第 2 章 按用途分类的产品流程图 想克隆 DNA 片段 高保真的扩增 DNA 模板入手 基因组 DNA 抽提试剂盒 (6-4 页 ) MagExtractor -Genome- MagExtractor -Plant Genome- 高保真性 PCR 酶 (2-12 页 ) KOD -Plus-

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1 第 2 章 INDEX 第 2 章目录 2-1 第 2 章按用途分类的产品流程图 2-2 PCR 及 PCR 周边技术 2-4 cdna 的合成 2-10 常见问题 2-11 PCR KOD -Plus- Neo 2-12 KOD -Plus- / KOD -Plus- Ver KOD FX Neo 2-16 KOD FX 2-18 KOD DNA Polymerase 2-20 Blend Taq / Blend Taq -Plus KOD Dash 2-22 Quick Taq HS DyeMix 2-23 InsertCheck -Ready- / InsertCheck -Ready- Blue 2-25 rtaq DNA Polymerase 2-26 rtth DNA Polymerase 2-27 RT-PCR ReverTra -Plus ReverTra Dash 2-29 RT-PCR Quick Master Mix 2-30 逆转录 ReverTra Ace -α ReverTra Ace 2-34 相关试剂 RNase Inhibitor 2-36 anti-taq high 2-37 核苷酸 2-38 PCR RT-PCR 用缓冲液

2 第 2 章 按用途分类的产品流程图 想克隆 DNA 片段 高保真的扩增 DNA 模板入手 基因组 DNA 抽提试剂盒 (6-4 页 ) MagExtractor -Genome- MagExtractor -Plant Genome- 高保真性 PCR 酶 (2-12 页 ) KOD -Plus- Neo KOD -Plus- Ver.2 KOD -Plus- KOD DNA Polymerase 保真性 : 约为 Taq 酶的 50~80 倍 cdna 的合成 高效率逆转录酶 (2-34 页 ) ReverTra Ace 高效率 cdna 合成试剂盒 (2-32 页 ) ReverTra Ace -α- 高成功率的扩增 ( 什么都能扩 ) 高成功率 PCR 酶 (2-16 页 ) KOD FX Neo KOD FX 保真性 : 约 Taq 酶的 11 倍 PCR 产物的纯化 DNA 片段纯化试剂盒 (6-14 页 ) MagExtractor -PCR & Gel Clean up- 平滑末端克隆 脱磷酸化酶 (3-17 页 ) BAP CIAP 磷酸化酶 (3-19 页 ) T4 Polynucleotide Kinase Protocol 请参照 3-4 页相关介绍 使用 KOD Dash 以外的 KOD 系列酶扩增 DNA 片段, 请注意 PCR 产物的末端已被平滑化 TA 克隆 高效率 TA 克隆试剂盒 (KOD 系列专用 ) (3-8 页 ) TArget Clone -Plus- 使用 KOD Dash 以外的 KOD 系列酶扩增 DNA 片段, 请注意 PCR 产物的末端已被平滑化, 不可以直接进行 TA 克隆 高效率 PCR 菌落直接 PCR 高效率 PCR 酶 (2-21 页 ) Blend Taq / Blend Taq -Plus- KOD Dash InsertCheck -Ready- 保真性 : 约 Taq 酶的 3 倍 Quick Taq HS DyeMix TA 克隆 高效率 TA 克隆试剂盒 (3-8 页 ) TArget Clone 2-2

3 想要对粗样品进行基因分型 粗样品的 PCR 高成功率 PCR 酶 (2-16 页 ) KOD FX Neo KOD FX 想要进行逆转录反应 (cdna 合成 ) RNA 入手 Total RNA 抽提试剂盒 (6-8 页 ) MagExtractor -RNA- cdna 合成试剂盒 高效率 cdna 合成试剂盒 (2-32 页 ) ReverTra Ace -α- 逆转录反应用试剂 高效率逆转录酶 (2-34 页 ) ReverTra Ace 相关试剂 (2-38 页 ) dntps RT-PCR 试剂盒 高效率 RT-PCR 试剂盒 (2-28 页 ) ReverTra -Plus- 高保真 ReverTra Dash 高效率 RT-PCR Quick Master Mix 简便 2-3

4 1 PCR 及 PCR 周边技术 1. 可用于 PCR 的 DNA 聚合酶 (1) 可用于 PCR 的 DNA 聚合酶可用于 PCR 的 DNA 聚合酶大体可分为两种 一种是以 Taq DNA polymerase( 以下称 Taq) 为代表的从嗜热菌中分离出来的聚合酶, 归为 family A(PolⅠ 型 ) 另一种是以 KOD DNA polymerase( 以下称 KOD) 为代表的从超嗜热 Archaea 中分离出来的聚合酶, 归为 family B(α 型 ) 这些分类是以组成聚合酶碱基序列的相似性为基础的, 从严格意义上来讲, 并不能反映各酶的特性 但是, 单从可用于 PCR 的聚合酶这一着眼点来看的话, 这样的分类是很有用的, 如果记住了这样的分类方法, 有助于实验中酶的选择 (2) 关于 Exonuclease 活性 表 1 α 型 PCR 酶的特性 Family B(α 型 ):KOD Pfu etc. 来源 : Archaea 3 5 Exonuclease 活性 ( 校正活性 ) 5 3 Exonuclease 活性 TdT 活性 图 1 PCR 酶的分类 表 2 PolⅠ 型 PCR 酶的特性 Family A(PolⅠ 型 ):Taq, Tth etc. 来源 : Bacteria 3 5 Exonuclease 活性 ( 校正活性 ) 5 3 Exonuclease 活性 TdT 活性 α 型与 PolⅠ 型 PCR 酶最大的差异在于 Exonuclease 活性 ( 以下称 Exo 活性 ) 的有无 该活性是从 DNA 一端开始逐一分解碱基的活性, 有从 3' 端开始分解的活性, 和从 5' 端开始分解的活性 DNA 从 5' 端开始向 3' 端合成的情况下,DNA 聚合酶偶尔会出现碱基读取错误 此时,KOD Pfu DNA polymerase( 以下称 Pfu) 等 DNA 聚合酶会反方向从 3' 端开始将读取错误的碱基消除 ( 图 2) 该活性被称为 3' 5'Exo 活性 ( 校正活性 ) 具有该活性的 DNA 聚合酶在 DNA 合成时的保真性要远远高于不具有该活性的酶 这就是该活性被称为校正活性 (Proofreading activity) 的缘由 因此,KOD 系列 (KOD Dash 除外 ) 可用于基因克隆等对保真性要求很高的实验 另一方面,Taq Tth DNA polymerase( 以下称 Tth) 等由于不具有校正活性, 不能修复读取错误的碱基, 因此保真性不高 但这类酶具有从 DNA 的 5' 端分解的 5' 3'Exo 活性 该活性在生物体内, 主要是消除后随链 (lagging strand) 的合成起点的 RNA 片段 该活性被应用于 TaqMan Assay ( 图 3) 具有 3' 5' Exonuclease 活性 ( 校正活性 ) 的 DNA 聚合酶 (KOD DNA polymerase etc.) Polymerase 活性 具有 5' 3' Exonuclease 活性 ( 校正活性 ) 的 DNA 聚合酶 (Taq/Tth DNA polymerase etc.) F: 荧光物质 Q:Quencher TaqMan Probe Hybridization Polymerase 活性 3' 5' Exonuclease 活性 ( 校正活性 ) 去除错配的碱基 荧光 3' 5' Exonuclease 活性 图 2 聚合酶活性与校正活性 图 3 TaqMan Assay 的原理 (3) 关于 TdT 活性 TdT(Terminal deoxynucleotidyl transferase) 活性是指在 DNA 的 3' 末端附加多余碱基的活性 实际上, 在通过具有 TdT 活性的 Taq 等 PCR 酶扩增的 DNA 片段的 3' 末端, 被附加一个腺嘌呤碱基的情况很常见 TA 克隆法就是以该特性为着眼点开发的 另一方面, 用 KOD 等 PCR 酶扩增的 DNA 片段末端已被平滑化 从前述的表中可以看到,KOD Pfu 的 TdT 活性表示为 (-), 严格来说, 这样的表示并不准确, 应该是 即便追加碱基 A, 也会被校正活性去除 不管如何表述, 其含义是由于用 KOD( 除 KOD Dash 外 ) Pfu 等扩增的产物 DNA 片段末端已被平滑化 TA 克隆的效率非常低 因此, 我公司开发了在 KOD 的扩增产物末端附加新的 A 以后, 可进行 TA 克隆的专用试剂盒 TArget Clone -Plus- 此外, 根据碱基的添加侧与另一侧引物的 5' 末端的碱基种类的不同, 各酶的 TdT 活性有所差异 我们通过实验进行了调查 采用 5' 末端分别为 G,A,T,C 的 Reverse Primer 与生物素化的 Forward Primer 进行 PCR, 结果如图 4 所示 ( 具体来讲, 就是将 PCR 扩增产物在变性条件下用测序胶进行电泳, 转录到尼龙膜上后, 用生物素检测系统进行检测后得到的结果 ) 结果可见,TdT 活性的强弱顺序为 Taq = Tth > KOD Dash>> KOD = Pfu, 另外它们对 Reverse Primer 的 5' 末端添加碱基的优先顺序为 A G > C > T Polymerase Reverse primer 的 5' 序列 图 4 各酶的 Terminal Transferase 活性 2-4

5 (4) 各聚合酶的特性 KOD 和 Pfu 虽然同被归为 α 型聚合酶类, 还是有所差异 比如,Elongation rate( 合成速度 ) 方面 Pfu 是 1 秒钟约 20 碱基, 而 KOD 则是约 130 碱基 从总体而言, 该类聚合酶被认为合成速度较慢, 但 KOD 是例外, 它的合成速度很快, 非常利于进行 PCR 表 3 Elongation rate 的比较 Elongation rate(bases/sec.) 约 130 约 20 α 型 PCR 酶的特征是具有 3' 5'Exo 活性 ( 校正活性 ), 而该活性却是造成 PCR 效率低下的主要原因 因此, 为了提高 KOD ( 高合成速度 ) 的 PCR 效率, 我们制备了使校正活性失活的变异酶 KOD Exo(-) 通过这样的改变, 降低了保真性, 但成功地提高了 PCR 效率 该酶被用于 KOD Dash 另外,Tth 是同时具有以 RNA 为模板 合成 DNA 的活性 ( 逆转录活性 ) 的独特的酶 利用该活性, 可在同一体系中完成 RT-PCR 本公司提供两种利用 Tth 的该活性开发的 RT-PCR 用试剂 RNA-direct Realtime PCR Master Mix 系列 ( 1-8 页 ) RT-PCR Quick Master Mix( 2-30 页 ) (5) 混合型酶 (Barnes 等方法的解说 ) 我们知道, 在不具备校正活性的 PCR 酶中, 混入微量的 α 型 PCR 酶, 能提高 PCR 效率 Barnes W.M. PNAS 91:2216(1994) 利用该原理开发的, 有 Blend Taq( 2-21 页 ) 和 KOD Dash( 2-22 页 ) Blend Taq 是在 Taq 中混合了微量的 α 型 PCR 酶, 而 KOD Dash 则是在前述的 KOD Exo(-) 中混 合了具有校正活性的 KOD 由于混合型酶的 PolⅠ 型或者 Exo(-)α 型酶效率比较高, 可用于菌落直接 PCR 等各种用读取错误途 此外,KOD Dash 由于 PCR 的延伸时间可设定为 30sec./kb, 因此可用于高速 PCR 但停止反应由于其保真性只有 Taq 的 3~4 倍, 因此不适用于对保真性有要求的基因克隆等实验 由 α 型酶开始修复 α 型酶重新插入正确的碱基 由 PolⅠ 型酶重新开始反应 继续反应 图 5 使用混合型酶进行高效率 PCR 酶的原理 2.PCR 性能的改良技术 (1) 热启动技术从 PCR 反应液配制到热循环仪温度上升之间,PCR 反应液在室温至 50 的温度中被加热 由于引物的 Tm 值多被设定为 50 以上, 在该温度区域, 引物的特异性可被充分地发挥出来 而另一方面, 在该温度区域, 由于聚合酶显示其微弱的活性, 在错配的引物基础上进行反应, 会产生各种各样的副反应, 如杂带 引物二聚体等 为避免该副反应, 开发了使用聚合酶中和抗体的热启动技术 通过预先在聚合酶中混合中和抗体, 在室温至 60 的温度区域, 可以抑制聚合酶活性 ( 有时为 Exo 活性 ) 抗体在 PCR 的最初变性步骤即发生失活, 不会影响到扩增反应 本公司的 Blend Taq -Plus-( 2-21 页 ) KOD -Plus-/KOD-Plus- Ver.2 ( 2-14 页 ) KOD FX Neo( 2-16 页 ) KOD FX( 2-18 页 ) RT-PCR Quick Master Mix( 2-30 页 ) 及 Realtime PCR 试剂 ( 1-5 页 ) 都使用了该技术 抗 Taq 单克隆抗体 [anti-taq high( 2-37 页 )] 与 rtaq DNA Polymerase ( 2-26 页 ) 混合即可进行廉价的热启动 PCR 中和抗体 KOD DNA Polymerase ( 活性被抑制 ) 加热 聚合酶活性中心 核酸酶活性中心 失活 活性化 图 6 HotStart 法原理 ( 例 :KOD -Plus-) KOD -Plus- KOD -Plus- Ver.2 及 KOD FX Neo KOD FX 含两种抗体 2-5

6 (2) 通过改良 Buffer 等提高 PCR 性能如前面 1.(4) 所述, 具有 3' 5'Exo 活性 ( 校正活性 ) 的 PCR 酶一般 PCR 效率比较低, 因此, 经常会通过热启动 改良酶的组成 改善反应条件等来提高其性能 KOD -Plus- Ver.2 KOD FX KOD -Plus- Neo KOD FX Neo 等都是在 KOD -Plus- 的基础上, 应用了改良后的 buffer, 从而相比 KOD -Plus-,PCR 效率有了大幅的提高 KOD -Plus- Ver.2 和 KOD -Plus- Neo 保持了保真性而 PCR 成功率更高, 而 KOD FX KOD FX Neo 的保真性是 Taq 的约 11 倍, 虽然相比 KOD -Plus- 系列较低, 但却具有无可匹敌的 PCR 成功率及综合性能 (3) 通过延伸增强剂提高 PCR 性能 KOD DNA polymerase 具有强力的 3' 5' 核酸外切酶活性 ( 校正活性 ), 可准确地对目的片段进行扩增, 作为克隆用 PCR 酶获得了广泛的好评 然而, 高保真性 PCR 酶在 循环以后, 容易出现扩增无法持续的 < 停滞现象 > KOD -Plus- Neo 在高保真性 PCR 酶 :KOD -Plus- 系列技术的基础上, 应用了本公司新开发的 延伸增 KOD -Plus- Neo 强剂, 保持了 KOD -Plus- 系列高保真性 ( 约为 Taq 的 80 倍 ) 的同时, 通过抑制 < 停滞现象 >, 明显提高延伸增强剂了对微量模板 DNA 长目的片段的扩增效率 的效果以往的 PCR 酶 扩增量 停滞现象 40 图 7 延伸增强剂的效果 3. 可用于粗样品的 PCR( 基因分型 ) KOD FX 是在具有各种优良特性的 PCR 酶 KOD DNA polymerase 基础上开发的高性能 PCR 试剂 该酶显示了出色的 扩增成功率 扩增效率 和 延伸性, 可对各种长度的目的片段进行 PCR 经典的 KOD -Plus- 系列是以 KOD DNA polymerase 的高保真性为着眼点开发的, 而 KOD FX 系列则是着重于 扩增成功率 扩增效率 和 延伸性 开发的 ( 图 8) 特别是其优良的 扩增成功率, 已达到了迄今为止其他 PCR 酶所不能及的高度, 具有划时代的意义 以粗样品为模板进行 PCR, 即便将粗样品如全血 培养细胞等直接添加到 PCR 反应液中, 也可得到充分的扩增 也就是说, 使用 KOD FX, 无需烦杂的 DNA 纯化步骤, 只需对样品进行简单的前处理, 即可进行 PCR 实验 KOD FX Neo 是在 KOD FX 的基础上, 结合新开发的 KOD -Plus- Neo 的 延伸增强剂 等技术, 抑制 < 停滞现象 >, 使长链目的片段 难配序目的片段 粗样品的扩增效率更高 KOD FX KOD FX Neo 粗样品的 PCR 扩增!! 难配序的目的片段的扩增!! 重视扩增成功率 扩增效率 延伸性 KOD DNA polymerase 重视保真性 ( 约为 Taq 的 80 倍 ) KOD -Plus- 系列 高保真性 PCR( 克隆用 ) 图 8 用 KOD DNA polymerase 的试剂 2-6

7 到目前为止我们已收集了许多粗样品的扩增例 ( 如表 4) 样品直接扩增是 KOD FX 系列独有的特征, 能直接扩增其他 PCR 酶所不能扩增的霉菌 酵母等具有细胞壁的生物样品 同时, 用 KOD FX 系列还能高效率地扩增通过简单的前处理 ( 图 9 10) 配制的各种裂解液, 可主要用于基因分型 除表 4 所列举的样品外,KOD FX Neo 能扩增的还有 : 添加果酱的样品 添加腐殖酸的样品 用堆肥进行亚基因组分析及老鼠指甲等 详见我司中文网站 : 表 4 可用 KOD FX KOD FX Neo 扩增的样品样品种类样品来源小鼠尾巴植物 ( 稻叶 米粒 烟草叶 番茄叶等 ) 裂解液扩增人发根果蝇翅膀人血液大鼠滤纸血培养细胞霉菌直接扩增酵母真菌 ( 隐球菌等 ) 精液 鼻涕 眼泪 汗液植物浮游生物 ( 隐藻 ) 杂质较多的 DNA 粪便纯化得到的 DNA 碱裂解法 Mouse tail ( 约 3mm) 置入离心管 1 2 一步法 叶 (3mm 小块 ) 精米 (1 粒 ) 置入离心管 1 2 添加 50 mm NaOH 180μl Vortex 充分振荡 3 添加 Buffer A Vortex 充分振荡 Buffer A: 100mM Tris-HCl(pH9.5) 1M KCl 10mM EDTA min. 添加 1M Tris-HCl(pH8.0) 20μl Vortex 充分振荡离心 (12,000 rpm, 10 min.) min. Vortex 充分振荡 4 取 0.5~2μl 上清进行 PCR 反应 (Mouse tail 不会也无需完全溶解 ) 接触热碱性溶液时, 请务必十分小心!! 图 9 Mouse tail 的前处理方法 5 取 1μl 上清进行 PCR 反应 ( 植物组织不会也无需完全溶解 ) 左 : 叶右 : 精米 参考文献 BioTechniques, 19: 394 (1995) 图 10 植物样品的前处理方法 5 KOD FX A 公司高效率 PCR 酶 B 公司 Long PCR 酶 M M Taq based PCR 酶 KOD FX A 公司高效率 PCR 酶 B 公司 Long PCR 酶 M M kb 1.5 kb 1.3 kb M: 1kb DNA Ladder 1: Tg / Tg 2: Tg / W 3: W / W M: 1kb DNA Ladder 1: 番茄叶 2: 烟草叶 3: 稻叶 4: 精米 5: 经纯化的水稻基因组 DNA 其他公司酶按其推荐条件 其他公司酶按其推荐条件 图 11 小鼠尾巴裂解液的 PCR 结果 图 12 各种植物样品裂解液直接 PCR 2-7

8 末端延伸时模板扩增成功率可扩增链长)扩增效率产量)伸性启4.PCR 用聚合酶的基本性质比较 各 PCR 用聚合酶的基本性质如下表 选择 PCR 酶时请参考 表 5 PCR 用聚合酶的基本性质比较 起源 KOD Thermococcus kodakaraensis KOD1 KOD Exo( ) Thermococcus kodakaraensis KOD1(Mutant) Taq Thermus aquaticus Tth Thermus Thermophilus HB8 各温度下活性半衰期 12hr.(95 ) 3hr.(100 ) 12hr.(95 ) 3hr.(100 ) 1.6hr.(95 ) ND dsdna 5' 3'Exonuclease 活性 dsdna 3' 5'Exonuclease 活性 TdT 活性 RT 活性 (Mn 2+ 存在下 ) Elongation rate*(bases/sec.) Processivity(bases) 约 130 >300 约 130 约 60 约 60 >300 ND ND 用途 相关产品 高保真性 PCR KOD DNA Polymerase KOD -Plus- KOD -Plus- Ver.2 KOD -Plus- Neo KOD FX KOD FX Neo KOD Dash Mix 系列保真性高效率 PCR 普通 PCR Realtime PCR KOD Dash rtaq DNA Polymerase Realtime PCR Master Mix 系列 RT-PCR Realtime PCR Tth/rTth DNA Polymerase RNA-direct Realtime PCR Master ND:Not determined * Elongation rate 是指过量的酶存在的情况下每秒钟合成速度的指标 PCR 的最佳延伸时间根据添加酶量的不同而变化 KOD -Plus- 由于采用了 3' 5' Exonuclease 活性较高的酶, 为了提高 PCR 效率而添加的酶量较低 (1U/50μl reaction), 因此延伸时间应设定为比 KOD Dash 长些 表 6 PCR 用聚合酶在 PCR 实验中的特性比较 (延(高G C 含量P C R 产物间(/Kb) 热5.PCR 用聚合酶选择的指标 各酶的 PCR 特性表示如下 根据用途的不同对 PCR 酶性能的要求也各有差异, 因此根据各酶的特性和商品的价格 来选择所需要的酶非常重要 下表所列出的仅为高性能 PCR 酶, 根据实际需要也可选择 Taq Tth 等通用型酶 另外, 把 Taq 和抗 Taq 单克隆抗体 anti-taq high (2-37 页 ) 混合使用, 可进行较便宜的热启动 PCR (Taq 的约 80 倍 ) (Taq 的约 80 倍 ) 平滑末端 平滑末端 因 PCR 不能顺利地进行而烦恼? < 适用于广泛的 PCR 实验 > 动想进行高保真性的 PCR (Taq 的约 11 倍 ) 平滑末端 ( ) (Taq 的约 11 倍 ) 平滑末端 (Taq 的约 80 倍 ) 平滑末端 (Taq 的约 50 倍 ) 平滑末端 (Taq 的约 3 倍 ) 带 A 末端 想高效率地进行通用 PCR (Taq 的约 3 倍 ) 带 A 末端 (Taq 的约 3 倍 ) 带 A 末端 保真性是利用 rpsl 基因方法测定值计算的结果 [H. MO et al., J.Mol.Biol. 222: (1991)] 2-8

9 菌落直接PCR操作流程6.PCR 周边技术 (1) 菌落直接 PCR 进行基因克隆实验时, 需要频繁地进行插入确认, 而每次对质粒进行抽提再确认插入非常麻烦 因此, 最近以菌落 使用接种针 直接作为模板样品, 使用在载体两端设计的引物进行 PCR, 确认插入有无的方法正在被越来越多的实验者接受 ( 参照右边流程图 ) 适合该方法的 PCR 酶为, 高效率且延伸时间较短的 KOD Dash( 2-22 页 ) 或高效率且 PCR 价格实惠 保种 置入 PCR 溶液 的 Blend Taq( 2-21 页 ) 价格便宜且能简便地进行 PCR 的 Quicker Taq HS DyeMix( 2-23 页 ) 等 使用该些酶进行菌落直接 P C R 的实验步骤如下所示 另外以 K O D 请勿带入过量菌体 < 菌体为肉眼看不见即可 > PCR 溶液 Dash 为基础开发的 InsertCheck -Ready-( 2-25 页 ) 是为菌落直接 PCR 专用而开发的的预混合试剂, 可简便地进行菌落直接 PCR 此外, 平滑末端克隆或 TA 克隆时, 被克隆的 DNA 片段以两个方向插入的概率很高, 如图 13 所示, 因此有必要进行方向性的确认 将引物设计为一条在载体上, 一条在插入 PCR 反应 Vortex Spin down 用 MagExtractor -PCR & Gel Clean up- (Code No.NPK-601, 6-14 页 ) 纯化 片段上, 则可简单地确认插入方向 ( 图 14) 以一部分为模板确认序列 Protocol#1: 菌落直接 PCR 灭菌水 10 Buffer 2mM dntps Forward primer(10pmole/μl) Reverse primer(10pmole/μl) Blend Taq 1 份样品份样品 21.9(μl) (μl) 每 30μl 分装 灭菌水 10 KOD Dash Buffer 2mM dntps Forward primer(10pmole/μl) Reverse primer(10pmole/μl) KOD Dash 1 份样品份样品 23(μl) (μl) 每 30μl 分装 图 13 通过 PCR 进行方向性的确认 将引物设计为一条在载体上, 一条在插入片段上进行 PCR 可通过 a 或 b 的组合得到的扩增图形确认方向性 Quick Taq HS DyeMix 1 份样品份样品 灭菌水 Quick Taq HS DyeMix Forward primer(10pmole/μl) Reverse primer(10pmole/μl) 13.8(μl) (μl) 每 30μl 分装 68 图 14 菌落直接 PCR 法例 将 0.5kb 的 PCR 产物进行 TA 克隆后, 如图 13 所示与各种引物组合进行菌落直接 PCR R1 为设计在载体上的反向引物 (2)PCR 产物的测序一般情况下, 常用纯化后的质粒 DNA 进行测序, 但也可以用纯化后的 PCR 产物直接进行测序 此时, 在做 PCR 时所使用的引物可直接作为测序引物 即便是使用保真性较差的酶扩增得到的 PCR 产物, 其变异也会被平均导入, 将该 PCR 产物直接测序没有任何问题 因此, 用上述的菌落直接 PCR 法的纯化产物也可进行测序 纯化步骤推荐使用 MagExtractor -PCR&Gel Clean up-(code No.NPK-601, 6-14 页 ) 该试剂盒即便对于已混合了染料的反应液也可高效率地纯化 PCR 产物 2-9

10 2 cdna 的合成 1.RT-PCR 实验中的逆转录反应 (1) 逆转录酶科研用逆转录酶一般有 病毒来源的逆转录酶 与 微生物来源的具有逆转录活性的 DNA 聚合酶 两种 病毒来源的逆转录酶一般使用来自 M-MLV(Moloney Murine Leukemia Virus) 或 AMV(Avian Myeloblastosis Virus) 等的逆转录病毒 其中,M-MLV 来源的逆转录酶由于合成能力较高而被频繁使用 本公司通过向 M-MLV 基因的两个位点导入突变, 开发出了合成能力更高的 ReverTra Ace 该酶被用于以下介绍的两种 cdna 合成试剂盒中 另一方面, 微生物来源具有逆转录活性的 DNA 聚合酶, 例如 Tth DNA polymerase( 以下称 Tth), 在 Mn 离子存在条件下具有将 RNA 模板合成 DNA 的能力 因此, 使用该酶可在同一离心管完成 RT-PCR 而且该酶的最适温度在 60 左右, 因此可在高温下进行逆转录反应, 对容易形成高级结构的 RNA 的逆转录非常有效, 但不适用于长片段 cdna 的合成 (2)RT-PCR 过程中的注意点 Total RNA mrna rrna 及 trna 都可作为逆转录反应的模板 逆转录时要注意, 尽量不要使用含基因组 DNA 的 RNA 如图 15 所示, 基因组 DNA 通过 splicing 转录成成熟型的 mrna, 含有基因组 DNA 的序列, 而不小心混入的基因组 DNA 也同样会被扩增 因此, 一般实验中都会将分离后的 RNA 进行 DNaseⅠ 处理 同时, 在 Exon 连接点上设计引物, 或者跨 Exon 设计引物会比较有效 从理论上讲, 用前一种方法基因组 DNA 不会被扩增, 而用后一种方法会产生不同大小的产物 此外, 逆转录用的引物也十分重要 使用病毒来源的 ReverTra Ace 等逆转录酶时, 主要可以使用如图 16 所示的三种引物, 例如, 在 5' 末端附近设计 PCR 引物时, 使用 Oligo dt primer 或 Random primer 的灵敏度不同 而且, 混入部分 mrna 被分解的 RNA 时, 该灵敏度的差异更明显 考虑到该情况, 现在实验中也经常会使用 Oligo dt 与 Random 混合的引物 Mix 使用预混的两种引物, 可在各种条件下得到稳定的结果 ReverTra Ace qrt PCR Kit ( 1-9 页 ) 中使用的即是该种引物 Mix 使用 Tth 等进行的 1-step RT-PCR 中, 用的是 Specific 引物 一般情况下, 为 PCR 用设计的 Reverse primer 可直接作为逆转录引物使用 通常, 在 1-step RT-PCR 中不能使用 Oligo dt 和 Random primer Splicing 图 15 RT-PCR 引物的设计 图 16 逆转录引物 (3)cDNA 合成用试剂盒 本公司生产和销售 ReverTra Ace -α-( 2-32 页 ) 和 ReverTra Ace qpcr RT Kit( 1-9 页 ) 两种 cdna 合成试剂盒, 其 各自的用途如表 7 所示 表 7 cdna 合成试剂盒的特征 品名试剂盒组成备注 ReverTra Ace -α- ReverTra Ace qpcr RT Kit 逆转录酶 5 RT buffer dntps Oligo dt primer Random primer Positive control 其他 Enzyme Mix 5 RT buffer Primer Mix Nuclease-free Water 适用于基因克隆用 cdna 合成等各种用途的标准试剂盒 Realtime PCR 用 cdna 合成用试剂盒 将酶与 RNase inhibitor dntp buffer 等预混在一起, 使得操作非常简便 2-10

11 3 常见问题 1.PCR RT-PCR 实验中的注意点 (1)PCR 条件市面上有各种各样的 PCR 酶销售 根据实验目的选择合适的酶, 按照各酶的最适条件进行实验, 往往能得到更好的结果 尤其是退火温度 延伸时间以及酶的浓度对实验结果有很大的影响, 请务必仔细注意 表 8 PCR 最适条件 最适条件 / 产品名 Taq / Tth Blend Taq KOD KOD Dash Mg 2+ 浓度 dntp 引物长度退火温度延伸时间 1.5mM 0.2mM 20~22mer Tm-5~10 1min./kb 2mM ( 含在 buffer 中 ) 0.2mM ( 长片段 0.3mM) 20~22mer Tm-5~10 1min./kb 1 1.2mM 0.2mM 22~24mer Tm-5~10 30sec./kb 1.2mM ( 含在 buffer 中 ) 0.2mM 22~24mer Tm~Tm-5 30sec./kb 酶浓度 1.25~2.5U/50μl 1.25U/50μl 1.25~2.5U/50μl 1.25~2.5U/50μl 最适条件 / 产品名 KOD -Plus- KOD -Plus- Ver.2 KOD -Plus- Neo KOD FX KOD FX Neo Mg 2+ 浓度 1mM 1.5mM 1.5mM 2mM ( 含在 buffer 中 ) 2mM ( 含在 buffer 中 ) dntp 0.2mM 0.2mM 0.2mM 0.4mM 0.4mM 引物长度 22~24mer 22~24mer 22~ 22~35mer 22~35mer 退火温度 Tm-5~10 Tm-5~10 Tm Tm-5~10 Tm 延伸时间 1min./kb 1min./kb 30sec./kb 1min./kb 30sec./kb ( 粗样品 1min./kb) 酶浓度 1U/50μl ( 不超过 1U) 1U/50μl ( 不超过 1U) 1U/50μl ( 不超过 1U) 1U/50μl ( 不超过 1U) 1U/50μl ( 不超过 1U) (2) 引物条件 对 10kb 以上的目的片段进行 PCR 时, 我们已通过 KOD FX 的实验证明, 引物的纯化级别高, 则可得到良好的扩增 因此, 进行 Long PCR 时, 推荐使用 Cartridge 纯化级别以上的引物, 而非脱盐纯化级别 (3) 难扩增目的片段的扩增对高 GC 含量的目的片段进行扩增时, 在反应液中按 1~5%(V/V) 加入 DMSO( 二甲基亚砜 ) 则可改善扩增结果 用 KOD -Plus- 确认 DMSO 对保真性的影响, 可知添加至 5% 的时候没有观察到保真性低下 在本公司 PCR 酶中,KOD FX KOD FX Neo 最适用于高 GC 含量等难扩增的目的片段 (4) 关于 RNA 带入的问题进行 RT-PCR 反应时, 有时会将逆转录反应液直接添加到 PCR 反应溶液中, 但如果反应液带入过量, 则会造成 PCR 效率低下, 请务必注意 其主要原因是,cDNA 溶液中所含的大量 RNA 会与 Mg 离子结合 我们在开发 KOD -Plus- Ver.2 KOD FX KOD FX Neo 等酶时, 为缓和这种现象做了很多努力, 但我们仍建议带入到 PCR 中的逆转录反应液的量在 1/25 以下, 最好在 1/50 以下, 以便于得到稳定的扩增结果 此外, 植物样品等基因组 DNA 中, 由于抽提方法不同, 有可能会混入大量的 RNA 此时, 可通过核糖核酸酶处理 减少基因组 DNA 的添加量等, 得到良好的结果 图 17 表示在 PCR 反应液中故意添加 RNA 时, 对 PCR 的抑制结果 添加 RNA 的影响, 用 KOD -Plus- Ver.2 可得到一定程度的缓和, 但在高浓度 RNA 存在的情况下, 仍会抑制扩增, 而用 KOD FX KOD FX Neo 则通过组分的优化, 受 RNA 的影响较小 图 17 混入 RNA 对 PCR 反应的影响 Human myosin h.c. (5.2kb) Lane M: 1kb DNA Ladder Marker 1: 人基因组 DNA 0ng+HeLa Total RNA 0ng 2: 人基因组 DNA 0ng+HeLa Total RNA 50ng 3: 人基因组 DNA 50ng+HeLa Total RNA 0ng 4: 人基因组 DNA 50ng+HeLa Total RNA 50ng 5: 人基因组 DNA 50ng+HeLa Total RNA 100ng 6: 人基因组 DNA 50ng+HeLa Total RNA 150ng 7: 人基因组 DNA 50ng+HeLa Total RNA 200ng 8: 人基因组 DNA 50ng+HeLa Total RNA 250ng 反应液 50μl. 2-11

12 PCR RT-PCR 逆转录相关试剂 PCR KOD -Plus- Neo Code KOD-401S 20U 1 <20 > 150 Code KOD U 1 <200 > 1,000 Code KOD-401B(200U 1 ) 5<1,000 > 4,60 50μl KOD -Plus- Neo 在高保真性 PCR 酶 KOD -Plus- 系列技术的基础上, 应用了本公司新开发的 延伸增强剂, 保持了 KOD -Plus- 系列高保真性 ( 约为 Taq DNA polymerase 的 80 倍 ) 的同时, 通过抑制 < 停滞现象 >, 明显提高了对微量模板 DNA 长目的片段的扩增效率 KOD -Plus- Neo(1U/μl) 200μl 1 10 PCR Buffer for KOD -Plus- Neo 1ml 1 25mM MgSO4 1ml 1 2mM dntp 1ml 1 50μl mM Tris-HCl(pH8.0) 25mM KCl 0.1mM EDTA 1mM DTT 0.05% Tween DNA % Nonidet P-40 KOD -Plus- Neo 50% Glycerol Taq 80 KOD -Plus- Neo KOD -Plus- Ver.2 KOD -Plus- KOD FX Pfu DNA Polymerase A Long PCR Taq DNA Polymerase nmoles 1U E.coli -20 Mutation frequency PCR <30sec./kb>( ) 1) M.Takagi et al., Appl.Environ. 1min./kb 30sec./kb Microbiol., 63: (1997) 2) H.Hashimoto et al., J.Biochem. 循环条件 KOD -Plus- Ver.2 KOD -Plus- Neo (Tokyo), 125: (1999) 94, 2min. 3) H.Mizuguchi et al., J.Biochem. M M , 10sec. (Tokyo), 126: (1999) 68, X 30 cycles 4) M.Nishioka et al., J.Biotechnol. 延伸时间 X: 88: (2001) 1:18sec.(5sec./kb) 3.6 kb 5) H.Hashimoto et al., J.Mol.Biol., 2:36sec.(10sec./kb) 3:54sec.(15sec./kb) 306: (2001) 4:108sec.(30sec./kb) 6) T.Imanaka et al., J.Chin.Inst., Sample:Genomic DNA(50ng) 5:216sec.(60sec./kb) Chem.Engrs., 32: Target:Human β -globin(3.6kb) M:1kb DNA Ladder (2001) 24.0kb DNA 20mer (Tm 63 ) 2 ( ) * Tm (Nearest Neighbor method) <> Primer 20mer 2 Step Down ( 22mer ) Tm > 63 3 Tm 63 Tm 2-12 TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

13 相关试剂逆转录 RT-PCR PCR : PCR Xμl 10 PCR Buffer for KOD -Plus- Neo 5μl KOD DNA polymerase 3' 5' ( ) 2mM dntps 5μl 25mM MgSO4 3μl PCR PCR 10pmol/μl Primer F 1.5μl 20~30 < > KOD -Plus- Neo 10pmol/μl Primer R 1.5μl PCR KOD -Plus- KOD -Plus- Neo(1.0U/μl) 1μl KOD -Plus- ( Taq 80 ) < > Genomic DNA ~200ng Plasmid DNA ~50ng DNA cdna ~200ng(RNA ) Total 50μl 0 10 Cycle(1) <2 Step Cycle> * 94 2min sec sec./kb Cycle(2) <3 Step Cycle> 94 2min sec. Tm 30sec sec./kb 25~45 cycles 25~45 cycles 1.Total RNA ORF Cycle(3) HeLa Total RNA cdna(total RNA 50ng ) <Step Down Cycle> * 94 2min. ORF(open reading frame) PCR 98 10sec. 30 KOD -Plus- Neo 5 cycles 74 30sec./kb 98 10sec. 5 cycles KOD -Plus- Neo 72 30sec./kb A B KOD -Plus- Neo 的循环条件 M M M , 2min sec. 5 cycles 98, 10sec sec./kb 30 cycles 68, 30sec./kb 98 10sec. 15~30 cycles 68 30sec./kb M : 1kb DNA Ladder 68 7min. 30sec./ kb 1min./ kb 30sec./ kb 20 Cycle Number KOD -Plus- Neo PCR : Human brk Tyrosine kinase 1.6kb 2 : Human rac protein kinase-alpha 1.7kb 3 : Human 63kDa protein kinase 2.0kb 4 : Human c-syn protooncogene 2.2kb 5 : Human FER Tyrosine kinase 2.7kb 6 : Human cell adhesion kinase beta 3.2kb 7 : Human Jak2 kinase 3.6kb Tm 63 1 F : ATGGTGTCCCGGGACCAGGCT R : GACCTCTGCTGGCTTCGTGTCAC 3 F : ACTTGACAGAATGAGGTGCGCG R : ATCCTTCACGTGTTCTGCCAAC 5 F : AGACTTCACTGCACGTTTTCTC R : TGGAGGACAGAGTCCTGAAGGC 7 F : GCCCGATCTGTGTAGCCGGTTT R : ATCTTTGCTGGCTAGCATCATG 2 F : TGTCAGCTGGTGCATCAGAG R : GCGTGGCTTCTCTCAAATGCAC 4 F : GTAGAGGCGAGGTTGTTGTGCG R : CAGAGGAGGTTCGGATTTGGGG 6 F : ACTGCAATGTGCCGATCTTAGC R : TGCAAAGTGGCAAGGGAAGGT 2. DNA 50ng β-globin PCR 30 KOD -Plus- Neo 17.5kb 17.5kb KOD -Plus- Neo KOD -Plus- Neo KOD -Plus- Ver.2 A 公司高保真性酶 B 公司高保真性酶 M 延伸时间 30sec./ kb 1min./ kb 1min./ kb 30sec./ kb KOD -Plus- Neo 的循环条件 1~4: 94, 2min. 98, 10sec , 30sec./kb cycles 1: Human β-globin 1.3kb 2: Human β-globin 2.7kb 3: Human β-globin 3.6kb 4: Human β-globin 8.5kb 5: Human β-globin 17.5kb M: 1kb DNA Ladder 5:Step down 循环 94, 2min. 98, 10sec. 74, 30sec./kb 98, 10sec. 72, 30sec./kb 98, 10sec. 70, 30sec./kb 98, 10sec. 68, 30sec./kb 68, 7min. 5 cycles 5 cycles 5 cycles 20 cycles KOD TA (KOD Dash ) TArget Clone -Plus DNA MagExtractor -PCR & Gel Clean up TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

14 PCR RT-PCR 逆转录相关试剂 NO.1( Taq 80 ) PCR KOD -Plus-/KOD -Plus- Ver.2 KOD -Plus- Code KOD-201 Code KOD-201B 本产品是以 KOD DNA polymerase( 2-20 页 ) 为基础开发的高保真性 PCR 用酶 在本 公司的 PCR 酶中保真性最高 ( 与 KOD -Plus- Neo 同等水平 ) ( ) 25mM MgSO4 2mM dntps*** 1ml 1 1ml 1 KOD DNA polymerase KOD -Plus- * KOD 1.6μg/μl Taq DNA Polymerase 80 DNA PCR Buffer Buffer ( 2-38 ) KOD PCR *** PCR 3' 5' PCR dntps KOD DNA polymerase 50mM Tris-HCl(pH8.0) 0.1mM EDTA 1mM DTT 0.001% Tween 20 Taq DNA Polymerase 0.001% Nonidet P-40 GC 50% Glycerol PCR [KOD -Plus- Ver.2] KOD -Plus- cdna RNA PCR PCR KOD -Plus- Ver.2 200U 1 <200 > 80 Code KOD U 1 <200 > 1,00 (200U 1 ) 5<1,000 > 3,700 Code KOD-211B (200U 1 ) 5<1,000 > 4,600 50μl <KOD -Plus-> KOD -Plus-(1U/μl)* 10 PCR Buffer** 25mM MgSO4 2mM dntps*** <KOD -Plus- Ver.2> KOD -Plus-(1U/μl)* 10 PCR Buffer** 200μl 1 1ml 1 1ml 1 1ml 1 200μl 1 1ml 1 **KOD -Plus- KOD -Plus- Ver nmoles 1U E.coli -20 (KOD DNA polymerase 2-20 ) PCR KOD -Plus- Ver.2 PCR 1) J.Mo et al., J.Mol.Biol., 222: (1991) 2) M.Takagi et al., Appl.Environ. ( 2-5 ) Microbiol., 63: (1997) 3) H.Hashimoto et al., J.Biochem. (Tokyo), 125: (1999) 4) H.Mizuguchi et al., J.Biochem. PCR (Tokyo), 126: (1999) PCR 5) H.Hashimoto et al., J.Mol.Biol., 306: (2001) PCR 5' 6) M.Watanabe et al., J.Biochem. ( 3-3 ) (Tokyo), 131: (2002) PCR TA 7) H.Terasaki et al., Intl.J.Mol.Med., TA TA TArget Clone -Plus- ( 3-8 ) 9: (2002) PCR 50μl 1U 10 PCR Buffer 681kb 1min. KOD DNA polymerase( 2-20 ) smear MgSO 4 MgSO Buffer TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

15 相关试剂逆转录 RT-PCR PCR GC DMSO 2~5% PCR RT <KOD -Plus-> 10 PCR Buffer* 5μl 25mM MgSO4 2μl(1mM) RT PCR RT PCR PCR 1/25 1/50 2mM dntps 15pmoles each 5μl(0.2mM) 1~50ng(Plasmid) RT Mg 2+ dntps PCR 10~200ng(Genomic DNA) dntps MgSO 4 3' KOD -Plus-(1U/μl) Total Volume ~1μl( ) 1μl(1U) 50μl : *KOD -Plus- Buffer( 2-38 ) 1. PCR ( KOD -Plus-) Cycle(1) 100 PCR KOD 94 -Plus- 2min. 90 Taq DNA Polymerase sec. 80 Tm-5 30sec min./kb KOD -Plus KOD -Plus- A High Fidelity B High Fidelity A C High Fidelity B High Fidelity B Blend Taq -Plus- D Long PCR Cycle(2) 94 2min sec. 68 1min./kb 25~35 cycles 25~35 cycles 0 Tm 72 Cycle(1) Smear Cycle(2) 2. PCR PCR Smear Human β-globin 0.6~3.6kb KOD -Plus- PCR <KOD -Plus- Ver.2> High Fidelity KOD -Plus- 10 PCR Buffer* 5μl KOD -Plus- High Fidelity 延伸时间 25mM MgSO4 3μl(1.5mM) KOD -Plus-:1min/kb 其他公司高保真性 PCR 酶 :30sec/kb 两种酶对所有目的片段都用了同样的循环条件进行 PCR 2mM dntps 15pmoles each 5μl(0.2mM) 1~50ng(Plasmid) 10~200ng(Genome DNA) ~2μl( ) Target KOD -Plus-(1U/μl) 1μl(1U) 1:human β-globin 0.6 kb 2: 1.3 kb Total Volume 50μl 3: 2.8 kb 4: 3.6 kb *KOD -Plus- Ver.2 Buffer( 2-38 ) Cycle(1) 3. cdna PCR PCR 94 2min. HeLa total RNA cdna 4 PCR KOD -Plus- Ver sec. 6.8kb Tm-5 30sec. 25~40 cycles A 68 1min./kb KOD -Plus- Ver.2 KOD -Plus- PCR M Cycle(2) Template:HeLa 细胞来源 cdna 94 2min. 1 : human transferrin receptor cdna 3.5kb 98 10sec. 2 : human tuberous scleosis cdna 5.3kb 68 1min./kb 25~40 cycles 3 : human adaptin cdna 5.7kb 4 : human polymerase ε cdna 6.8kb M :1kb ladder Tm 72 Cycle(1) Smear Cycle(2) Smear KOD TA (KOD Dash ) TArget Clone -Plus- TAK KOD -Plus- RT-PCR ReverTra -Plus- PCR , DNA MagExtractor -PCR & Gel Clean up- NPK , PCR Buffer 10 PCR Buffer - 1ml TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

16 PCR RT-PCR 逆转录相关试剂 PCR PCR KOD FX Neo UP DNA 40kb 30sec./kb ( 1min./kb) GC 在 KOD FX( 2-18 页 ) 的基础上, 结 合新开发的 KOD -Plus- Neo( 2-12 页 ) 的 延伸增强剂 等技术, 抑制 < 停 滞现象 >, 使长链目的片段 难配序目 的片段 粗样品的扩增效率更高 UP PCR KOD FX PCR E.coli PCR ( 试用装 )Code KFX-201S20U 1 <20 > 20 Code KFX U 1 <200 > 2,400 Code KFX-201B(200U 1 ) 5<1,000 > 11,04 50μl KOD FX DNA Polymerase(1U/μl) 200μl 1 10 PCR Buffer* 1.7ml 3 2mM dntps 1ml 2 * 2.0ml Mg 2+ 请注意节约使用 10 PCR Buffer 50mM Tris-HCl(pH8.0) 25mM KCl 0.1mM EDTA 1mM DTT 0.05% Tween % Nonidet P-40 50% Glycerol 10nmoles 1U -20 1) M.Takagi et al., Appl.Environ. KOD DNA polymerase KOD Microbiol., 63: (1997) FX PCR 2) H.Hashimoto et al., J.Biochem. (Tokyo), 125: (1999) 3) H.Mizuguchi et al., J.Biochem. PCR 20~30 < > (Tokyo), 126: (1999) PCR KOD FX Neo KOD FX KOD 4) M.Nishioka et al., J.Biotechnol. -Plus- Neo < > 88: (2001) 5) H.Hashimoto et al., J.Mol.Biol., 306: (2001) 6) T.Imanaka et al., J.Chin.Inst., Chem.Engrs., 32: (2001) 2-16 TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

17 相关试剂逆转录 RT-PCR PCR 1. DNA 40kb : 2 PCR Buffer for KOD FX Neo 25μl 2mM dntps 10μl(0.4mM) 15pmoles each KOD FX KOD FX A 1~50ng(Plasmid) Neo Long PCR 10~200ng(Genomic DNA) M M M M : / Hind Marker ~200ng(cDNA) 1: Human tpa 24kb ~5μl( ) 2: Human -globin 32kb 3: Human -globin 40kb KOD FX Neo(1U/μl) 1μl(1U) Total Volume 50μl 30 sec./kb 60 sec./kb 30 sec./kb 25~45 cycles sec./kb DNA KOD FX Neo 10 KOD FX KOD FX Neo M 1 2 M 1 2 Template: DNA 200ng/ l 2 Step Cycle* 94 2min sec. 3 Step Cycle* 94 2min sec. (Tm) 30sec sec./kb 25~45 cycles Step Down Cycle* 8.5 kb 1 : 0.1 ng / 50 μl 2 : 0.01 ng / 50μl 94 2min sec. 5 cycles Template: DNA 74 30sec./kb 98 10sec. Target: Human β-globin 5 cycles 72 30sec./kb 30 sec./kb 60 sec./kb 98 10sec. 5 cycles 70 30sec./kb 3. Mouse tail lysate 98 10sec. 15~30 cycles sec./kb 68 7min. KOD FX KOD FX Neo KOD FX Neo * Tm 68 KOD FX KOD FX Neo A PCR 1 M: 1kb DNA Ladder A PCR 2 M Sample: 0.5 μl M:100 bp DNA Ladder, 1 kb DNA Ladder 1 :Mouse TATA box binding protein (TBP) 0.5 kb 2 :Mouse transferrin receptor (Tfr) 1.5 kb 3 :Mouse membrane glycoprotein (Thy-1) 2.6 kb KOD TA (KOD Dash ) TArget Clone -Plus- TAK DNA MagExtractor -PCR & Gel Clean up- NPK , PCR Buffer 10 PCR Buffer for KOD FX Neo KFX-2B 1.7ml TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

18 PCR RT-PCR 逆转录相关试剂 PCR High Performance DNA polymerase KOD FX Code KFX-101T 50U 1 <50 > 300 Code KFX U 1 <200 > 1,200 Code KFX-101B(200U 1 ) 5<1,000 > 5,55 50μl 在 KOD DNA polymerase( 2-20 KOD FX DNA Polymerase(1U/μl) 页 ) 基础上开发的高性能 PCR 试剂 200μl 1 本酶具有出色的 扩增成功率 扩 10 PCR Buffer* 1.7ml 3 2mM dntps 1ml 2 增效率 和 延伸性, 可对各种长 * 2.0mM Mg 2+ 度的目的片段进行 PCR 请注意节约使用 10 PCR Buffer 50mM Tris-HCl(pH8.0) 0.1mM EDTA 1mM DTT 0.001% Tween % Nonidet P-40 50% Glycerol GC / 10nmoles 1U λdna 40kb 24kb cdna 13.5kb E.coli PCR KOD PCR -20 3' 5' PCR 1) M.Takagi et al., Appl.Environ. Microbiol., 63: (1997) 2) H.Hashimoto et al., J.Biochem. PCR (Tokyo), 125: (1999) 3) H.Mizuguchi et al., J.Biochem. (Tokyo), 126: (1999) 4) H.Hashimoto et al., J.Mol.Biol., KOD FX PCR PCR KOD FX PCR ( ) ( Taq DNA polymerase 11 ) KOD FX KOD 6) H.Terasaki et al., Intl.J.Mol.Med., -Plus- KOD -Plus- Ver.2 KOD -Plus- Neo DNA KOD -Plus- KOD FX Pfu DNA polymerase D Long PCR Taq DNA polymerase PCR : (2001) 5) M.Watanabe et al., J.Biochem. (Tokyo), 131: (2002) 9: (2002) 1) K.Wakahara et al., Mol Cancer Res 6: (2008) 2) N.Yamada et al., Mol Vis.,15: (2009) Mutation Frequency 10-5 KOD -Plus- Ver.2 KOD -Plus- Neo KOD -Plus- ( 2-5 ) 10kb Cartridge 27mer 3' 2-18 TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

19 相关试剂逆转录 RT-PCR PCR PCR PCR : PCR 5' 2 PCR Buffer for KOD FX 25μl ( 3-3 ) 2mM dntps 10μl(0.4mM) PCR TA 15pmoles each TA TA TArget Clone -Plus- ( 3-8 1~50ng(Plasmid) 10~200ng(Genomic DNA) ) ~200ng RNA (cdna) ~2μl( ) < μl> 1. Mouse tail lysate ( ) Mouse tail lysate 0.5μl PCR KOD FX(1U/μl) Total Volume 1μl(1U) 50μl Mouse membrane glycoprotein(thy-1) gene(m10246) 2 Step Cycle* min. KOD FX 98 10sec. 25~40 cycles Proteinase K 68 1min./kb KOD FX A Taq based PCR enzymes B 3 Step Cycle* 94 2min sec. (Tm-5) 30sec. 68 1min./kb 25~40 cycles 2.6 kb Step Down Cycle* 94 2min sec. 74 1min./kb 5 cycles lysate 10sec. 5 cycles 72 1min./kb ( ) 1μl 98 10sec. PCR rbcl 30 5 cycles 70 1min./kb KOD FX 98 10sec. 15~25 cycles KOD FX 68 1min./kb 68 7min. Taq based PCR enzymes * Tm 73 A B KOD FX PCR PCR < > M M ) Mouse tail( 3mm) M : 1kb Ladder Marker 2) 50mM NaOH 180μl 1 : 2 : 3) Vortex 1.3 kb 3 : 4) 95 10min 4 : 5 : DNA 5) 1M Tris-HCl(pH8.0) 20μl 6) Vortex 7) (12,000rpm,10min) 3. DNA 8) 0.5~2μl PCR KOD FX DNA 0.1ng~100ng (Mouse tail ) DNA Human β-globin 2.8kb 50μl 15pmoles < > KOD FX 1U 2 step cycle 30 cycles 1) (3mm ) (1 ) PCR KOD FX A 2) Buffer A* KOD FX KOD -Plus- PCR B Ver.2 Taq based Taq DNA pol. 3) Vortex M M M M M M M 4) 95 10min 5) Vortex M 1kb DNA Ladder 1 0.1ng 2 1ng 3 10ng 4 100ng 6) (12,000rpm,10min) 7) 1μl PCR ( ) human DNA 0.1ng 100ng/50 l -globin 2.8kb PCR 94 2min sec. 68 3min. 30 cycles *Buffer A: 100mM Tris-HCl(pH9.5) 1M KCl 10mM EDTA KOD TA (KOD Dash ) TArget Clone -Plus- TAK DNA MagExtractor -PCR & Gel Clean up- NPK , PCR Buffer 10 PCR Buffer for KOD FX KFX-1B 1.7ml TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

20 PCR RT-PCR 逆转录相关试剂 KOD PCR Taq 50 Taq 2 PCR KOD DNA Polymerase 本酶是从日本鹿儿岛县小宝岛的含硫气孔中分离出来的超嗜热原始菌 Thermococcus kodakaraensis KOD1 株的 DNA 多聚酶 具有强力 3' 5' 核酸外切酶活性 ( 校正活性 ), 保真性高于 Taq DNA 多聚酶约 50 倍 Code KOD U 1 <100~200 > 450 Code KOD-101B (250U 1 ) 5<500~1,000 > 2,070 50μl KOD DNA Polymerase(2.5U/μl) 1 10 Buffer #1 1ml 1 10 Buffer #2 1ml 1 25mM MgCl2 1ml 1 2mM dntps* 1ml 1 KOD DNA Polymerase 3' 5' Taq DNA * PCR PCR 50 PCR dntps DNA KOD DNA Polymerase 2 Taq DNA 6 Pfu DNA 50mM Tris-HCl(pH8.0) PCR 0.1mM EDTA 50mM KCl 1mM DTT Taq DNA % Tween 20 GC 0.1% Nonidet P-40 50% Glycerol PCR DNA PCR KOD FX PCR KOD -Plus- 2.5U/ (1kb/30sec.) <#2> KOD -Plus- KOD FX PCR 1.2M Tris-HCl(pH8.8) 100mM KCl 1U/ Taq 1kb/1min. 60mM (NH4)2SO4 1% Triton X μg/ml BSA PCR PCR PCR 5' 10nmoles PCR 1U 1kb 30sec. E.coli GC 96 3' 5' Taq DNA Tm 2 PCR 3' #1 4kb #1 #2 PCR PCR KOD Dash( 2-22 ) 10 Buffer <#1> 1.2M Tris-HCl(pH8.0) 100mM KCl 60mM (NH4)2SO4 1% Triton X μg/ml BSA -20 PCR KOD -Plus-/KOD -Plus- Ver PCR KOD FX TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

21 相关试剂逆转录 RT-PCR PCR NO.1 Taq Taq DNA polymerase Blend Taq/Blend Taq -Plus- Blend Taq Blend Taq -Plus- (Hot Start) Code BTQ U 1 <200 > 300 Code BTQ U 1 <200 > 500 Code BTQ-101B (250U 1 ) 5<1,000 > 1,380 Code BTQ-201B (250U 1 ) 5<1,000 > 2,300 50μl < > 本酶是在 Barnes 法 ( 2-5 页 ) 的基础上开发的高性能 Taq DNA polymerase 通过将 rtaq DNA Polymerase 与具有校正活性的 DNA polymerase 按照最合适的比例进行混合, 扩增效率与延伸性等 PCR 性能得到了显著的提高 <Blend Taq:BTQ-101> Blend Taq(2.5U/μl) 10 Buffer* 2mM dntps <Blend Taq -Plus-:BTQ-201> Blend Taq -Plus-(2.5U/μl) 10 Buffer* 2mM dntps 1ml 1ml 1ml 1ml PCR 20mM Tris-HCl(pH8.0) 100mM KCl Taq DNA polymerase PCR 1mM TA PCR TA Taq DNA polymerase 3 Taq DNA Polymerase Taq PCR PCR [Blend Taq -Plus-] Blend Taq -Plus- PCR PCR Taq DNA polymerase PCR Blend Taq -Plus- Taq PCR Barnes ( 2-5 ) * 2.0mM Mg 2+ (Blend Taq Blend Taq -Plus- ) 0.1mM EDTA DTT 0.5% Tween % Nonidet P-40 50% Glycerol nmoles 1U -20 1) W.M.Barnes, Proc.Natl.Acad. Sci.USA, 91: (1994) 1) E.Higashi et al., Drug Metab Dispos, 35(10): (2007) 2) I.Ogiwara et al., J.Neurosci., 27: (22): (2007) 3) I.Nishimura et al., Endocrinology, 149(2): (2008) TA TArget Clone TAK ReverTra Ace cdna ReverTra Ace -α ReverTra Ace DNA MagExtractor -PCR & Gel Clean up- NPK , PCR Buffer Blend Taq/Blend Taq -Plus- Buffer BTQ-1B 1ml TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

22 PCR RT-PCR 逆转录相关试剂 No.1 PCR PCR KOD Dash 本酶是在 Barnes 法 ( 2-5 页 ) 的基础上开发的高效率 PCR 酶 本酶通过将 具有强力 3' 5' 核酸外切酶活性 ( 校正活性 ) 的 KOD DNA Polymerase( 2-20 页 ), 与利用基因工程手段使 3' 5' 核酸外切酶活性 失活的改良型 KOD DNA Polymerase 按照最合适的比例进行混合, 实现了绝佳的反应效率和延伸性等 PCR 性能 1mM 30sec./1kb Taq DNA polymerase PCR PCR PCR PCR PCR / GC-rich TA TA Taq DNA polymerase 3 PCR KOD Dash KOD DNA KOD DNA polymerase Exo(-) KOD 4) W.M.Barnes., Proc.Natl.Acad.Sci. DNA polymerase USA.91: (1994) Barnes ( 2-5 ) Code LDP U 1 <100~200 > 35 Code LDP-101B (250U 1 ) 5<500~1,000 > 1,600 50μl KOD Dash(2.5U/μl) 10 Buffer* 2mM dntps * 1.2mM Mg 2+ 50mM Tris-HCl(pH8.0) 0.1mM EDTA 50mM KCl DTT 0.1% Tween % Nonidet P-40 50% Glycerol 1.2ml 1ml nmoles 1U Taq DNA polymerase E.coli -20 1) M.Morikawa et al., Appli.Environ. Microbiol., 60: (1994) 2) M.Takagi et al., Appli.Environ. Microbiol., 63: (1997) 3) M.Nishioka et al., J.Biotechnology., 88: (2001) 5) H.Kanzaki, J.Bone and Mineral Res. 17: (2002) 6) H.Nakayashiki et al., Genetics, 153: (1999) 7) A.Kikuchi et al., Gene, 236: (1999) 1) H.Sawai et al., Chem.Commun., (2001) 2) Y.Ogawara et al., J.Bio.Chem., 277(24): (2002) 3) T.Ohbayashi et al., Org.Biomol. Chem.,3: (2005) TA TArget Clone TAK Insert Check -Ready Insert Check -Ready- Blue KOD Dash RT-PCR ReverTra Dash PCR , PCR Buffer KOD Dash Buffer LDP-1B 1ml TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

23 相关试剂逆转录 RT-PCR PCR Taq Master Mix Taq Master Mix Quick Taq HS DyeMix Quick Taq HS DyeMix 为预混了 Taq DNA polymerase 的 2 Master Mi x ( 采用热启动 添加了电泳染料 ) (BPB) PCR PCR Buffer Taq DNA polymerase PCR PCR Code DTM Code DTM-101B ,780 Quick Taq HS DyeMix 1.25ml 2 50μl 100 rtaq DNA Polymerase Taq dntps ( BPB) Reaction Buffer -20 (3 ) 4 2 Master Mix( ) 2 Master Mix 1) F.C.Lawyer et al., J.Biol. Chem., 264: (1989) 2) D.E.Kellogg et al., Bio Techniqus, 16:1134(1994) Taq DNA polymerase PCR PCR DNA polymerase(taq DNA Polymerase) PCR Buffer dntp Mixture 2 PCR DNA PCR (BPB) Master Mix Taq Quick Taq HS DyeMix Primers PCR-grade water Quick Taq HS Dye Mix 2 PCR DNA TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

24 PCR RT-PCR 逆转录相关试剂 : 1. PCR pta2( 500bp ) DH5α 2 Quick Taq HS DyeMix 25μl PCR 10pmol/μl Primer F 1.0μl PCR 10pmol/μl Primer R 1.0μl Genomic DNA(50ng/μl) ~200ng Plasmid DNA ~50ng ( ) DW up to 50μl PCR 800 bp 300 bp M 2. p53 (2.9kb) DNA(50ng) p53 (2.9kb) Quick Taq HS DyeMix (3 4 ) (Quick Taq HS DyeMix ) N M M: 100bp DNA Ladder 1 : 2 : 3 : 4 : 5 : N: M: 100 bp DNA Ladder PCR < 扩增条件 > 94 2 min sec sec min. PCR Forward Primer: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC Reverse Primer: AGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC 0.2 M 25 cycles 2 Step Cycle* 94 2min sec. 68 1min./kb 3 Step Cycle* 94 2min sec. (Tm-5) 30sec. 68 1min./kb 25~40 cycles 25~40 cycles * Tm 73 M kb : DNA 50ng/50 l M: 1kb Ladder 1: Quick Taq HS DyeMix 2: Hotstart rtaq DNA polymerase 3: rtaq DNA polymerase 4: A Taq Master Mix < 扩增条件 > 94 2 min sec sec min. 40 cycles Forward Primer : AATGGATGATTTGATGCTGTCCC Reverse Primer : ATAAGAGCTCCCAAGACTTAG 0.2 M 3. (50ng) β-globin (1.3kb,3.6kb) (3.9kb) Quick aq HS T DyeMix 3.9kb 3.6kb 1.3kb Quick Taq HS Dye Mix B Hotstart Taq Master Mix M DNA 50ng/50 l M : 1kb Ladder 1: -globin 1.3kb 2: -globin 3.6kb 3: PCR 3.9kb -globin 1.3kb Forward Primer : TTAGGCCTTAGCGGGCTTAGAC Reverse Primer : CCAGGATTTTTGATGGGACACG -globin 3.6kb Forward Primer : GGTGTTCCCTTGATGTAGCACA Reverse Primer : ACATGTATTTGCATGGAAAACAACTC PCR 3.9kb P7, P8 Forward Primer : CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC Reverse Primer : AGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC 0.2 M TA TArget Clone TAK DNA MagExtractor -PCR & Gel Clean up- NPK , TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

25 相关试剂逆转录 RT-PCR PCR PCR PCR PCR InsertCheck -Ready-/InsertCheck -Ready- Blue InsertCheck -Ready-( ) Code PIK ,000 InsertCheck -Ready- Blue( ) Code PIK ,000 InsertCheck -Ready-( ) Code PIK ,000 InsertCheck -Ready- Blue( ) Code PIK ,000 50μl 本试剂是以 KOD Dash( 2-22 页 ) 为基础开发的用于菌落直接 PCR 的高效 <PIK-101> 率预混型试剂 插入片段确认的操作步骤非常简便 InsertCheck -Ready- 1ml 5 ( ) 1 (PIK-101 PIK- 201) dntps DNA PCR PCR InsertCheck-Ready-Blue PCR PCR KOD Dash DNA Taq DNA PCR PCR KOD Dash M13 Primer P7 M13 Primer P8 dntps Reaction Buffer <PIK-151> InsertCheck -Ready- ( ) KOD Dash dntps Reaction Buffer 1ml 5 <PIK-201> InsertCheck -Ready- Blue 1ml 5 / ( ) KOD Dash M13 Primer P7 M13 Primer P8 dntps (BPB) Reaction Buffer KOD Dash DNA Polymerase <PIK-251> PCR InsertCheck -Ready- Blue 1ml 5 ( ) Loading Dye Blue Blue PCR KOD Dash M13 PCR dntps puc pbluescript Ⅱ pgem λzap (BPB) Ⅱ pta2 M13 Reaction Buffer M13 M13 Primer P7: Insert Check -Ready- 5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3' M13 Primer P8: 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC-3' Overnight Pick up Mini Prep 1.5hr. RNase hr. 1hr. PCR 1 1.5hr. Pick up PCR 1hr ) M.Takagi et al., Appli.Environ. Microbiol., 63: (1997) 2) W.M.Barnes., Proc.Natl.Acad.Sci. USA.91: (1994) 3) L.Amery et al., Biochem.J., 357: (2001) TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

26 PCR RT-PCR 逆转录相关试剂 PCR DNA rtaq DNA Polymerase Mg 2+ Mg 2+ Code TAP U 1 <100~200 > 150 Code TAP U 1 <100~200 > 150 Code TAP-201B (250U 1 ) 5<500~1,000 > 690 Code TAP-211B (250U 1 ) 5<500~1,000 > μl 本酶是由 Thermus aquaticus YT-1 克隆出的耐热性 DNA polymerase 基 因经大肠杆菌表达生成的重组型酶, 可广泛应用于各种 PCR 实验 PCR Mg 2+ Mg 2+ 20mM Tris-HCl(pH8.0) 100mM KCl PCR 0.1mM 0.5% EDTA Nonidet P-40 1mM 0.5% DTT Tween 20 Taq DNA Polymerase 50% Glycerol PCR Taq DNA polymerase [anti-taq high( 2-37 )] < Mg 2+ > PCR( 2-5 ) PCR 100mM 500mM Tris-HCl(pH8.3) KCl PCR TA TA [TArget Clone( 3-9 )] 3' 5' PCR PCR 1kb 1min Tm E.coli DNA PCR 1) F.C.Lawyer et al., J.Biol.Chem., Human DNA (50ng) Primer 20pmoles 1.25U 264: (1989) 2+ 50μl Mg dntps 1.5mM 0.2mM 2) T.Nagahama et al., Stem cells, bp 1.3kb 19: (2001) 500bp M M:100bp Ladder 1:180bp p53 exon8 2:444bp p53 exon8 3:408bp β-globin 4:1kb β-globin 5:1.3kb β-globin rtaq DNA Polymerase(5U/μl) 10 Buffer 25mM MgCl2( Mg 2+ ) 2mM dntps 10 Buffer < Mg 2+ > 100mM Tris-HCl(pH8.3) 500mM KCl KOD DNA Polymerase Pfu DNA 10nmoles 1U 循环条件 94,2min. 15mM MgCl2 : < Mg 2+ > 10 Buffer 5μl 25mM MgCl2 3μl(1.5mM) 5~50pmoles each 2mM dntps 5μl(0.2mM) Taq(5U/μl) 0.25~0.5μl(1.25~2.5U) 1~50ng(Plasmid) 10~1000ng(Genomic DNA) ~1μl( ) Total 50μl TA TArget Clone TAK PCR anti-taq high TCP PCR Buffer rtaq DNA Polymerase Buffer - 1ml ,45sec. Tm-5,45sec. 72,1min./1kb 35cycles 2-26 TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

27 相关试剂逆转录 RT-PCR PCR PCR rtth DNA Polymerase rtth Code TTH U 1 <100~200 > μl 本酶是来源于高度嗜热菌 Thermus thermophilus HB8 的耐热性 DNA 多聚酶, 经大肠杆菌表达生成的重组型酶 另外, 它还具有逆转录活性, 该活性在 Mn 2+ 存在的情况下会得到强化 利用该性能, 可以用同一酶在同一试管中进行逆转录反应和 PCR 反应 rtth DNA Polymerase(5U/μl) 10 Buffer Dilution Buffer 2mM dntps 10mM 300mM Tris-HCl(pH7.5) KCl 0.1mM EDTA Taq DNA polymerase GC-rich 1mM DTT RT-PCR 1% Triton X-100 Mn 2+ RTase RT-PCR 500μg/ml BSA 50% Glycerol 60 RT GC-rich PCR RT-PCR Taq DNA GC PCR Dilution Buffer Mn 2+ 1-step RT-PCR PCR PCR Taq DNA TA PCR Taq DNA TA [TArget Clone( 3-8 )] PCR 1sec. 1 RT-PCR Mn 2+ RT-PCR 10 Buffer 100mM Tris-HCl(pH8.9) 800mM KCl 15mM MgCl2 1% Triton X-100 1% 5mg/ml BSA Taq DNA nmoles 1U <rtth> E.coli PCR 1) T.W.Myers and D.H.Gelfand, Biochem., 30: (1991) 2) K.Yamada et al., J.Biochem.(Tokyo) 130: (2001) TA TArget Clone TAK rtth RT-PCR RT-PCR Quick Master Mix PCR , DNA MagExtractor -PCR & Gel Clean up- NPK , PCR Buffer rtth DNA Polymerase Buffer - 1ml TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

28 PCR RT-PCR 逆转录相关试剂 RT-PCR RT-PCR ReverTra -Plus- 使用高效率逆转录酶 ReverTra Ace( 2-34 页 ) 及高保真性 PCR 酶 KOD -Plus-( 2-14 页 ) 的 RT-PCR 试剂盒 ReverTra Ace M-MLV RTase[ReverTra Ace( 2-34 )] Code PCR kb cdna 10mM dntps PCR KOD -Plus- RNase Free H2O Oligo(dT)20 PCR [KOD -Plus-( 2-14 )] RT-PCR 2,39 ReverTra Ace KOD -Plus- RNase Inhibitor 5 RT Buffer( 25mM MgCl2) 400μl 10 PCR Buffer for ReverTra -Plus-* 500μl 25mM MgSO4 500μl 300μl 1,200μl 500μl Random Primer 1kb 3% G3PDH Control Primer Set** 50μl each Positive Control RNA 50μl PCR *10 PCR Buffer for ReverTra -Plus- KOD -Plus- Ver.2 Buffer ** Human Mouse Rat Swine G3PDH RT-PCR DNaseⅠ PCR [KOD -Plus-( 2-14 )] -20 RT-PCR human G3PDH (1kb) 60~100 Taq DNA polymerase 80 1) M.Takagi et al., Appl.Environ. Microbiol., 63: (1997) ReverTra -Plus- 3 60~100 2) H.Hashimoto et al., J.Biochem. (Tokyo), 125: (1999) A HiFi RT-PCR 32 3) H.Mizuguchi et al., J.Biochem. (Tokyo), 126: (1999) B HiFi RT-PCR 22 4) H.Hashimoto et al., J.Mol.Biol., 306: (2001) C HiFi RT-PCR 4 D HiFi RT-PCR RT Oligo(dT)20 FSK-201 1nmoles Random Primer(9mer) FSK nmoles KOD TA (KOD Dash ) TArget Clone -Plus- TAK cdna ReverTra Ace -α ReverTra Ace PCR KOD -Plus-/KOD -Plus- Ver PCR Buffer KOD -Plus- Ver.2 Buffer KOD-3B 1ml Buffer ReverTra Ace Buffer(5 RT Buffer) TRT-1B 1ml TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

29 相关试剂逆转录 RT-PCR PCR RT-PCR RT-PCR ReverTra Dash Code PCR ,20 使用高效率逆转录酶 ReverTra Ace( 2-34 页 ) 及高效率 PCR 酶 KOD Dash ( 2-22 页 ) 的高效率 RT-PCR 试剂盒 可在同一试管内同时进行逆转录反 KOD Dash(2.5U/μl) 应和 PCR 反应, 故省略了将逆转录反应的产物进行分管加样的操作 ReverTra Ace 5 RT Buffer 400μl 10 PCR Buffer* 1ml Random Primer Oligo(dT)20 Primer 10mM dntps 200μl RT-PCR RNase Inhibitor RNase Free H2O 1.2ml RT PCR G3PDH Control Primer Set** 50μl each(10pmol/μl each) KOD Dash PCR 1kb./30sec. RT-PCR Positive Control Human G3PDH RNA 50μl *10 PCR Buffer KOD Dash Buffer ** Human Mouse Rat Swine PCR G3PDH RT-PCR DNaseⅠ -20 ReverTra Ace 1) S.Natsuka et al., J.Biochem. M-MLV RTase(RNaseH ) RTase cdna( (Tokyo), 130: (2001) 14kb cdna) PCR KOD Dash RT-PCR RT Oligo(dT)20 FSK-201 1nmoles Random Primer(9mer) FSK nmoles TA TArget Clone TAK cdna ReverTra Ace -α ReverTra Ace PCR KOD Dash PCR Buffer KOD -Plus- Ver.2 Buffer KOD-3B 1ml Buffer ReverTra Ace Buffer(5 RT Buffer) TRT-1B 1ml RNase Inhibitor RNase Inhibitor Native type RNase Inhibitor Recombinant type TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

30 PCR RT-PCR 逆转录相关试剂 RT-PCR 100 One Step RT-PCR RT-PCR Quick Master Mix 本产品为使用 rtth DNA polymerase( 2-27 页 ) 的单酶 一步法 RT-PCR 试剂盒 采用了热启动法, 可进行高灵敏度的检测 1) T.M.Myers and D.H.Gelfand, Biochem., 30: (1991) : Master Mix 25μl 50mM Mn(OAc)2 2.5μl 10pmoles each RNA PCR RNA Master Mix Total RNA <2.5μg Poly(A) + RNA <500ng GC Total Volume 50μl RNA Cycle Tth DNA polymerase GC 90 30sec min. 94 1min. RT-PCR 94 30sec. 50~70 30sec. 30~40 cycles 72 1min. Tth DNA polymerase Mn 2+ RTase 72 7min. cdna PCR 1-step RT-PCR RT-PCR high -Plus- RT-PCR Code PCR RT-PCR Quick Master Mix 50mM Mn(OAc)2 Nuclease-free Water Positive Control RNA Control Primer F (10pmoles/μl) Control Primer R (10pmoles/μl) , μl 2 200μl 1 50μl 50μl 50μl Tm 50~70 RT-PCR 2-10 PCR Reverse Primer oligo dt Random Primer RT-PCR Mn 2+ PCR Mn 2+ PCR PCR 2-30 TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

31 相关试剂逆转录 RT-PCR PCR 1. Positive Control Primer Set 450bp human G3PDH mrna PCR RT-PCR Master Mix 100 RT-PCR Quick Master Mix B B 450bp : G3PDH mrna* 10 6 ~10 2 Copy/50 l B: * in vitro transcription 2. mrna cdc2 mrna (5ng 0.5ng ) cdc2 ORF ( 900bp) RT-PCR RT-PCR Quick Master Mix RT-PCR Quick Master Mix M 5ng 0.5ng M 5ng 0.5ng human mrna 5ng or 0.5ng/ 50 l reaction Target cdc2 mrna ORF 900bp M 100bp Ladder Marker PCR rtth DNA Polymerase TTH U TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

32 PCR RT-PCR 逆转录相关试剂 M-MLV cdna cdna ReverTra Ace -α- Code FSK ,100 Code FSK-100B50 2 2,05 Code FSK ,950 本试剂盒为使用高效率逆转录酶 ReverTra Ace( 2-34 页 ) 的高效率 FSK-100(50 ) cdna 合成试剂盒 ReverTra Ace(10U/μl) 5 RT Buffer* Random Primer Oligo(dT)20 Primer 10mM dntps ReverTra Ace( 2-34 ) cdna RNase Inhibitor RNase Free H2O G3PDH Control Primer Set** 25μl each Random Primer Oligo dt Primer Specific Primer Positive Control Human G3PDH RNA*** 25μl RT-PCR cdna FSK-101(100 ) ReverTra Ace(10U/μl) 5 RT Buffer* 400μl Random Primer Oligo(dT)20 Primer ReverTra Ace 10mM dntps 200μl M-MLV RTase(RNaseH ) RTase cdna( RNase Inhibitor cdna 14kb) RNase Free H2O 1.2ml G3PDH Control Primer Set** 50μl 200μl 50μl 50μl 50μl 600μl 50μl each Positive Control Human G3PDH RNA*** 50μl RNase H *5 RT Buffer ReverTra Ace Buffer 5 RT Buffer ** Human Mouse Rat Swine G3PDH DNaseⅠ ***Positive Control RNA -80 Total RNA Control RNA -20 1) M.Hatta et al., Intl.J.Mol.Med., RNA 9: (2002) Total RNA mrna trna rrna RNA RT-PCR G3PDH Human Mouse Rat Swine 0.45kb PCR 2-32 TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

33 相关试剂逆转录 RT-PCR PCR 1. PCR ReverTra Ace -α- HeLa Total RNA(1μg) 1st strand cdna PCR β-actin(838bp) PCR 1st strand cdna 20μl 42 20min. 99 5min. cdna 2.5U PCR PCR ReverTra α- Ace - DNA PCR 1.0kb : <cdna > RNA Total RNA mrna Oligo(dT)20 Random Gene Specific 5 RT Buffer 10mM dntps ReverTra Ace RNase Inhibitor Total Volume ng ng 1μl 1μl 10pmoles* 4μl 2μl 1μl 1μl 20μl * PCR 3' ( anti sense ) 30 10min.* 42 20min. 99 5min. * RT Oligo(dT)20 FSK-201 1nmole Random Primer(9mer) FSK nmoles ReverTra Ace RT-PCR ReverTra Dash PCR , RT-PCR ReverTra -Plus- PCR , Realtime PCR cdna ReverTra Ace qpcr RT Kit Buffer ReverTra Ace Buffer(5 RT Buffer) TRT-1B 1ml RNase Inhibitor RNase Inhibitor Native type RNase Inhibitor Recombinant type TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

34 PCR RT-PCR 逆转录相关试剂 M-MLV RTase ReverTra Ace Code TRT-101T 2,000U Code TRT ,000U 1 80 Code TRT-101B (10,000U 1 ) 5 3,680 本酶是对 M-MLV 逆转录酶改良后的高效率逆转录酶 提高了延伸性 反应效率及高温反应性 M-MLV RTase RNaseH RNaseH M-MLV RTase DNA 50mM Tris-HCl(pH7.5) RT-PCR 100mM NaCl 0.1mM EDTA RT RT-PCR 10mM 0.01% DTT Nonidet P-40 50% Glycerol cdna RNaseH cdna / DNA-RNA RNA RTase cdna <TRT-101> ReverTra Ace(100U/μl) 5 Buffer* deletion M-MLV RTase 4 RT-PCR 1 RNA 1ml *5 Buffer dntps( ) 5 RT Buffer Poly(rA) Oligo(dT) 20 / nmole dttp 1U ReverTra Ace M-MLV(Moloney Murine Leukemia Virus)RTase RNaseH E.coli DNA -20 RNA RTase cdna RTase RNA 50U 0.2μg MS2 RNA RNA RT polymerase Reverse Transcription RNaseH RNase H RNase H 5' p A p T p C OH 3' HO C p U p A p G p C p U p A p G Mg 2+,dNTPs 5' p A p T p C p G p A p T p C O H 3' H O C p U p A p G p C p U p A p G 5' p G p A p T p C p G p A p T p C O H 3' HO C p U p A p G p C p U p A p G p Mg 2+ 5' p G p A p T p G p p p A p T p C O H 3' HO C p T p O H G p C p H O T p A p G p 1) K.Miyazaki et al., J.Bacteriology., 185: (2003) 2) A.Nezu et al., Biochem.J.,263: 59-66(2002) 3) S.Nakamura et al., J.Biochem. (Tokyo), 131: (2002) 4) S.Atsumi et al., EMBO J., 20: (2001) 5) Y.Yabuta et al., Plant Cell Physiol.,41: (2000) 6) S.Lee et al., Gene,245: (2000) 1) T.Ikeda et al., Endocrinology 142 (4): (2001) 2) S.Ohuchi et al., Nucleic Acids Research,30(15): (2002) 3) K.Minami et al., Toxicological Sciences, 87(1): (2005) 2-34 TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL:

35 相关试剂逆转录 RT-PCR PCR mrna : mrna (65 5 ) <RT-PCR cdna > RNA total RNA ng poly(a) + RNA ng 1. 42~60 cdna Primer Oligo(dT)20 5pmoles Random 25pmoles 100U poly(a)tail RNA μg( Gene Specific 5pmoles 1.35kb) 25pmoles [Oligo(dT)20] 42~60 30min. cdna 5 Buffer 4μl kb kb kb cdna 10mM dntps ReverTra Ace(100U/μl) 2μl(1mM) 1μl(100U) RNase Inhibitor 1μl ReverTra Ace A Total Volume 20μl kb min.* 20~60min. 5min. 2.cDNA <1st strand DNA > poly(a) in vitro G3PDH RNA 10 2 ~10 5 copies G3PDH + RNA Oligo(dT) min. cdna G3PDH 5 Buffer rtaq DNA Polymerase(Code No.TAP-201) PCR 10mM dntps ReverTra Ace 10 2 copies RNA ReverTra Ace(100U/μl) RNase Inhibitor ReverTra Ace A Total Volume * 0.4μg 25pmoles 4μl 2μl(1mM) 1μl(100U) 20U 20μl min. 5min. 3.14kb cdna dystrophin mrna 3' cdna poly(a) + RNA 42 30min. mrna 5' PCR ( cdna 14kb ) KOD Dash(Code No.LDP-101) PCR ReverTra Ace 14kb M bp M:φX174/Hinc Ⅱ Marker 1 :ReverTra Ace 2 :A 公司产品 3 : 本公司原产品 RT Oligo(dT)20 FSK-201 1nmole Random Primer(9mer) FSK nmoles dntps dntps Mixture(10mM) NTP-301 2μmoles RNase Inhibitor RNase Inhibitor Native type RNase Inhibitor Recombinant type cdna ReverTra Ace -α RT-PCR ReverTra Dash PCR , RT-PCR ReverTra -Plus- PCR , TEL: FAX: sales@bio-toyobo.cn 9:00~17:00 TEL: FAX: tech@bio-toyobo.cn URL: