实时定量PCR的全套解决方案

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适贺
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1 RT-PCR Kit- rtth DNA polymerase RT-PCR high Plus- 逆转录一次成功 (Code No.:PCR-301) 使用说明书研究用 TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN

2 目录 [1] 前言... 1 [2] 本试剂盒的特点... 1 [3] 本试剂盒的组成 (50 次份 )... 2 [4] 本试剂盒不包含的内容... 3 [5] 操作程序... 4 [6] 添附引物的使用实例... 5 [7] 使用 RNA 时的一般注意事项... 6 [8] 进行 RT-PCR 时的一般注意事项... 6 [9] 疑难解答... 7 注意本试剂盒包含的试剂均为研究用试剂, 请不要当作诊断和临床试剂在本试剂盒的使用过程中, 请务必严格遵守实验室的各项注意事项, 注意安全本产品的销售遵循与 F.Hoffmann-La Roche Ltd., Roche Molecular Systems Inc. 和 The Perkin-Elmer Corporation 之间签定的许可协议

3 [1] 前言 RT-PCR 法是将 RNA 逆转录成 cdna 并进行 PCR 扩增的技术, 能以较高的敏感度迅速分析 RNA RT-PCR 的反应方法有 :1 将逆转录和 PCR 分成两个阶段进行 2 使用具有逆转录酶活性的耐热性 DNA 多聚酶, 将逆转录反应和 PCR 一次完成这些方法的特征有 :1 进行逆转录反应时, 一般使用 M-MLV RTase(RNase H - ) 或 AMV RTase, 可以进行高效的逆转录反应 PCR 反应循环少, 适用于 cdna 克隆等另外, 使用 M-MLV RTase(RNase H - ) 的时候, 尤其是使用 oligo(dt) 引物的时候, 具有比较容易得到全长 cdna 的优点 2 通过 rtth DNA 多聚酶具有的逆转录酶活性合成 cdna, 继而进行 PCR 逆转录反应后, 可以直接进行 PCR, 所以不必中途添加试剂, 省去反复打开和关闭反应管盖的麻烦本品是利用 rtth DNA 多聚酶的逆转录酶活性, 一次性完成反应的 RT-PCR 试剂盒, 包含反应必须的所有的酶缓冲液等内容 [2] 本试剂盒的特点本制品具有以下特点 :( 参照图 1) 1 反应过程中无需打开盖子, 操作简便, 可以一次性处理多个检测样品 2 样品之间的交叉感染和纵向感染的危险性比较低, 可以避免假阳性 3 改良了酶的品质, 实现了优良的检测敏感度 4 由于添附了不含有 RNase 的水和 RNase 抑制剂, 任何人都能够迅速一次性完成 RT-PCR 5 作为阳性对照, 添附了人源 G 3 PDH ( Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase) 基因的转录 RNA 和特异序列的引物同时使用本 RNA 和引物进行实验, 可以确认 RT-PCR 的反应是否得以正常进行 6 另外,G 3 PDH 基因是管家 (housekeeping) 基因, 广泛存在于所有组织中因此, 使用试剂盒中添附的序列特异引物进行 RT-PCR 时, 可以确认从组织和细胞中抽提的 RNA( 总 RNA 及 mrna 等 ) 的品质是否良好这种特异引物除了可用于人源 G 3 PDH 以外, 还适用于 Mouse Rat Swine 等多种 RNA 1

4 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司图 1 2 步完成的 RT-PCR 和 1 次完成的 RT-PCR [3] 本试剂盒的组成 (50 次份 ) RNase Free H2O 1100μl 2 支 5 Reaction Buffer 1000μl 1 支 2.5mM dntps 300μl 1 支 25mM Mn(OAc)2 500μl 1 支 Primer F (10pmoles/μl) 50μl 1 支 Primer R (10pmoles/μl) 50μl 1 支 10U/μl RNase Inhibitor 100μl 1 支 2.5U/μl rtth DNA polymerase 100μl 1 支 Positive Control RNA ( copies/μl) (Human G3PDH RNA 的转录 poly(a) + RNA)50μl 1 支 [ 阳性对照 RNA] 本试剂盒包含阳性对照用 RNA 和特异引物对通过使用这些物质可以确认 RT-PCR 反应是否正常进行阳性对照用 RNA 是人源 G 3 PDH(Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase) 基因的转录产物垂询电话 :

5 [ 关于添附引物 ] G 3 PDH 基因是在各种哺乳类的组织中表达的管家 (housekeeping) 基因, 其 mrna 的表达水平不受所含有的部分细胞因子和 Phorbol Ester 等诱导物质的影响而保持恒定因此, 使用从组织抽提的 Total RNA 和 mrna 进行实验的时候, 如果用添附的特异引物 (Primer R,Primer F) 进行 RT-PCR 反应, 可以准确了解抽提 RNA 的质量, 同时还可以知道抽提 RNA 的量另外,Primer R 是模板 RNA 的反向引物,Primer F 是模板的正向引物, 可以得到 0.45Kb 的 PCR 产物 ( 参照图 2) 这些引物除了适用于人源 G 3 PDH 基因之外, 还适用于来源于 Mouse Rat Swine 等的 G3PDH 基因 [ 添附引物的序列 ] Primer R 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' Primer F 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' (20mers) (20mers) 图 2 阳性对照 RNA 和添附引物的结合位点 [4] 本试剂盒不包含的内容进行实验时, 除了本产品以外还需要以下物品 : 1. 仪器热循环仪 3

6 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司凝胶电泳装置微型离心机 2. 耗材和器材反应管微型移液枪微型移液枪用 tip 头 ( 请使用湿热灭菌过的新 tip 头 ) 3. 试剂矿物油 *( 特级轻质液体石蜡 ) 电泳用凝胶电泳用缓冲液 *) 使用无需矿物油类型的热循环仪时无需加入 [5] 操作程序标准操作程序如下 : 1. 在反应管中制备以下反应液使用阳性对照 RNA 使用其他阳性对照 RNA RNase Free H2O 19(μl) A(μl) 5 Reaction Buffer mM dntps mM Mn(OAc)2 5 5 Anti-Sense 引物 (Primer R) 2 b Sense 引物 (Primer F) 2 c 10U/μl RNase Inihibitor U/μl rtth DNA polymerase 2 2 RNA ( 阳性对照 RNA) 2 d 50(μl) 50(μl) (a+b+c+d=25μl) 垂询电话 :

7 2. 加入矿物油 50μl ( 使用无需矿物油类型的热循环仪时无需加入 ) 3. 设置热循环仪, 按照以下程序进行反应 60,30 分钟 94,2 分钟 94, 1 分钟 *60, 1.5 分钟 (40 个循环 ) *60,7 分钟 [ 注意 ] * 的温度低于引物的 Tm 温度 5 较为适合试剂盒添附的引物 F,R 温度在 60 时较为适合 (Tm=melting temperature) 4. 取样品进行凝胶电泳 [6] 添附引物的使用实例从人胎盘中抽提 total RNA, 使用 G 3 PDH 特异引物进行一次性 RT-PCR 反应和阳性对照 RNA 一样, 能得到目标 0.45Kb 的扩增片断, 说明 RNA 抽提成功另外, 还可以根据需要确认是否混入了基因组 DNA 图 3 添附引物的使用实例 5

8 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司以添附的阳性对照 RNA(10 6 copies) 为对照, 进行 total RNA(1µg) 的 RT-PCR 反应结果, 任何一个样品都得到了 0.45Kb 目标的扩增片断 [7] 使用 RNA 时的一般注意事项 1 防止 RNase 的混入和作用非常重要在 RT-PCR 法中防止 RNase 的作用非常重要因此, 有必要除去使用器具和试剂里的 RNase, 提高 RNA 样品的纯度另外, 在注意实验环境的同时, 建议使用手套 2 器具使用之前的处理反应管是塑料材质的一次性器具, 建议使用高温湿热灭菌过的反应管另外, 根据需要还应进行氯仿处理使用玻璃器具时, 要进行干热灭菌 (180, 60 分钟以上 ), 或用 0.1% 的 Diethylpyrocarbonate (DEPC) 液浸泡 12 小时 (37 ) 之后, 进行高温湿热灭菌 ( 分钟 ) 挥发掉 DEPC 后, 再使用 [8] 进行 RT-PCR 时的一般注意事项 1 关于模板 RNA 的纯度本产品的模板虽然不论总 RNA mrna rrna 和 trna 都可采用, 但无论在何种条件下, 为了提高得到目标片断扩增的效率, 建议使用纯度较高的 RNA 2 关于 PCR 的循环次数模板 RNA 数量较少时, 有时可以通过增加 PCR 循环的数目, 来增强目标片断扩增的效果, 但是由于容易产生非特异性扩增, 故 20~50 次较为合适 3 关于特异引物新设计特异引物时, 建议考虑 PCR 时的条件 ( 退火温度等 ) 另外, 也要注意引物的方向性等垂询电话 :

9 [9] 疑难解答 1RT-PCR 后, 在电泳中检验不出 DNA 链原因确认对策模板 RNA 纯度较差用控制对照进行确认再次制备模板 RNA 模板数量不足用控制对照进行确认提高模板 RNA 的浓度引物 Tm 值和 PCR 条件不调整退火温度, 一般比 Tm 低 5 较为合适匹配序列不合适确认特异序列确认 GC 含量是 40~60% 之间确认引物序列中没有互补的序列确认成对的引物之间的 3 末端上没有互补的序列确认成对的引物没有与同一片断序列结合确认引物的 3 末端上没有发生引物 / 模板的错配浓度偏低一次反应使用 10pmoles 以上 PCR 条件逆转录时间或 PCR 的延伸时间较短本文中的操作程序适用于 100~1,000bases 的目标扩增对更长的目标进行扩增时, 要延长逆转录反应时间和 PCR 的延伸反应时间其他被 RNase 污染用对照 RNA 进行确认再次制备模板 RNA 保存状态不好, 酶失去活性使用对照 RNA 进行确认 2 杂带较多引物原因对于模板不是特异序列 Tm 值和 PCR 条件不匹配 Tm 值偏低确认对策重新设计引物调整退火温度, 一般比 Tm 低 5 较为合适使用 Tm 值较高的引物比使用一般引物更易获得特异性较高的扩增结果 7

11 [ 制造销售商 ] 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司上海市浦东新区张杨路 188 号汤臣商务中心 C 座 310 室邮编 : 交货期限订货相关咨询 Tel: Fax: sales@bio-toyobo.cn 产品内容技术相关咨询 Tel: Fax: tech@bio-toyobo.cn 代理商资料 :

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实时定量PCR的全套解决方案 11-05 高效率逆转录试剂盒 First Strand cdna Synthesis Kit ReverTra Ace -α- (Code No. FSK-100,FSK-101) 使用说明书科研用 TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN 目录 1 简介...1 2 RT-PCR 法的原理...2 3 试剂盒的组成...3 4 操作步骤...5