< 愛滋病毒感染者併發結核病之相關問題 > 為因應全球對結核病診斷這個議題的關注以及大量且快速的新知擴增, 聯合國衛生組織及其下屬單位包括 N e w diagnostic working group(ndwg) special programme for research training in

結核病的診斷 李欣蓉 高雄榮民總醫院感染科主治醫師. 感染管制室主任 及時且正確的診斷是成功治療及控制結核病的要件 結核病的診斷是依據 [1] 微生物學的診斷 偵測結核菌的存在與否是確診的必要條件, 也是治療追蹤評估和確立療效的重要指標 近年來, 隨著實證醫學的趨勢, 結核病的診斷也邁向實證醫學的時代 全世界每年花費在結核病診斷方面的經費高達十億美元, 這麼龐大的花費需要實證醫學來證實 [2, 3] 具有其價值和意義 應用實證醫學在結核病診斷的目的, 在確保大量廣泛使用某種檢驗方法前, 先確認方法是有效和精確的, 包括敏感度 特異性 實際 [4] 應用的成效等等 也希望所有結核相關政策及指引的建立, 應建立在實證醫 [3] 學的基礎上 錯誤的診斷導致病情延誤和預後不佳, 到底那一些檢驗方法對 病患而言可以有比較好的結果, 是現今受到重視的議題 所謂實證結核病診斷, 乃是經由系統性 systematic reviews 和 meta-analyses 來整合個別檢驗研究 ( [4] primary diagnostic trials) 的結果 有別於傳統的檢驗研究, 其著重於評估檢驗方法是否對病人預後有重要影響, 依據的文獻其研究的品質是否可信, 檢驗在實際執行的可行性包括使用者之價 [5, 6] 值觀和習性, 以及價錢的考量 並針對未來的研究訂定報告的標準,(The STARD initiative), 以確保研究報告 [7] 的完整性 正確性和可信度 在訂定政策或 recommendations 也依照 GRADE(Grading of Recommendations Assessment, Development and Evaluation) [5], 以落實實證醫學的精神 11

< 愛滋病毒感染者併發結核病之相關問題 > 為因應全球對結核病診斷這個議題的關注以及大量且快速的新知擴增, 聯合國衛生組織及其下屬單位包括 N e w diagnostic working group(ndwg) special programme for research training in tropical diseases(tdr) foundation for innovative new diagnostics(find) STOP TB partnership 和加拿大的公共衛生局和 McGill University 以及其他數個學術單位, 共同架構一個新網站 (h t t p : / / www. tbevidence.org), 提供整合性資源, 包括實證結核診斷相關的學術文章 最新指引 政策和議題 近年來, 許多重大公共衛生政策的訂定, 都先以數理模式模擬成效 以數理模式模擬若有一個快速 普及 且不受愛滋病毒感染影響, 能夠偵測痰液抹片陽性和陰性個案, 並可達到敏感度 85%, 特異性 97% 的診斷方法, 則預估每年可以拯救 392,000 條生命, 減少全球結核病死亡達 22% [8] W.H.O. 自 2007 年依據實證醫學的精神, 做了許多 [4, 9] 政策上的改變 包括對痰液抹片陽性新個案的定義 (definition of a new sputum smear-positive TB case) [10] 對結核診斷痰液所需套數由三套減為兩套 (reduction on number of smears for the diagnosis of pulmonary TB) [11], 推行液態結核培養基以加速培養陽性結果和藥物敏感測試所需時間 (liquid media for culture and drug susceptibility testing) [12, 13], 推行使用新的分生線型探針檢驗法對有可能抗藥性結核個案進行快速篩檢 (molecular line probe assays for rapid screening of patients at risk for multi-drug resistant TB), 對發光二極體 (light-emitting diode, LED) 光顯微鏡的支持 (LED microscopy), 同一天收集兩套痰液抹片的做法 (same-day smear diagnosis 又稱之 front-loaded microscopy), 和快速培養方法 (selected non-commercial rapid culture methods) 等等 結核病的診斷學分為診斷潛伏性結核和活動性結核 愛滋病毒合併活動性肺結核感染比較常見痰液染色陰性, 或是以非典型臨床表現, 或是以肺外結核感染表現, 臨床上不易診斷 近年來有許多檢驗方法的發展, 可以增進敏感度, 有助於愛滋病毒合併結核感染的診斷 [14, 15] 12 71 期.http://www.aids-care.org.tw

一 潛伏性結核感染的診斷方法 潛伏性結核感染的診斷方法有傳統的結核菌素皮膚測試 (tuberculin skin test, TST) 和全血丙型干擾素檢驗 ( interferon-gamma release assay, IGRA ) 目前市面上有兩種 I G R A, 包括 QuantiFERON-TB GOLD(QFT-G) (Cellestis Ltd., Melbourne, Australia ) 和 T-SPOT.TB(Immunotec Ltd., Oxford, UK) [16] ( 一 ) 結核菌素皮膚測試 (Tuberculin skin test, TST): 已經具有一百年歷史和經驗的老方法 經由在皮下注射結核菌素 (2 tuberculin units(tu), purified protein derivative(ppd), 若有感染過結核, 則經由第四型細胞免疫產生對結核菌素反應, 分泌 cytokines 包括丙型干擾素 (interferon-gamma), 而在皮膚上呈現紅腫硬塊 一般健康人判斷陽性標準為, 在施打 48 至 72 小時後, 在有卡介苗施打的族群定在硬塊 ( 非紅暈 )>=15mm, 未接受過卡介苗的族群為硬塊 >=10mm [17] 在免疫不全者, 如愛滋病患者則陽性標準定在硬塊 > =5mm TST 其缺點有判斷不易需要專業受訓人員, 病人需要 48 至 72 小時回診, 可能有 boosting 的效果, 在施打過 卡介苗族群或非結核分枝桿菌感染患者 [16] 易產生偽陽性 在免疫不全患者如愛滋病毒感染者則易呈現偽陰性 (falsenegative), TST 的陽性率 ( 敏感度 ) 隨 [18] 著 CD4 數目下降而減少 ( 二 ) 全血丙型干擾素釋放檢驗 (interferon-gamma release assay, IGRA): 為免疫診斷方法, 偵測 T 細胞免疫對結核的反應, 但是無法區別潛伏性結核和活動性結核 此方法可以克服 TST 部分的缺點, 包括只需要抽血一次不需要回診, 經由儀器判斷, 具有客觀性, 最重要的是不會因卡介苗施打或非結核分枝桿菌感染產生偽陽性 經由抽全血後, 體外對淋巴球進行特異性結核菌抗原刺激後 ( 第二代 QFT-G 和 T-SPOT.TB 包括 ESAT-6 CFP-10, 第三代的 QFT-G in tube test 還多加一個 TB7.7 抗原 ), 感染過結核的淋巴球將活化, 分泌丙型干擾素, 再經由 E L I S A ( QF T- G) 或 EL IS P O T 的方法 (T- SPOT.TB) 來進行丙型干擾素的偵測及定量 目前文獻顯示其敏感度和 TST 相當, QFT-G 其特異性在非卡介苗族群高達 100%, 卡介苗族群亦可達 96%, ELISPOT 特異性達 92% [19] 在愛滋病毒感染者合併潛伏性結核 13

< 愛滋病毒感染者併發結核病之相關問題 > 感染時, 在 CD4 淋巴球小於 200 者, 其 QFT-G 的陽性率偏低和 indeterminate 的比率偏高, 顯示在免疫低下者, 會產生偽陰性的情況 因此有指引建議在這類病人檢查為陰性者, 在給予抗反轉錄病毒治療後, 當 CD4 淋巴球大於 200 時, 再作一次以排除偽陰性 二 活動性結核感染的診斷方法 對於活動性肺結核的確診為痰液結核菌培養 傳統和新發展之診斷方法有九大類, 如下 : * Sputum Microscopy( 痰液鏡檢 ) * Liquid Culture( 結核菌液態培養基 ) * Tuberculin Skin Testing( 結核菌素皮膚測試 ) * Biomarkers(Adenosine deaminase(ada) & Interferon-gamma) for extrapulmonary TB( 生物標記 ( ADA 和丙型干擾素 ) 用來診斷肺外結核 ) * Interferon gamma release assays (IGRAs)( 丙型干擾素釋放檢驗 ) * Serological Tests for TB( 結核血清學 ) * Nucleic Acid Amplification Tests (NAAT)( 核酸 增幅測驗 ) * Bacteriophage-Based Assay( 噬菌體為基礎的檢驗 ) * Rapid Tests for MDR-TB( 多重抗藥性結核快速檢驗 ) ( 一 ) 痰液鏡檢 (Sputum microscopy): 痰液鏡檢是個簡單 便宜 廣泛普及使用, 且在結核盛行地區是個具有高度特異性的檢查 唯其敏感度不甚理想, 報導從 20% 至 80% 均有 在愛滋病毒感染者, 痰抹片陰性比例甚至可以高達 24% 到 61% [20] 另外, 除耗費人力也需要具有專業訓練的人力方能執行 因此, 須要積極推行能夠提升鏡檢的策略, 稱之為痰液鏡檢最佳化策略 (optimizing sputum smear microscopy) 以達到肺結核診斷的最高效益 此策略包括六個 [21] 步驟 / 方向 : 1 ) 清楚教導如何咳出一口好痰 : 研究顯示只要簡短兩分鐘教導如何收集痰液之後, 再去領取痰容器, 可以增加 [22] 5% 痰抹片陽性率 教導內容包含強調要收集痰液而非口水的重要性, 並描述兩者外觀上之不同 ; 教導示範咳一口好痰的技術 ( 深呼吸三口氣後, 深咳將痰液從肺部咳出 ); 請病人把痰容器裝滿 14 71 期.http://www.aids-care.org.tw

至少四分之一 (5 cc, 並用手指直接指出痰容器需要收集的量 ); 請病患立即咳一口痰, 第二口收集明早清晨睡醒第一口痰, 隔日再送來 2 ) 減少診斷肺結核所需痰液套數由三至二套 由於第三套痰所增加的診斷率為 <5% [11], 且在資源拮据的國家也 [23] 顯得相當昂貴, 效益差, 故 WHO 建議可以減少診斷肺結核痰液套數, 但前提是要有一個好的實驗室, 具有外部品質檢定的功能包括 : 現場指導和回饋, 如果工作量超越負荷, 且人力資源不足 [24] 時, 可減少診斷痰液套數 在先進國家人力和資源皆豐富, 則不見得適合放棄那 5% 的陽性個案的診斷 3 ) 快速收集兩套痰液 (F r o n t - loaded sputum microscopy) [25] : 病人看診當天相隔一個小時收集兩套痰液的做法, 以減少病人因為不回診而流失 4 ) 痰液檢查前先進行前處理 ( processing of sputum specimens prior [26] to examination) 包括離心濃縮和漂 [27] 白水或 sodium hydroxide(naoh) [28] 前處理 在愛滋病高盛行率國家可以提升鏡檢診斷率 5) 利用螢光顯微鏡 (fluorescent microscopy): 敏感度比起一般光學顯 微鏡增加 10% [29] 或發光二極體 (lightemitting diode) 光學顯微鏡 (LED microscopy), 可以減少花費時間, 增加診斷率 ( 二 ) 結核菌素皮膚測驗 (Tuberculin skin test, TST): [30] 根據 meta-analysis 顯示, 在健康人之活動性肺結核感染, TST 敏感性僅達 70%(95% CI:0.67-0.72) 在活動性結核合併有愛滋病毒感染患者, 若 CD4<200/mm 3, 僅有 20~30% TST 會呈陽性, 若 CD4>200/mm 3, 也僅有 [1,31] 20 ~ 50% 會陽性 ( 三 ) 結核菌培養 (culture) 及藥物敏感測試 (drug susceptibility testing, DST): 結核菌培養為結核病確診的依據, 而藥物敏感測試偵測是否有抗藥性為治療用藥選擇及治療時間長短之重要決定因素 傳統使用固體培養基 ( Lowenstein-Jensen, 簡稱 LJ medium), 培養時間需長達 4 週, 延誤治療時機 液態培養基包括 B a c T / A L E R T ( Biomerieux, France), BACTEC(BD Diagnostics, USA), Mycobacterial Growth Indicator Tube(MGIT )( Becton Dickinson, USA 氛 ) 則可以縮 15

< 愛滋病毒感染者併發結核病之相關問題 > [13] 短培養陽性所需時間到 11.7 ~ 16.5 天 這些液態培養系統利用螢光或是呈色反應持續測量結核菌生長所產生的氣體壓力改變, 二氧化碳 (CO 2 ) 產量, 或氧氣 (O 2 ) 消耗量 BACTEC960/ MGIT 的敏感性達 81.5%, 特異性達 99.6% 對於藥物敏感測試, 固體培養基需要 21 天, 而液態培養基可以縮短到 9.5 天 (MGIT-AST) 和 4 ~12 天 ( BACTEC960TB), 但是比較昂貴和需 [32,33] 要實驗室設備和人才 ( 四 ) 全血丙型干擾素釋放檢驗 (Interferon-gamma release assay, IGRA): 此方法為免疫診斷, 偵測 T 細胞免疫對結核的反應 ( 詳見前述 ) 第三代 QFT-G 為 QFT-G in tube test( QFT-IT), 在活動性結核敏感度 81%, 另 T-SPOT.TB 敏感度 88% 若侷限在已開發國家, 則敏感度增加到 84%( QFT-IT) 和 89%(T-SPOT.TB) [30] 特異性則 QFT-IT 高達 99%,T-SPOT.TB 則 88% 不確定結果(indeterminate) QFT-IT 為 2.1%, T-SPOT.TB 為 3.8% 在免疫不全者不確定結果分別為 4.4% 和 6.1% [30] 在愛滋病毒合併活動性結核感染時, T-SPOT.TB 的敏感度從 62. 6% 到 92.9% [31, 34], 而 QFT-IT 的敏感 度從 63% 到 66% [35~37] IGRA 的敏感度隨著 CD4 數目下降而下降, 但也有數篇小型研究報告顯示, 敏感度不受 CD4 數目下降影響, 但需要更大型的研究證實 [34, 37] ( 五 ) 肺外結核 Adenosine deaminase( ADA) 和丙型干擾素 (Interferongamma) 偵測 : 肋膜結核的確定診斷相當困難, 可從痰液或肋膜積液內培養出結核菌, 或是肋膜切片病理檢驗看到乾酪化的肉芽腫 然而, 肋膜積液的抗酸染色很少陽性 (<5%), 結核菌培養陽性率很低 ( 10 ~ 35%), 且肋膜經皮穿刺切片也有 [38] 高達 20 ~ 40% 沒有結果 基於結核性肋膜積液乃發炎所致, 故利用偵測可溶性的免疫活化標記, 如 ADA 或丙型干擾素, 根據某些研究報告顯示在結核性肋膜積液會增加, 且具有高敏感度和 [39] 特異性, 可以用來協助診斷 ADA 為單核球吞噬作用的嘌呤代謝酵素產物, 而丙型干擾素為 T 細胞在肉芽腫發炎反應時會分泌的細胞激素 所以當診斷有困難時, 可以使用肋膜積液裡的生物標記, 如 ADA 或丙型干擾素來協助診斷, 但目前仍建議需要配合臨床來綜合判斷 16 71 期.http://www.aids-care.org.tw

( 六 ) 結核病血清檢驗 (Serological tests for TB): 此為免疫診斷的另一種方法, 偵測抗結核菌抗體的產生 方法有酵素免疫分析法 (E L I S A ) 和免疫色層分析法 (immunochromatographic methods) 目前血清學診斷在愛滋病患者 兒童和痰染色陰性患者的使用還沒足夠的研究可以證實其診斷價值 不論在肺結核 [40] [41] 或肺外結核, 血清學診斷方法的敏感度和特異性差異很大, 在健康人的特異性比疑似結核個案高, 在肺結核痰抹片陽性個案敏感度較高 在肺外結核敏 [41] 感度更低, 且特異性差異大 故目前血清學診斷法在結核的臨床照護或是個案診斷均不被推薦 ( 七 ) 快速核酸增幅檢驗 (N A A T, nucleic acid amplification tests): 雖然 NAAT 理論上連一隻結核菌也可以偵測得到, 但是由於敏感度和準確度的疑慮, 仍無法取代傳統診斷方法 [42] 在痰液裡 NAAT 之偽陰性, 可能因為取樣本量少, 另外 3 ~ 25% 偽陰性也可能因為痰液裡面有抑制複製反應的酵素所致 另外這個方法容易產生檢體之間的汙染, 導致偽陽性 雖然自動化商業化的系統可以經由 標準化作業及試劑來減少以上的問題, 但是目前美國疾病管制局仍是建議 commercialized NAAT 應和痰液鏡檢一同使用來增加診斷精確性, 且臨床醫師需加入臨床判斷來做結果的判讀 一般標準為痰陽性個案若 NAAT 也陽性, 或是痰陰性個案, NAAT 陽性結果兩次, 可以診斷肺結核 判陰性結果需要痰抹片陰性, 加上兩次 NAAT 陰性 Meta-analysis 顯示 NAAT 的敏感度在痰液抹片陽性個案可以達 96%, 特異性達 85%, 但在痰液抹片陰性者則敏感度大幅下降至 66%, 特異性維持 98% [42] 而非商業化自家設計的聚合 鏈反應 (In-house PCR), 敏感度 96% 但特異性僅達 81%, 可能會造成錯誤決定 [42] 故目前不論是 commercialized NAAT 或是 in-house PCR 的臨床應用建議侷限於痰液抹片陽性個案排除結核 [42] 的診斷用 ( 八 ) 噬菌體為基礎之檢驗法 (Bacteriophage-based assay) [43] 此方法相當快速, 僅須要 48 小時 檢驗法有兩種 : ( 一 ) 斑塊形成法 (Plaque formation): 噬菌體感染結核菌後, 必須 17

< 愛滋病毒感染者併發結核病之相關問題 > 在活的結核菌體內才能夠增生, 利用細胞產生斑塊來偵測噬菌體增生代表有活的結核菌存在 ( 二 ) 螢光報告噬菌體法 (Luciferase reporter phages,lrp ): 噬菌體含有會發放螢光的 luciferase reporter gene, 感染結核菌後, 必須要在活的結核菌體內才能夠增生, 加入 luciferin 和 ATP 後就會發光 這些方法具有高特異性 (83 ~ 100%) 但是敏感度差異相當大 (21 ~ 88%) 因此目前無法取代痰液鏡檢和結核培養 已有 commercialized kits 包括 FASTPlaque- TB R, PhageTek MB R (Biotec Laboratories Ltd, UK) [14] 另外也有發展可以偵測抗結核藥物 (rifampin) 抗藥性的噬 [44] 菌體檢驗, 可以直接由培養菌株快速檢測抗藥性 ( 九 ) 多重抗藥性結核快速檢定 ( Rapid tests for multidrug-resistant TB, MDR-TB): 多重抗藥性結核指的是同時對兩個最重要的抗結核藥物 rifampin 和 isoniazid 產生抗藥性 由於一旦產生多重抗藥性結核, 治療相當棘手, 需要用到二線抗結核藥物, 且治療時間可長至兩年或更久, 故其早期偵測相當的重要 ( 一 ) 分生線型探針檢驗 (M o - lecular line probe assay) [45] : 目前商業化試驗有兩種 :INNO-LiPA1Rif.TB assay(innogenetics, Ghent, Belgium) 和 GenoType1 MTBDR assay(hain LifeScience GmbH, Nehren, Germany ) 對於偵測 rifampin 抗藥性, 敏感度和特異性均達 98% [45] 對於偵測 isoniazid 抗藥性敏感度 84.3%, 特異性 99.5% [45] GenoType MTBDR assay 包括 : 核酸 萃取 multiplex PCR 增幅 reverse hybridization MTBDR assay 偵測 rpob 基因 (rifampin 抗藥 ) katg 基因的突變 (isoniazid 高度抗藥 ) 第二代的 MTBDRplus 多偵測 inha 基因 (isoniazid 低度抗藥 ) ( 二 ) 呈色氧化還原抗藥性檢驗法 (Colorimetric redox indicator method ) [46] : 在結核菌培養出來後, 加入抗結核藥物, 以刃天青 (resazurin) Alamar blue 或 tetrazolium salts, MTT(3(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium- bromide) 氧化還原 (r e d o x) 試劑呈色反應, 若有菌種生長代表有抗藥性 又稱之為 microplate Alamar Blue assay(maba) 或 tetrazolium microplate assay(tema 18 71 期.http://www.aids-care.org.tw

) 此方法可以 7 ~ 14 天內有結果, 但必須受限於培養所需時間 (2 ~ 6 週 ) 不論對 rifampin 或是 isoniazid, 此方法偵測抗藥性之敏感度和特異性均可達到 89 ~ 100% [46] ( 三 ) 鏡檢抗藥性檢驗法 (M i c r o - scopic Observation Drug Susceptibility Assay, MODS): 此方法於 2004 年由 [47] 秘魯發展, 可以直接由臨床收集的痰 驗室設備, 尚未能廣泛使用 愛滋病病患結核病診斷的困難點在於臨床及影像 ( 肺部 X 光及電腦斷層 ) 表現不典型甚至可能正常, 及痰液抹片檢查常常為偽陰性, 皮膚測試常為偽陰性 [1,14,15] 故發展更好的, 不受愛滋病毒感染影響準確度的, 且可用在醫療第一線的診斷工具 (point-of-care diagnostics ), 是 W.H.O. 近年來極力努力的重點 做檢驗, 報告時間比液態培養基還縮短 到 7~9 天 利用結核菌在液態培養基產生典型 cording 外觀, 經由鏡檢偵測確 [48] 診 可以與培養同步做藥物抗藥性檢查 其敏感度高達 97.8%, 比較自動化培養基為 89%, 而固體培養基為 84% 目前推廣在資源拮据的國家 結論 台灣目前結核病檢驗除傳統痰液鏡檢, 也有部分醫院採用螢光顯微鏡, 少部分有提供快速 PCR 方式來鑑定痰液陽性個案是否可以排除結核診斷 結核菌培養也多採取液體培養, 只有少數仍使用固體培養基 所有檢體均做藥物敏感測試 疾管局也努力落實實驗室品管系統, 固定行外部稽查 唯快速分子診斷工具礙於價格昂貴, 需要專業人員及實 < 參考文獻 > 1.Aaron L, et al. Tuberculosis in HIVinfected patients: a comprehensive review. Clin Microbiol Infect 2004;10(5):388-98. 2.W.H.O./T.D.R./FIND, Diagnostics for Tuberculosis: Global demand and market potential 2006,W.H.O.: Geneva, Switzerland. 3.Pai M, A Ramsay, and R. O'Brien, Comprehensive new resource for evidencebased TB diagnosis. Expert Rev Mol Diagn 2009;9(7):637-9. 4.Pai M, et al. New and improved tuberculosis diagnostics: evidence, policy, practice, and impact. Curr Opin Pulm Med 2010;16(3):271-84. 5.Shunemann AHJ, et al. GRADE: grading quality of evidence and strength of recommendations for diagnostic tests and strategies. British Medical Journal 2008 ;336:1106-10. 6.Minion, J. and M Pai, Evidence-based diagnosis of tuberculosis: resources for the medical microbiologist. Indian J Med Microbiol 2010;28(1):2-4. 19

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