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孓谭
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细菌耐药机制研究新进展沈继录安徽省细菌耐药监控中心安徽医科大学第一附属医院检验科细菌耐药机制遗传性耐药获得性耐药固有耐药染色体突变耐药灭活酶和钝化酶的产生抗生素作用靶位的改变细胞膜通透性改变 β 内酰胺酶氨基糖苷类钝化酶大环内酯类药物钝化酶氯霉素乙酰转移酶细菌的主动外排功能 1 细菌生物被膜的形成细菌耐药的基因机制 CLSI 有关于固有耐药的内容根据遗传特性,

1 细菌耐药机制研究新进展沈继录安徽省细菌耐药监控中心安徽医科大学第一附属医院检验科细菌耐药机制遗传性耐药获得性耐药固有耐药染色体突变耐药灭活酶和钝化酶的产生抗生素作用靶位的改变细胞膜通透性改变 β 内酰胺酶氨基糖苷类钝化酶大环内酯类药物钝化酶氯霉素乙酰转移酶细菌的主动外排功能 1 细菌生物被膜的形成细菌耐药的基因机制 CLSI 有关于固有耐药的内容根据遗传特性, 将细菌耐药性分为两类 1. 固有性耐药 : 来源于该细菌本身染色体上的耐药基因, 代代相传, 具有典型的种属特异性 2. 获得性耐药 : 由于细菌在生长繁殖过程中, 其 DNA 发生改变而使其形成或获得了耐药性表型 4 获得性耐药产生类型 : 1. 染色体介导的耐药性 2. 质粒介导的耐药性染色体介导的耐药 : 一般是由于遗传基因 DNA 自发变化的结果, 具有典型的种属特异性, 能够代代相传细菌的这类耐药性, 一般对一种或两种相类似的药物耐药, 且比较稳定, 耐药性的产生与消失与药物接触无关, 在自然界中这类耐药菌占次要地位 1

2 质粒介导的耐药 : 这类耐药性是由于细菌获得外源新基因而产生的细菌外源耐药性基因既可以通过染色体垂直传播而获得, 又可以通过质粒或转座子水平传播而获得因此, 细菌耐药性的传播方式主要有转化 (transformation) 转导 (transduction) 接合 (conjugation) 和转座 (transposion)4 种抗菌药物钝化酶 AB AB PBP 细菌耐药机制 g g IV 主动外排 PBP I 抗菌药物钝化 II 抗菌靶位变异 g PBP plasmid III 通透性降低 2014/9/9 8 细菌耐药的生化机制一灭活酶或钝化酶的产生 1.β- 内酰胺酶 2. 氯霉素乙酰基转移酶 3. 红霉素酯化酶 4. 氨基糖苷类钝化酶 ( 乙酰转移酶 : 磷酸转移酶 : 核苷转移酶 ) - 内酰胺酶 : 最主要的灭活酶目前已发现 750 种以上新的种类不断出现对 - 内酰胺抗生素造成严重威胁具体种类氨基酸位点改变及等电点见 : /9/9 10 BJM 分类分子分类 β- 内酰胺酶分类水解底物抑制剂代表酶 CA EDTA 1 C 头孢菌素 - - AmpC 2 2a A 青霉素 + - 青霉素酶 2b A 青霉素窄谱头孢 + - TEM1,2 SHV1 2be A 青霉素头孢菌素 + - TEM3-26,SHV2-6,CTX-M 2br A 青霉素 +/- - TEM c A 青霉素, 羧苄西林 + - PSE1,3,4 2d D 青霉素素, 苯唑西林 +/- - OXA1-11,PSE2 2e A 头孢菌素 + - 诱导头孢菌素酶 2f A 青霉素头孢碳青霉烯 + - KPC 3 B 碳青霉烯类 - + IMP VIM NDM 4 ND 青霉素 - - 洋葱假单胞菌青霉素酶 2014/9/9 11 β- 内酰胺酶青霉素 1st 头孢 2ed 菌素 3rd 头孢菌素 4th 头孢菌素碳青霉烯类青霉素酶广谱 β- 内酰胺酶超广谱 β- 内酰胺酶金属碳青霉烯酶 : 活性部位需要有锌离子结合, 包括 : NDM-1 IMP VIM GIM SIM SPM 等型别碳青霉烯酶 2014/9/9 非金属碳青霉烯酶 : 活性部位不需要金属离子存在, 包括 OXA(D 类 ) KPC(A 类 ) 代表酶 12 2

3 β- 内酰胺酶热点近年来, 与细菌耐药发展和新抗生素开发密切相关的 β- 内酰胺酶有 4 类 : 1ESBLs; 2 对酶抑制剂敏感性下降的 β- 内酰胺酶 ; 3 质粒介导 AmpC 酶 ; 4 水解碳青霉烯类的 β- 内酰胺酶四类酶的初步区别 CLAV CLOX EDTA 广谱超广谱酶 ++ 耐抑制剂广谱酶 AmpC 酶 - ++ 金属酶 ++ 超广谱 - 内酰胺酶 (ESBLs) TEM:202 种 SHV:189 种 CTX-M:160 种 OXA:420 种 (19 为 ESBL) 我国主要流行 CTX-M 型酶, 主要是 CTX-M-14 和 CTX-M-3 北美主要流行 TEM 型 ESBL ESBL 的检测方法 Initial Screen Test For K. pneumoniae, K. oxytoca,and E. coli: Cefpodoxime zone 17 mm Ceftazidime zone 22 mm Aztreonam zone 27 mm Cefotaxime zone 27 mm Ceftriaxone zone 25 mm For P. mirabilis: Cefpodoxime zone 22 mm Ceftazidime zone 22 mm Cefotaxime zone 27 mm Phenotypic Confirmatory Test 等电聚焦电泳 : PCR 核酸序列分析 2014/9/ /9/9 16 肠杆菌科细菌对头孢菌素类敏感性折点 MIC (μg/ml) 头孢菌素类 FDA 批准的 CLSI-2009 给药方案 CLSI-2010 CLSI-2011 Cefazolin 2g Q8H Cefotaxime 1g Q8H Ceftizoxime 1g Q12H Ceftriaxone 1g Q24H Ceftazidime 1g Q8H Aztrenam 1g Q8H 部分头孢菌素的新折点和报告的原则 2009 年前的折点是在 25 年前建立的 ( 那时还没有 ESBLs) 细菌对新旧 β- 内酰胺类抗生素的耐药性和耐药机制在变迁和发展中, 人类对其的认识逐渐深刻临床药理学科的发展,PK/PD 对治疗效果决定作用临床医生需要最佳治疗方案为了在目前的用药方式和用药剂量的情况下, 能更好地预示抗菌药物在对抗感染治疗中所起的作用 2014/9/9 18 3

4 现在我们对检测 ESBLs 理解 ESBL 表型试验不是最佳的在确证试验中, 多重耐药机制的存在可能会掩饰 ESBL ESBL + AmpC ESBL + 孔蛋白突变除大肠杆菌, 克雷伯菌和奇异变形杆菌外, 肠杆菌科其它细菌中也存在 ESBLs, 这使确证实验更加不可靠在有些实验室不能实施 MIC 与预后的相关性优于耐药机制 CLSI 对肠杆菌科细菌的 ESBL 检测和报告的建议目的如果使用旧折点新折点病人管理进行 ESBL 筛选和确证实验是否把头孢菌素, 青霉素, 氨曲南 S 结果改成 R 是否感染控制进行 ESBL 筛选和确证实验是 ( 如果有要求 ) 是 ( 如果有要求 ) 把头孢菌素, 青霉素, 氨曲南 S 结果改成 R 是否 2014/9/ /9/9 20 使用新折点的报告原则 : 没有必要进行 ESBL 初筛和确证试验来报告结果以指导病人治疗采用纸片扩散法的临床实验室即可采用新的折点向临床报告药敏结果在商品化药敏系统中目前受到限制, 需要修改软件系统中的折点, 并需进行实验室内验证新的折点适用于美国 FDA 批准的给药方案, 各医疗机构的药物剂量和药物调整政策需要重新评估, 以保证与 CLSI 推荐折点相一致要让感染科的医师药师医院感染控制委员会的医师临床微生物实验室的技术人员了解和学习新折点, 并通过他们教育其他医务人员新折点和 ESBLs 的关系不是所有的产 ESBLs 酶的菌株使用新折点时均被检测为耐药关注的是抗菌药物的 MIC 和药代动力学, 而不是耐药机制抗菌药物的 MIC 是产酶菌株感染治疗预后的最佳指标采用新折点时, 假如一株产 ESBLs 的菌株对头孢他啶或头孢噻肟或头孢曲松敏感, 则不需要将敏感修改为耐药 2014/9/ /9/9 22 AmpC 酶是由革兰阴性细菌 ( 肠杆菌科细菌, 铜绿假单胞菌等 ) 的染色体或质粒介导产生的一类 β 内酰胺酶, 属 Bush 分类 ( 底物谱分类法 )Group 1,Ambler 分类 ( 分子结构分类法 )Class C 首选作用底物是头孢菌素且不被克拉维酸所抑制, 因此在国内又称作头孢菌素酶因可被某些 β 内酰胺类抗生素诱导产生, 又称诱导酶 2014/9/9 23 AmpC 酶生化特性相对分子量 (Mr) 介于 KDa 灭活 β- 内酰胺酶抑制剂, 如对克拉维酸等不敏感. 正在研究开发的硼酸类抑制剂 BRL42715 RO RO 对其有较强的抑制作用 2014/9/9 24 4

5 AmpC 酶生化特性对青霉素类抗生素除氮脒青霉素 ( 美西林 ) 或脒基青霉素 ( 替莫西林 ) 外均耐药对多种三代头孢菌素和单环类抗生素耐药对头霉素类耐药对第四代头孢菌素一般表现为敏感对碳青霉烯类抗生素敏感但细菌高产 AmpC 酶结合外膜孔蛋白缺失可导致对其耐药 2014/9/9 25 产 ESBL 与 AmpC 的耐药谱差别 ESBL AmpC 耐药谱多重多重对三代头孢多耐药耐药头孢吡肟多敏感敏感哌酮 / 舒巴坦大多敏感耐药哌拉 / 他唑巴坦大多敏感耐药头霉素大多敏感耐药碳青霉烯类敏感敏感 2014/9/9 26 AmpC 酶的基因构成由 5 个不连锁基因即 ampc ampr ampd ampe 和 ampg 组成 ampc 是 AmpC 酶的结构基因, 编码产生 AmpC 酶蛋白基因 ampr ampd ampe ampg 是 AmpC 酶的调节基因, 参与调控 AmpC 酶的合成过程 2014/9/9 27 AmpC 酶的基因构成 ampr 是 AmpC 的转录调节因子, 属于 LysR 调节子家族 AmpR 在非诱导状态下作为 ampc 转录的抑制因子, 而在诱导状态下作为转录激活因子存在 ampd 是 AmpC 表达的负调控基因, 位于远处染色体上, 参与肽聚糖代谢 ampd 的基因序列与 AmpC 酶的表现型密切相关 2014/9/9 28 AmpC 酶的基因构成 AmpE 蛋白充当一个感受器, 协助 ampd 完成对 ampc 的阻遏作用, 在整个调节系统中居次要地位 ampg 编码转膜蛋白 AmpG, 具有透性酶活性, 感受肽聚糖量的变化, 在 AmpC 酶的表达中起着 2014/9/9 29 向胞浆内传递诱导信号的作用染色体 AmpC 酶表达类型 (1) 诱导高产型 : 低基础水平和高诱导产生 (2) 持续高产型 : 高基础水平持续表达, 亦称 : 稳定的去阻遏表达型 (3) 持续低产型 : 低基础水平持续表达 2014/9/9 30 5

6 各种抗生素对 AmpC 酶的诱导能力 : (1) 诱导高产型当有诱导作用的 β 内酰胺类抗生素存在的条件下,AmpC 酶的产量明显增加, 增加的范围在 100~1000 倍之间青霉素类 : 羧苄西林替卡西林哌拉西林阿洛西林头孢菌素类 : 头孢唑啉头孢西丁头孢噻肟头孢哌酮头孢曲松头孢他啶碳青霉烯类 : 亚胺培南 ß- 内酰胺酶抑制剂 : 克拉维酸舒巴坦他唑巴坦轻中高 2014/9/9 31 (2) 持续高产型原因为去阻遏突变, 即调控基因之一的 ampd 基因发生突变, 产生有缺陷的 AmpD 蛋白, 不能与 AmpR 调控蛋白结合形成复合物,AmpR 蛋白即以激活子状态发挥激活作用, 引起 AmpC 酶的大量表达 2014/9/9 33 (3) 持续低产型部分产 AmpC 酶的菌株持续低水平的产生 AmpC 酶, 其原因可能是缺乏 ampr 基因或 ampr 基因发生突变, 产生有缺陷的 AmpR 蛋白, 不能在无 β 内酰胺类存在的条件下起到抑制子的作用, 也不能在有 β 内酰胺类存在的条件下起到激活子的作用, 故 AmpC 酶得以持续低水平表达 2014/9/9 34 染色体型质粒质粒 AmpC 酶种类 20 世纪 90 年代前, 为染色体型 90 年代后发现质粒型, 呈持续高表达, 并在同种和不同种细菌间水平播散, 造成更严重的耐药性质粒型 AmpC 种类在不断增加, 目前已达 130 余种产质粒型 AmpC 酶细菌 : 没有或具有不健全 AmpC 染色体的细菌种属具有健全 AmpC 染色体的细菌 CMY:121 种 ACT:37 种 DHA:23 种 MIR:18 种 FOX:12 种 MOX:11 种 ACC:6 种 2014/9/

7 质粒 AmpC 酶流行背景 1989 年 Bauenfeind 等报道了质粒 AmpC 酶 CMY-1, 但没有提供其生化特征第一个公认的质粒 AmpC 酶是 1988 年在美国普罗维登斯一家医院由 Papanicolaou 等从肺炎克雷伯菌中发现的 MIR-1 从此以每年发现 1~3 个新质粒的速度增加 2014/9/ /9/9 38 质粒 AmpC 酶的世界流行状况非洲亚洲欧洲美洲 ACC-1,CMY-4 MOX-1,DHA-1,ACT-1, FOX-2,CMY- I/2/6/7/8/9/10/11/15/16/18/21/21/22/26 BIL-1,CMY-2/3/4/5/12/13,DHA-1/2, FOX-2/4,LAT-1/3/4,MOX-2,ACC-1 MIR-1,ACT-I,FOX-1/2/5/6/8/10,CMY- 2/3/4/5/19/20/23/24/ /9/ /9/9 40 我国 pampc 酶的检测状况 pampc 酶的来源北京协和医院首都医科大学中山医科大学浙江医科大学上海市传染病医院安徽医科大学 ACT-1, CMY-2 DHA-1,CMY-2 DHA-1,ACT-1,CMY-2 DHA-1,CMY-2/4/11 DHA-I, CMY-2 DHA-1,ACT-1/2,CMY- 2,MOX-4,ACT-6 系统进化树研究表明 :pampc 酶和某些菌属的染色体 AmpC 酶有着高度的同源关系根据和不同菌属的染色体 AmpC 酶的同源关系,pAmpC 酶可分为以下 5 组 : 2014/9/ /9/9 42 7

8 弗氏枸橼酸杆菌组阴沟肠杆菌群组 pampc 酶的分类 LAT-1/2/3/4 CMY- 2/3/4/5/6/7/9 BIL-1 MIR-1 ACT-1 气单胞菌属组 MOX-1/2 FOX-1/2/3/4/5/6 CMY-1/8/11 摩根摩根菌组蜂房哈夫尼菌组 DHA-1/2 ACC-1 pampc 酶的来源途径推测推测质粒介导的 AmpC 酶基因是来源于染色体的, 目前大量的线索表明可能是通过整合子实现的整合子 (Integron) 是近来新发现的能将耐药基因传递给其他细菌同时还能接受其他细菌的耐药基因, 是细菌遗传进化天然克隆和表达系统 2014/9/ /9/9 44 AmpC 酶的检测方法表型检测基因检测 pampc 酶确认需分两步 : (1) 明确是否为高产 AmpC 酶 AmpC 酶的检测方法表型检测方法 : 头孢西丁敏感实验头孢西丁三维试验 (2) 是否为质粒介导 : 通过质粒接合实验 Southern 杂交证实 2014/9/ /9/9 46 头孢西丁敏感试验操作 : 按 CLSI 标准操作判断 :K-B 法 <18mm, 稀释法 >16μg/ml 为耐药意义 : 耐 FOX 的菌株有可能产生 AmpC 酶缺点 : 特异性差头孢西丁三维试验将 0.5 麦氏单位大肠埃希菌 ATCC25922 菌液涂布于 M-H 平板上, 取 30μg 头孢西丁纸片置于平皿中心, 用刀片在离纸片边缘 5mm 处放射状地由里向外切割一道狭缝, 取 40 微升受试菌酶粗提取物由里向外加入狭缝内, 尽量避免酶液溢出狭缝将 MH 平板放入 35 孵箱过 2014/9/9 47 夜 2014/9/9 48 8

头孢西丁三维试验结果判断 : 出现 ATCC25922 箭头样生长, 为三维试验阳性是目前公认的检测高产 AmpC 酶的经典方法 AmpC 酶的检测方法基因检测法 : 1 聚合酶链反应 (PCR) 2 核酸杂交 (Southern blot) 3 核苷酸序列分析法 : 是诊断最可靠和发现新酶的方法 2014/9/9 49 2014/9/9 50 AmpC 酶的检测方法方法虽多, 但至目前

9 头孢西丁三维试验结果判断 : 出现 ATCC25922 箭头样生长, 为三维试验阳性是目前公认的检测高产 AmpC 酶的经典方法 AmpC 酶的检测方法基因检测法 : 1 聚合酶链反应 (PCR) 2 核酸杂交 (Southern blot) 3 核苷酸序列分析法 : 是诊断最可靠和发现新酶的方法 2014/9/ /9/9 50 AmpC 酶的检测方法方法虽多, 但至目前 CLSI 仍未制定临床筛选 AmpC 酶的标准, 随着产 AmpC 酶的革兰阴性杆菌引起的耐药性在临床上越来越受到重视, 需要建立一种快速简便的方法常规筛选 AmpC 酶, 任务任重而道远 2014/9/9 51 新折点和 AmpC 的关系不是所有的产 AmpC 酶的菌株使用新修订的折点时均被检测为耐药大多肠杆菌科细菌均低水平产染色体介导的 AmpC 酶, 头孢菌素对其的 MIC 较低, 并处于敏感范围 ( 新折点 ) AmpC 酶介导的耐药是因为产高水平 AmpC 酶的突变株 ( 去阻遏突变体 ), 可灭活头孢菌素继而导致细菌耐药头孢吡肟是不容易被 AmpC 酶灭活药敏报告应与药敏结果一致, 不需要修改 CLSI 不推荐 AmpC 酶的检测试验以进行治疗决策 2014/9/9 52 碳青酶烯酶碳青霉烯酶是指能够明显水解亚胺培南或美罗培南的一类 β 内酰胺酶, 它包括 Ambler 分子分类为 A B D 三类酶 A 类为丝氨酸酶碳青霉烯酶 B 类是金属酶 D 类为丝氨酸酶 2014/9/9 53 Ambler 分子分类 Bush 分群碳青霉烯酶的分类酶青霉素一二代头孢水解底物三代头孢氨曲南 a 亚胺培南 a EDTA b 酶抑制物克拉维酸 b A 2f NMC IMI SME KPC GES B 3 IMP VIM GIM SPM D 2d OXA 注 :a:+, 强水解 (kcat>2s-1);+-, 弱水解 (0.5 s-1<kcat<2s-1);-, 不水解 (kcat<0.5s-1) b:+, 抑制 ;+-, 不确定 ;-, 不抑制 2014/9/9 54 9

10 碳青酶烯酶分类酶最常见的细菌 Class A Class B ( 金属 - - 内酰胺酶 ) KPC, SME, IMI, NMC, GES IMP, VIM, GIM, SPM NDM-1 肠杆菌科 ( 铜绿中报道较少 ) 铜绿假单胞菌肠杆菌科细菌不动杆菌属 Class D OXA 不动杆菌属碳青酶烯酶的变种 KPC:21 种 GES:25 种 VIM :41 种 IMP :48 种 NDM: 12 种 /9/ /9/9 56 KPC-1 的出现 1996 年 Yigit 在美国北卡罗来纳州一株对碳青霉烯类药物耐药的肺炎克雷伯菌中发现, 由质粒介导的碳青霉烯酶 KPC-1(K. pneumoniae carbapenemase- 1, KPC-1) KPC-1 耐药表型表现出高度亚胺培南和美罗培南耐药性 (MIC 都为 16μg/ml) 氨基酸序列分析显示, KPC-1 与 SME-1 NMC-A IMI- 1 分别有 45% 44% 43% 的相似性 (SME-1 NMC-A IMI-1 之间的氨基酸相似性 >90%), 可能是 KPC-1 与这 3 种酶不是由同一基因分化而来 KPC 酶亚型不断增多 KPC-3 和 KPC-2 相比有 1 个碱基的改变 ; 以后的文献又陆续报道了多种酶, 目前已达 21 种 ; Antimicrob Agents2014/9/9 Chemother Apr;45(4): /9/9 58 KPC 酶据文献报道,KPC 酶都需要合并膜孔蛋白 OmpK35 的缺失, 引起细菌对碳青霉烯类药物耐药肠杆菌科铜绿假单胞菌不动杆菌属头孢菌素酶 + 膜孔蛋白缺失碳氢酶烯酶 +/- 膜孔蛋白缺失膜孔蛋白缺失泵出增强碳氢酶烯酶头孢菌素酶 + 膜孔蛋白缺失碳氢酶烯酶 +/- 膜孔蛋白缺失 2014/9/9 59 KPC 酶的传播 KPC 酶的传播机制还不是完全清楚有限的 DNA 指纹和脉冲凝胶电泳资料显示与医院感染有关最早在美国特别在美国的东北部各州蔓延, 并造成局部地区暴发流行以后几年再世界各地都有报告 2014/9/

KPC 酶的传播研究认为,bla KPC 位于一种新型的 Tn3 型的转座子 Tn4401 上, 其转座子的结构是 KPC 基因转移的原因这种新型的转座子结构可以使 bla KPC 从其原始位置转移至各类不同的质粒同时认为转座子 Tn4401 是一个复合转座子, 由 2 次序列插入形成 2014/9/9 61 KPC 酶的传播 Iskpn6 位于 blakpc 下游, Iskpn7 位于

11 KPC 酶的传播研究认为,bla KPC 位于一种新型的 Tn3 型的转座子 Tn4401 上, 其转座子的结构是 KPC 基因转移的原因这种新型的转座子结构可以使 bla KPC 从其原始位置转移至各类不同的质粒同时认为转座子 Tn4401 是一个复合转座子, 由 2 次序列插入形成 2014/9/9 61 KPC 酶的传播 Iskpn6 位于 blakpc 下游, Iskpn7 位于 blakpc 上游, ISKpn6 和 ISKpn7 可能编码转移酶 tnpa 和 tnpr 分别编码转移酶 IRL 和 IRR 有 39bp 构成最外面的靶位复制点 ( TSD) 由 5-bp ATTGA 组成 2014/9/9 62 菌种克雷伯菌属肠杆菌属大肠埃希菌沙门菌属弗劳地枸橼酸杆菌沙雷菌属肠杆菌科细菌中的 KPC 注解源于肺炎克雷伯菌的暴发流行源于产酸克雷伯菌的散在发生散在发生铜绿假单胞菌哥伦比亚 & 2014/9/9 波多黎各 63 实验室检测产 KPC 菌株问题 : 1) 一些菌株表现为低水平的碳氢酶烯类抗生素耐药, 甚至敏感 2) 有些自动化系统尚不能发现低水平耐药 2014/9/9 64 肠杆菌科细菌对碳青霉烯类敏感性折点的修订 MIC (μg/ml) 碳青霉烯类 FDA 批准的 CLSI-2009 给药方案 CLSI-2010-U CLSI-2012 Doripenem 500mg q8h Ertapenem 1g q24h Imipenem 5oomg q6h or 41g q8h 1 1 Meropenem 1g q8h 实验室当前的工作厄他培南是检测 KPC 酶的最佳底物建议将厄他培南列为常规药敏试验的品种对所有具有 ESBLs/AmpC 酶样表型 ( 即对第三第四代头孢菌素耐药 ) 的肠杆菌科细菌都要怀疑产 KPC 酶, 最好进行 Hodge 试验 2014/9/

KPC 酶的检测方法采用改良的 Hodge 试验, PCR 直接检测 KPC 酶的基因改良 Hodge 试验 0.

改良 Hodge 试验存在的问题肠杆菌科细菌 : 特异性和敏感性均 >90%; MHT 阳性 : 不意味一定是产碳青霉烯酶 ; MHT 阴性 : 不意味一定不产碳青霉烯酶 ; NDM 型 : 敏感性较低 ( 仅 11%); 非发酵菌 : 不适用 ; 变形杆菌普罗威登斯菌和摩根菌 :

CLSI 建议 : 报告 MIC 值, 但不报告 S 或者报告 R I 任选其一 2014/9/9 70 产 NDM-1 细菌产 NDM-1 细菌 : 全称产 Ⅰ 型新德里金属 β- 内酰胺酶 ( New Delhi Metallo-β-lactamase 1, NDM-1)

12 KPC 酶的检测方法采用改良的 Hodge 试验, PCR 直接检测 KPC 酶的基因改良 Hodge 试验 0.5 麦氏浊度单位大肠埃希菌 ATCC25922 涂布 MH 平板中间贴亚胺培南 (10μ g) 纸片接种待检菌的无菌接种环自纸片外缘向平板边缘划线 35 过夜培养结果判断 : 亚胺培南抑菌圈内出现待检菌矢状生长者为产碳青霉烯酶菌株 2014/9/ /9/9 68 改良 Hodge 试验存在的问题肠杆菌科细菌 : 特异性和敏感性均 >90%; MHT 阳性 : 不意味一定是产碳青霉烯酶 ; MHT 阴性 : 不意味一定不产碳青霉烯酶 ; NDM 型 : 敏感性较低 ( 仅 11%); 非发酵菌 : 不适用 ; 变形杆菌普罗威登斯菌和摩根菌 : 可以通过其他机制提高亚胺培南的 MIC 值, 因此亚胺培南 MIC 筛选试验不适用于该 3 种菌属 ; 69 MHT 阳性结果如何报告? 如果发现菌株 MHT 试验结果阳性, 是否应该将碳氢酶烯类抗生素敏感的结果改为耐药? CLSI 建议 : 报告 MIC 值, 但不报告 S 或者报告 R I 任选其一 2014/9/9 70 产 NDM-1 细菌产 NDM-1 细菌 : 全称产 Ⅰ 型新德里金属 β- 内酰胺酶 ( New Delhi Metallo-β-lactamase 1, NDM-1) 肠杆菌科细菌, 简称产 NDM-1 细菌, 是一种对多种抗菌药物广泛耐药的细菌, 主要为大肠埃希菌肺炎克雷伯菌 ; 特点 : 属于肠杆菌科细菌, 致病力与普通肠杆菌科细菌没有差别 ; 由于产生 NDM-1 导致广泛耐药, 为泛耐药菌 ; 主要导致医院感染 ; 源于南亚地区, 已在全球播散为什么需要关注产 NDM-1 细菌泛耐药导致的治疗挑战 ; 多种肠杆菌科细菌发现 ; 快速从南亚地区传播到欧美国家 ; 不仅在医院感染这种发现, 同时社区感染这种发现 2014/9/ /9/

产 NDM-1 细菌的发现 2008 年在一位印度裔瑞典尿路感染患者中发现对碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌, 该菌对所有 β- 内酰胺类抗菌药物耐药, 对环丙沙星也不敏感, 仅对多粘菌素 E 敏感 ; 该患者有多年糖尿病和中风史, 经常往返于印度和瑞典之间, 此前 4 月曾因臀部脓肿在印度住院治疗, 其后回到瑞典, 因尿路感染再度入院 ; 这株细菌携带一种新型金属 β- 内酰胺酶,

弥散泛菌普罗威登菌属产碱普罗威登菌斯氏普罗威登菌鲁氏普罗威登菌沙雷菌属变形杆菌属志贺菌属沙门菌属哈弗尼亚属耶尔森菌属粘质沙雷菌液化沙雷菌深红沙雷菌居泉沙雷菌奇异变形杆菌普通变形杆菌产粘变形杆菌志贺宋内弗氏鲍氏志贺菌伤寒沙门菌肠炎沙门菌猪霍乱沙门菌副伤寒沙门菌蜂房哈弗尼亚菌 2014/9/9 75 鼠疫耶尔森菌, 小肠结炎肠耶尔森菌假结核耶尔森菌

13 产 NDM-1 细菌的发现 2008 年在一位印度裔瑞典尿路感染患者中发现对碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌, 该菌对所有 β- 内酰胺类抗菌药物耐药, 对环丙沙星也不敏感, 仅对多粘菌素 E 敏感 ; 该患者有多年糖尿病和中风史, 经常往返于印度和瑞典之间, 此前 4 月曾因臀部脓肿在印度住院治疗, 其后回到瑞典, 因尿路感染再度入院 ; 这株细菌携带一种新型金属 β- 内酰胺酶, 研究人员根据患者感染地命名这种酶为 NDM-1 全球产 NDM-1 细菌流行情况 2014/9/ /9/9 74 肠杆菌科埃希菌属枸橼酸菌属克雷伯菌属肠杆菌属摩根菌属泛菌属产 NDM-1 细菌种类大肠埃希菌弗劳地枸橼酸菌异型枸橼酸菌无丙二酸枸橼酸菌肺炎克雷伯菌产酸克雷伯菌臭鼻克雷伯菌阴沟肠杆菌产气肠杆菌板崎肠杆菌聚团肠杆菌摩根摩根菌成团泛菌弥散泛菌普罗威登菌属产碱普罗威登菌斯氏普罗威登菌鲁氏普罗威登菌沙雷菌属变形杆菌属志贺菌属沙门菌属哈弗尼亚属耶尔森菌属粘质沙雷菌液化沙雷菌深红沙雷菌居泉沙雷菌奇异变形杆菌普通变形杆菌产粘变形杆菌志贺宋内弗氏鲍氏志贺菌伤寒沙门菌肠炎沙门菌猪霍乱沙门菌副伤寒沙门菌蜂房哈弗尼亚菌 2014/9/9 75 鼠疫耶尔森菌, 小肠结炎肠耶尔森菌假结核耶尔森菌实验室诊断产 NDM-1 细菌感染临床表现与敏感菌没有差异, 临床诊断困难 ; 对碳青霉烯治疗无效的阴性菌感染需要考虑这类细菌感染可能 ; 诊断主要依据实验室检查结果 ; 实验室检查分为三步 : 表型筛查 - 表型确认 - 基因确证 2014/9/9 76 碳青霉烯类抗生素水解酶 Class D β-lactamases D 类酶 (OXA 酶 ) 在 Bush 分群中属于 2d 类, 对苯唑西林的水解活性很强 OXA 型碳青霉烯酶对亚胺培南的水解活性较低, 对头孢他啶头孢噻肟氨曲南水解活性也很弱除 OXA-23 外, 其它酶能被三唑巴坦克拉维酸抑制 OXA 型碳青霉烯酶编码基因可位于质粒或染色体上, 或定位在 I 型整合子基因盒中, 具备向其他菌种转移的能力 AAC, 2010, p

Dendrogram of precursor OXA-type carbapenemases.

这些插入序列可能含有目的基因的启动子, 能够促进目的基因的表达 Walther-Rasmussen J, Høiby N J. Antimicrob. Chemother. 2006;57:373-383 2014/9/9 The Author 2006.

org 83 2014/9/9 84 MBLS 表型筛选和基因检测图 1 图 2 图 1:EDTA 协同试验 (EDTA 纸片 :100 mmol/l,5 l/ 片 ) 图 2:Etest 试验结果图 3: VIM-2 型金属酶 PCR 结果电泳图耐碳青霉烯菌株的碳青霉烯酶基因分型细菌名称菌株数基因型检出率鲍曼不动杆菌 34 OXA-23 21%(7/34) OXA-23+ OXA-66

14 Dendrogram of precursor OXA-type carbapenemases. 关于插入序列 blaoxa 酶的水解活性比较弱, 研究发现在 blaoxa 基因的上游通常有段插入序列, 可以增强 OXA 基因的表达插入序列 :ISAbaI ISAba4 IS26 ISAba2 blaoxa- 58 ISAba3 模块 IS26 ISAba2 ISAba3 通常仅在 CRAB 中可以检测到这些插入序列中的一种或几种, 而在敏感菌株中, 这些插入序列通常缺失这些插入序列可能含有目的基因的启动子, 能够促进目的基因的表达 Walther-Rasmussen J, Høiby N J. Antimicrob. Chemother. 2006;57: /9/9 The Author Published by Oxford University Press on behalf of the British Society for Antimicrobial Chemotherapy. All rights reserved. For Permissions, please journals.permissions@oxfordjournals.org /9/9 84 MBLS 表型筛选和基因检测图 1 图 2 图 1:EDTA 协同试验 (EDTA 纸片 :100 mmol/l,5 l/ 片 ) 图 2:Etest 试验结果图 3: VIM-2 型金属酶 PCR 结果电泳图耐碳青霉烯菌株的碳青霉烯酶基因分型细菌名称菌株数基因型检出率鲍曼不动杆菌 34 OXA-23 21%(7/34) OXA-23+ OXA-66 27%(9/34) OXA-23+ OXA-24+OXA-66 32%(11/34) OXA-24+OXA-66 6%(2/34) OXA-66 3%(1/34) 检测阴性 12%(4/34) 洛菲不动杆菌 7 OXA % (7/7) 弗劳地柠檬酸杆菌 11 KPC-2+IMP-8 新亚型 55%(6/11) KPC-2 46%(5/11) 肺炎克雷伯菌 5 KPC-2 100% (5/5) 粘质沙雷菌 1 KPC-2 100% (1/1) 沈继录, 朱德妹中华检验医学杂志 2008; 31(4): /9/ /9/9 碳青霉烯酶检测的新技术 : MALDI-TOF MS 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱国外最新报道有德国学者 Irene 等利用 MALDI-TOF MS 检测厄他培南降解产物来确定碳青霉烯酶的产生, 此法可以检测产 NDM-1 VIM-1 VIM-2 KPC-2 和 IMP 各型携带菌株捷克学者利用 MALDI-TOF MS 技术检测肠杆菌和铜绿假单胞菌共 124 株菌包括 30 株产碳青霉烯酶菌株, 发现此法检测碳青霉烯酶的敏感性为 96.67%, 特异性为 97.87%, 证明了 MALDI-TOF MS 可以作为肠杆菌及铜绿假单胞菌中产碳青霉烯酶的实验室常规检测方法 1. Irene Burckhardt,Stefan Zimmermann.Using MALDI-TOF Mass Spectrometry to detect carbapenem resistance within one to two and a half hours[j].j. Clin.Microbiol.2011 Jaroslav Hrabak, Radka Walkova, Vendula Študentova, et al. 2. Carbapenemase Activity Detection by Matrix- Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight 2014/9/9 (MALDI-TOF) Mass Spectrometry[J]. J. Clin.Microbiol /9/

15 Evaluation of a DNA microarray for the rapid detection of ESBLs(TEM, SHV and CTX-M), plasmid-mediated cephalosporinases (CMY-2-like, DHA, FOX, ACC-1, ACT/MIR and CMY-1-like/MOX) and carbapenemases (KPC,OXA-48, VIM, IMP and NDM). 仪器 :Check-MDR CT103 array' test (Check-Points, Wageningen, The Netherlands 结果 : 所有 CTX-M 基因均能被正确分类 ( 如 :CTX-M-1 group, CTX-M-2 group, CTX-M-9 group and CTX-M- 8/25/26 group). 质粒 AmpC 酶和碳青酶烯酶也均能检出, 灵敏度和特异性 100% 2014/9/ /9/9 90 氯霉素乙酰转移酶机制 : 将氯霉素乙酰化, 使其不能与细菌 50S 核糖体亚基结合而失去抗菌活性由细菌质粒或染色体基因编码, 能在大肠杆菌中稳定表达红霉素酯化酶机制 : 此酶是一种体质酶, 由质粒介导, 主要作用是水解红霉素及大环内酯类抗生素结构中的内酯而使之失去抗菌活性氨基糖苷类耐药氨基糖苷类钝化酶分为 : 磷酸转移酶 (APH) 乙酰转移酶 (AAC) 核苷转移酶 (ANT) 氨基糖苷类钝化酶作用机制 : 三者分别使抗生素的羟基磷酸化氨基乙酰化和羟基核苷化, 使之不能再与细菌核糖体 30S 亚基结合氨基糖苷类耐药庆大霉素高水平耐药 (HLGR ) 主要的耐药机制氨基糖苷类修饰酶耐药基因百分率 AAC(6 )-Ie-APH(2 )-Ia aac(6 )-Ie-aph(2 )-Ia >90% APH(2 )-Ic aph(2 )-Ic APH(2 )-Id aph(2 )-Id <10% <10% APH(2 )-Ib aph(2 )-Ib 15

16 一种新的质粒介导的肠球菌氨基糖苷类耐药基因 aph(2 )-Ie 5 ORF1 ORF2 ORF3 ORF4 ISEcp1 (tnpa) aph-ie 8,724bp repd str 部分序列 3 aac(6)-ib-cr 介导的喹喏酮类新耐药机制 2006 年所报道的喹诺酮类修饰酶介导的对部份喹诺酮类药物的耐药性显然是耐药机制的重要发现之一 Hooper 的实验小组发现变异的 AAC(6 )-Ib-cr 氨基糖苷乙酰转移酶具有了更广的底物范围, 能修饰灭活氨基糖苷类和喹诺酮类两类化学母体结构各异的药物, 但该酶对氨基糖苷类的乙酰化作用仍强于喹诺酮类这种变异酶是 AAC(6 )-Ib 仅发生 Trp102Arg 和 Asp179Tyr 两个氨基酸残基改变, 介导了对诺氟沙星和环丙沙星的耐药性 (MIC 增加 2~4 倍 ) 对 313 株耐环丙沙星 (MIC 0.25μg/ml) 及降低了对头孢他啶敏感性的肠道杆菌 ( 主要为大肠埃希菌 ) 分析, 发现一半的受检测菌株存在 aac(6 )-Ib 基因, 其中有 28% 产生变异的 AAC(6 )-Ib-cr, 并导致了对环丙沙星的低程度耐药喹诺酮类系全合成药物, 其修饰酶的发现具有重要的临床意义,aac(6 )-Ib 的变异基因已有 30 种以上, 设计新型喹诺酮药物应该考虑到潜在的酶修饰灭活机制 16S rrna 甲基化酶氨基糖苷类抗生素作用位点 : 细菌 16S rrna 以往认为最重要的氨基糖苷类抗生素耐药机制 : 修饰酶, 作用位点在药物, 引起一种或几种药物耐药 2002 最新发现一类新的氨基糖苷类抗生素耐药机制 : 16S rrna 甲基化酶, 引起药物作用位点的甲基化, 导致细菌对所有氨基糖苷类抗生素高水平耐药, 目前发现 4 种 :arma rmta rmtb rmtc 多重耐药鲍曼不动杆菌在我国各省市广泛流行, 该菌对氨基糖苷类抗生素耐药率和耐药水平高 16S rrna 甲基化酶是否在介导该菌对氨基糖苷类抗生素耐药中发挥作用需要系统研究二细菌药物作用靶位改变由于抗菌药作用的靶位发生突变或被细菌产生的某种酶修饰而使抗菌药物无法结合或亲和力下降, 这种耐药机制在细菌耐药中普遍存在主要有两种方式 : 1 改变细菌靶蛋白抗生素结合位点的蛋白质结构发生改变或被修饰, 均可导致亲和力的降低 2 产生新的靶位细菌遗传物质变异产生新的低亲和力蛋白酶, 替代原先途径, 拮抗抗菌药物作用 16

17 主要抗菌药物作用靶位 β- 内酰胺类 : 青霉素结合蛋白 (PBP), 氨基糖苷类 : 核糖体 30 S 亚基四环素类 : 核糖体 30 S 亚基大环内酯类 : 核糖体 50 S 亚基氯霉素 : 核糖体 50 S 亚基克林霉素 : 核糖体 50 S 亚基, 利福霉素类 : 依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶喹诺酮类 : DNA 促旋酶磺胺类 : 二氢碟酸合成酶和二氢叶酸还原酶万古霉素 : 细胞壁五肽末端的 D- 丙氨酰 -D- 丙氨酸末端的游离羧基青霉素结合蛋白 (PBPs) 占细菌全部膜蛋白的 1% 多数存在内膜中不同细菌内膜所含 PBPs 数目不等, 一种细菌常含 4-8 种 PBPs 肠杆菌属 :6-8 个肺炎链球菌化脓性链球菌 :5 个金葡菌 :5 个淋球菌 :3 个流感杆菌 :8 个 PBP2a 的作用 PBP 2a 与 β- 内酰胺抗生素亲和力低, 替代正常 PBP 功能 87Kda PBP 1 合成细菌细胞壁肽聚糖 80 PBP 2 细菌处于非生长状态的转肽酶 78 PBP 2a 编码 PBP2a 基因为 meca 75 PBP 3 70 PBP 3 与细菌分裂有关的转肽酶 41 PBP 4 在粘肽二级交联过程中具有转肽酶和羧肽酶的双重活性大环内酯类的耐药机制核糖体靶位点的改变 : erm 编码, 高耐 ; 法国西班牙中国主动外排泵 : mef 编码, 低耐, 加拿大美国修饰酶喹诺酮类药物的作用靶位在细菌细胞内, 喹诺酮类药物的作用靶位是 Ⅱ 型拓扑异构酶 (DNA 促旋酶和拓扑异构酶 Ⅳ) DNA 促旋酶是由 2 个 A 亚基和 2 个 B 亚基组成的四聚体, 催化依赖于 ATP 的 DNA 负超螺旋, 在 DNA 复制和转录阶段起重要作用 A 亚基由 gyra 编码, 负责 DNA 的断裂和重接 ; B 亚基由 gyrb 编码, 催化 ATP 的水解哇诺酮类药物通过与促旋酶一 DNA 复合体相结合而抑制 DNA 的断裂一重接循环拓扑异构酶 Ⅳ 为 2 个 C 亚基和 2 个 E 亚基组成的四聚体, 在 DNA 复制后期姊妹染色体的分离过程中起重要作用 C 亚基由 parc 编码, 负责 DNA 的断裂和重接, E 亚基由 pare 编码, 催化 ATP 的水解靶位基因的突变 DN A 促旋酶和拓扑异构酶 N 都是细菌细胞生长所必需的酶, 其受到抑制将导致细胞死亡编码这两种酶的基因发生点突变, 导致密码子的改变, 或引人终止密码子不能产生完整的酶亚基 ; 或形成编码另一氨基酸的密码子, 使所编码的酶亚基发生氨基酸取代, 影响到喹诺酮类药物与靶位的结合, 从而影响细菌对喹诺酮类药物的敏感性及耐药性的出现 17

DNA 促旋酶基因和拓扑异构酶基因的突变都与喹诺酮类耐药性有一定的相关性. 已观察到的 GyrA 突变所致 GyrA 氨基酸取代有 :1 Ser83 Leu2Asp87 Gly,Tyr,Asn,His.3Gly81 Asp.4Ala84 Val. 5 Asp678 Glu. parc 突变所致 ParC 氨基酸取代有 : 1 G1y78 Asp 2 Ser80 Lle,Arg.

18 DNA 促旋酶基因和拓扑异构酶基因的突变都与喹诺酮类耐药性有一定的相关性. 已观察到的 GyrA 突变所致 GyrA 氨基酸取代有 :1 Ser83 Leu2Asp87 Gly,Tyr,Asn,His.3Gly81 Asp.4Ala84 Val. 5 Asp678 Glu. parc 突变所致 ParC 氨基酸取代有 : 1 G1y78 Asp 2 Ser80 Lle,Arg. 3 Glu84 Lys. 4 Val253 ILe.51Le228 Val.6Gly435 Ala.7His584 Tyr.8Asp583 Gly; gyrb 突变所致的 GyrB 氨基酸取代仅观察到 Lys447 Glu, 未发现 pare 能引起 ParE 氨基酸取代的突变三细菌细胞膜渗透性改变革兰阴性菌细胞壁的外膜上有脂多糖, 孔蛋白等通透性低, 是一种有效的屏障, 不仅使细菌不易受到机体杀菌物质的作用, 还可阻止某些抗菌药的进入, 是细菌耐药的机制之一这种耐药是非特异性的, 主要见于阴性细菌中膜通透性屏障相关基因突变而在革兰阳性菌中细胞膜被一层厚厚的肽聚糖细胞壁所包裹尽管细胞壁具有很强的机械强度, 但由于其结构比较粗糙, 几乎不影响抗菌药物这样的小分子物质扩散至细胞内大量研究表明, 可引起膜通透性降低的基因突变在革兰阴性菌中广泛存在已在氟哇诺酮耐药性大肠埃希菌的染色体上发现 norb, norc,nfxb,nfx C 和 cfxb 等多个影响药物在细菌体内蓄积的染色体突变基因携带这些突变基因的耐药菌株几乎都具有共同的表型 - Omp 的异常, 尤其是作为亲水性小分子药物通道的 OmpF 减少或缺失 ; 细菌除对氟唆诺酮类药物的摄人减少外, 对其它小分子亲水性药物, 如 R- 内酸胺类抗生素四环素和氯霉素等也发生交叉耐药 OmpF 减少或缺失是细菌膜通透性降低的主要因素后天获得外膜孔蛋白减少或丢失一些具有高渗透性外膜且对抗菌药物敏感的细菌可以通过降低外膜的渗透性而发展成为耐药菌, 即原有的孔蛋白通细胞内抗生素浓度降低道由于细菌发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失, 则细菌就会对该抗菌药物产生很高的耐药性膜孔蛋白 (OprD): 亚胺培南是一种非典型的 β- 内酰胺类抗菌药物, 主要是通过一个特殊的孔蛋白通道 OprD2 的扩散进入细菌的, 一旦这一孔蛋白通道消失, 则产生耐药性 18

19 Efflux System Exit Portal (OprM) Outer Membrane Periplas Linker m Lipoprotein (Mex A) Cytoplasmic Membrane 四药物主动外排系统 MexAB OprM (1993) MexCD OprJ (1996) MexEF OprN (1997) MexXY OprM (1999) MexJK-OprM (2002) Porin MexGHI OpmD(2002) Efflux System Pump (Mex B) 使抗菌药物外排, 降低细菌细胞内的药物浓度而耐药, 而且是导致多重耐药的重要机制目前研究表明主要有两大类外排系统 : 特异性 ( 单一性 ) 外排系统和多种药物耐药性 (multidrug resistance,mdr) 外排系统 Adapted with permission from Livermore DM. Clin Infect Dis 2002;34: 外排泵的基本组成 : 内膜转运蛋白外膜通道蛋白融合蛋白一般来说, 两个外排系统的作用都各不相同, 其中特异性外排系统一般只作用于单一的底物 ( 药物 ), 常常是某一类的抗生素, 如四环素氯霉素链霉素等而多种药物耐药性外排系统可以作用于多种抗菌药或者一些结构和功能不相关的复合物多重耐药系统主动泵出活动增强和外排药物通透性下降的协同作用例如 : 铜绿假单胞菌 MexA-MexB-OprM 表达增强和 OprD2 的缺失, 对亚胺培南耐药特点 : 结构上无关的多重抗生素耐药, 但是对氨基糖苷类敏感, 多见于大肠埃希菌, 铜绿假单胞菌喹诺酮类药物耐药基因 - 质粒介导的外排泵机制截止到目前, 在铜绿假单胞菌中已经报道了 12 种 RND 型外排泵系统, 分别命名为 MexAB-OprM MexCD-OprJ MexEF- OprN MexXY MexJK MexGHI-OpmD MexVW-OprM CzcCBA TriABC-OpmH MuxABC-OpmB MexPQ-OpmE 和 MexMN-OprM 此外最近也有报道在铜绿假单胞菌中发现了 MATE 家族的外排泵系统 PmpM 这些过度表达的外排泵常常导致对 3 种以上的抗生素, 消毒剂 ( 杀虫剂 ) 染料及去污剂耐药, 其中主要包括 : 喹诺酮类 ( 萘啶酸环丙沙星和诺氟沙星 ) 四环素氯霉素乙啡啶吖啶黄 ( 消毒灭菌剂 ) 十二烷基硫酸钠三重氢核 X-100 三氯森有机溶剂染色体突变 : gyra gyrb parc pare 质粒介导 : qnra qnrb qnrc qnrd qnrs QepA AAC(6')-Ib-cr

20 耐药表型外排泵介导的亚胺培南耐药新机制如以美罗培南的 MIC 值下降 4 倍为判断标准,141 株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌中约有 69.1%(65/94) 的菌株具有外排泵机制株数泵抑制剂 MC 对美罗培南的抗菌作用影响单药 + 泵抑制剂后 MIC 范围 MIC 50 MIC 90 MIC 范围 MIC 50 MIC 90 MIC 下降 4 倍或以上的菌株 (%) MIC 下降倍数范围 IMP R MEM R 94 16~> ~> (69.1) 4~512 IMP R MEM S 46 2~ ~ (23.9) 4~32 IMP S MEM R 抑制剂 PAβN 对 74 株多重耐药鲍曼不动杆菌 MIC 的影响抗生素添加泵抑制剂后 MIC 抑菌率 (%) MIC 下降倍数下降 4 倍以上 ( 株 ) 美罗培南亚胺培南头孢他啶环丙沙星庆大霉素五细菌生物被膜 (Biofilm) 是指细菌粘附于固体或有机腔道表面, 形成微菌落, 并分泌细胞外多糖蛋白复合物将自身包裹其中而形成的膜状物其生化组成为藻酸盐多糖和蛋白复合物菌膜可阻止巨噬细胞抗体药物作用于菌体细菌形成生物被膜后, 往往对抗菌药物产生高度耐药性, 原因有 : 细菌生物被膜可减少抗菌药物渗透吸附抗菌药物钝化酶, 促进抗菌药物水解细菌生物被膜下细菌代谢低下, 对抗菌药物不敏感生物被膜的存在阻止了机体对细菌的免疫力, 产生免疫逃逸现象, 减弱机体免疫力与抗菌药物的协同杀菌作用其他耐药机制缺乏自溶酶替代途径酶的过量产生等靶位保护机制质粒介导的喹诺酮耐药性 (plasmid mediated quinolone resistance,pmqr ) 携带 qnr 基因的喹诺酮耐药质粒于 1998 年在美国确证, 现 qnr 质粒已在世界范围流行 qnr 编码一种属于五肽重复家族的蛋白 Qnr, 其作用机制是保护 DNA 回旋酶免受喹诺酮药物的作用 Qnr 与传统的染色体介导的耐药机制 ( 即靶位改变和药物外排泵 ) 发挥明显的协同作用 20

21 依据 qnr 基因序列与系统分类比较已将 Qnr 分为 3 个耐药决定族, 即 QnrA(QnrA1~5) QnrB(QnrB1~5) 和 QnrS(QnrS1~5) qnr 质粒已证实存在于多种革兰阴性菌, 包括肺炎克雷伯菌 ( 最先确认菌 ) 大肠埃希菌沙门菌阴沟肠杆菌变形菌及柠檬酸杆菌等, 并分布于美洲欧洲亚洲非洲及澳洲等地区所分离的病原菌中中国的上海安徽浙江湖南广东香港和台湾等均有 Qnr 报道 qnr 质粒常同时携带整合子转座子与多重耐药基因决定族, 特别是与产超广谱 β- 内酰胺酶 (ESBL) 的基因相联系, 这有助于耐药基因在多类不同药物的选择压力下有效地在同一细菌或不同菌属间水平或垂直传播此外, 已发现同时表达 QnrB 和 QnrS 的阴沟肠杆菌及革兰阳性肠球菌的染色体 qnr 类似基因介导的天然耐药性核蛋白体保护作用通过降低 30s 核蛋白体亚基 A 位点和 P 位点氨基酰 trna 的亲和力, 四环素发挥其抗菌作用耐药菌可产生一种蛋白质, 后者与核蛋白体相互作用, 使蛋白质合成不受影响, 称核蛋白体保护作用基因有 tetm teto tetp tetw 等多重耐药及泛耐药多种耐药基因在同一菌株中的同时表达, 即多种耐药机制同时并存值得注意的是 : 核蛋白体保护基因 tetm 2006 年在人临床分离大肠杆菌中检出 tetm 能介导对四环素类药物如多西环素米诺环素的耐药株 XDR-AB 对碳青霉烯类耐药机制结果菌株编号 β- 内酰胺酶基因型外膜蛋白机制外排泵机制 KPC-2 型基因 TEM-1 基因 OXA-23 型基因 AB1 + _ + + _ AB _ AB _ AB AB AB AB51 + _ AB _ 膜耐药的调控多耐 Mar 系统 Mar 基因随着膜耐药分子机制的深入研究, 人们发现, 在一些细菌中, 不论是外膜通透性降低还是主动外排作用加强, 都是由于染色体上的特定的编码基因发生突变引起 MAR 基因就是其中的典型代表

22 Mar 基因早在 1983 年,George 和 Levy 就报道了位于大肠杆菌染色体 34 分位的多种抗生素耐药基因 MAR(Multiple antibiotic resistance) 某些药物可以单独诱导染色体发生突变, 使 mar 基因脱抑制产生 Mar 耐药 Mar 最初是从含四环素的或氯霉素的培养基上获得的,Mar 在含四环素的培养基上的发生率为 , 氯霉素的诱变率稍高于四环素 MAR 基因的突变可以引起细菌以膜耐药机制为主的对多种抗生素的耐药表型 Mar 基因 Mar 基因也普遍存在与其他肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌中目前 MAR 区的基因序列也已基本查明大肠杆菌的 mar 区长度约 1.6Kb, 以 maro 为中心, 包含四个开放阅读框架, 分别编码 MarC MarR MarA 和 MarB 如下图主要抗菌药物的作用机制和细菌耐药机制抗菌药物主要靶位作用机制主要耐药机制 - 内酰胺类万古霉素大环内酯类林可霉素类细胞壁 PBPs 细胞壁蛋白合成蛋白合成抑制细胞壁交叉连接干扰新细胞壁亚单位的加入 ( 胞壁酰五肽 ) 结合到 50S 核糖体亚单位结合到 50S 核糖体亚单位 1 灭活药物 ( - 内酰胺酶 ) 2 靶位敏感性下降 ( 改变青霉素结合蛋白 ) 3 通透性下降 ( 改变革兰阴性菌外膜孔蛋白 ) 4 主动泵出改变靶位 ( 取代肽聚糖亚单位末端的氨基酸 ) 1 改变靶位 ( 核糖体甲基化 ) 2 主动泵出改变靶位 ( 核糖体甲基化 ) 主要抗菌药物的作用机制和细菌耐药机制氯霉素四环素氨基糖苷类磺胺类和甲氧苄氨嘧啶利福平喹诺酮类蛋白合成蛋白合成蛋白合成细胞代谢核酸合成 DNA 合成结合到 50S 核糖体亚单位结合到 30S 核糖体亚单位结合到 30S 核糖体亚单位竞争性抑制与叶酸生物合成有关的两步酶抑制依赖 DNA 的 RNA 多聚酶抑制 DNA 螺旋酶 (A 亚单位 ) 和拓扑异构酶 IV 1 灭活药物 ( 氯霉素乙酰转移酶 ) 2 主动泵出 1 减少细胞内药物的积累 ( 主动泵出 ) 2 靶位敏感性下降 1 灭活药物 ( 氨基糖苷类修饰酶 ) 2 降低革兰阴性菌外膜通透性 3 主动泵出产生不敏感的靶位 [ 二氢喋啶合成酶 ( 磺胺类 ) 和二氢叶酸还原酶 ( 甲氧苄氨嘧啶 )] 靶位不敏感 ( 多聚酶基因变异 ) 1 靶位不敏感 ( 酶基因变异 ) 2 减少细胞内药物的积累 ( 主动泵出 ) 控制细菌耐药, 任重道远 Thank you for your attention! 22

目录一 2014 年全院 5533 株细菌分布及前 10 位主要细菌耐药性结果二按照标本类型 ( 或感染部位 ) 进行的病原菌构成及药敏分析 1 呼吸道标本病原菌构成及药敏分析 2 尿液标本病原菌构成及药敏分析 3 血流骨髓标本病原菌构成及药敏分析 4 皮肤软组织标本病原菌构成及药敏分析 5

目录一 2014 年全院 5533 株细菌分布及前 10 位主要细菌耐药性结果二按照标本类型 ( 或感染部位 ) 进行的病原菌构成及药敏分析 1 呼吸道标本病原菌构成及药敏分析 2 尿液标本病原菌构成及药敏分析 3 血流骨髓标本病原菌构成及药敏分析 4 皮肤软组织标本病原菌构成及药敏分析 5 2014 年安医大一附院病原菌分布及药物敏感性分析编者 : 沈继录编审 : 王中新徐元宏 1 目录一 2014 年全院 5533 株细菌分布及前 10 位主要细菌耐药性结果二按照标本类型 ( 或感染部位 ) 进行的病原菌构成及药敏分析 1 呼吸道标本病原菌构成及药敏分析 2 尿液标本病原菌构成及药敏分析 3 血流骨髓标本病原菌构成及药敏分析 4 皮肤软组织标本病原菌构成及药敏分析 5 伤口引流液标本病原菌构成及药敏分析