 广州环凯生物科技有限公司 ) 缓冲蛋白胨水 (buffered peptone water, BPW) 四硫磺酸钠煌绿 (tatrathionate broth base, TTB) 增菌液亚硒酸盐胱氨酸 (selenite cystine broth, SC) 增菌液亚硫酸铋 (bismuth sulfite agar, BS) 琼脂沙门氏菌显色培养基营养琼脂三糖铁 (triple sugar iron agar, TSI) 琼脂 ( 广州环凯生物科技有限公司 ); 细菌基因组 DNA 快速提取试剂盒 ( 北京天根生物公司 ); 实时荧光 PCR Mix( 上海东洋纺公司 ); 特异性引物探针 ( 上海华大基因公司 ); VITEK2 革兰氏阴性细菌鉴定卡 ( 法国梅里埃公司 ); 沙门氏菌生化鉴定试剂盒 ( 广州环凯生物科技有限公司 ); Swarm 琼脂 ( 丹麦国家血清研究院, states serum institute, SSI); 沙门氏菌属诊断血清 ( 宁波天润生物药业有限公司, 丹麦国家血清研究院 ) 高压灭菌锅 ( 厦门致微公司 ); 拍打式均质器 ( 法国 INTERSCIENCE 公司 ); 生化培养箱 ( 广州环凯公司 ); 生物安全柜 ( 美国赛默飞公司 ); VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定仪 ( 法国梅里埃公司 ); 1-14K 冷冻高速离心机 ( 德国 sigma 公司 ); HDTC-100 恒温金属浴 ( 上海汉诺仪器有限公司 ); 实时荧光 PCR 仪 ( 美国 Bio-Rad 公司 ); 移液器 ( 德国 Eppendorf 公司 ) 2.3 实验方法样品前处理按照作业指导书要求对样品进行处理 : 在生物安全柜内采用无菌操作方式开启玻璃瓶, 共需准备 90 ml 预热至 45 的 BPW, 首先取 20 ml 灭菌 BPW 加入检样瓶内, 待巧克力样品融化后加入无菌均质袋内, 另取 20 ml 灭菌 BPW 清洗检样瓶, 将洗液加入均质袋内, 再取 20 ml 灭菌 BPW 重复清洗一次, 最后向均质袋内加入 30 ml 灭菌 BPW, 充分均质混匀, 制成 10 倍稀释液将编好号的 BPW 稀释液阴性对照增菌液 [BPW 中加入标准菌株大肠埃希氏菌 (ATCC 25922)] 阳性对照增菌液{BPW 中加入标准菌株伤寒沙门氏菌 [CMCC(B)50071]} 空白对照液 (BPW) 一同放入 36 培养箱中静置培养 18 h 增菌分离与生化鉴定参照 GB 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验 [14], 对样品进行后续增菌与分离, 以 VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定仪对分离出的疑似菌进行生化鉴定模板 DNA 的制备样品增菌液及分离纯化所得单菌落的模板 DNA 提取, 参照试剂盒的方法进行

2386 2.3.4 食品安全质量检测学报第 10 卷实时荧光 PCR 快速筛查参照 SN/T 1059.7-2010 进出口食品中沙门氏菌检测方法剂盒阳性对照和样品阳性对照有明显的扩增曲线(Ct 值分实时荧光 PCR 法 [15], 对样品的增菌液和分离得到的单菌落纯别为 29.01 15.

3 食品安全质量检测学报第 10 卷实时荧光 PCR 快速筛查参照 SN/T 进出口食品中沙门氏菌检测方法剂盒阳性对照和样品阳性对照有明显的扩增曲线(Ct 值分实时荧光 PCR 法 [15], 对样品的增菌液和分离得到的单菌落纯别为 ), 说明本次试验结果有效所有样品增培养物进行实时荧光 PCR 快速筛查筛查引物为: P1:5 -CTC ACC AGG AGA TTA CAA CAT GG-3, P2: 5 -AGC TCA GAC CAA AAG TGA CCA TC-3, 探针为: FAM-CAC CGA CGG CCA 菌液(包括 BPW TTB 和 SC)均出现明显的扩增曲线(Ct 值 GAC CGA CTT T-TAMARA 检测体系: 实时荧光 Mix, 10 μl; P1(10 μmol/μl), 1 μl; P2(10 μmol/μl), 1 μl; 探针(10 μmol/μl), 1 μl; DNA 模板, 1 μl; 最后补水至 25 μl 扩增程序为: 95, 10 min; (95, 15 s; 65, 30 s)45 个循环血清学鉴定及分型本次实验采用 2 种品牌的血清,主要以进口血清凝集结果为主,国产血清做验证先用国产血清 A~F 多价尝试凝集试验, 若不凝集, 则采用丹麦国家血清研究院的 OMG 多价血清再次进行试验; 然后进行 O 抗单价血清凝集, 确定 O 抗原加入 1~2 滴已凝集的诱导血清至 Swarm 琼脂培养基中, 混合均匀, 将待试菌接种到板中央, 36 培养 18 h, 沾取菌落最边缘的部分进行 H 相凝集试验从图 1 可见, 空白对照和阴性对照均无扩增曲线, 试分别为 ), 表明检测结果为阳性图中曲线出现波折是由于样品增菌液中含有杂菌/杂质较多, 直接提取 DNA 进行扩增, 会存在一些抑制物质导致曲线不平滑从图 2 可见, 空白对照和阴性对照均无扩增曲线, 试剂盒阳性对照和样品阳性对照有明显的扩增曲线(Ct 值分别为 ), 说明本次试验结果有效分离到的单菌落样品出现明显的扩增曲线(Ct 值分别为 ), 检测结果为阳性由于用纯菌落培养物直接提取 DNA, 无明显样品本底杂质影响, 扩增曲线较平滑 3.2 平板分离及生化鉴定结果样品的菌落特征及 VITEK 2 Compact 生化鉴定结果详见表 1 通过 VITEK 2 Compact 生化鉴定样品 CODE 0575 的分离菌株, 检出结果显示沙门氏菌双相亚利桑那亚种阳结果与分析性, 可信度为 95%, 但在分离平板上的菌落特征却不是沙门氏菌的典型特征(如表 1 中伤寒沙门氏菌的菌落特征) 样品样品的实时荧光 PCR 检测结果样品增菌液和分离所得菌落纯培养物的实时荧光 PCR 检测结果分别如图 1 2 所示, 两个步骤检测结果均为阳性 (Ct 值 35) CODE 0575 的分离菌在沙门氏菌显色平板上分离得到蓝绿色圆形菌落, 在 BS 平板上分离得到灰绿色圆形菌落(如图 3 和图 4 所示), 在三糖铁上不产硫化氢, ONPG 为阳性, 生化表形上易与枸橼酸杆菌大肠埃希菌相混淆注: 1 为 SC 增菌液; 2 为 SC 增菌液; 3 为样品阳性对照; 4 为 TTB 增菌液; 5 为 SC 增菌液; 6 为 BPW 增菌液; 7 为试剂盒阳性对照; 8 为试剂空白; 9 为阴性对照; 10 为提取对照 Fig.1 图 1 样品增菌液的实时荧光 PCR 检测结果 The detection results of real-time PCR of enrichment liquid

第8期张彬彬, 等: 能力验证巧克力样品中肠道沙门氏菌双相亚利桑那亚种的分离鉴定 2387 注: 1 2 3 4 5 为分离到的单菌落; 6 为样品阳性对照; 7 为试剂盒阳性对照; 8 为试剂空白; 9 为阴性对照; 10 为提取对照图 2 样品分离所得菌落纯培养物的实时荧光 PCR 检测结果 Fig.

of the samples 样品编号沙门显色平板 BS 平板 VITEK 2 Compact 生化鉴定结果(可信度) CODE 0575 蓝绿色圆形菌落灰绿色圆形菌落 Salmonella enterica subspecies diarizonae(95%) 阴性对照(大肠埃希氏菌) 蓝色圆形菌落黑褐色圆形菌落 Escherichia coli(99%)

4 第8期张彬彬, 等: 能力验证巧克力样品中肠道沙门氏菌双相亚利桑那亚种的分离鉴定 2387 注: 为分离到的单菌落; 6 为样品阳性对照; 7 为试剂盒阳性对照; 8 为试剂空白; 9 为阴性对照; 10 为提取对照图 2 样品分离所得菌落纯培养物的实时荧光 PCR 检测结果 Fig.2 The detection results of real-time PCR of pure colony culture obtained from sample separation Table 1 表 1 样品的菌落特征及生化鉴定结果 Colony characteristics and biochemical identification results of the samples 样品编号沙门显色平板 BS 平板 VITEK 2 Compact 生化鉴定结果(可信度) CODE 0575 蓝绿色圆形菌落灰绿色圆形菌落 Salmonella enterica subspecies diarizonae(95%) 阴性对照(大肠埃希氏菌) 蓝色圆形菌落黑褐色圆形菌落 Escherichia coli(99%) 阳性对照(伤寒沙门氏菌) 紫红色圆形菌落黑色圆形菌落, 周围培养基变棕色 SalmonellaserTyphi(99%) 空白对照不生长不生长样品 CODE 0575 Fig.3 阳性对照图 3 样品 CODE 0575 与阳性对照(伤寒沙门氏菌)在沙显平板上的菌落特征 Colony morphology of sample and positive controlin Salmonella chromogenic medium

5 2388 食品安全质量检测学报第 10 卷样品 CODE 0575 阳性对照图 4 样品 CODE 0575 与阳性对照 ( 伤寒沙门氏菌 ) 在 BS 平板上的菌落特征 Fig.4 Colony morphology of sample and positive control in BS medium Table 2 表 2 沙门氏菌血清分型结果 Serotype results of Salmonella isolated from the samples 样品编号 O 抗原 H 抗原第 1 相 H 抗原第 2 相菌名 CODE r e, n, x, z 15 沙门氏菌双相亚利桑那亚种阳性对照菌 9,12,Vi d 伤寒沙门氏菌 3.3 血清学鉴定结果样品 CODE 0575 分离菌和阳性对照菌株 CMCC(B) 的血清分型结果如表 2 结果表明, 样品 CODE 0575 分离菌与 OMG 多价血清凝集, 用 O 抗血清单因子逐一进行凝集试验, 可与 O 60 发生凝集, 阳性对照菌株 [ 伤寒沙门氏菌 CMCC(B)50071] 与 O 9 和 O 12 发生凝集在 H 抗原凝集试验中, 样品 CODE 0575 分离菌先与第 2 相 H e, n, x, z 15 抗血清发生凝集, 第 1 相受到抑制, 经诱导后, 可与 Hr 抗血清发生凝集, 阳性对照菌株 ( 伤寒沙门氏菌 ) 与 Hd 抗血清发生凝集 3.4 结果与报告综合以上生化实验和血清学鉴定结果, 在 10 g 样品中编号为 CODE 0575 分离菌检测为沙门氏菌双相亚利桑那亚种, 血清型为 60: r: e, n, x, z 15 4 讨论与结论 4.1 注意菌落特征, 避免漏检, 并结合快筛方法提高检验效率样品分离的沙门氏菌双相亚利桑那亚种在沙门氏菌显色培养基上显示蓝绿色菌落, 与标准菌落紫红色不一致, 容易被直接排除, 导致漏检误判该菌生化具有非典型生长特性, 通常迟缓发酵乳糖, 在三糖铁上不产硫化氢, ONPG 为阳性, 生化表形上易与枸橼酸杆菌大肠埃希菌相混淆, 需结合血清学和分子检测将 3 者甄别因此, 在沙门氏菌的相关检测中, 双相亚利桑那亚种不同于常见沙门氏菌的这个特征应引起高度重视建议采用不同的选择性平板进行筛选分离, 并尽可能多地挑取具有不同特征的可疑菌落进行生化试验, 同时结合 VITEK 2 鉴定仪实时荧光 PCR 等其他仪器方法进行辅助验证并综合分析, 避免漏检误判 4.2 实时荧光 PCR 检测的注意事项实时荧光 PCR 方法具有快速准确特异性好等优点, 但在 PCR 扩增过程中, 容易受到干扰物质的影响本实验中利用增菌培养液直接提取 DNA 并进行 PCR 扩增, 由于培养液本底杂质较多, 对试验结果影响很大, 为了得到更好的扩增曲线, 在前处理时需进行多几次的离心并洗涤过滤操作, 尽量除去杂质和颜色对荧光 PCR 反应的影响同时, 利用增菌培养液直接快速筛查, 假阳性概率较大, 需结合后续分离纯化等步骤的结果一起使用利用纯菌落培养物直接提取 DNA 进行荧光 PCR 检测, 由于不受样品本底杂质的影响, 扩增曲线呈明显的 S 型不足之处是不能直接进行血清型的鉴定有研究指出, 可利用 MLST 技术准确快速检测沙门氏菌血清型, 并有望在沙门氏菌血清型鉴定中成为替代传统血清分型的方法 [16] 4.3 诊断血清建议采用两种品牌并做好质控, 提升准确度在对样品进行血清鉴定前, 需做好血清的质控由于双相亚利桑那沙门菌与常用沙门菌属诊断血清 (A-F) 群 O

6 第 8 期张彬彬, 等 : 能力验证巧克力样品中肠道沙门氏菌双相亚利桑那亚种的分离鉴定 2389 抗血清和 Vi 因子血清均不凝集, 在常规血清学鉴定中容易漏检, 所以在 VITEK 系统生化的提示下, 即使上述血清不凝集, 需要对照 Kauffman-White 表, 测试其他罕见 O 血清因子的凝集情况, 双相亚利桑那沙门菌有 331 种血清型, O 抗型别确定后, 再继续鞭毛 H 抗原的凝集测试, 明确其血清型在本实验中, 血清凝集实验的难点在于 H 抗原的第 1 相诱导, 采用加入诱导血清的 Swarm 琼脂培养基进行培养后再进行血清凝集实验, 过程持续时间长且繁琐, 要求实验人员专心且耐心进行相关操作, 并在平时注意积累经验本研究采用两种品牌诊断血清进行鉴定, 鉴定效果良好, 保证了实验结果的准确性 4.4 对于沙门氏菌双相亚利桑那亚种的监控监测, 应适当扩大范围根据 Sörén 等 [17] Bonke 等 [18] 齐景文等 [19] 史怀平等 [20] [21] 郭龙宗等的相关研究, 在畜禽及其产品中均有检出亚利桑那沙门氏菌和双相亚利桑那沙门氏菌, 因此, 建议适当扩大对沙门氏菌双相亚利桑那亚种的监控监测, 以保障人民的食品安全综上所述, 为了更好地对沙门氏菌双相亚利桑那亚种开展检测, 在传统培养鉴定法的基础上, 可结合分子生物学等快速检测技术进行筛查, 并特别注意鉴定平板上的菌落特征, 防止漏检, 血清分型时需结合两种诊断血清产品一起鉴定 ; 同时, 在畜禽及其产品中扩大对其监控监测范围, 保障食品安全参考文献 [1] 高晗, 何娟, 严礼. 3 种沙门氏菌检测方法能力验证 [J]. 食品安全质量检测学报, 2017, 8(2): Gao H, He J, Yan L. Capability verification of three detection methods of Salmonella [J]. J Food Saf Qual, 2017, 8(2): [2] 赵垠莹. 质谱法检测食源性致病菌技术研究进展 [J]. 化工管理, 2018, (35): Zhao YY. Advances in detection of food-borne pathogens by mass spectrometry [J]. Chem Enterp Manag, 2018, (35): [3] 骆海朋, 唐颂, 陈怡文, 等. 沙门氏菌能力验证样品的研制及其应用 [J]. 食品安全质量检测学报, 2016, 7(4): Luo HP, Tang S, Chen YW, et al. Preparation of quality control samples of Salmonella and their application in the proficiency test [J]. J Food Saf Qual, 2016, 7(4): [4] 王志伟, 徐琼, 陈欣钦, 等. 能力验证样品中沙门氏菌的分离与鉴定 [J]. 食品研究与开发, 2016, 37(7): Wang ZW, Xu Q, Chen XQ, et al. Isolation and identification of Salmonella in the proficiency testing sample [J]. Food Res Dev, 2016, 37(7): [5] 王超, 吴亚英. 一株沙门氏菌能力验证的鉴定与分析 [J]. 世界最新医学信息文摘, 2016, 16(30): Wang C, Wu YY. Identification and analysis of a strain Salmonella in proficiency testing [J]. World Latest Med Inf, 2016, 16(30): [6] 曲梅, 黄瑛, 吕冰, 等. 引起腹泻的肠道沙门菌双相亚利桑那亚种病原学鉴定 [J]. 中国预防医学杂志, 2016, 17(6): Qu M, Huang Y, Lv B, et al. Etiological identification of Salmonella enterica subspecies diarizonae isolate [J]. Chin Prev Med, 2016, 17(6): [7] 沈丽珍. 亚利桑那沙门氏菌引起腹泻一例 [J]. 江西医学检验, 2001, 19(5): 319. Shen LZ. A case of diarrhea caused by Salmonella enterica subspecies arizonae [J]. Jiangxi J Med Lab Sci, 2001, 19(5): 319. [8] 彭易根, 张正群. 亚利桑那沙门氏菌食物中毒 72 例临床分析 [J]. 现代医药卫生, 2011, 27(4): Peng YG, Zhang ZQ. Clinical analysis of 72 cases of Salmonella enterica subspecies arizonaein food poisoning [J]. Mod Med Health, 2011, 27(4): [9] 李明, 利娟. 亚利桑那沙门氏菌引起胆管炎合并胆石症致败血症一例 [J]. 中国厂矿医学, 2004, 17(1): 6. Li M, Li J. A case of cholangitis with cholelithiasis induced septicemia by Salmonella enterica subspecies arizonae [J]. Chin Med Factory Mine, 2004, 17(1): 6. [10] 冯雪, 玛依努尔, 于中丽. 亚利桑那沙门菌致急性肠炎 1 例 [J]. 检验医学与临床, 2011, 8(4): 427, 429. Feng X, Ma YNE, Yu ZL. A case of acute enteritis caused by Salmonella enterica subspecies arizonae [J]. Lab Med Clinic, 2011, 8(4): 427, 429. [11] 王青龙, 蔡雪凤, 周艳霞, 等. 实时荧光 PCR 法检测食品中亚利桑那沙门氏菌 [J]. 中国酿造, 2018, 37(6): Wang QL, Cai XF, Zhou YX, et al. Detection of Salmonella arizonae in food by real-time PCR [J]. China Brew, 2018, 37(6): [12] 柳鹏. 揭秘巧克力 [J]. 江苏卫生保健, 2016, (11): 39. Liu P. Discover the secrets of chocolate [J]. Jiangsu Health Care, 2016, (11): 39. [13] 罗荣, 任秀, 崔生辉. 食品中沙门氏菌快速检测技术研究进展 [J]. 食品安全质量检测学报, 2016, 7(4): Luo R, Ren X, Cui SH. Research progress of rapid detection technique of Salmonella in food [J]. J Food Saf Qual, 2016, 7(4): [14] GB 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验 [S]. GB National food safety standard-food microbiological examination-salmonella [S]. [15] SN/T 进出口食品中沙门氏菌检测方法实时荧光 PCR 法 [S]. SN/T Detection of Salmonella in food for import and export-real-time PCR method [S]. [16] 方婷子, 史贤明, 施春雷. 沙门氏菌血清型快速 PCR 鉴定方法的建立 [J]. 中国食品学报, 2017, 17(2): Fang TZ, Shi XM, Shi CL. Development of rapid PCR determination method of Salmonella serovars [J]. J Chin I Food Sci Technol, 2017, 17(2): [17] Sörén K, Lindblad M, Jernberg C, et al. Changes in the risk management of Salmonella enterica subspecies diarizonae serovar 61:(k):1,5,(7)in Swedish sheep herds and sheep meat due to the results of a prevalence study 2012 [J]. Acta Vet Scand, 2015, (57): 6.

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