TOYOBO 技术讲座 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司
讲座内容 第一部分使用 KOD 酶进行高效率 PCR! 教您高保真性扩增 粗样品 PCR 及 Multiplex PCR 相关的 PCR 酶的基础知识及 PCR 的技巧 第二部分 实践!Realtime PCR! 从 qpcr 试剂的选择到应用 第三部分重要! 逆转录反应! 帮您进行高效率的逆转录反应更简便地进行去除 gdna 及从细胞开始的逆转录
讲座内容 第一部分 使用 KOD 酶进行高效率 PCR! 教您高保真性扩增 粗样品 PCR 及 Multiplex PCR 相关的 PCR 酶的基础知识及 PCR 的技巧 第二部分 实践!Realtime PCR! 从 qpcr 试剂的选择到应用 第三部分 重要! 逆转录反应! 帮您进行高效率的逆转录反应更简便地进行去除 gdna 及从细胞开始的逆转录
TOYOBO 产品涉及的研究领域 DNA RNA Protein Animal Plant Cell PCR Cloning Detection qpcr RT Western blot ELISA Mutagenesis Genotyping IHC 高效率 Realtime PCR Master Mix THUNDERBIRD qpcr Mix 高保真 高效率 PCR 酶 KOD -Plusseries Taq Master Mix Quick Taq 高效率 Taq 聚合酶 Blend Taq 使用 KOD 的高效率 PCR Master Mix KOD SYBR Mix qpcr Realtime PCR 用高效率逆转录试剂盒 ReverTra Ace qpcr RT Kit 免疫反应增强剂 Can Get Signal 定点突变导入试剂盒 KOD -Plus- Mutagenesis kit 高效率 高成功率 PCR 酶 KOD FX series 免疫反应增强剂 Can Get Signal immunostain qpcr 用的细胞裂解和 cdna 合成试剂盒 SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qpcr
讲座内容 关于 PCR 酶的基础知识 为什么 KOD DNA 聚合酶具有高性能? KOD -Plus- 系列和 KOD FX 系列 KOD -Plus- 系列 KOD FX 系列 典型实验例介绍及 PCR 技巧
PCR 酶来源于两类生物 真核生物 原始菌 ( 古细菌 ) 超嗜热原始菌 [ ~100 o C] (KOD, Pfu etc) Kodakara island, Japan 原核生物 Evolutional family tree (Bacteria) 嗜热细菌 [~80 o C] (Taq, Tth etc) Thermococcus kodakaraensis KOD1 Intermittent spring [Yellowstone national park (USA)] Thermus aquaticus
DNA 聚合酶具有两种不同的活性 超嗜热原始菌 (KOD) 嗜热细菌 (Taq) Polymerase domain 3 5 Exonuclease domain (Proof-reading activity) Polymerase domain 5 3 Exonuclease domain
两种核酸外切酶活性 3 5 Exo 活性 3 5 5 3 错配的碱基 ( 校正活性 ) 错配碱基的修复 KOD 3 5 5 消除 DNA pol. 3 5 3 高保真性 5 3 Exo 活性 ( 修复 ) Taq 5 3 3 5 3 可用于检测 5 5 3 TaqMan probe (RNA primer etc.)
基本性能总结 TABLE 1. Properties of thermostable DNA polymerases 属性 Value for indicated DNA polymerase KOD DNA polymerase Pfu DNA polymerase Taq DNA polymerase 来源 原始菌 ( 古细菌 ) 原始菌 ( 古细菌 ) 细菌 分子量 (kda) 90.0 90.1 93.9 最适温度 ( ) 75 75 75 75 最适 ph 6.5 6.5 8.0-8.5 5 3 核酸外切酶活性 - 10 万碱基中有 3 个错配碱基 - + 10 万碱基中有 144 个错配碱基 3 5 核酸外切酶活性 + + - 保真性非常高 末端转移酶活性 - - + 核苷酸掺入效率 (bases) >300 <20 ND 延伸速度 (bases/s) 106-138 25 61 热稳定性 ( 半衰期 ) 95, 12 h; 100,3.0 h 95, 6h; 100, 2.9h 95, 1.6 h 1 个分子酶的平均合成的链长
DNA 聚合酶的延伸速度比较 Incubation Time (sec) KOD Pfu Taq 20 sec 40 sec 60 sec 90 sec 120 sec 6557 4361 2322 2027 564 60 sec 90 sec 120 sec 150 sec 60 sec 90 sec 120 sec 150 sec 6557 4361 2322 2027 564 Fig. Comparison of elongation rates of KOD Pfu and Taq DNA polymerase. The elongation rate was measured according to the length of synthesized DNA, using M13 ssdna as the template at 75. 可快速扩增 可扩增长片段及高 GC 含量的序列 含有抑制物的反应体系也可以扩增
基本性能总结 TABLE 1. Properties of thermostable DNA polymerases 属性 Value for indicated DNA polymerase KOD DNA polymerase Pfu DNA polymerase Taq DNA polymerase 来源 原始菌 ( 古细菌 ) 原始菌 ( 古细菌 ) 细菌 分子量 (kda) 90.0 90.1 93.9 最适温度 ( ) 75 75 75 75 最适 ph 6.5 6.5 8.0-8.5 5 3 核酸外切酶活性 - 10 万碱基中有 3 个错配碱基 - + 10 万碱基中有 144 个错配碱基 3 5 核酸外切酶活性 + + - 保真性非常高 末端转移酶活性 - - + 核苷酸掺入效率 (bases) >300 <20 ND 高速 PCR 长链或高 GC 的难扩增序列 以及粗样品都可扩增 延伸速度 (bases/s) 106-138 25 61 热稳定性 ( 半衰期 ) 95, 12 h; 100,3.0 h 95, 6h; 100, 2.9h 95, 1.6 h 产物得率高 检测灵敏度高
KOD 系列的开发理念 KOD Plus 系列 以保真性为着眼点开发 KOD DNA polymerase 改良 Buffer Hot Start 以 PCR 效率 成功率为着眼点开发 KOD FX 系列 GC 含量高 长片段 粗样品的扩增 KOD exo(-) DNA polymerase 经优化的适用于 qpcr 的突变体 KOD SYBR qpcr Mix 将 KOD 的优势应用于 qpcr
延伸增强剂技术 停滞现象 PCR 酶进行基因扩增时, 在 20 个循环以后, 往往容易发生底物的消耗 劣化 酶的失活 副产物等现象, 从而抑制反应, 导致无法获得更多的扩增产物, 该现象被称为 停滞现象 新开发的延伸增强剂技术可抑制该 停滞现象 扩增量 0 10 KOD Neo 系列 20 Cycle Number 以往的 PCR 酶 30 停滞现象 40 延伸增强剂的效果 同时可进行 高灵敏度检测 高速 PCR 长片段扩增 图 1 延伸增强剂的效果
KOD 系列产品的进程 KOD -Plus- KOD -Plus- Ver.2 高保真 & 高效率 更高效率 & 长片段 KOD -Plus- Neo New! & 高速 KOD DNA polymerase KOD FX 高効率 & 高成功率 GC 含量高, 长链目的片段的扩增 粗样品的扩增 多重 PCR KOD FX Neo 更高效率 & 长片段 New! & 高速 延伸增强剂技术
KOD -Plus- 系列的特征 KOD Plus series KOD FX series Pfu DNA Polymerase High efficient Taq Taq DNA Polymerase 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Mutation frequency (Number of misincorporated bases/100,000 bases) KOD -Plus- 系列的保真性约为 Taq DNA polymerase 的 80 倍 最适用于克隆
KOD -Plus- 系列 KOD -Plus- Neo 扩增长度的比较 KOD -Plus- 系列在扩增量 特异性方面有显著优势只有用 KOD -Plus- Neo, 才能扩增 17.5 kb 长的片段, 并得到清晰的条带 17.5 kb KOD -Plus- Neo KOD -Plus- A 公司的高保真 PCR 酶 M 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 30 sec./ kb 1 min./ kb 1 min./ kb 30 sec./ kb Extension time B 公司的高保真 PCR 酶 Cycling conditions of KOD Plus Neo 1~4: 94, 2 min. 98, 10 sec. 30 cycles 68, 30 sec./ kb 5: Step down cycle 1: Human β-globin (1.3 kb) 2: Human β-globin (2.7 kb) 3: Human β-globin (3.6 kb) 4: Human β-globin (8.5 kb) 5: Human β-globin (17.5 kb) M: 1 kb DNA Ladder 长片段目的基因也可以高速并且高保真地扩增!
TA 克隆时需要注意 注意! 用 KOD -Plus- 及 KOD FX 系列扩增得到的 DNA 片段, 其末端已被平滑化! TA 克隆专用试剂盒 5 3 Blunt end PCR products 3 5 5 3 A-attachment Mix Taq DNA pol. anti-kod antibody 3 5 T T T-Vector (pta vector) 5 3 A Ligation A 3 5 High efficient TA cloning reagent for KOD TArget Clone -Plus- (Code No. TAK-201) pta Vector 2xLigation Buffer T4 DNA Ligase 10xA-attachment Mix
KOD FX 系列的特点 KOD FX 系列是以 PCR 效率 成功率为重点而开发的产品 粗样品的扩增 小鼠尾巴 指甲 植物样品 ( 叶 根 ) 微生物 ( 细菌 酵母 真菌 ). 全血 头发 口腔粘膜 无须纯化即可扩增 难扩增序列的扩增 长链目的片段 GC 含量高的序列 GCCGACGG TCCACGA CGGCTGCC AGGTGCT ATGCATGCATGCATGCATCAT CATGCATGCATGCATGCATG TACGTACGTACGTACGTACGA GTACGTACGTACGTACGTAC PCR Powerful Up to 40kb 可扩增之前不能扩增的序列 挑战之前不能扩增的 PCR 想省略繁琐的纯化步骤时
KOD FX 系列 可直接扩增血液样品 直接 PCR 电泳分析 8.5 kb 3.6 kb 1.3 kb KOD FX Citric acid Heparin M1 A B C M2 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M1: 1kb Ladder Marker M2: l/hind III Marker Anticoagulant 1:KOD FX 2:KOD FX Neo 3:PCR enzyme (A company) 4:PCR enzyme (B company) M:1 kb DNA Ladder <Sample> Whole blood 2 μl Template : Whole blood 5 μl Target : Human β-globin 1.3 kb
KOD FX 系列 霉菌 酵母可直接进行 PCR 酵母 挑取 1 个克隆 直接 霉菌 PCR 电泳分析 KOD FX Company A M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5 M: 100 bp DNA Ladder 1 Aspergillus oryzae 2 Aspergillus niger 3 Saccharomyces cerevisiae 4 Schizosaccharomyces pombe 5 Pichia pastris
KOD FX 系列 土壤样品直接 PCR PCR 凝胶电泳分析 土壤堆肥 用灭菌水作 10 倍的稀释, 取 1μl 为模板, 配制 50μl 的 PCR 反应体系 KOD FX Neo KOD FX A 公司的粗样品用 PCR 酶 1 非高保真性 PCR 试剂 A 公司的粗样品用 PCR 酶 2 B 公司的粗样品用 PCR 酶 M 1 2 3 M 1 2 3 M 1 2 3 M 1 2 3 M 1 2 3 最适合用于 Metagenomic 的分析! 700 bp 600 bp 550 bp 1 原核生物的 rdna(700 bp) 2 Bacillus sp. 的 rdna (600 bp) 3 高 G/C 革兰氏阳性菌的 rdna (550 bp)
KOD FX 系列 用小鼠尾巴裂解物进行基因分型 碱裂解法 ( 前处理方法 ) 小鼠尾巴 ( 约 3mm) 置入离心管 50 mm NaOH 180 μl Vortex 充分振荡 95 o C for 10 min. 1M Tris-HCl(pH8.0) 20 μl Vortex 充分振荡 12,000 rpm, 5 min.[optional] Taq based high efficient KOD FX PCR enzyme 1 2 3 M 1 2 3 M 1 2 3 取上清 0.5-2 μl PCR (50 μl) 1: Tg / Tg 2: Tg / W 3: W / W
KOD FX 系列 对植物裂解液进行直接 PCR 一步法 简便 叶片 (3x3mm) 精米 Buffer A 100 μl 置入离心管 1: Leaf (Tomato) 2: Leaf (Tobacco) 3: Leaf (Rice) 4: Grain (Rice) 5: Purified rice leaf DNA Vortex 充分振荡 Buffer A*: 100mM Tris-HCl(pH9.5) 1M KCl 10mM EDTA KOD FX Taq based PCR enzyme 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5 M 95 for 10 min. Vortex 充分振荡 取上清 1 μl 1.3kb 左 : 叶片右 : 精米 PCR (50μl) *BioTechniques, 19: 394 (1995)
KOD FX 系列 以基因 DNA 为模板的长片段 PCR 以人基因组 DNA 为模板, 扩增了 24~40 kb 的目的片段 结果, 只有使用 KOD FX Neo 的情况下全部目的片段都得到了良好的扩增 KOD FX Neo KOD FX A 公司 Long PCR 用酶 M 1 2 3 M 1 2 3 M 1 2 3 M : λ/hind III Marker 1:tPA 24kb 2:HBg 32kb 3:HBg 40kb 延伸时间 : 30 sec./kb 60 sec./kb 30 sec./kb 至今为止不能扩增的粗样品的扩增 ~40kb 的长链目的片段的扩增
PCR 的要点 无扩增 非特异性扩增 原因 模板不好 抑制物太多 (cdna 中含有的 RNA 也是抑制剂 ) 循环条件不合适 引物太短 循环条件不合适 引物设计得不好 扩增不出来, 非特异性扩增, 诸如此类问题的咨询很多 针对每个问题的解决对策不同, 但基本上多是循环条件与引物设计方面的问题
PCR 循环的设定方法 PCR 的循环通常由 3 步构成 Templature ( ) 1cycle step1 step3 step2 Time (min) step1 变性 step2 退火 Fwd primer Rev primer step3 延伸 其中退火这一步对 PCR 成功与否至关重要
PCR 循环的设计方法 退火温度 过高 PCR 产物很少扩增不出来 过低 弥散 产生非特异性条带 引物难以退火 产生错配的退火 Templature ( ) 1cycle step1 step3 step2 Time (min) Tm-5 (Taq) Tm(KOD) KOD 因为具有很高的扩增效率, 结合较弱的退火也能够扩增 KOD 酶在这方面的咨询很多 与 Taq 酶的使用条件不同, 可将退火温度设定得稍高一些 ( 没有退火步骤的 2 步法循环也可以 )
引物 Tm 值的计算方法 TOYOBO 公司采用 Nearest Neighbor 方法进行计算 Tm = (1000 * ΔH) /( -10.8 + ΔS + 1.987 x ln(ct/4)) -273.15 + 16.6log[Na mole conc.] Na+ :50 mm, Primer conc: 500 nm Breslauer, K.J. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 3746-3750. 一般用于 Tm 在 20 以下的计算 一般用于 Tm 80 以上的计算 Primer 配列 Wallace 法 Nearest Neighbor 法 GC 法 CCAGGATTTTTGATGGGACA 58.0 64.5 53.4 GGTGTTCCCTTGATGTAGCACA 66.0 65.9 57.7 TGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTC 104.0 77.5 65.5 虽然有各种计算方法, 但是不同的方法得到的值差别很大! 一般的 PCR 引物的 Tm 在 20 ~80 之间 用 Nearest Neighbor 法计算得到的值最准确! 用错误的 Tm 计算方法会导致 PCR 反应失败!! TOYOBO 公司计算用的 Excel 软件可以免费提供
引物设计的要点 18~20mer 23~25mer 左右最合适 ( 目的片段长度不到 10kb) * 目的片段长度超过 10kb 时为 25~35mer Primer 长度 16 19 21 25 28 31 GC 含量 :45~60% 注意引物 3 端不要有 GC 不能使用含次黄苷酸的引物 特异性 扩增量 图 特异性与引物长度的关系 使用 KOD 酶的时候, 将引物设计得稍长一点, 反应循环也从 2 步法开始摸索, 这样比较容易得到好的结果
扩增实验例 3 步法 2 步法 KOD -Plus- KOD -Plus- Neo 1 2 3 4 1 2 3 4 KOD -Plus- KOD -Plus- Neo GC biases 1 2 3 4 1 2 3 4 Tm 1: TGTGTTACCTGGGCAGCTCCAG 59 2: CCAATGCAGGTTAAGACGACAG 55 3: ACAGAATGGGGAATGAGGCTGG 57 4: CACCAGGTCCATGATCTTCCAG 57 3 末端有 GC 的引物产生了非特异性扩增通过改变引物 将循环反应变为 2 步法等方法来消除非特异性扩增
总结 1. KOD DNA 聚合酶是高保真且高效率的 PCR 酶 2. 在 KOD -Plus-( 用于高保真性 PCR) 与 KOD FX( 用于难扩增序列 粗样品 ) 的基础上, 添加了延伸增强剂的 KOD -Plus- Neo KOD FX Neo 是效率更高的酶 可根据其各自的特征和用区别使用 3. 由于 KOD FX Neo 具有更高的效率及更高的成功率, 因此可用于多重 PCR, 且还可用于粗样品的扩增 KOD FX Neo 是我司以成功率 No.1 而著称的酶, 对以前不能扩增的目的片段的挑战, 请大家一定要试试其效果 4. KOD 与 Taq 酶的 PCR 最适条件不同 在最适条件下进行 PCR 时可以得到比 Taq 更好的结果
讲座内容 第一部分 使用 KOD 酶进行高效率 PCR! 教您高保真性扩增 粗样品 PCR 及 Multiplex PCR 相关的 PCR 酶的基础知识及 PCR 的技巧 第二部 实践!Realtime PCR! 从 qpcr 试剂的选择到应用 第三部分 重要! 逆转录反应! 帮您进行高效率的逆转录反应更简便地进行去除 gdna 及从细胞开始的逆转录
TOYOBO 产品涉及的研究领域 DNA RNA Protein Animal Plant Cell PCR Cloning Detection qpcr RT Western blot ELISA Mutagenesis Genotyping IHC 高效率 Realtime PCR Master Mix THUNDERBIRD qpcr Mix 高保真 高效率 PCR 酶 KOD -Plusseries Taq Master Mix Quick Taq 高效率 Taq 聚合酶 Blend Taq 使用 KOD 的高效率 PCR Master Mix KOD SYBR Mix qpcr Realtime PCR 用高效率逆转录试剂盒 ReverTra Ace qpcr RT Kit 免疫反应增强剂 Can Get Signal 定点突变导入试剂盒 KOD -Plus- Mutagenesis kit 高效率 高成功率 PCR 酶 KOD FX series 免疫反应增强剂 Can Get Signal immunostain qpcr 用的细胞裂解和 cdna 合成试剂盒 SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qpcr
讲座的内容 Realtime PCR 的问题点及其对策 qpcr 中特异性 PCR 效率的重要性 ~ 围绕 THUNDERBIRD ( 雷鸟 ) 系列的介绍 ~ 难扩增序列的定量方法 ~ 使用 KOD 的 至今没有的 qpcr 试剂 ~ 总结
Realtime PCR 的问题点 对 100 名研究人员问卷调查的结果 30 % 成本 其他 24 % 效率 19 % 长链目的片段的扩增 高 GC 含量的难扩增序列 抑制剂的影响 特异性 ( 引物二聚体 ) 向参加 BMB2007( 日本分子生物学会 生化学会联合大会 ) 的约 100 位老师询问了 RealtimePCR 实验中碰到的问题点 为了解决这些问题, 我们开发了两类 Realtime PCR 试剂
解决问题的两类 Realtime PCR 试剂 THUNDERBIRD ( 雷鸟 ) 系列 KOD SYBR qpcr Mix 减少引物二聚体 ( 提高特异性 ) 可扩增长链目的片段 实现了均一性高效率的扩增 可解决难扩增序列 ( 高 GC 含量 二级结构 ) 追求性价比 可解决粗样品的扩增问题
THUNDERBIRD ( 雷鸟 ) 系列的特点 (1) 高特异性 扩增曲线 融解曲线 10 0 稀释 未见到引物二聚体 THUNDERBIRD SYBR qpcr Mix 10-3 稀释 引物二聚体 本公司以往产品 SYBR Green Realtime PCR Master Mix -Plus- 引物二聚体 A 公司 Realtime PCR 试剂 图 1 通过 SYBR Green I 检测体系比较反应特异性 ( 使用 Roche LightCycler 1.1) 优化了组分 提高了特异性减少了引物二聚体
特异性的重要性 产生引物二聚体的情况 特异性高的情况 引物二聚体 10 4 copy 10 0 由于引物二聚体的扩增 目的基因的定量变得困难 10 4 copy 10 3 10 2 10 1 10 0 No template Control 产生非特异性扩增的情况 非特异性扩增 因间隔相等, 在低拷贝区域也可以定量 10 4 copy 10 0 Ct 值的偏差 扩增效率低下 No template Control 难以准确定量 选择特异性高的试剂很重要
引物设计的技巧 TFR 基因中设计引物 末端 4 个碱基互补末端 2 个碱基互补末端 1 个碱基互补
引物设计的技巧 M 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1:10 5 拷贝 2:10 4 拷贝 3:10 3 拷贝 4:10 2 拷贝 5:10 1 拷贝 6:0 拷贝 图 2 模板量与引物二聚体的关系 引物末端 1 个碱基互补 图 1 引物条件与引物二聚体的关系 M:100bp Ladder marker 1:2F-3R ( 无互补性 ) 2:1F-3R( 末端 1 个碱基互补 ) 3:1F-2R( 末端 2 个碱基互补 ) 4:1F-1R( 末端 4 个碱基互补 ) 5:1F-4R( 内部互补 ) 6:1F-5( 部分互补 + 末端 GC 含量高 ) 要注意引物对的 3 末端是否有互补的碱基 需对模板浓度低的区域进行探讨
SYBR Green I 分析 THUNDERBIRD 系列的特点 (2) 高效率 PCR 效率 10 0 稀释 A 公司试剂 85% 10-4 Ct 值延迟 << THUNDERBIRD SYBR qpcr Mix 93% 图 2 SYBR Green I Norovirus GI cdna detection (Roche LightCycler 1.1) PCR 效率的理想值 :100% 独特的反应组分, 显示出高效率
何谓 PCR 效率? 扩增效率 =10 (-1/Slope) -1 循环数 (Ct 值 ) 可定量扩增区域 Log ( 浓度 ) 扩增产物 2 倍 4 倍 8 倍. 增加是最理想的 1.0 比如, 标准曲线的斜率 (slope) 为 -3.322 时 E=10 (-1/-3.322) - 1 =10 0.301 1 =1.999 1 = 0.999 (99,9%) 这个值越接近 1 则 PCR 效率越高 ( 理想值 :1)
PCR 效率 可定量扩增区域的重要性 通过 ΔΔCt 法 ( 比较 Ct 法 ) 进行相对定量 脏器 目的片段基因的 Ct (X) 内控的 Ct (Y) ΔCt 值 (X-Y) ΔΔCt ( 各脏器的 ΔCt- 胰腺的 ΔCt) 代入到 2 -ΔΔCt 中 相对表达量 ( 相对比 ) 胰腺 31.23 23.72 7.51 7.51-7.51=0 2 0 =1.0 1.0 脑 27.43 22.7 4.73 4.73-7.51=-2.78 2 2.78 =6.9 6.9 心脏 26.55 24.55 2.00 2.00-7.51=-5.51 2 5.51 =45.6 45.6 肺 25.99 23.03 2.96 2.96-7.51=-4.55 2 4.55 =23.4 23.4
PCR 效率 可定量扩增区域的重要性 循环数 (Ct 值 ) 可定量扩增区域 可定量扩增区域 Log ( 浓度 ) 管家基因 目的基因 各引物的效率相等 在可定量扩增区域内测定 不同引物测定到的 PCR 效率不同 在可定量扩增区域外进行测定 循环数 (Ct 值 ) 循环数 (Ct 值 ) 可定量扩增区域 Log ( 浓度 ) 可定量扩增区域 Log ( 浓度 ) 模板量不同结果也不同 要想使引物效率相一致比较困难设计时应尽可能使引物扩增效率接近 1.0 产生了错误的定量结果 务必在可定量扩增区域内进行定量 选择各种引物都可以得到高效率扩增的高效试剂以及可定量扩增区域广的试剂是非常重要的
TaqMan Assay 中的效率比较 TaqMan Assay THUNDERBIRD Probe qpcr Mix 在 TaqMan Assay 中也可以进行高效率的 PCR 分析 B 公司 Master Mix 通过 TaqMan 检测体系对 GAPDH cdna 的定量 ( 使用 Roche LightCycler 1.1)
微表达量差异的检测 Sample:cDNA の 2 0.5 (=1.414) dilution from HeLa cell Total RNA (N=4) Target : GAPDH Reaction volume:20μl Cycler: Applied Biosystems 7900HT (normal block-type) Ct 24.5 24.0 23.5 23.0 22.5 22.0 21.5 21.0 slope: -3.2587 Correlation factor : 0.9956 可检测出 2 0.5 稀释的差异 20.5-1.00-0.90-0.80-0.70-0.60-0.50-0.40-0.30-0.20-0.10 0.00 Log (template concentration)
KOD SYBR qpcr Mix KOD SYBR qpcr Mix 可解决长链目的片段的扩增 (~2kb) 可解决难扩增序列的扩增 ( 高 GC 含量 二级结构 ) 粗样品的扩增 200 次份 (50μl 反应体系 ) KOD SYBR qpcr Mix (1.67ml x 3 支 ) 50x ROX reference dye (250μl) 40 次份 (50μl 反应体系 ) KOD SYBR qpcr Mix (1ml) 50x ROX reference dye (50μl)
KOD SYBR qpcr Mix 的特征 与以前使用 Taq DNA polymerase 的方法比较 使用的酶 扩增长度 以往的方法 Taq DNA polymerase 70~150bp (Max : 300bp) KOD SYBR qpcr Mix KOD DNA polymerase 70~2kb 高 GC 含量目的片段的扩增 不擅长 高 GC 含量目的片段也可扩增 抑制剂的影响 易受影响 ( 需要纯化 DNA) 不易受影响 ( 粗样品也可以扩增 )
KOD SYBR qpcr Mix 的特征 (1) 长链目的片段的扩增 可扩增长链目的片段 (~2kb) M 电泳检测 1 2 3 可扩增 2kb 的片段 以往用 Taq polymerase 的方法则不能扩增 10 4 10 0 个拷贝 2.0 kb 使用相同引物 1: KOD FX Neo 2: KOD FX 2: KOD Plus- Ver.2 KOD SYBR qpcr Mix 以往的 Realtime PCR 试剂 ( 使用 Taq) 引物的选择范围很广设计的用于 PCR 的引物可以直接用于 Realtime PCR
可扩增长链目的片段 Forward primer Reverse primer 目的基因 (~2kb) 特异性序列少的基因 特异性序列 共同序列 (~2kb) Variant 1 Variant 2 特异性序列少的突变体检测 引物的选择范围扩大, 目的基因内特异性序列少的以及 2kb 以内的目的片段均可扩增
IGF2R (GC 含量 :83% 模板 :cdna) KOD SYBR qpcr Mix 的特征 (2) 可扩增 GC 含量超过 70% 的高 GC 目的片段 KOD SYBR qpcr Mix A 公司 Realtime PCR 试剂 ( 针对 GC 含量 70% 以上的序列 ) 以往的 Realtime PCR 试剂 ( 使用 Taq) 5-1 稀释 5-5 稀释 5-1 稀释 5-5 稀释 5-1 稀释 引物二聚体 5-5 稀释 使用本公司高性能的逆转录试剂盒 ReverTra Ace qpcr RT kit (Code No. FSQ-101) 合成的 HeLa 细胞 total RNA 由来的 cdna 将 cdna 作 5 倍稀释 (5 个梯度 ) 进行反应 可用于高 GC 含量目的基因的检测
粗样品扩增的实验例 用 ASP(Allele specific primer)-pcr 进行 SNP 分析 ALDH2(dehydrogenase2 ): 一种酒精分解酶 血液 2μl 用 100μl 灭菌水稀释 20μl 反应体系中添加 2~5μl 用棉棒取样 口腔粘膜 用 200μl 灭菌水悬浮 20μl 反应体系中添加 2~5μl G-specific Primer C G A-specific Primer T A CGCCCGTCCCGCCG 能喝酒 Length of amplified DNA:57bp Tm value:80 Length of amplified DNA:45bp Tm value:73 不能喝酒 血液 A/A G/G 口腔粘膜 A/A G/G G/A G/A 可直接从粗样品扩增省去了凝胶电泳 能否喝酒很快就可以得到判断
两种荧光定量 PCR 试剂对应的仪器一览表 各种仪器均适用 对应的仪器适用 ROX ABI PRISM 7000 / 7700 Applied Biosystems Bio-Rad/MJ Applied Biosystems 7300 Applied Biosystems 7500 / 7500 Fast Applied Biosystems 7900HT Applied Biosystems StepOne / StepOnePlus TM MiniOpticon TM - CFX96 Touch TM - Roche Agilent Technologies LightCycler 1.x / 2.0 - LightCycler Nano - LightCycler 480 - Mx3000P / Mx3005P / Mx4000 TaKaRa Thermal Cycler Dice Real Time System - 适用 ROX 另外添加 1 ( 添加 1/50 的量 ) 0.1 ( 添加 1/500 的量 ) BioFlux LineGene -
总结 ~Realtime PCR 试剂 ~ 选择 Realtime PCR 试剂的时候, 不能仅仅看起峰的早晚和信号的强弱, 而更应看中 PCR 效率 特异性和可定量扩增区域的范围 想要进行高效的 Realtime PCR 不改变目前的使用条件, 得到更高效 更理想的结果! 在目前的试剂和条件下难以检测的目的片段也可以进行检测! THUNDERBIRD ( 雷鸟 ) 系列 KOD SYBR qpcr Mix TaqMan SYBR Green I SYBR Green I THUNDERBIRD Probe qpcr Mix THUNDERBIRD SYBR qpcr Mix KOD SYBR qpcr Mix 优良的特异性 ( 降低引物二聚体 ) 高 PCR 效率 ( 更广的可定量扩增区域 ) 高性价比 适用于难配序 ( 高 GC 二级结构 ) 可扩增长链目的片段 (~2kb) 适用于粗样品
讲座内容 第一部分使用 KOD 酶进行高效率 PCR! 教您高保真性扩增 粗样品 PCR 及 Multiplex PCR 相关的 PCR 酶的基础知识及 PCR 的技巧 第二部分 实践!Realtime PCR! 从 qpcr 试剂的选择到应用 第三部重要! 逆转录反应! 帮您进行高效率的逆转录反应更简便地进行去除 gdna 及从细胞开始的逆转录
TOYOBO 产品涉及的研究领域 DNA RNA Protein Animal Plant Cell PCR Cloning Detection qpcr RT Western blot ELISA Mutagenesis Genotyping IHC 高效率 Realtime PCR Master Mix THUNDERBIRD qpcr Mix 高保真 高效率 PCR 酶 KOD -Plusseries Taq Master Mix Quick Taq 高效率 Taq 聚合酶 Blend Taq 使用 KOD 的高效率 PCR Master Mix KOD SYBR Mix qpcr Realtime PCR 用高效率逆转录试剂盒 ReverTra Ace qpcr RT Kit 免疫反应增强剂 Can Get Signal 定点突变导入试剂盒 KOD -Plus- Mutagenesis kit 高效率 高成功率 PCR 酶 KOD FX series 免疫反应增强剂 Can Get Signal immunostain qpcr 用的细胞裂解和 cdna 合成试剂盒 SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qpcr
讲座内容 逆转录反应的陷阱 为了合成高品质的 cdna ~ 简单去除基因组 DNA 的方法 ~ 挑战细胞 RNA 的迅速分析 ~ 从培养细胞开始的高通量 qpcr 分析 ~ 总结
逆转录效率的比较 以 HeLa 細胞的 100ng 总 RNA 为模板 用各公司的试剂盒推荐的条件进行逆转录反应, 通过 Realtime PCR 对逆转录生成的 cdna 量进行定量 cdna 合成量 ( 定量値 ) 10 0 80 60 40 20 ReverTra Ace qpcr RT Kit β-actin Polymerase ε A 公司试剂 B 公司试剂 C 公司试剂 D 公司试剂 试剂不同,cDNA 的合成量有很大差异 使用 ReverTra Ace qpcr RT Kit 两个目的基因都以很高的灵敏度检测到
低表达量基因 TNF-α 检出率的比较 30.0 用各公司的试剂盒, 对来源于 HeLa 细胞的 Total RNA 100ng 进行逆转录后, 以其反应液为模板 ( 逆转录反应液量占 Realtime PCR 反应体系的 2%), 通过 SYBR Green I 分析法进行 Realtime PCR 分析 (n=5) 31.0 Ct 值 32.0 X: 未检出 33.0 34.0 ReverTra Ace qpcr RT Kit A 公司试剂 B 公司试剂 C 公司试剂 D 公司试剂 Ct 值平均 31.56 31.90 32.40 32.76 33.03 PCR 成功率 100% 40% 100% 60% 40% 低表达量基因无法被检测到时 扩大可定量扩增区域 为了提高 qpcr 的检测灵敏度及定量性, 逆转录反应也非常重要
使用 ReverTra Ace 的 qpcr 系列产品 ReverTra Ace qpcr RT Kit 高品质的 cdna New! ReverTra Ace qpcr RT Master Mix Master Mix 使用方法比以往更简单 New! New! 用预混试剂高效合成高品质的 cdna ReverTra Ace qpcr RT Master Mix with gdna remover 去除基因组 DNA 的功能 + 预混试剂 高效合成高品质的 cdna SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qpcr 可以从细胞直接进行 RT 反应 无需纯化 RNA
RT-PCR 中引物的设计方法 为降低基因组 DNA 的影响, 通常进行以下的设计 设计例 1: 横跨内含子进行引物设计 Genomic DNA Exon Intron 扩增片段过长则无法扩增 mrna 设计例 2: 外显子连接点进行引物设计 Genomic DNA Exon Intron 引物不能退火则无法扩增 mrna
RT-PCR 时引物设计的问题点 没有内含子的基因不能设计引物 碱基序列有偏差时用跨越法就不能很好地设计引物 内含子的长度短或者在跨越足够大的内含子的位置不能设计引物 含假基因的基因, 即使横跨内含子设计也会对基因组 DNA 进行扩增 与 β-actin 相似的假基因的扩增例 Genomic DNA 假基因 (Pseudogene) RT(+) cdna RT(-) mrna Genomic DNA 假基因 (Pseudogene)
RNA 中基因组 DNA 的影响 为将基因组 DNA 完全去除, 使用 DNaseⅠ 等将 gdna 分解是非常必要的 + - DNase I 处理 M + - + - RTase 反应 用 cdna 样品对 G3PDH 基因的 RT-PCR 分析结果 ( 使用 DNase I 未处理的 Total RNA) RNA 的 DNaseⅠ 处理非常烦杂 纯化则可能引起量的损失
带有基因组 DNA 去除功能的逆转录试剂 Master Mix for cdna synthesis & gdna DNA remover ReverTra Ace qpcr RT Master Mix with gdna remover (FSQ-301) RNA sample Digestion of genomic DNA (DNase I treatment) 4x DN Master Mix (with gdna Remover) 37ºC, 5min cdna synthesis gdna Remover (reverse transcription) 4x DN Master Mix 5x RT Master Mix II 5x RT Master Mix II no-rt Control 5x RT Master Mix II <Inhibit DNase activity> 37ºC, 15min 98ºC, 5min cdna(gdna-free) qpcr 64
用 gdna remover 去除基因组的实验例 No DNase I treatment before cdna synthesis ReverTra Ace qpcr RT Master Mix with gdna remover (FSQ-301) β-actin RT(+) RT(-) RT(+) RT(-) AMIGO3 RT(+) RT(+) (Low expressing gene) RT(-) RT(-) 用 ReverTra Ace qpcr RT Master Mix with gdna remover 试剂盒, 可以简单地去除 gdna, 进行准确定量
基因组 DNA 添加实验的性能比较 ReverTra Ace qpcr RT Kit with gdna remover A 公司产 ReverTra Ace qpcr RT Kit ( 原产品 ) 来源于基因组 DNA 的信号 cdna 合成 Template: HeLa total RNA (1pg-1ug) + 人 gdna 100ng /20ul 反应体系 反应 : 按各公司推荐的条件 qpcr 使用 QPS-201 cdna2ul/20ul 反应体系 ( 带入量 10%) Target:ACTB(188bp) 检测 : ABI 7900HT
从培养细胞入手用 qpcr 进行表达分析 < 以往的流程 > 大约 2 小时 操作步骤多, 非常繁琐 培养细胞 药物处理 分化诱导等. RNA 抽提 & DNaseI 处理 简便化 cdna 合成 Realtime PCR Realtime PCR 用的细胞裂解和 cdna 合成试剂盒 SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qpcr 只需裂解细胞而省去了 RNA 抽提步骤 可同时进行 DNase I 处理 经过最优化的 RT 反应 Master Mix
从培养细胞入手无需纯化 RNA 即可进行 qpcr 分析 Realtime PCR 用的细胞裂解和 cdna 合成试剂盒 ( 培养细胞用 ) SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qpcr <Lysis Reagents> <RT Reagents> 本产品 细胞裂解 RT 反应 RNA 纯化 1 细胞裂解简单制作可作为逆转录反应模板使用的 RNA 的细胞裂解液 同时进行基因组 DNA 的降解反应 2 逆转录反应添加细胞裂解液, 温育反应 20 分钟 0 30 60 90 120 所需时间 (min) 合成 cdna 所需时间 RNA 纯化的细胞裂解时间用抽提 RNA 操作的时间表示
SuperPrep 的使用方法 Lysis solution (DNase I) 用 PBS 洗涤 室温 5min. Cultured cell RNA Cell lysis / DNase I treatment Stop solution (RNase inhibitor) RT- Maste Mix RNA 室温 2min. 将裂解液与 RT Master Mix 混合 cdna Approx. 30~40 min 37 15min. 50 5min. 98 5min.
SuperPrep 试剂盒的特点 1 特点 1 无需 RNA 纯化 < 与纯化 RNA 的定量性比较 > < 与纯化 RNA 的相关性 > Ct 35 30 25 20 P urified R N A (C t) 30 25 20 15 R 2 = 0.9 8 3 15 0 2 4 6 Log(cell num ber) 10 10 15 20 25 30 TM SuperPrep Lysate(Ct) purified R NA Lysate 检测了 15 种管家基因的相关性 处理的细胞数相同时 可得到与纯化 RNA 相同或以上的灵敏度 多数基因都与纯化 RNA 有很高的相关性
SuperPrep 试剂盒的特点 2 特点 2 可由裂解液合成高品质的 cdna 有效抑制了 RNA 的降解, 所得到的裂解液中的 RNA 可在冰上放置 2 小时 cdna 合成前的 DNase I 处理可使混入的基因组 DNA 量很少, 可以合成高品质的 cdna RT 试剂是以 ReverTra Ace 为基础, 经过优化的 Master Mix, 可以简便 高效地合成 cdna 合成的 cdna 可长期保存
SuperPrep 试剂盒的特点 3 特点 3 可用于各种细胞 < 已确认的适合使用的细胞例 > 细胞名 贴壁 / 悬浮 来源 1 A431 贴壁 上皮样细胞癌 2 C 2 C 12 贴壁 肌细胞 3 Caco-2 贴壁 大肠癌 4 CHO-K1 贴壁 卵巢 5 COLO205 悬浮 大肠癌 6 DLD-1 贴壁 大肠癌 7 HCT-15 贴壁 大肠癌 8 HDF 贴壁 皮肤纤维芽细胞 9 HEK293 贴壁 胎儿肾 10 HeLa S3 贴壁 子宫颈癌 11 HepG2 贴壁 肝癌 12 HUVEC 贴壁 脐带静脉内皮细胞 细胞名贴壁 / 悬浮来源 13 Jurkat 悬浮白血病 T 细胞 14 K562 悬浮 成红细胞样白血病细胞 15 KUSA-A1 贴壁 成骨细胞样细胞系 16 L929 贴壁 结缔组织 17 MCF7 贴壁 乳腺癌 18 Neuro2a 贴壁 神经细胞瘤 19 NIH-3T3 贴壁 胎仔纤维芽细胞 20 PC12 贴壁 肾上腺褐色细胞瘤 21 rmsc 贴壁 骨髓间质细胞 22 THP-1 悬浮 单核细胞 23 U937 悬浮 单核细胞
细胞适合性评价例 :U937 细胞 ( 悬浮细胞 ) Ct 45 40 35 30 25 20 15 0 1 2 3 4 5 Log (Cell Number) 本产品纯化 RNA A 公司产品 用梯度稀释不同浓度的细胞 :1x10 4 1x10 3 1x10 2 1x10 1 检测 ACTB 基因的表达量 可以确认 :SuperPrep 可得到与纯化 RNA 良好的相关性结果
实验例 HeLa S3 中的表达分析 PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) Activate IL s Seed 2x10 4 HeLa S3 cells/well (96-well plate) 100nM PMA Incubate at 37C for 24hr) Lysate (8 μl) cdna Remove medium Wash with PBS(-) qpcr (β-actin, IL6, IL1β) Lysis Solution (50 μl) incubate for 5 min Stop Solution (10 μl) incubate for 2 min RT Master Mix (32 μl) incubate for 25 min 100 nm PMA 0 nm PMA
实验例 HeLa S3 中的表达分析 < 结果 > 使用 THUNDERBIRD Probe qpcr Mix < 本公司试剂 > <A 公司试剂 > n=12 n=12 IL6 IL6 β-actin β-actin IL1B IL1B PMA + - + + - - PMA + - + + - - 可以确认 : PMA 的添加引起了 Ct 值的变化 因为操作简便, 可用于药物的高通量筛选
总结 1. 逆转录反应对提高 qpcr 的灵敏度及定量性非常重要 选择效率高的的逆转录酶是 RT 反应的关键 2. 合成无 gdna 污染的高品质 cdna 对于获得更广的可定量扩增区域是非常重要的 使用 ReverTra Ace qpcr RT Master Mix with gdna remover 可以简单地去除基因组 DNA 3. 新开发的能迅速对细胞 RNA 进行分析的试剂是 SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qpcr, 它无需纯化 RNA 就可进行定量 NEW