骨, 用一小块纱布来回搓干净附在骨上的肌肉碎渣剪掉股骨两端膨大的关节头, 然后用注射器吸取 5 ml 生理盐水, 插入股骨一端, 将骨髓细胞冲洗至 10 ml 的离心管中可重复冲洗多次, 直至骨髓腔呈白色为止 3. 离心处理将所获得的细胞悬浮液以 1000 rpm 离心 10 min, 吸去上清

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平花
5 years ago
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1 生物医学实验讲义实验一小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验一实验目的 1. 掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的制备方法 2. 熟悉微核的形态特征 3. 了解微核检测的实际意义和应用范围二实验原理染色单体或染色体的无着丝点断片, 或因纺锤体受损而丢失的整个染色体, 在细胞分裂后期, 仍然遗留在细胞质中末期之后, 单独形成一个或几个规则的次核, 被包含在子细胞的胞质内, 因比主核小, 故称为微核大小应为主核的 1/20~1/5 微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样微核率与用药的剂量或辐射累积效应呈正相关, 所以可用简易的快速灵敏的微核计数来代替繁杂的畸变染色体计数微核检测技术目前已广泛应用在辐射损伤以及化学诱变剂研究和新药保健食品的毒理实验中嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段, 此时红细胞的主核已排出, 因胞质内含有核糖体, 姬姆萨 Giemsa 染色呈灰蓝色, 成熟红细胞的核糖体已消失, 被染成淡桔红色骨髓中嗜多染红细胞数量充足, 由于无核, 极易观察到微核, 因此, 骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群三实验材料 1. 主要器材显微镜, 低速离心机, 电子天平, 解剖器械 ( 搪瓷解剖盘探针剪刀镊子 ), 干净纱布, 注射器试管试管架磨口试剂瓶滴管染色缸吸耳球量筒清洁载玻片 2. 主要试剂 0.9% 生理盐水灭活的小牛血清环磷酰胺甲醇磷酸盐缓冲液 PBS (ph6.8) Giemsa 染液瑞氏染液 3. 实验动物成年昆明小鼠四实验方法 1. 环磷酰胺处理取骨髓前 24 h 先给小鼠腹腔注入环磷酰胺, 注射剂量为 100 mg/kg 动物体重 2. 取骨髓用损伤脊髓法处死小鼠, 然后用剪刀剪开大腿上的皮肤和肌肉, 取出大腿

2 骨, 用一小块纱布来回搓干净附在骨上的肌肉碎渣剪掉股骨两端膨大的关节头, 然后用注射器吸取 5 ml 生理盐水, 插入股骨一端, 将骨髓细胞冲洗至 10 ml 的离心管中可重复冲洗多次, 直至骨髓腔呈白色为止 3. 离心处理将所获得的细胞悬浮液以 1000 rpm 离心 10 min, 吸去上清液, 在沉淀物中加入 2 滴灭活的小牛血清, 制成细胞悬液 4. 涂片滴一滴悬液于载玻片一端, 按常规方法涂片, 在空气中晾干 5. 固定将晾干的载玻片放入甲醇固定液中 10 min, 取出晾干 6. 染色将制片平放在玻璃板上, 用 Giemsa:PBS: 瑞氏染液 (1:9:10), 染色 15 min, 流水冲洗后晾干即可镜检 7. 观察先以低倍镜高倍镜粗检, 选择细胞分布均匀疏密适度形态完整染色良好的区域, 再在油镜下按一定顺序进行嗜多染红细胞和微核计数嗜多染红细胞为年幼红细胞, 呈灰蓝色, 略大于红细胞 ( 红色 ), 微核多呈圆形和椭圆形, 呈蓝紫色或紫红色嗜多染红细胞中微核多为一个, 也可有两个或以上微核, 此时仍按有微核的嗜多染红细胞计算 8. 结果分析在显微镜下, 每只小鼠骨髓涂片标本计数 1000~2000 个嗜多染红细胞, 包括其中出现微核的细胞数, 计算微核细胞率计算公式如下 : 含微核的细胞数微核细胞率 100% 观察的细胞总数五结果意义按 100 mg/kg 体重剂量给小鼠腹腔注射环磷酰胺, 其嗜多染红细胞微核率为千分之 48.9±3.6 正常小鼠嗜多染红细胞微核率为千分之五以下, 超过千分之五为异常六注意事项 1. 防止小牛血清污染 2. 大腿骨须擦拭干净, 以免影响结果 3. 涂片不要过厚或过薄 4. 选择分布均匀疏密适度形态完整染色好的区域镜检由低倍镜到高倍镜, 并按一定顺序镜检 5. 注意微核与其他颗粒异物的区分实验二小鼠骨髓细胞染色体畸变实验一实验目的

3 1. 掌握动物骨髓细胞标本制作技术 2. 了解染色体畸变实验剂量设计原则和体内染毒过程 3. 掌握染色体畸变的类型二实验原理哺乳动物细胞核中均具有一定的数目和特定形态结构的染色体当外源化学物质作用于动物机体后, 其母体化学物或代谢产物可能作用于染色体或与染色体分裂有关的过程, 引起染色体断裂和错误重接结构, 或者引起染色体分离过程的改变, 从而导致染色体结构畸变或数目畸变动物骨髓细胞具有数目多和分裂旺盛的特点, 可以直接用于染色体标本的制备而无需体外培养为了清楚地观察染色体畸变, 必须选择处于细胞分裂中期相的细胞因此在细胞收获前给予动物一定剂量的秋水仙碱处理, 通过阻止纺锤体对染色体向细胞两极的牵拉作用使细胞分裂间期和分裂前期的细胞产生同步化, 并停留在中期相细胞收获后, 还必须通过低渗处理使细胞体积增大, 并使染色体均匀分散在细胞质中小鼠骨髓细胞染色体畸变实验检测的遗传学终点是染色体结构的改变和染色体分离的改变, 用于检测环境中的染色体断裂剂和有丝分裂毒物三实验材料 1. 器材 : 小剪刀镊子滴管离心管载玻片注射器水浴箱, 离心机, 生物显微镜 2. 试剂 : 全部试剂除注明外均为分析纯, 实验用水为蒸馏水 1)500mg/L 秋水仙素, 置于棕色瓶中, 冰箱保存 2)2.2% 柠檬酸钠 3)PH7.4 磷酸盐缓冲液 :1/15mol/L 磷酸氢二钠溶液 : 磷酸氢二钠 (Na2HPO4)9.47g 溶于 1000mL 蒸馏水中 1/15mol/L 磷酸二氢钾溶液 : 磷酸二氢钾 (KH2PO4)49.07g 溶于 1000mL 蒸馏水中将磷酸氢二钠溶液 80mL 与磷酸二氢钾溶液 20mL 混合, 用 PH 记调节 PH 至 7.4 4)0.075mol/L 的氯化钾溶液 5) 甲醇 : 冰乙酸以 3:1 混合, 临用时现配 6)Giemsa 储备液 :Giemsa 染料 3.8 克, 加少量甲醇研磨, 逐渐加甲醇 375mL, 溶解后再加 125mL 纯甘油, 于 37 溫箱保温 48 小时, 在此期间摇动数次, 放置 1~2 周备用 Giemsa 应用液 : 取 1mL 储备液加入 9mL,PH7.4 的磷酸盐缓冲液

4 3. 实验动物常用健康成年小鼠, 每组 6~10 只, 雌雄各半动物购买后适应环境至少 3 天四实验方法 1. 剂量及分组受试物应设三个剂量组, 最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和 / 或个别动物出现死亡的剂量, 一般可取 30%~80%LD50, 低剂量组应不表现出毒性, 可取 1/8 LD50 作为低剂量组当急性毒性试验给予受试物最大剂量 ( 最大使用浓度和最大灌胃容量 ), 动物仍无死亡而求不出 LD50 时, 高剂量组则按以下步骤确定 :1)10g/kg 体重 ;2) 人的可能摄入量的 100 倍 ;3) 一次最大灌胃剂量进行设计, 再下设中低剂量组同时设溶剂对照组和阳性对照组, 阳性物可用丝裂霉素 C 或环磷酰胺经口或腹腔注射给予 2. 受试物配制 : 一般用蒸馏水作溶剂, 一般蒸馏水不溶于水, 可用食用油, 医用淀粉, 羧甲基纤维素, 配成乳浊液或悬浊液受试物应于灌胃前新鲜配制 3. 实验动物的处理 : 受试物经口给予实验动物 2~4 次, 每次间隔 24 小时, 在末次给受试物后间隔 24 小时取材必要时可先用一个剂量的 3 只动物, 于给受试物后小时分别处死动物取材, 以选择处死动物的最适时间在一次给受试物时也可每个剂量组用 15 只动物, 于小时后分别各处死 5 只动物取材处死动物前 2~4 小时, 按 4 mg/kg 体重注入秋水仙素小鼠颈椎脱臼处死 4. 标本制备 1) 取材, 取股骨, 去附着的肌肉, 剪去两端骨骺, 用带针头的注射器吸取 2~4 ml 2.2% 柠檬酸钠溶液, 将骨髓洗入 10mL 离心管中, 反复冲洗数次, 然后以 1000r~1500r/min 离心, 弃去上清液 2) 制片 : 离心后的沉淀物加入 4mL0.075mol/L 氯化钾溶液, 混匀后于在 37 低渗水浴箱中, 放置 15~20 分钟, 再以 1000~1500r/min 离心, 弃去上清液将新配制的甲醇 ~ 冰乙酸固定液 4mL 沿管壁加入受试物中,10~15 分钟后, 用吸管将细胞团块打碎继续固定 10~ 15 分钟, 以 1000~1500r/min 离心, 弃去上清液再加固定液 4mL 静置 20 分钟后离心, 弃去上清液, 用吸管混匀细胞悬液先将洗净的载玻片保存于冰水中备用自冰水中取出载玻片, 倾斜 30 度放置, 立即吸取细胞悬液在玻片的 1/3 处滴 3 滴, 轻吹细胞悬液扩散平铺于玻片上每个标本制 2~3 张玻片, 空气中自然干燥临用时取 Giemsa 储备液 1mL, 磷酸盐缓冲液 9mL, 置染色缸中, 将涂片浸于染液中染色 15 分钟左右, 取出玻片用水冲洗, 空气中自然干燥

5 5. 阅片 1) 阅片要求 : 在低倍镜下检查制片质量, 制片应为全部染色体较集中, 而各个染色体分散互不重叠长短收缩适中两条单体分开清楚地显示着丝粒点位置, 染色体呈红紫色用油镜进行细胞中期染色体分析每只动物分析 100 个中期相细胞, 每个剂量组不少于 1000 个中期相细胞 2) 观察项目 : 染色体数目的改变 :1 非整倍体 : 亚二倍体或超二倍体 ;2 多倍体 : 染色体成倍增加 ;3 内复制 : 包膜内的特殊形式的多倍化现象染色体结构的改变 ; 1 断裂 : 损伤长度大于染色体的宽度 ;2 微小体, 较断片小而呈圆形 ; 3 有着丝点环 : 带有着丝点部分, 两端形成环状结构, 并伴有一双无着丝粒点断片 ;4 无着丝粒点环 : 成环状结构 ;5 单体互换, 行成三辐体四辐体或多种形状的图像 ;6 双微小体 : 成对的染色质小体 ;7 裂隙 : 损伤的长度小于染色体的宽度 ;8 非特定性变化 : 如粉碎化, 着丝点细长化粘着等五结果意义 1. 结果判定试剂组与对照组相比, 试验结果染色体畸变率有明显的剂量反应关系并有统计学意义时, 即可确认为阳性结果, 若统计学上差异有显著性, 但无剂量反应关系时, 则应进行重复试验结果能重复者确定为阳性 2. 数据处理统计处理用 X 2 检验六注意事项 1. 控制好低渗时间, 可使染色体标本分散良好, 便于观察 2. 固定的次数和时间对制片的质量也有影响 3. 本实验不适用于有证据表明受试物或反应代谢产物不能达到靶组织骨髓的情况实验三小鼠精子致畸实验一实验目的 1. 了解小鼠精子畸形实验是一种检测环境理化因素对雄性生殖细胞遗传损伤的遗传毒理学手段 2. 熟悉小鼠精子畸形实验的操作步骤, 学习精子悬液的制备, 畸形精子形态的辨别及

6 正确的计数方法二实验原理小鼠精子形态直接或间接地受基因控制, 具有高度遗传性精子的畸形主要是指形态的异常, 已知精子的畸形是决定精子形成的基因发生突变的结果因此形态的改变提示有关基因及其蛋白质产物发生了变化该试验通过观察小鼠精子头部和尾部形态的改变, 来研究外界化学物对人或动物精子细胞的毒性作用三实验材料 1. 主要器材细胞培养板, 镊子, 吸管, 微量可调节加样器, 清洁载玻片, 染色缸, 中性树脂, 显微镜 2. 主要试剂环磷酰胺 ;0.9% 生理盐水 ;1% 伊红染液 3. 实验动物成年昆明小鼠四实验方法 1. 染毒将 10 只雄性小鼠分为两组, 每组 5 只, 染毒组以环磷酰胺按 40 mg/kg 腹腔注射 ; 阴性对照组以 0.9% 生理盐水按 0.1 ml/10 g 体重腹腔注射, 每天 1 次, 连续 5 天 2. 精子悬液制备两组小鼠均于首次给药后第 35 天用颈椎脱臼法处死, 摘取双侧附睾分别置于盛有 1 ml 0.9% 生理盐水的细胞培养板中, 用镊子轻轻撕开附睾包膜, 徐徐摇动附睾组织后, 静置 5~10 min, 然后用镊子将组织碎片尽量取出 3. 制片轻轻吹打精子悬液, 按 1 ml 精子悬液加入 1% 伊红溶液 0.1ml 混匀染色 15~20 min 后, 取 1 滴于清洁的玻片上, 均匀推片, 空气自然干燥后, 用中性树脂封片, 每个精液样本制片 2 张 4. 镜检在低倍镜下 ( 绿色滤光片 ) 找到背景清晰精子重叠较少的部位, 用高倍镜顺序检查精子形态, 计数精子有头无尾 ( 轮廓不清 ) 或头部与其他精子或碎片重叠, 或明显是人为剪碎者均不计算, 每只动物检验 1000 个精子精子畸形主要表现在头部, 其次表现在尾部, 畸形类型可分为无钩香蕉形胖头无定形尾折叠双头双尾等, 最后统计其畸形百分率五结果意义经统计处理 : 对照组与 40 mg/kg 染毒组比较有显著意义,P<0.05 表明环磷酰胺能够引起小鼠的精子畸形六注意事项

7 1. 异常精子均应记录显微镜的坐标数, 以备复查 2. 分别记录异常类型, 以便统计精子畸形率及精子畸形类型实验四倾注平板法测定水中细菌菌落总数一实验目的 (1) 了解水中菌落总数测定的意义和原理 (2) 熟悉水样的采集与保存 (3) 掌握倾注平板法测定水的菌落总数的技术方法, 及正确进行结果的卫生评价二实验原理样品中的微生物细胞充分分散开, 使其均匀分布于平板中的培养基内经培养后, 单个细胞及聚在一起的细胞可以生长繁殖, 形成一个肉眼可见的菌落, 统计菌落数目, 即可用以评价样品中的微生物的数量水中细菌菌落总数是指 1ml 水样在营养琼脂培养基中,37 经 24h 培养后所生长的菌落数用平板菌落计数测定水中细菌菌落总数, 仅包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的和兼性厌氧的细菌菌落总数三仪器与试剂营养琼脂高压蒸汽灭菌器恒温培养箱灭菌平皿放大镜灭菌采样瓶灭菌刻度吸管制备培养基用一般设备 : 量筒, 三角烧瓶,pH 计或精密 ph 试纸等四实验方法检验程序, 见下图所示 : 水样做成几个适当倍数的稀释液选择 2~3 个适宜稀释度, 各以 1ml 分别加入灭菌平皿内, 每个浓度同时做 2 个平皿同时做营养琼脂空白对照每皿加入适量营养琼脂 37 24h 菌落计数图报告细菌菌落测定程序

8 操作步骤 : 1. 检测细菌的水样采集与保存 1) 选择容量 500ml 的磨口带塞无色细口瓶, 在采样前必须洗净, 瓶口包扎后灭菌备用 2) 按无菌操作采集水样, 采水量为瓶容量的 80% 左右, 以便检验时充分摇动, 使菌胶团分散 3) 在采集加氯消毒水样时, 采样瓶应在消毒前, 按每 500ml 水样加入 1.5% 硫代硫酸钠溶液 2ml, 以中和水中的余氯, 终止氯的持续杀菌作用 ; 然后,121 高压灭菌 20min 备用 4) 水样采集后, 应立即记录水样名称时间地点等项目, 从速检验, 一般不应超过 2h, 置冰箱保存时也不应超过 4h 2. 水样的检测 1) 用力振摇水样 20~25 次, 以分散可能存在的菌胶团 2) 以无菌操作法吸取 10ml 充分混匀的水样, 注入盛有 90ml 灭菌水的玻璃瓶中, 混匀成 1:10 稀释液 3) 吸取 1:10 稀释液 1ml 注入盛有 9ml 灭菌水试管中, 混匀成 1:100 稀释液, 按同法依次稀释成 1:1000 1:10000 稀释液等备用吸取不同浓度的稀释液时, 每次必须更换吸管 4) 用 1ml 无菌吸管吸取 2~3 个适当浓度的稀释液 1ml, 分别注入无菌平皿中, 每个稀释度同时做 2 个平皿, 不同稀释度更换吸管 5) 倾注约 15ml 己融化并冷却到 45 左右的营养琼脂于上述平皿中, 并立即旋转平皿, 使水样与琼脂充分混匀每次检验时另用一个平皿只倾注营养琼脂作空白对照 6) 待平皿内琼脂冷却凝固后, 翻转平皿, 使底面向上, 置 37 培养 24h 3. 菌落计数在记下各平板上的菌落数后, 应求出同一稀释度的平均菌落数, 供计算时使用在求同一稀释度的平均数时, 若其中一个平板有较大片状菌落生长时, 则不宜计数, 应以没有片状菌落生长的平板计数平均菌落数若片状菌落不到平板的一半, 而另一半中菌落分布均匀, 则可用计数一半平板上生长的菌落数乘 2, 代表整个平板上的菌落数然后再求该稀释度的平均菌落数不同情况下的计算方法 : 1) 首先选择平均菌落数在 30~300 之间者进行计算, 当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时, 即以该平均菌落数乘以其稀释倍数报告 2) 若有两个稀释度, 其平均菌落数均在 30~300 之间, 则应按两者菌落总数之比值来决定若其比值小于 2, 应报告菌落的平均数 ; 若比值大于 2, 应报告其中较少的菌落 3) 若所有稀释度的平均菌落数均大于 300, 则应该按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告

9 4) 若所有稀释度的平均菌落数均小于 30, 则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告 5) 若所有稀释度的平均菌落数均不在 30~300 之间, 则应以最接近 300 或 30 的平均菌落数乘以稀释倍数报告报告方式 : 菌落数在 100 以内时, 按实有数报告 ; 大于 100 时, 采用两位有效数字乘以 10 的指数来表示. 在两位有效数字后面的数值, 以四舍五入方法计算在报告菌落数为无法计数时, 应注明水样的稀释倍数表检验结果记录 : 稀释度平板号菌落数平均菌落数菌落总数五结果意义细菌菌落总数用以说明水被有机物污染的程度我国生活饮用水卫生标准中规定 lml 生活饮用水中, 细菌菌落总数不得超过 100 个六注意事项 1. 实验开始前, 应先将各稀释管平皿做好标记, 包括 : 稀释度小组等 2. 进行水样的稀释时, 吸管的更换 : 每支吸管吹打混匀本稀释度的水样, 然后吸取 1ml 水样注入到下一支无菌水管后 ( 不要插入到无菌水中 ) 即弃去, 再用新的吸管在下一稀释度重复上述操作 3. 倾注平板前注意琼脂的温度, 不要太烫和太凉, 否则使细菌烫伤和使琼脂凝固预先融化的琼脂可放入 45 水浴保温培养 24h 后, 做平板计数时, 可用肉眼观察, 必要时可用放大镜检查, 以防遗漏实验五多管发酵法测定水中大肠菌群一实验目的 1 了解水中大肠菌群的检测意义 2 熟悉水中大肠菌群的检测原理, 掌握多管发酵法检测大肠菌群的原理与技术方法二实验原理大肠菌群系指一群在 37 培养 24h 能发酵乳糖产酸产气需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌多管发酵法采用最大可能数 (most probable number,mpn) 的计数方法, 根据大肠菌群的定义, 将不同量的水样接种到含乳糖的培养基中, 经培养后根据阳性反应结果,

10 查相应的 MPN 表, 可获得原水样中大肠菌群的量三实验材料伊红美蓝平板乳糖蛋白胨培养基革兰染液显微镜无菌水高压蒸汽灭菌器恒温培养箱灭菌采样瓶灭菌刻度吸管试管小倒管制备培养基用一般设备 : 量筒, 三角烧瓶,pH 计或精密 ph 试纸等四实验方法 1. 检验程序 : 水样稀释乳糖蛋白胨发酵管,37,24 小时不产酸产气产酸产气或产酸大肠菌群阴性伊红美蓝琼脂平板,37,24 小时报告革兰氏阳性革兰氏染色革兰氏阴性无芽胞杆菌大肠菌群阴性乳糖蛋白胨发酵管,37,24 小时报告大肠菌群阴性不产气大肠菌群阳性产气报告图大肠菌群检测程序报告 2. 操作步骤 : 1) 将水样作 1:10 及 1:100 稀释 2) 初步发酵试验 : 分别吸取 1ml1:100 稀释水样,1ml1:10 稀释水样及 1ml 原水样, 分别注入装有 10ml 乳糖蛋白胨培养液的试管中 ( 内有倒管 ), 每个浓度接种 5 份混合后置于 37 恒温箱中培养 24 小时 3) 平板分离 : 经培养 24 小时后, 将初步发酵试验产酸产气及只产酸不产气的发酵管分别接种在伊红美蓝琼脂平板培养基上, 置 37 培养箱内培养 18~24h, 观察菌落形态, 挑选符合下述特征的可疑菌落涂片革兰染色镜检和进行复发酵试验 :1 深紫黑色, 具有金属光泽的菌落 ;2 紫黑色, 不带或略带金属光泽的菌落 ;3 淡紫红色, 中心色较深的菌落 ; 4) 复发酵试验 : 若挑取可疑菌落涂片镜检为革兰阴性无芽孢杆菌, 再接种于乳糖蛋白胨培养液 ( 内有倒管 ) 中, 每管可接种分离自同一初发酵管的最典型的菌落 1~3 个, 置 37 培养箱中培养 24h 有产酸产气( 不论倒管内气体的多少均为产气 ) 者, 即可证实有大肠菌群的存在

11 查表报告结果 : 根据证实为大肠菌群阳性的管数, 查 MPN 表 ( 见后页 ), 即可报告每 100 毫升水样中的总大肠菌群数五结果意义该菌群主要来源于人畜粪便, 它基本包括了粪便内全部兼性需氧的革兰阴性杆菌, 以埃希菌属为主, 尚有柠檬酸杆菌属肠杆菌属克雷伯菌属等在成人每日粪便中, 大肠菌群细菌数量极大, 排菌数可达 5~ 个, 是评价水体被粪便污染的指标菌, 可用于评价饮用水的卫生质量我国生活饮用水卫生标准为在 100ml 水中总大肠菌群不得检出六注意事项以下的大肠菌群 MPN 检索表, 总接种量为 55.5 ml, 其中 5 份 10 ml 水样, 5 份 1mL 水样, 5 份 0.1 ml 水样如水样含菌量少, 也可按 100,10,1mL 接种, 那么实际 MPN 值应为表中的 MPN 值除以 10; 反之如水样含菌量多, 也可按 1,0.1,0.01mL 接种, 那么实际 MPN 值应为表中的 MPN 值乘以 10 表菌群 MPN 检索表接种量,mL MPN/100m 接种量,mL MPN/100m 接种量,mL MPN/100m L L L

12 接种量,mL MPN/100m 接种量,mL MPN/100m 接种量,mL MPN/100m L L L

13 应用 MPN 方法计数应注意 :1) 菌液的稀释度要合适, 原则是最低稀释度的所有重复都应有菌生长, 而最高稀释度的所有重复无菌生长 2) 每个接种稀释度必须有重复, 一般 3~5 个重复, 重复越多, 误差越小, 不同重复数应查相应的 MPN 表计算结果 3. 水样接种后需混匀实验六自然沉降法测定室内空气中细菌菌落总数一实验目的 1 了解空气中细菌菌落总数的测定意义与常用的方法, 不同场所空气污染情况的测定 2 熟悉自然沉降法测定空气中细菌菌落总数的原理 3 掌握自然沉降法测定空气中细菌菌落总数的技术方法二实验原理自然沉降法是利用空气微生物粒子的重力作用, 在一定时间内将微生物粒子收集到带有培养介质的平皿内, 对在适宜温度下培养生长的菌落进行生物学观察和计数, 能反映落下菌的数量, 可用于大致了解环境空气微生物污染状况三实验材料高压蒸汽灭菌器恒温培养箱 9cm 直径营养琼脂平板制备培养基用一般设备 : 量筒, 三角烧瓶,pH 计或精密 ph 试纸等四实验方法 1. 根据现场的大小, 选择有代表性的位置设采样点, 离地高度为 1.2~1.5m 一般于室内四角及中央放平板各一块, 于同一时间揭开皿盖, 暴露放置 5min, 盖上皿盖 2. 平皿倒置, 放 37 培养 48h 3. 计数 5 个平板菌落总数, 结果以 cfu/ 皿表示五结果意义自然沉降法能反映落下菌的数量, 用落下菌推算悬浮菌量, 在推理上有误差, 偏少可用于大致了解环境空气微生物污染状况不适用于在有气流环境中使用 ; 其采样效率普遍低于采样器法, 但在脏环境采样效率较好, 但难于测出空气中含菌量极少的菌类六注意事项 1. 设置采样点时, 应根据现场的大小, 选择有代表性的位置作为空气细菌检测的采样

14 点通常设置 5 个采样点, 即室内墙角对角线交点为一采样点, 该交点与四墙角连线的中点为另外 4 个采样点室内面积小于 10m 3 时, 可设置 3 个采样点采样高度为 1.2 ~1.5m 采样点应远离墙壁 lm 以上, 并避开空调门窗等空气流通处 2. 采样中打开平皿时, 可将皿盖扣置于皿底之下, 切忌皿盖向上暴露于空气中. 影响采样结果 3.5 人一组, 一人一皿不同组可选择采样地点 : 实验室办公室图书馆食堂医院门诊寝室教室商店理发店等, 并对实验结果进行各采样点的比较实验七粮食中霉菌的计数与鉴定一实验目的 1 了解粮食中霉菌存在的情况 2 熟悉粮食中霉菌的分离鉴定技术, 掌握真菌的培养方法常见产毒真菌的形态特点二实验原理粮粒的内部和外部均有大量霉菌存在, 通过霉菌和酵母菌菌落总数的测定可反映粮食外部带菌情况, 采用直接平板法可了解粮食内部霉菌侵染情况霉菌的鉴定主要依靠形态学特征, 包括菌落的形态特征和菌丝孢子的形态特征霉菌的形态除菌种之间各有不同外, 也常因发育的不同阶段培养条件的不同而有较大差异因此, 对霉菌进行鉴定时, 要选用标准培养基一般鉴定青霉和曲霉用察氏琼脂培养基, 镰刀菌和其他一些霉菌用马铃薯葡萄糖琼脂三实验材料小镊子, 灭菌锥形瓶, 灭菌试管, 灭菌吸管,75% 酒精, 灭菌蒸馏水. 高渗察培养基, 灭菌刀以及灭菌平皿 ( 直径 9cm), 载玻片, 盖玻片, 接种钩针, 分离针, 察氏琼脂培养基, 马铃薯葡萄糖琼脂, 乳酸苯酚液等四实验方法 1. 粮粒表面除菌 : 为了分离侵染粮粒内部的霉菌, 在分离培养前, 必须将附在粮粒表面的霉菌除去, 粮粒表面除菌的方法是采用无菌水多次洗涤的方法取粮食样品 10~20g 放入灭菌的 150ml 锥形瓶中, 以无菌技术. 加入无菌水超过粮粒 1~2cm 左右, 塞好棉塞充分振荡 1~2min 将水倒净, 再换水振荡, 如此反复洗涤 10 次, 最后将水弃去将粮粒倒在无菌平皿中备用如为原粮 ( 如玉米小麦等 ) 须事先用 75% 酒精浸泡 1~2min, 以脱粮粒表面的蜡质倾去酒精后, 再用无菌水洗涤粮粒 2. 粮粒接种方法 : 1) 粮粒直接接种法 : 粮粒内部的霉菌分离主要应用此法以无菌操作, 用灭菌镊子将上述表面除菌的粮粒, 胚部向下按等距离排列接种在高渗察琼脂平板上, 接种时需将粮粒一部

15 分插入培养基中每块平板大粒 ( 玉米大豆等 ) 者接种 5 粒, 小粒者接种 10 粒, 每份样品共接种 50~100 粒接种完毕后, 立即置 28 恒温箱中培养一周 2) 粮粒切开接种法 : 此法多用于大粒粮食如玉米大豆花生米等的直接接种因为大粮粒在培养期间可能出现由于粮粒发芽顶开皿盖, 而使培养物遭到污染切开接种法即粮粒洗涤后先放在无菌容器内, 用灭菌刀或剪将粮粒切成两半或只切取其胚部, 再用灭菌镊子将半颗粮粒或其种胚接种在琼脂平板上, 使粮粒的切面紧贴附于培养基, 置 28 恒温箱中培养一周 3. 粮粒培养霉菌菌落的检查 : 在培养期间应随时观察并标记 50~100 粒粮粒中生长霉菌的粮粒和菌落, 最后计算出受霉菌侵染的粒数即侵染率和菌落数 4. 粮粒培养霉菌的鉴定 : 将从粮食中初步分离出来的霉菌菌落, 点植于标准培养基平板上每个平板接种一个或三个菌落 ( 青霉曲霉点种三点, 镰刀菌点种一点 ) 方法是将平板翻转, 倒置接种置 25~28 恒温箱中培养, 每隔一定时间进行观察记录 1) 菌落观察内容包括 : 生长速度 : 培养一定天数 (5d 10d 和 14d), 以菌落直径表示 ; 描述时也可用生长极慢, 慢中等快加以说明菌落颜色 : 表面 ( 气生菌丝子实体菌核 ) 和营养菌丝的颜色及变化以及菌落反面的颜色及变化菌落质地 : 绒状絮状绳状粉粒状和束状菌落表面 : 疏松或紧密扁平或隆起边缘是否整齐表面有无放射状沟纹或同心环气味 : 如霉味或芬芳以及其他特殊气味 2) 制片镜检 : 在载玻片中央加一滴乳酸苯酚液, 用接种针钩取一小块霉菌培养物置液滴中, 再用两支接种针小心地将培养物撕成小块, 不要研磨, 以防霉菌结构破坏, 然后加上盖玻片如有气泡, 可将载玻片稍加热排除制片时最好在无菌箱中操作, 以防孢子飞扬首先用低倍镜观察菌丝和孢子形态特征, 然后换高倍镜 3) 根据菌落形态及镜检结果, 参照霉菌鉴定检索表, 鉴定到属或种五结果意义真菌在自然界分布极广, 种类繁多, 几乎无处不在, 因此经常污染粮食食品和饲料全世界每年平均有 2% 的谷物因发生霉变而不能食用, 造成巨大的经济损失, 而且有些产毒真菌可以产生真菌毒素, 引起人畜中毒有些毒素具有强烈的致癌性, 可使实验动物产生癌症经过霉菌和酵母菌数测定及粮食内部霉菌的分离, 可初步判断粮食被霉菌和酵母菌污染的情况通过鉴定粮食中污染霉菌的种类, 了解是否有产毒霉菌的存在粮食中常见的产毒霉菌有青霉曲霉和镰刀菌六注意事项 1. 霉菌培养应用专用培养箱, 培养温度在 25~30 之间对结果影响不大为尽快得到

16 结果, 我们以 27 为培养温度菌落计数应于培养后的 72 小时进行第一次观察这时主要是观察那些密集生长的平皿, 以免到第五天之后, 菌落生长成片而难以计数 2. 实验时手脚要快, 动作宜轻观察平板时, 动作稍重, 生长快速的霉菌孢子就会在培养基内扩散, 导致二次污染, 结果读数异常特别是翻转平板进行培养, 观察时再转过来, 特别容易导致孢子飞散一般以第五天的读数为最终计数, 但观察应持续七天 3. 由于霉菌和酵母菌落较大, 光线正常时可以方便地计数选择那些霉菌数为 10~100 个之间的平皿计数, 而不是象细菌的 30~300 个 10~50 个菌落的平皿也可以 4. 考虑到霉菌孢子容易飞散而造成污染, 霉菌和酵母检验应在单独的实验室中进行尽量保持实验室安静, 减少空气流动

前言本标准代替 GB 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验本标准与 GB 相比, 主要变化如下 : 标准名称修改为食品安全国家标准哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 ; 修改了范围 ; 增加了术语和定义 ; 修改了试验目的和原理 ; 修改了试验方法 ; 修

前言本标准代替 GB 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验本标准与 GB 相比, 主要变化如下 : 标准名称修改为食品安全国家标准哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 ; 修改了范围 ; 增加了术语和定义 ; 修改了试验目的和原理 ; 修改了试验方法 ; 修中华人民共和国国家标准犌犅 15193.6 2014 食品安全国家标准哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 2015 01 28 发布中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 2015 05 01 实施发布前言本标准代替 GB15193.6 2003 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验本标准与 GB15193.6 2003 相比, 主要变化如下 : 标准名称修改为食品安全国家标准哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验