Ｃｏｄｅ Ｎｏ
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- 剧 尹
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1 13-01 KOD SYBR qpcr Mix (Code No.QKD-201,QKD-201T) 使用说明书 科研用 TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN
2 目录 1 简介 本产品的组成 其他必需品 使用方法 使用例 (Ⅰ) 长链 / GC Rich 目的片段的定量 PCR 使用例 (Ⅱ) 通过融解曲线对各种扩增长度进行分析 使用例 (Ⅲ) 通过 ASP-PCR 进行 SNP 分析 相关 Protocol: 从 RNA 样品合成 cdna 常见问题 相关产品 注意 该系列产品为科研用试剂 请勿作为诊断 临床试剂用 此外, 对于本产品的有害性调查还不 十分全面, 因此, 在使用时, 请严格遵守实验室的一般注意事项, 适当使用保护用品, 安全操作 保存 所有组分请均保存于 -20 条件下 SYBR 为 Molecular Probes Inc. 的注册商标
3 1 简介 KOD SYBR qpcr Mix 是基于 SYBR Green I 检测体系的 Realtime PCR 用 2 浓度的 Master Mix 试剂 本产品已将除 ROX( 另外添附 ) 和引物以外的成分预混, 因此, 使得反应液的配制非常简便, 同时, 可将样品间的荧光强度散乱控制在最小范围内, 可获得很高的重复性 本产品通过将去除 3 5 核酸外切酶活性 ( 校正活性 ) 的 KOD exo(-) DNA polymerase 和组分最适化的 buffer 相结合, 使得 KOD 出色的合成能力和不易受粗样品抑制的能力在掺入法检测 (SYBR Green I) 中得到最大限度的发挥 本产品特征 1. 可用于长片段 (~2kb) 可对用以往 Realtime PCR 试剂难以扩增的 500bp~2kb 的目的片段进行定量的扩增 因此, 对于为 KOD FX 系列 KOD -Plus- 系列等常用的 PCR 设计的引物可直接使用 此外, 由于可扩增至 2kb 的目的片段, 引物的选择范围变得更大 而且, 由于可选择各种长度的目的片段, 因此对于 Tm 值不同的扩增产物的设计变得更容易, 可对更广范围的融解曲线进行分析 本产品的这些特性, 可在使用 end point assay 的多重分析中得到充分发挥 2. 可用于使用粗样品的 end point 分析粗样品例 可使用粗样品 ( 右表 ) 进行扩增 因此, 最适用于 直接使用裂解液的基因分型 3. 对高 GC 含量的目的片段非常有效 通过使用 KOD DNA polymerase, 即便是用以往产品难以扩 增的 GC 含量超过 70% 的目的片段也可进行定量的扩增 血液 指甲 头发 口腔粘膜 终浓度 1.0% 左右 1mm 左右 从发根开始 1~2cm 取样后 水悬浊液 培养细胞 ~10 3 细胞 动物组织 植物组织 碱裂解液 裂解液 ( 终浓度 1% 以下 ) 4. 高特异性 通过组分最适化, 提高了 PCR 的特异性 通过抑制引物二聚体等非特异性反应, 即便是低拷贝条 1
4 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 件下也能得到更广的可定量区域 5. 可适应各种仪器除适用于普通及高速的模块型 (Block Type) 仪器, 也可用于玻璃毛细管型 (Glass Capillary Type) 高速 Realtime PCR 仪 此外, 由于另外添附了 50 ROX reference dye, 对于使用 Passive Reference 的仪器 ( 如 Applied Biosystems 公司制造的仪器 ), 可根据各种仪器的特征把 ROX 浓度调到最适值 2 本产品的组成 本产品包含以下试剂 品名及内容 KOD SYBR qpcr Mix 50 ROX reference dye 保存 -20 C ( 或在 2~8 C 条件下 3 个月以内 ) 避光保存 -20 C ( 或 2~8 C) 避光保存 容量 (QKD-201) 5ml (1.67ml 3) 250μl 容量 (QKD-201T) 1ml (1ml 1) 50μl KOD SYBR qpcr Mix 该组分是包含反应缓冲液 SYBR Green I dntps Mg 2+ KOD exo(-) DNA polymerase 及抗 DNA 聚合酶抗体的 2 预混液 请添加模板 DNA (cdna genomic DNA plasmid DNA 等 ) 和引物溶液, 并用灭菌蒸馏水配制成 1 浓度后再使用 该溶液中不包含 ROX (passive reference dye) 收到产品后, 请立即置于 -20 C 冷冻保存 初次使用时, 请先将其融解, 然后轻轻地颠倒混合, 使溶液完全均一后再使用 如果在短时间内要持续使用时, 可在 2~8 C 条件下冷藏保存, 并在 3 个月内使用完毕 融解后的产品短期内不用时, 请装入原包装袋, 再次于 -20 C 冷冻保存 经确认该组分反复冻融约 10 次对品质没有影响 垂询电话 :
5 为防止 SYBR Green I 的荧光淬灭, 请避光保存 50 ROX reference dye 以 Applied Biosystems 公司 Agilent Technologies 公司制造的仪器为代表, 为校正各孔间的荧光强度及分注误差, 在使用 Passive Reference 的仪器进行反应时, 请添加 ROX 最适添加量根据仪器种类的不同而不同 几种主要仪器的添加量请参考 [4] 使用方法 (1) 反应液的配制 不用 Passive Reference 进行校正的仪器无需添加 ROX 请在-20 C 或 2~8 C 条件下避光保存 长时间不使用时, 请于 -20 C 冷冻避光保存 ROX reference dye 固定使用同一浓度时, 也可将 50 ROX reference dye 预先与 KOD SYBR qpcr Mix 混合后保存 混合后请轻轻颠倒混匀, 然后按上述 KOD SYBR qpcr Mix 的保存条件保存 混合比例如下 ROX 的浓度请参考 [4] 使用方法 (1) 反应液的配制 1 ROX 浓度 qpcr Mix : 50 ROX = 1.67ml : 66.8μl (QKD-201) / 1ml : 40μl (QKD-201T) 0.1 ROX 浓度 qpcr Mix : 50 ROX = 1.67ml : 6.7μl (QKD-201) / 1ml : 4μl (QKD-201T) 3 其他必需品 除本产品外, 还需准备以下试剂和仪器 (1)Realtime PCR 仪本产品适用于普通及高速的模块型 (Block Type) 玻璃毛细管型 (Glass Capillary Type) 等各种 Realtime PCR 仪 请使用者根据各仪器说明书, 结合实际情况进行适当调整 (2) 引物请准备与目的基因序列相对应的引物 在使用 SYBR Green I 的掺入法检测中引物的特异性非常重要 而为 KOD -Plus- 系列 KOD FX 系列 KOD Dash 等普通 PCR 设计的扩增片段长达 2kb 3
6 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司的高特异性引物, 基本上也可直接使用 以下列举了设计引物时需注意的一般事项 引物请设计在扩增长度 2kb 以下 引物的融解温度 (melting temperature: Tm *1 ) 请设定在 60~70 C 的范围内 融解温度根据计算方法不同而有所差异, 但请以 60~70 C 为基准进行考虑 GC 含量为 45~60% 请注意不要使其形成引物二聚体 其中, 以下三种情况很容易产生引物二聚体, 请尽量避免 1 Forward Reverse 引物的 3 末端相互补 2 引物的 3 末端附近 GC 含量很高 3 引物内含有相互补的序列 3 末端设计为 G 或 C 可提高引物与模板结合效率 但如前所述, 如果 GC 过于偏向 3 端, 则容易出现非特异性反应 以 cdna 为目的片段时, 引物设计应尽量横跨内含子, 以防止基因组 DNA 的扩增而引起假阳性 此外, 引物的纯化程度对反应特异性有很大的影响 经过一般纯化 纯度较低的引物荧光强度 散乱, 容易产生非特异性产物 请尽可能使用 HPLC 级别纯化, 至少要用经 Cartridge(OPC) 级 别以上纯化的引物 *1 : 引物 Tm 值的计算请使用最邻近法 (Nearest Neighbor method) 本说明书中所记载的引物 Tm 值是 在 50mM Na + 浓度和 0.5μM 寡聚核苷酸浓度条件下计算而得 (3) 模板 DNA 用本产品,cDNA genomic DNA plasmid DNA virus DNA 等各种 DNA 及一部分粗样品都 可作为模板使用 但含尿嘧啶的模板不能使用 (a)cdna 将普通逆转录反应试剂合成的 cdna, 无需纯化, 用灭菌水等适当稀释后可直接添加到 垂询电话 :
7 RealtimePCR 反应液中 添加量不应超过总反应体系的 10% *1 过量添加会大大改变 PCR 反应缓冲液的组成, 导致定量性低下 本公司的 Realtime PCR 用逆转录试剂盒 ReverTra Ace qpcr RT Kit (Code: FSQ-101) ReverTra Ace qpcr RT Master Mix(Code : FSQ-201) ReverTra Ace qpcr RT Master Mix with gdna Remover(Code : FSQ-301), 通过改良组分, 使带入到 Realtime PCR 反应体系的逆转录反应液的影响降到最小, 即便在 PCR 反应体系中添加最多至 20% 的液量, 也能表现出良好的反应曲线 *1 : 市售的某些逆转录反应用试剂不是专门针对荧光定量 PCR 设计的, 此时添加量应小于总反应体系 的 10% (b)genomic DNA virus DNA genomic DNA virus DNA 也可以作为模板使用 添加量以每 50μl 反应体系 200ng *2 为上限 *2 : 由于 SYBR Green I 具有和双链 DNA 分子结合发光的特性, 在以大量的双链 DNA 为模板的情况下, SYBR Green I 与模板 DNA 自身相结合, 会造成基线上飘 因此, 在以 genomic DNA 为模板时, 在 高浓度区域会出现直线性低下的情况 (c) plasmid DNA plasmid DNA 也可作为模板使用 如果直接使用环状 plasmid DNA, 容易导致扩增效率低下, 从而不真实地反应拷贝数 *3 因此, 请使用限制酶将其切断, 线性化后再使用 当稀释纯化过的 plasmid DNA 溶液时, 溶液中的 DNA 浓度会变得非常低,DNA 容易被容器吸附 因此, 进行 Realtime PCR 时, 会造成低浓度区域的线性和重现性低下 如果在稀释时, 将与反应无关的核酸 (yeast RNA 等 ) 作为掺入物与稀释液混合, 可改善低浓度区域的线性 5
8 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 *3 : plasmid DNA 的拷贝数, 可用以下简易公式计算 每 1μg plasmid DNA 的拷贝数 = 9.1 x / plasmid DNA 的大小 (kb) (d) 粗样品 将活体组织等粗样品添加到 PCR 反应液中时, 请参照以下的添加量 过量添加会导致反应性低下, 请务必注意 end point 检测时可确认到扩增的添加量 (20μl 反应体系时 ) 全血指甲头发口腔粘膜培养细胞 稀释至 1/10 添加 2μl 按米粒的 1/3 大小 直接添加从发根处开始 1~2cm 直接添加用棉棒取样后, 在 200μl 水中悬浊 向反应液中添加 5μl ~10 3 cells 动物组织 碱裂解液 * 1 植物组织 一步法得到的植物裂解液 * 2 *1 : 碱裂解液按以下方法配制 活体样品 ( 添加量参照右图 ) 添加 50mM NaOH 180μl Vortex 充分振荡 95 C 10 分钟温育 用 1M Tris-HCl(pH8.0) 20μl 中和 Vortex 充分振荡 离心 12,000rpm 5 分钟 (optional) 在 20μl 反应体系中添加上清 0.5μl~2μl ( 活体样品不会也无需完全溶解 ) 活体样品例鼠尾猪肉牛肉指甲 约 3mm 约 20mg 约 20mg 约 5mg *2 : 植物裂解液按以下方法 ( 一步法 ) 配制 植物 ( 稻叶 烟草叶 米粒等 )( 约 3mm 的小块 ) 添加 Buffer A 100μl Vortex 充分振荡 95 C 10 分钟温育 Vortex 充分振荡用灭菌水将上清稀释至 1/10 在 20μl 反应体系中添加上清 0.5μl~2μl Buffer A 100mM Tris-HCl (ph9.5) 1M KCl 10mM EDTA 在 Buffer A 中, 通过使用 Pestle 对植物组织进行匀浆, 可提高效率 此时, 不需要加热 垂询电话 :
9 4 使用方法 (1) 反应液的配制 以下为 50 μl 及 20 μl 反应体系时的配制例 请根据使用的 Realtime PCR 仪的特性, 适当增减 反应液量 试剂 50μl 反应体系 20μl 反应体系终浓度 灭菌水 X μl X μl KOD SYBR qpcr Mix 25 μl 10 μl 1 Forward Primer 10 pmol 4 pmol 0.2 μm* 1 Reverse Primer 10 pmol 4 pmol 0.2 μm* 1 50 ROX 1 / 0.1 μl 0.4 / 0.04μl 1 / 0.1 * 2 reference dye DNA 溶液 Y μl Y μl 合计液量 50 μl 20 μl *1 : 扩增效率不充分的情况下, 可提高引物浓度, 发生非特异性反应时, 可降低引物浓度, 从而改善反应结果 引物浓度, 请以终浓度 0.05~1.0 μm 为标准进行探讨 *2 : Applied Biosystems 公司的仪器,Agilent Technologies 公司的仪器等, 为校正各孔间的荧光强度及分注误差而使用了 Passive Reference 因此使用这些仪器时请添加 ROX reference dye 最适添加量根据仪器种类的不同而有所差异, 几种主要仪器的添加量如下 不用 Passive Reference 进行校正的仪器无需添加 表 1: 几种主要仪器的最适 ROX reference dye 浓度仪器终浓度 ( 添加量 ) Applied Biosystems HT StepOne StepOnePlus 等 Applied Biosystems Fast Agilent Technologies 公司生产的仪器 (Option) 等 Roche 公司生产的仪器 Bio-Rad 公司生产的仪器 BioFlux LineGene 等 1 (1/50 量 ) 0.1 (1/500 量 ) 不添加 7
10 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 此外, 长期稳定地使用 ROX reference dye 同一浓度的情况下, 可预先按以下比例将 50 ROX reference dye 与 KOD SYBR qpcr Mix 混合后保存 ROX 按 1 浓度使用时 qpcr Mix : 50 ROX = 1.67ml : 66.8μl (QKD-201) 或 1ml : 40μl (QKD-201T) ROX 按 0.1 浓度使用时 qpcr Mix : 50 ROX = 1.67ml : 6.7μl (QKD-201) 或 1ml : 4μl (QKD-201T) (2)PCR 循环条件的设定 (a) 推荐的 PCR 循环条件首先, 建议以以下的条件进行 PCR 反应特异性较低, 或扩增效率较低时, 再按 (b)pcr 循环条件探讨方法 中记载的方法摸索条件 Step 温度时间升降速度 预变性 98 C 2 分钟 * 1 最大 变性 98 C 10 秒 最大 PCR 退火 60 C* 2 10 秒 最大 (40 cycles* 4 ) 延伸 68 C 30 秒 /500bp* 3 最大 (500bp 以下 30 秒 ) (Data Collection 设定在延伸步骤 ) 融解曲线分析 (Melting / Dissociation Curve Analysis)* 5 *1 : 本产品由于采用了使用抗体的热启动系统, 需进行 98 C 2 分钟的预变性, 使抗体热变性 *2 : 无法得到充分的扩增效率的情况下, 可将退火温度设定得低一些 (~50 C), 发生非特异性反应 时, 可将退火温度设定得高一些 (~68 C), 从而改善反应结果 *3 : 一般情况下, 标准序列目的片段在 500bp 以下时, 延伸时间 30 秒即可进行充分的反应 但一部分仪器为测定稳定的荧光, 延伸时间需大于 30 秒 扩增曲线散乱, 或各孔间的差异较大时, 请设定较长的延伸时间 (45-60 秒 ) 另外, 部分仪器由于硬件或控制用的软件原因, 无法设定为 30 秒, 此时请根据仪器的使用说明书, 设定最适的可设定时间 标准序列目的片段在 500bp 以上时, 延伸时间按目的片段链长 30 秒 /500bp 设定 垂询电话 :
11 *4 : 检测粗样品时, 有时会出现起峰值 (Ct 值 ) 很低的情况 此时, 在特异性不影响的范围内增加循 环数 (~50 cycles), 可改善检测灵敏度 *5 : 在 SYBR Green I 检测体系中, 通过将 SYBR Green I 和 DNA 扩增产物结合, 以该荧光强度的增大为指标, 进行检测 虽然与普通的 PCR 进行同样的反应非常简便, 但由于会检测出引物二聚体及非特异性的扩增产物, 需要在扩增后通过融解曲线分析进行确认 融解曲线分析的设定请按各仪器的标准进行设定 详细请参照各仪器的使用说明书 目的片段的 GC 含量超过 80% 时, 根据仪器的不同, 有时会发生融解曲线中途无法检测到的情况, 此时, 请进行电泳以确认特异性 将融解温度的上限设定为 99 C 可解决该问题 (b)pcr 循环条件探讨方法 反应特异性较低或扩增效率较低 ( 无法确认扩增 ) 时, 请按以下方法摸索 PCR 循环的最适条件 反应特异性较低时可通过提高退火温度及 2 step PCR 来改善反应特异性 此时, 请在确认与扩增效率平衡性的同时, 来决定最适的退火条件 推荐条件 98 C 10 秒 60 C 10 秒 68 C 30 秒 /500bp (40 cycles) 提高退火温度 * 1 98 C 10 秒 ~68 C 10 秒 68 C 30 秒 /500bp (40 cycles) 进行 2 step PCR 98 C 10 秒 68 C 30 秒 /500bp (40 cycles) 扩增效率较低 ( 无法确认扩增 ) 时 可通过延长延伸时间 降低退火温度来改善扩增效率 此外, 有时也可通过增加引物量来改善扩 增效率 9
12 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 推荐条件 98 C 10 秒 60 C 10 秒 68 C 30 秒 /500bp (40 cycles) 延长延伸时间 98 C 10 秒 60 C 10 秒 68 C ~1 分钟 /500bp (40 cycles) 降低退火温度 * 1 98 C 10 秒 50 C~ 10 秒 68 C 30 秒 /500bp (40 cycles) *1 : 摸索退火温度时, 可通过使用 ABI StepOnePlus 的 VeriFlex TM 功能 Bio-Rad 公司仪器的温度梯 度功能, 一次运转可探讨几个退火温度, 从而使得摸索条件更加简便 (3)-1 Applied Biosystems StepOnePlus TM 循环条件设定例 ( 普通的 Block type 软件版本 2.2.2) 以下为在 Applied Biosystems StepOnePlus TM 上使用本试剂的循环条件设定例 1 启动软件, 选择 Design Wizard Advanced Setup QuickStart 中的其中之一 2 选择下表的标签,reagents 选择 SYBR Green Reagents Design Wizard Advance Setup QuickStart 3 选择 Run Methods, 如下所示设定温度条件 *1 Methods & Materials Setup Experiment Properties Experiment Properties *2 *4 *3 垂询电话 :
13 *1 : Sample Volume (μl) 栏中, 请务必输入正确的反应液量 *2 : 由于初期设定为 2 step, 请选择 Add Step, 变更为 3 step *3 : 延伸反应时请设定为数据回收 point *4 : 请添加制作融解曲线用的循环 GC 含量较高时, 融解温度的上限请设定为 99 C 4 在正确的位置放置 PCR 板和离心管, 就可以开始 PCR 反应了 (3)-2 Applied Biosystems 7500 Fast Real Time System 循环条件设定例 ( 普通的 Block type 软件版本 1.4) 以下为在 Applied Biosystems 7500 Fast Real Time System 上使用本试剂的循环条件设定例 1 启动软件, 选择 Instrument 标签 2 如下所示设定温度条件 *3 *2 *1 *1 : Sample Volume (μl) 栏中, 请务必输入正确的反应液量 *2 : 延伸反应时请设定为数据回收 point *3 : 请添加制作融解曲线用的循环 GC 含量较高时, 融解温度的上限请设定为 99 C 目的片段的 GC 含量超过 80% 时, 会出现融解曲线中途无法检测到的情况 2 在正确的位置放置 PCR 板和离心管, 就可以开始 PCR 反应了 11
14 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 (3)-3 Roche LightCycler Nano 循环条件设定例 ( 软件版本 1.0) 以下为在 Roche LightCycler Nano 上使用本试剂的循环条件设定例 1 启动软件, 选择 New 键 2 打开 Experiment 标签, 在 Name 中记载实验名 3 打开 Run Settings 标签, 选择 Intercalating Dyes 4 打开 Profile 标签, 如下设定温度条件 A) 按 Program 的 add 按钮, 选择 Hold B) 温度条件变更为 秒 5 C / 秒 C) 按 Program 的 add 按钮, 选择 3-step Amplification D) 如下所示设定温度条件 E) 请确认延伸反应时 Acquire 有 check F) 按 Program 的 add 按钮, 选择 Melting G) 请确认是否已按如下所示设定程序 5 在正确的位置放置 PCR 板和离心管, 就可以开始 PCR 反应了 垂询电话 :
15 (3)-4 Bio-Rad MiniOpticon 循环条件设定例 ( 软件版本 2.0) 以下为在 Bio-Rad MiniOpticon 上使用本试剂的循环条件设定例 1 启动软件, 选择 Create a new run 2 选择 Create New, 按如下所示设定温度条件 *1 *2 *3 *4 *1 : Sample Volume (μl) 栏中, 请务必输入正确的反应液量 *2 : 由于初期设定为 2 step, 请选择 Insert Step, 变更为 3 step *3 : 选择 Insert Melt Curve, 追加制作融解曲线用的循环 GC 含量较高时, 融解温度的上限请设定为 99 *4 : 延伸反应循环请选择 Add Plate Read to Step, 设定数据回收 point 3 在正确位置放置 PCR 板和离心管, 就可以开始 PCR 反应了 13
16 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 5 使用例 (Ⅰ) 长链 / GC Rich 目的片段的定量 PCR 实验例 1: 长链目的片段 方法 直接使用为 KOD FX 系列 KOD -Plus- 系列等普通 PCR 用设计的引物, 用以往产品和本产品对 TGF β 的长链目的片段 (1.9kb) 进行反应性的比较 模板使用 Human genomic DNA (gdna),gdna 的 10 倍稀释 (5 个梯度 ) 和 no-template control(ntc), 进行反应 PCR 循环条件 : 98,2 分钟 98,10 秒 / 60,10 秒 / 68,120 秒 (40 cycles) 延伸时间设定为 30 秒 / 500bp 仪器 : ABI StepOnePlus TM 结果 即便是使用 Taq DNA polymerase 的本公司产品 (THUNDERBIRD SYBR qpcr Mix) 难以扩增 定量的 1.9kb 的长链目的片段, 用本产品也能确认到扩增 电泳分析 M kb M : 1kb DNA Ladder 1 : KOD FX Neo 2 : KOD FX 3 : KOD -Plus- Ver.2 垂询电话 :
17 实验例 2:GC Rich 目的片段 方法 用各 Realtime PCR 试剂对 GC 含量超过 70% 的目的片段进行反应性的比较 模板使用本公司高效率逆转录试剂盒 ReverTra Ace qpcr RT Kit (Code: FSQ-101) 合成的源于 HeLa 细胞 total RNA 的 cdna,cdna 5 倍稀释 (5 个梯度 ), 进行反应 PCR 循环条件使用各试剂推荐的条件 本产品的 PCR 循环条件 : 98,2 分钟 98,10 秒 / 60,10 秒 / 68,30 秒 (40 cycles) 仪器 : ABI StepOnePlus TM 结果 即便是用本公司以往产品 (THUNDERBIRD SYBR qpcr Mix) 难以扩增的 GC 含量超过 70% 的目的片段, 用本产品也能确认到定量的扩增 另外, 用其他公司产品会确认到引物二聚体, 而用本产品不容易产生, 因此在低拷贝区域也能得到范围很广的定量 目的片段 :IGF2R 基因 (GC 含量 83% / cdna) KOD SYBR qpcr Mix A 公司 Realtime PCR 试剂 ( 适用于 GC 含量 70% 以上的片段 ) 本公司以往产品 THUNDERBIRD SYBR qpcr Mix 15
18 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 6 使用例 (Ⅱ) 通过融解曲线对各种扩增长度进行分析 由于 KOD SYBR qpcr Mix 可选择长至 2kb 的各种目的片段, 如下图, 可通过扩增长度不同使得扩增产物的 Tm 值产生差异 因此, 在计算上, 可通过在 Tm 值 * 1 产生差异的区域设计数个引物, 从而可在单管中进行 Multiplex PCR 扩增长度不同的目的片段等 该 Multiplex PCR 中的峰值识别,Tm 值的间隔在 3 C 以上 ( 根据仪器种类的不同, 有时可能是 5 C 以上 ) 时可进行分析 (C) 扩增长度和预测以及实测 Tm 值 扩增长度 (bp) 预测 Tm 值 * 1 ( C) 实测 Tm 值 * 2 ( C) , 使用 KOD SYBR qpcr Mix, 用各种引物对人 β-actin 基因进行扩增 (A) 扩增后, 进行电泳 (B) 扩增后, 进行融解曲线分析, 求 Tm 值的实测值 (C) 比较扩增产物的实测 Tm 值和预测 Tm 值 *1 : 扩增产物的 Tm 值按以下公式估算 Tm = (yg+zc-16.4) / (wa+xt+yg+zg) w x y z 为扩增产物中 A T G C 的各碱基数 Wallace RB et al. (1979) Nucleic Acids Res 6: Sambrook,J., and Russell,D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 本公司已将基于上述方法的 Tm 值计算表格公布在网站上, 请登录本公司中文网站 下载 *2 : 有时会出现预测 Tm 值和实测 Tm 值不一致的情况 以下为利用各种扩增长度对 Knock-in 小鼠进行基因分型检测的引物设计应用例 在该方法中, 通过调整目的片段长度使得两个扩增产物的 Tm 值产生差异, 可进行 Multiplex PCR 垂询电话 :
19 基因分型用引物的设计方法 ( 一端共用引物的设计方法 ) 1 短链目的片段的设定为了和引物二聚体相区别, 请将引物设计为扩增产物 70bp~150bp 下图为 Wild type(wt) 作为短链侧的例子, 但 Knock-in(KI) 为短链侧也没有关系 2 短链扩增产物 Tm 值的计算 计算扩增长度为 70bp~150bp 的短链扩增产物的 Tm 值 ( 参考 P16) 3 长链目的片段的设定长链目的片段扩增产物的 Tm 值设计为比 1 设计的短链扩增产物高 3 C 以上 ( 如有可能, 最好是 5 C 以上 ) 考虑到扩增效率的平衡, 应将扩增长度设计为 500bp 以下 ( 最好是 300bp 左右 ) 此时, 如不能将 Tm 值的差设计为 3 C 以上, 请将短链目的片段的扩增长度设计得更短些 4 使用实际设计的引物的预实验这里主要的问题是异质体的检测 在 SYBR Green I Assay 中, 信号强度不是与扩增产物的摩尔数, 而是与扩增产物的量 ( 链长 ) 成比例 因此, 请按以下计算公式决定 PCR 时的引物量 < 引物浓度设定 > 长链用引物共用引物 短链用引物 引物浓度 (μm) 0.2μM ( 短链扩增产物长 [bp] 长链扩增产物长 [bp]) 0.2μM 17
20 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 5 峰值平衡的修正进行融解曲线分析, 比较峰值的高度 峰值的平衡有显著差异时, 尝试降低峰值高的目的片段扩增的引物浓度 下图为固定共用引物与短链用引物的浓度, 改变长链用引物浓度的例子 降低长链用引物的浓度, 则短链目的片段的峰值会变高 ; 提高长链用引物的浓度, 则短链目的片段的峰值会降低 实验例 3: 鼠尾裂解液的基因分型 方法 如上, 将引物设计为两种扩增产物的 Tm 值有差异, 可在单管内直接进行鼠尾裂解液 ( 碱裂解液 ) 的基因分型 在本实验中, 将引物设计为产生 100bp( 预测 Tm 值 : 79 C) 341bp( 预测 Tm 值 : 84 C) 的扩增产物 鼠尾 (3mm 左右 ) 添加 50mM NaOH 180μl Vortex 充分振荡 分钟温育 在 1M Tris-HCl(pH8.0) 20μl 中中和 Vortex 充分振荡 离心 12,000rpm 5 分钟 (optional) 在 20μl 反应体系中添加 0.5μl~2μl 上清 PCR 反应循环 98 C 2 分钟 98 C 10 秒 / 60 C 10 秒 / 68 C 30 秒 (40 cycles* 1 ) 仪器 ABI 7500 Fast Real Time System *1 : 为了抑制引物二聚体的产生, 建议添加不会阻碍扩增的最大浓度的样品, 将循环数设定为使扩增 达到平台 (Plat) 的最低数 垂询电话 :
21 结果 按照以上流程, 摸索引物设计 引物比, 结果可知,Reverse 侧的引物比在长链 : 短链 =1:3 的情况下, 可获得良好的分析 7 使用例 (Ⅲ) 通过 ASP-PCR 进行 SNP 分析 即便扩增片段长度相同, 通过在特定的引物 5 端添加高 GC 含量的 tail 序列 (GC tail), 可将特定扩增产物的 Tm 值提高 3~5 C 用该方法, 可在单管内使用 ASP(Allele specific primer)-pcr 法进行 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 分析 ASP-PCR 方法在添加 GC tail 以外, 和普通的 ASP-PCR 一样 通过将引物设计为 3 末端 ( 附近 ) 为 SNP 部位, 可分析扩增的有无 GC tail 引物的设计方法 为了通过 GC tail 使 Tm 值上升的效果显著, 应将扩增长度设计为 100bp 以下 可应用于各种原理的 ASP-PCR 在实验例 4( 下例 ) 中,SNP 部位可设计在 3 末端第二碱基, mismatch 部位设计在第三碱基 第三碱基的 mismatch, 可以选择任何与 A 相互补的 T 以外的任何碱基 下例中, 分别为 G 和 A 设计好之后, 请确认两种扩增产物的 Tm 值差异是否在 3 C 以上 *1 不满 3 C 的情况下, 请缩短扩增长度 GC tail 请参考下图添加 在 Tm 值产生差异的范围内, 可改变 GC tail 的长度 可参考各种关于 GC tail 的论文 扩增后, 峰值的平衡不好的情况下, 请参考 基因分型用引物的设计方法 (P.17) 探讨引物比 19
22 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 为 SNP 检测的引物设计例 5 *1 : 根据仪器种类的不同, 有的 smoothing 功能可将相邻的两个峰值表示为一个范围比较广的峰 值 此时, 请将引物设计为 Tm 值的差在 5 C 以上 为了将 Tm 值的差设计在 5 C 以上, 建议将 扩增长度设计得短一些 (50bp~60bp 左右 ) 实验例 4: 血液 口腔粘膜的检测 ~ALDH2 SNP 的检测 ~ 方法 血液 口腔粘膜的 DNA 不进行纯化, 在单管中进行 ALDH2(aldehyde dehydrogenase2) SNP 的检测 SNP 检测时, 由于扩增片段长度相同, 通过在一侧的 Allele 特异性引物中添加 GC tail, 将扩增产物的 Tm 值设计为产生差异 垂询电话 :
23 按如下条件配制模板, 直接添加到反应液中 PCR 循环条件 : 98,2 分钟 98,10 秒 / 60,10 秒 / 68,30 秒 (50 cycles) 结果 无需纯化基因组 DNA, 可识别基因型 8 相关 Protocol:RNA 样品合成 cdna 本试剂可以用各种逆转录反应用试剂合成的 cdna 作为模板 如使用 Realtime PCR 专用的逆转录反应用试剂, 则可进行灵敏度更高的反应 本公司 ReverTra Ace qpcr RT Kit (Code: FSQ-101) ReverTra Ace qpcr RT Master Mix(Code : FSQ-201) ReverTra Ace qpcr RT Master Mix with gdna Remover(Code : FSQ-301) 是专为 Realtime PCR 设计的高效率 cdna 合成试剂盒, 与本产品组合使用, 可获得可信度更高的结果 以下为使用 ReverTra Ace qpcr RT Kit,Realtime PCR 用 cdna 合成法的介绍 ( 详细请参考该试剂盒添附的产品使用说明书 ) ReverTra Ace qpcr RT Kit (Code: FSQ-101) (1)RNA 的变性 (Option) 按使用量分取作为模板使用的 RNA 溶液, 在 65 C 条件下进行 5 分钟温育后, 在冰上急速冷却 该步骤可省略, 但通过该处理, 可提高容易形成高级结构的 RNA 的逆转录效率 21
24 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 进行该处理时, 请不要添加 5 RT Buffer RT Enzyme Mix, 否则会造成 RNA 的分解和酶活性的 低下等 (2) 反应液的配制 在冰上配制如下反应液 Nuclease-free Water X μl 5 RT Buffer 2 μl RT Enzyme Mix 0.5 μl Primer Mix 0.5 μl RNA 0.5pg~1μg 相当 Total volume 10 μl (3) 逆转录反应 将反应液轻轻搅拌均匀后, 在以下温度条件下进行温育 37 C, 15 分钟 ( 逆转录反应 ) 98 C, 5 分钟 ( 酶失活反应 ) 4 C, hold 反应结束后, 在 4 C 或 -20 C 条件下保存 进行 Realtime PCR 时, 可作为模板直接或稀释后添 加到反应液中 9 常见问题 现象原因对策 用高浓度样品反应时线性 混乱 由于 SYBR Green I 与样品 DNA 的结合导致基线上飘 样品溶液中的杂质抑制了反应 SYBR Green I 与全部双链 DNA 相结合, 由于具有发荧光的特性, 当样品中含高浓度的双链 DNA 时, 会造成基线上飘, 从而无法计算出正确的 Ct 值 请适当降低样品浓度再进行反应 当样品纯度较低时, 其所含的杂质会抑制 PCR 反应 此外, 使用非 Realtime PCR 专用逆转录试剂盒合成的 cdna 时, 逆转录反应液中所含的物质也会抑制 PCR 反应 请降低样品浓度, 或将样品纯化后再进行反应 建议使用 Realtime PCR 专用 cdna 合成逆转录试剂盒 垂询电话 :
25 现象原因对策 用低浓度样品反应时线性 混乱 目标 DNA 的拷贝数过少 DNA 被反应离心管所吸附 反应液中的目标 DNA 的拷贝数只有几倍到几十倍时, 拷贝数散乱的概率变大, 容易形成线性混乱 此时请适当提高样品浓度再进行反应 使用样品的 DNA 量较少或样品稀释后被长时间存放的情况下, 会使得 DNA 被反应离心管吸附, 从而造成实质性的模板量减少 请提高样品浓度再进行反应 另外, 如果要对样品进行稀释, 请稀释后立即进行反应 同时产生引物二聚体对目标 DNA 进行扩增时, 同时发生引物二聚体的扩增, 从而无法检测出目的片段的扩增曲线 进行融解曲线分析, 出现几个峰值时, 请再次摸索反应条件, 防止引物二聚体的再次发生 在 end point assay 中, 在不会抑制反应的前提下, 将模板量增加到最大, 减少循环数, 可避免出现该问题 稀释系列样品的扩增曲线的间隔不均一 PCR 效率低于 80% (slope < -3.95) 与非特异性反应的竞争以质粒为模板反应条件不合适引物的 Tm 值低于一般情况 (60 C 以下 ) 引物质量不好计算 PCR 效率时, 包含了偏离直线的 Ct 值引物量少 引物的特异性不够充分的情况下, 会同时发生目标以外的扩增, 从而无法检测出目的片段的扩增曲线 进行融解曲线分析, 出现几个峰值时, 请再次摸索反应条件, 防止引物二聚体的再次发生 仍无法得到改善时, 请尝试重新摸索引物序列 以环状质粒为模板使用时, 容易产生荧光散乱 此时请用限制酶酶切, 使用直链的质粒 根据目的片段的不同, 有可能出现在标准的反应条件下无法得到充分的 PCR 效率的情况 请根据 [4] 使用方法 (2) PCR 循环条件的设定, 重新摸索 PCR 反应条件 使用 Tm 值较低的引物时, 会出现在标准的循环条件下无法充分退火的情况 请根据 [4] 使用方法 (2) PCR 循环条件的设定, 重新摸索退火温度 当引物质量不好时, 会导致 PCR 效率大幅下降 可从引物原液重新稀释, 或重新合成引物 如果计算 PCR 效率时, 包含了偏离直线的 Ct 值, 会增大计算值的误差 应将偏离直线的 Ct 值排除后再计算 增加引物量, 可改善扩增效率 23
26 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 现象原因对策 PCR 效率高于 110% (slope > -3.1) 计算 PCR 效率时, 包含了偏 离直线的 Ct 值 发生非特异性反应 如果计算 PCR 效率时, 包含了偏离直线的 Ct 值, 会增大计算值的误差 应将偏离直线的 Ct 值排除后再计算 由于发生了非特异性反应, 有时会出现 PCR 效率高于 110% 的情况 可进行融解曲线分析确认特异性 重现性差样品纯度不好不纯的样品会抑制 PCR 反应, 从而导致实验的重现性 差 可降低样品的浓度或对样品进行纯化后再反应 使用了稀释后长时间放置的 样品 浓度较低的 DNA 溶液长时间存放时, 由于被反应容器 吸附, 实际浓度会更低 请从原液重新稀释后再进行反 应 另外, 通过梯度稀释的标准样品应避免稀释后再保 存, 最好每次使用时直接从原液稀释 使用了纯化质粒 DNA 或 PCR 扩增产物作为模板 使用纯化质粒 DNA 溶液或 PCR 扩增产物作为模板时, 有时会使用稀释后的溶液 此时, 溶液中 DNA 浓度非 常低,DNA 很容易被容器吸附而减少, 这会造成低浓度区域的直线性及重现性差 在稀释时, 可以在稀释液中混合一些与反应无关的核酸 (Yeast RNA 等 ), 可改善低浓度区域的直线性 引物质量不好 即便是同一序列的引物, 在合成时也会发生质量上的差 异 可在新合成时, 与原来使用的引物做一下比较实验, 以确认质量差异 垂询电话 :
27 现象原因对策 no-template control (NTC) 可见扩增 产生了引物二聚体 发生交叉污染 融解曲线分析时,no-template control 在目的片段的低温侧出现峰值, 疑似有引物二聚体产生 引物二聚体根据引物序列或引物质量的不同而发生的程度有所差异 首先根据 [4] 使用方法 (2) PCR 循环条件的设定再次探讨 PCR 的反应条件, 如果仍无法改善, 则可进行引物的再设计或再合成 合成时, 纯化级别请选择 HPLC 以上 进行融解曲线分析时,no-template control 的峰值和目的片段大致在同一位置时, 可能是扩增产物的带入所引起的 如果再次尝试仍然如此, 则可能是由试剂类或灭菌水的交叉污染所引起的, 此时请换新的试剂或灭菌水 扩增曲线的荧光信号很弱, 50 ROX reference dye 添加或扩增曲线呈锯齿状量过剩 使用 Passive Reference 的仪器,50X ROX reference dye 添加量过剩的情况下, 荧光值修正后,SYBR Green I 的荧光值会较低 根据 [4] 使用方法 (1) 反应 液的配制确认 50X ROX reference dye 的添加量 荧光测定时间太短 一部分仪器,PCR 的延伸时间过短时, 荧光测定不能 充分完成 扩增曲线的锯齿状较明显时, 将延伸时间 设定得稍长些 (45~60 秒 ) 可得到改善 反应液量太少 以少于仪器的标准条件的液量进行反应时, 荧光测定 融解曲线分析时可看到几 个峰值 发生了非特异性反应 产生了引物二聚体 值的误差会增大, 此时应增加液量 引物的特异性不好的情况下, 会同时发生非特异性扩增, 无法检测出纯粹的目的片段的扩增曲线 此时应重新探讨反应条件, 以避免非特异性反应的产生 仍无法得到改善时, 请重新设计引物序列 目标 DNA 的扩增与引物二聚体的扩增同时发生 此时应重新探讨反应条件以避免引物二聚体的的发生 仍无法得到改善时, 可重新设计引物或提高纯化级别 25
28 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 现象原因对策 在引物上添加了 GC tail, 但无法确认到 Tm 值的差 Multiplex 检测时, 不知道 Tm 值 Multiplex 检测时, 峰值的平衡不好 扩增长度过长扩增产物的 GC 含量过高扩增长度过长扩增产物的 GC 含量过高两种目的片段的扩增长度差异过于显著退火效率不同 扩增长度过长时,GC tail 对 Tm 值的影响会减小 请将引物设计为扩增长度在 100bp 以下 另外, 通过求扩增产物的 Tm 值, 可推测 Tm 值的差 扩增产物的 GC 含量过高时, 即便不添加 GC tail,tm 值也会显著变高 因此,GC tail 对 Tm 值的影响会减小 此时, 请在其他区域设计引物 扩增产物的 Tm 值在扩增长度较短的范围内, 与扩增长度成比例,Tm 值会上升, 但到了某一长度之后, Tm 值会变得恒定 在计算时, 求扩增产物的 Tm 值, 请在产生差异的扩增长度的范围内重新设计引物 扩增产物的 GC 含量过高时, 由于在短链目的片段中 Tm 值也会变高,Tm 值的差不容易产生 在短链范围内计算, 请将引物设计为 Tm 值产生差异 Tm 值不变时, 请尝试在其他区域设计引物 SYBR Green I Assay 中, 与扩增长度成比例, 荧光强度会增强 因此, 扩增长度显著不同时, 即便扩增量相同, 峰值的高度也不同 请将引物重新设计为目的片段长度差异较小 此外, 减少峰值较高的目的片段的扩增引物量, 也可改善结果 由于两种引物的 Tm 值显著不同时, 退火效率也会有显著差异, 因此扩增量的平衡会变差 此时, 请先尝试减少峰值高的引物量 仍无法得到改善时, 请重新将引物设计为两种引物的 Tm 值相同 垂询电话 :
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30 [ 制造 销售商 ] 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司上海市浦东新区张杨路 188 号汤臣商务中心 C 座 310 室邮编 : 交货期限 订货相关咨询 Tel: Fax: sales@bio-toyobo.cn 产品内容 技术相关咨询 Tel: Fax: tech@bio-toyobo.cn 代理商资料 :
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吉林农业大学学报 ２０１６ ３８ １ ８７ ９１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｈｔｔｐ ｘｕｅｂａｏ ｊｌａｕ ｅｄｕ ｃｎ Ｅ ｍａｉｌ ｊｌｎｄｘｂ ｖｉｐ ｓｉｎａ ｃｏｍ 神 经 生 长 因 子 ｍｒｎａ 在 鹅 等 级 前 卵 泡 中 的 表达 刘璐璐 隋玉健 朱海洋 武惠岩 杨 辉 孙永峰 吉林农业大学动物科学技术学院 长春 １３０１１８
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Microsoft Word - sybr PCR 说明书200T doc
4ul 模板 --- 质粒 DNA(10-10 7 拷贝 ) 基因组 DNA(100pg-1ug) 或 cdna(1pg-100ng) 加入模板的体积可作适当调整, 但不应超过 10ul 4 将加好模板的 PCR 反应管进行短暂离心, 以确保所有试剂流到管子底部 5 PCR 反应 Real Time PCR 反应程序设置如下 : 三步法反应程序设置如下 : 94,2min; 94,10s, 60,15s,
目 录 产品介绍 产品特点 试剂盒应用 产品质量控制 试剂盒内容 试剂盒组分信息 储存条件 注意事项
Real Time PCR Easy TM -SYBR Green I Cat.No.QP-01111/01112/01113/01114 Real Time PCR Easy TM -Taqman Cat.No.QP-01021/01022/01023/01024 For qpcr using purified DNA Store at -20 C Research use only Copyright
Table of Contents 目录 Introduction 1 Limitations of the Product 1 Materials Provided and Storage 3 Other Supplies Required 3 Precaution 5 QC Testing 5
This package insert must be read entirely before using this product. For proper performance, use the insert provided with each individual product received. Catalog Number MR0302-1 MR0302-5 For fast quantitative
实验室常用培养基的配制方法
实验室常用培养基的配制方法 Ampicillin( 氨卡青霉素 )(100 mg/ml) 100 mg/ml Ampicillin 50 ml 配制方法 1. 称量 Ampicillin 置于 50 ml 离心管中 ; 2. 加入 40 ml 灭菌水, 充分混合溶解后, 定容至 50 ml; 3. 用 0.22 µm 过滤膜过滤除菌 ; 4. 小份分装 (1 ml/ 份 ) 后,-20 保存 IPTG(
如何迎接 临床基因诊断实验室 验收
如 何 迎 接 临 床 基 因 诊 断 实 验 室 验 收 江 苏 省 临 床 检 验 中 心 许 斌 质 量 管 理 的 历 史 质 量 控 制 (Quality Control,QC) 良 好 实 验 室 实 践 准 则 (Good Laboratory Practice,GLP), 质 量 保 证 (Quality assurance, QA) 质 量 体 系 认 证 及 实 验 室 认 可
:TGF-β bfgf 23 KEY WORDS:transforminggrowthfactor-β ;basicfibroblastgrowthfactor; bonemarrow mesenchymalstemcels;eukaryoticexpressionvector; liposomet
2 ( )208 58 JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)208,Vol.58No. TGF-β bfgf,, 2 (., 330006; 2., 5040) : -β (TGF-β ) (bfgf) (BMSCs), SD BMSCs Percol PCR TGF-β bfgf, pcdna3.(+), 3 BMSCs RT-PCR Westernblot
（精校版）陕西省语文卷文档版（含答案）-2011年普通高等学校招生统一考试.doc
绝 密 启 封 前 2015 年 普 通 高 等 学 校 招 生 全 国 统 一 考 试 生 物 试 题 ( 江 苏 卷 ) 一 单 项 选 择 题 : 本 部 分 包 括 20 题, 每 题 2 分, 共 计 40 分 1. 下 列 关 于 淀 粉 脂 肪 蛋 白 质 和 核 酸 4 种 生 物 分 子 的 叙 述, 正 确 的 是 ( ) A. 都 能 被 相 应 的 酶 水 解 B. 都 是
2
ISSN 0255-6162 GPN 2006900031 287 93 11 20 161-2 02 26531318 http://www.nlfd.gov.tw 1 2 3 287 4 287 5 44 93 13 1 monocrotophos 0.40 ppm 105 1300 99% 6 3 44 106 93 13 1 0.40 ppm 403 40 7 DNA (HPLC) DNA
四折特惠区目录号 规格 批号 到期日 库存 2014 目录价 特惠价 ER1951 AjuI 100 units /3/ ER1951 AjuI 100 units /3/ ER0725 BclI 3
三折特惠区目录号 规格 批号 到期日 库存 2014 目录价 特惠价 K1631 RevertAid H Minus First Strand cdna Synthesis Kit 20 react 00139956 2015/2/28 1 795 238 K1632 RevertAid H Minus First Strand cdna Synthesis Kit 100 react 00141899
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Code No. RR250A 研 究 用 TaKaRa qpcr Norovirus (GI/GII) Typing Kit 说 明 书 v201606da 目 录 内 容 页 码 制 品 说 明 1 制 品 内 容 2 保 存 2 试 剂 盒 外 所 需 仪 器 及 试 剂 2 使 用 注 意 事 项 3 操 作 注 意 事 项 3 使 用 GI & GII Positive Control DNA
目录 产品介绍 产品特点 试剂盒应用 产品质量控制 试剂盒内容 试剂盒组分信息 储存条件 注意事项 操作
Animal Tissue Direct qpcr Kit-SYBR Green I Animal Tissue Direct qpcr Kit-SYBR Green I Animal Tissue Direct qpcr Kit(UNG)-SYBR Green I For performing qpcr directly from animal tissue without prior DNA purification
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 40 94 88 82 77 72 67 62 57 53 48 44 40 37 33 29 26 23 20 17 14 11 8 39 94 88 82 77 71 66 61 57 52 48 44 40 36 32 28 25 22 18 15 12 9 7 38 94 88
《实验用小型猪环境条件》编制说明
中国实验动物学会团体标准 实验动物小鼠诺如病毒诊断方法 编制说明 联系人 : 岳秉飞 联系电话 :010-67095401 编制单位 : 中国食品药品检定研究院 时 间 : 2016 年 10 月 20 日 1 2 ~ 3 4 ~ 5 6 A B α μ μ μ 7 8 μ μ μ μ 9 μ μ 表 3 ELISA 检测重复性实验 血清号第一次第二次第三次血清号第一次第二次第三次 1 + + +
Jounal of Chinese Medicinal Mateials ml 10 ml 70% O G S G 70% mg /ml
2546 Jounal of Chinese Medicinal Mateials 40 11 2017 11 UPLC-DAD 28 * 310052 - UPLC-DAD 28 70% Agilent Eclipse Plus C 18 100 mm 2. 1 mm 1. 8 μm -0. 05 mol /L DAD 28 0. 001~ 0. 008 mg /g 88. 2% ~ 101. 5%
去 中 和 ; [3] 消 化 最 好 在 37 培 养 箱 或 室 温 25 以 上 的 环 境 下 进 行 消 化, 消 化 2--5 min 后, 把 培 养 瓶 放 在 显 微 镜 下 观 察, 发 现 胞 质 回 缩 细 胞 间 隙 增 大, 细 胞 变 圆 后, 立 即 将 培 养 瓶
![去 中 和 ; [3] 消 化 最 好 在 37 培 养 箱 或 室 温 25 以 上 的 环 境 下 进 行 消 化, 消 化 2--5 min 后, 把 培 养 瓶 放 在 显 微 镜 下 观 察, 发 现 胞 质 回 缩 细 胞 间 隙 增 大, 细 胞 变 圆 后, 立 即 将 培 养 瓶](/thumbs/42/23090277.jpg "去 中 和 ; [3] 消 化 最 好 在 37 培 养 箱 或 室 温 25 以 上 的 环 境 下 进 行 消 化, 消 化 2--5 min 后, 把 培 养 瓶 放 在 显 微 镜 下 观 察, 发 现 胞 质 回 缩 细 胞 间 隙 增 大, 细 胞 变 圆 后, 立 即 将 培 养 瓶")
第 一 节 细 胞 培 养 的 相 关 技 术 1 细 胞 的 复 苏 概 述 复 苏 细 胞 要 求 快 速 融 化 的 手 段, 这 样 可 以 保 证 细 胞 外 结 晶 在 很 短 的 时 间 内 即 融 化 避 免 由 于 缓 慢 融 化 使 水 分 渗 入 细 胞 内 形 成 胞 内 再 结 晶 对 细 胞 造 成 损 害 用 品 培 养 液 吸 管 离 心 管 培 养 瓶 步 骤 [1]
目 录 产品介绍 产品特点 试剂盒应用 产品质量控制 试剂盒内容 试剂盒组分信息 Foregene Reverse Transcriptase...
RT-PCR Easy TM I(One Step) One-step RT-PCR Master Mix RT-PCR Easy TM II(Two Step) Two-step RT-PCR Master Mix RT-qPCR Easy TM I (One Step)-SYBR Green I One-step Real-Time RT-PCR Master Mix RT-qPCR Easy
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1-1达安基因招股书_定稿_.doc
2,200 A [2004]119 2004 7 23 A 2,200 7.30 / 2004 7 22 1400-1800 2004 7 20 1 http://www.smers.com.cn http://www.stock2000.com.cn 2 2004 7 20 DAANGENECO. LTD.OFSUNYAT-SENUNIVERSITY 12 13 15 15 16 16 19
《自然》新方法解决癌症50年纷争
实 时 定 量 PCR: 了 解 影 响 CT 的 关 键 因 素 影 响 CT 值 的 因 素 CT( 阈 值 循 环,Threshold Cycle) 是 扩 增 曲 线 和 阈 值 线 的 交 叉 点 ( 图 1B) 它 是 PCR 反 应 中 模 板 浓 度 的 相 对 测 量 除 了 模 板 浓 度 外, 还 有 许 多 因 素 会 影 响 CT 的 绝 对 值 我 们 将 要 讨 论 最
FOREGENE RT-PCR Easy Instruction Manual RT-PCR Easy TM I(One Step) Cat.No.RT-02011/02012 One-step RT-PCR Master Mix RT-PCR Easy TM II(Two Step) Cat.No
RT-PCR Easy TM I(One Step) Cat.No.RT-02011/02012 One-step RT-PCR Master Mix RT-PCR Easy TM II(Two Step) Cat.No.RT-02021/02022 Two-step RT-PCR Master Mix RT-qPCR Easy TM I (One Step)-SYBR Green I Cat.No.RT-02111/02112
材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析
生物技术通报 黄艳燕 黄靖华 卢福芝 孙靓 彭立新 周兴 黄日波 利用 的方法从鼠李糖乳杆菌基因组 中扩增到 乳酸脱氢酶基因 并连接到载体 上 构建表达质粒 将重组质粒 转化大肠杆菌 重组菌株经 诱导表达 电泳分 析表明 在大肠杆菌中实现了表达 表达产物的分子量约为 同时采用紫外分光光度法测定 乳酸脱氢酶的酶活 测得重组菌株的 乳酸脱氢酶活力为 最适反应温度为 最适 乳酸脱氢酶 克隆 表达 鼠李糖乳杆菌
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miprofile mirna qpcr Primer Manual and Validation Report For quantitative detection of mature mirna with All-in-One mirna qrt-pcr Detection Kit Catalog number: HmiRQP9071 GeneCopoeia, Inc. 广州复能基因有限公司 地
目 录 产品介绍 产品特点 试剂盒应用 产品质量控制 试剂盒内容 试剂盒组分信息 储存条件 注意事项 操
Mouse Tail Direct qpcr Kit-SYBR Green I Mouse Tail Direct qpcr Kit-SYBR Green I Mouse Tail Direct qpcr Kit(UNG)-SYBR Green I For performing qpcr directly from mouse tail or earwithout prior DNA purification
Phanta
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase P505-d1/d2/d3 www.vazyme.com Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 7.1 目录 Contents www.vazyme.com 01/ 产品概述... 02 02/ 产品组分... 02 03/ 保存条件... 02 04/ 单位定义... 02 05/
DOI: /j.cnki.bingduxuebao CHINESEJOURNALOF VIROLOGY Vol.34 No.1 January 2018 RT-PCR *,,,,,, (, ) : (ZIKV virus,zikv) (
34 1 2018 1 DOI:10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003304 CHINESEJOURNALOF VIROLOGY Vol.34 No.1 January 2018 RT-PCR *,,,,,, (, 102206) : (ZIKV virus,zikv) (Denguevirus,DENV) (Chikungunyavirus,CHIKV) ZIKV NS1
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System User Bulletin: StepOne™ System Updates (PN A / SN 117UB20-01)
Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System ЪßÕ ³Ê Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System StepOne 2007 3............................................................... 2...............................................................
实时定量PCR的全套解决方案
08-03 ScriptMAX TM Thermo T7 Transcription Kit (Code No.:TSK-101) 使用说明书 科研用 TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN 目 录 1 前言... 1 2 试剂盒内容... 2 3 试剂盒以外所需物品... 2 4 模板 DNA 的准备... 3 5 RNA 的合成...
/. : 2008.10 ISBN 978-7-81086-588-3 Ⅰ. Ⅱ. Ⅲ. - Ⅳ. R155 CIP (2008) 149577, 17 710032 029-84776765 029-84776764 2008 10 1 2008 1
/. : 2008.10 ISBN 978-7-81086-588-3 Ⅰ. Ⅱ. Ⅲ. - Ⅳ. R155 CIP (2008) 149577, 17 710032 029-84776765 029-84776764 http://press.fmmu.sn.cn 2008 10 1 2008 10 1 787 1092 1/16 13.5 150 ISBN 978-7-81086-588-3/R
FOREGENE Animal Tissue Direct qpcr Kit-SYBR Green I Instruction Manual Animal Tissue Direct qpcr Kit-SYBR Green I Cat.No.DQS-0111T/01111/01112/01113 A
Animal Tissue Direct qpcr Kit-SYBR Green I Cat.No.DQS-0111T/01111/01112/01113 Animal Tissue Direct qpcr Kit(UNG)-SYBR Green I Cat.No.DQS-0112T/01121/01122/01123 For animal tissue direct qpcr using 10mg
产品信息 Thermo Scientific Luminaris HiGreen Low ROX qpcr 预混液 #K µl 体系可进行 250 次反应批号有效期 -20 C 避光贮存 1
产品信息 Thermo Scientific Luminaris HiGreen Low ROX qpcr 预混液 #K0971 20 µl 体系可进行 250 次反应批号有效期 -20 C 避光贮存 www.thermoscientific.com/onebio 1 分析证书 经质检确保该产品不含脱氧核糖核酸内切酶 脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶 以人类基因组 DNA 10 倍梯度稀释液为模板,
Microsoft Word - Human qPCR 引物验证报告模板.doc
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Gel Free cloning TM 不跑胶载体构建试剂盒 Gel Free Cloning TM Kit Gel Free cloning 技术是一种简单 快速并且高效的载体构建技术, 可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点 该技术不受酶切位点限制, 也不需要线性化质粒, 只需要两步 PCR 即可将目的片段构建到载体的任意位点, 具有省时, 简便的特点 克隆阳性率可达 90% 以上 Gel Free
X MGC X 22 X 23 X MGC X BALB/c 26 X MGC X MGC X MGC X..
1 0 3 8 4 9726023 UDC X MGC80-3 2000 7 2000 7 2000 7 2000 6 22.3.4...11..11 12 13 15 15 20 20 X MGC80-3. 22 X 22 X 23 X MGC80-3.23 X BALB/c 26 X MGC80-3.27 X MGC80-3 28 29 29 30 31 32 33 X MGC80-3 34 X..34.35.36
Real-time PCR 原理
Real-time PCR Xiao Jin Applied Specialist Molecular & Cellular Biology Real-time PCR 原 理 数 学 原 理 化 学 原 理 Real-time PCR 应 用 绝 对 定 量 相 对 定 量 等 位 基 因 分 型 阴 阳 性 判 定 microrna 荧 光 定 量 PCR 数 学 原 理 基 线 阈 值 Ct
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FOREGENE Serum(Plasma) Direct qpcr Kit-Taqman Instruction Manual Serum(Plasma) Direct qpcr Kit-Taqman Cat.No.DQT-0411T/04111/04112/04113 Serum(Plasma)
Serum(Plasma) Direct qpcr Kit-Taqman Cat.No.DQT-0411T/04111/04112/04113 Serum(Plasma) Direct qpcr Kit(UNG) -Taqman Cat.No.DQT-0412T/04121/04122/04123 For fast blood direct qpcr using serum, plasma For
材料與方法
10-12 250-350 Sprague-Dawley rat ( SD ) 12 ( AM 8 00-PM 8 00 ) (Control group) (HS) (Heat shock group) 15 0 4 6 16 24 (PAE) ( Pulmonary air embolism group) 20 40 (25 l/min) 40 17 20 (HS&PAE) 15 4 16 20
AL-M200 Series
NPD4754-00 TC ( ) Windows 7 1. [Start ( )] [Control Panel ()] [Network and Internet ( )] 2. [Network and Sharing Center ( )] 3. [Change adapter settings ( )] 4. 3 Windows XP 1. [Start ( )] [Control Panel
FOREGENE Zebra Fish Direct qpcr Kit-SYBR Green I Instruction Manual Zebra Fish Direct qpcr Kit- SYBR Green I Zebra Fish Direct qpcr Kit-SYBR Green I Z
Zebra Fish Direct qpcr Kit- SYBR Green I Zebra Fish Direct qpcr Kit-SYBR Green I Zebra Fish Direct qpcr Kit(UNG)-SYBR Green I For performing qpcr directly from zebra fish tissue without prior DNA purification
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BD-ES6600C Made in Japan P.366 ... 3... 7... 7... 8... 9... 10... 12... 13... 14... 15... 16... 18... 19... 20... 21... 22... 24... 25... 26... 28... 29... 30... 32... 33... 33... 33... 34... 34... 35...
Syngene GBOXHR Retsch MM400 KQ DE Eppendorf Table 1 The sources of Astragali Radix and Hedysarum Radix No. 1 AMM2011_NMGTY Astr
PCR 龙平, 崔占虎, 李虔全, 徐建平, 张春红, 周立社 * *, 李旻辉 ( 包头医学院, 内蒙古包头 014060) DNA 30 28 DNA trnl-trnf PCR PCR 136 bp 323 bp 10% PCR PCR Astragalus membranaceus Fisch. Bge. var. mongho- licus Bge. Hsiao A. membranaceus
2010 Q4 SPL
CELL CULTURE 系列 Flask 系列 25 T 70125 5/200 75T 70175 5/100 175T 72175 5/40 25 T, filter 70025 5/200 75 T, filter 70075 5/100 175 T, Filter 71175 5/40 Cell culture dish 系列 3.5 cm dish 20035 10/500 6 cm dish
Table of Contents 目录 Introduction 1 Limitations of the Product 1 Materials Provided and Storage 3 Other Supplies Required 3 Precaution 5 QC Testing 5
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FOREGENE Real Time PCR Easy TM Taqman Instruction Manual Real Time PCR Easy TM -Taqman Cat.No.QP-01021/01022/01023/01024 For qpcr using cdna,purified
Real Time PCR Easy TM -Taqman Cat.No.QP-01021/01022/01023/01024 For qpcr using cdna,purified DNA For research use only Store at -20 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 1/14 目 录 产品介绍........
<4D6963726F736F667420506F776572506F696E74202D20A5FEB279ACECA7DEADB2A95243322DA5CDA4C6ACECA7DEA4A7BDC4C0BB>
全 球 科 技 革 命 生 化 科 技 之 衝 擊 劉 承 揚 http://mail.tku.edu.tw/cyliu/ 生 化 科 技 之 衝 擊 基 因 解 碼 基 因 工 程 的 產 物 基 因 療 法 微 生 物 與 複 製 人 奈 米 生 醫 技 術 晶 片 科 技 生 化 科 技 的 衝 擊 1 細 胞 典 型 動 物 細 胞 中 各 個 胞 器 :⑴ 核 仁 ;⑵ 細 胞 核 ;⑶
Microsoft PowerPoint - Real-time PCR原理与应用 [兼容模式]
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荧 光 定 量 PCR 技 术 的 原 理 与 应 用 张 晓 辉 张 晓 辉 PCR 产 品 经 理 北 京 元 业 伯 乐 科 技 发 展 有 限 公 司 提 纲 荧 光 定 量 PCR 技 术 原 理 荧 光 化 学 物 质 简 介 定 量 PCR 技 术 延 伸 基 因 分 型 (SNP) 检 测 熔 解 曲 线 分 析 荧 光 定 量 PCR 技 术 应 用 常 规 PCR 技 术 : 常
g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min
25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 1. 2. 3. 4. 2 4 1. 2. 3. 4. 3. 4. 5. 6. 7 4. 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 1. 2. 3. 4. 3. 4. 5. 6. 1. 2. 3. 1. 2. 23 3. 1. 2. 3. 1. 2. 1. 2. C 3. 4. 5. 1. 2. 3. 1. 2. 3. 4.
Phire Hot StartII DNA 聚合酶
重 要 提 示 Phusion 人 源 样 本 直 接 PCR 试 剂 盒 产 品 货 号 :F-150,200rxns x 20μl 变 性 温 度 为 98 C 退 火 温 度 与 众 多 常 规 DNA 聚 合 酶 ( 如 Taq DNA 聚 合 酶 ) 不 同, 具 体 请 参 照 6.3 延 伸 时, 若 扩 增 子 片 段 1kb, 则 延 伸 时 间 设 定 为 15s 即 可 ; 若
Microsoft Word - Human miRNA qPCR 引物验证报告.doc
All-in-One TM mirna qpcr Primer Manual and Validation Report For quantitative detection of mature mirna with All-in-One TM mirna qrt-pcr Detection Kit Catalog number: HmiRQP9001 GeneCopoeia, Inc.; 广州复能基因有限公司
CyberScan ph/ion 510 ph/ion/mv 68X ver /99 Technology Made Easy
CyberScan ph/ion 510 ph/ion/mv 68X090811 ver 1.0 12/99 Technology Made Easy CyberScan ph 510 ph/mv/ CyberScan Ion 510 Ion/pH/mV/ PC510 : PC510 Eutech/ Oakton 65 778-6876 Eutech Eutech 2002 Eutech 1.0 1...3
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<4D F736F F D20312D3120D5D0B9C9CBB5C3F7CAE9A3A8C9EAB1A8B8E5A3A92E646F63>
创 业 板 风 险 提 示 本 次 股 票 发 行 后 拟 在 创 业 板 市 场 上 市, 该 市 场 具 有 较 高 的 投 资 风 险 创 业 板 公 司 具 有 业 绩 不 稳 定 经 营 风 险 高 退 市 风 险 大 等 特 点, 投 资 者 面 临 较 大 的 市 场 风 险 投 资 者 应 充 分 了 解 创 业 板 市 场 的 投 资 风 险 及 本 公 司 所 披 露 的 风 险
國防大學國防醫學院生理學研究所碩士論文
1. 6-8 Lewis 20 5 4 2. (dark adaptation) 24 (5A) 3. 24 (6) 1, 6, 12, 24 800-900 lux (dark recovery) 24 (5B) 1. 6-8 Lewis 20 5 4 2. (dark adaptation) 24 (5A) 3. 24 1, 6, 12, 24 800-900 lux (dark recovery)
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High Efficiency Particulate Air Filter HEPA CO 2 74 30 min 2 min CO 2 37 5 CO 2 CO 2 90 14 h) 3000 CO 2 4-20 -80-196 1000 2500 rpm Zeiss 70 1. 5 2. 3. 4. 15 20 1 2 3 4 2 NaOH 5 6 5 30 min
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农 学 学 报 2014,4(11):80-84 Journal of Agriculture www.caaj.org 海 带 属 配 子 体 DNA 提 取 及 ISSR-PCR 体 系 优 化 李 言, 崔 翠 菊, 罗 世 菊, 李 晓 捷, 赵 聚 萍, 赛 珊, 钱 瑞, 武 瑞 娜 ( 山 东 东 方 海 洋 科 技 股 份 有 限 公 司 / 国 家 海 藻 工 程 技 术 研 究
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分析证书 经质量检验确定该产品不含脱氧核糖核酸内切酶 脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶 以人类基因组 DNA 10 倍梯度稀释液为模板, 按照 25 µl 平行反应体系进行实时 PCR 产品性能检测, 证明线性分辨率超过 5 个数量级的动态范围 质量授权人 : Jurgita Zilinskiene
产品信息 Thermo Scientific Maxima SYBR Green qpcr 预混液 (2 ) 提供 ROX 溶液 #K0251 25 µl 体系可进行 200 次反应批号有效期 -20 C 避光储存 www.thermoscientific.com/onebio 1 分析证书 经质量检验确定该产品不含脱氧核糖核酸内切酶 脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶 以人类基因组 DNA 10 倍梯度稀释液为模板,
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福建农业学报 材料与方法 毒株 主要仪器 主要试剂 引物设计 的培养 反应条件的建立 荧光定量 检测临床样本 结果与分析
福建农业学报 林 甦 朱春华 陈 珍 刘斌琼 施少华 江 斌 蔡国漳 林 羽 黄 瑜 甦 男 硕士 助理研究员 主要从事病毒学和动物传染病学研究 福建农业学报 材料与方法 毒株 主要仪器 主要试剂 引物设计 的培养 反应条件的建立 荧光定量 检测临床样本 结果与分析 林 甦等 鸡 亚型白血病病毒荧光定量 检测方法的建立 福建农业学报 讨 论 林 甦等 鸡 亚型白血病病毒荧光定量 检测方法的建立 责任编辑
定量PCR之操作流程與注意事項
定 量 PCR 之 標 準 作 業 流 程 (SOP) 與 注 意 事 項 所 有 準 備 進 行 定 量 PCR 分 析 之 RNA 樣 本 必 須 全 程 儲 存 於 -80 度 C, 以 確 保 total RNA 的 完 整 性 ; 本 實 驗 流 程 中 採 用 QIAGEN RNeasy Mini - RNA Purification Kit (Cat No. 74104 與 74704)
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Ⅰ Ⅱ1 2 Ⅲ Ⅳ 1 1 2 3 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 ~ 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 ~ 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 ~ 46 47 ~ ~ 48 49 50 51 52 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63
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