实时定量PCR的全套解决方案

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境戊阮
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1 18-07 高效率逆转录试剂盒 First Strand cdna Synthesis Kit ReverTra Ace -α- (Code No. FSK-101) 使用说明书科研用 TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN

2 目录 1 简介 RT-PCR 法的原理试剂盒的组成操作步骤添付引物的说明处理 RNA 过程中的注意事项进行 RT-PCR 过程中的注意事项参考文献常见问题相关产品... 9 注意本产品为科研用试剂请勿作为诊断临床试剂使用此外, 对于本产品的有害性调查还不十分全面, 因此, 在使用过程中, 请严格遵守实验室作业的一般注意事项, 适当使用保护用品, 安全操作组分中的 5 RT Buffer 在溶解时, 可能会出现白色沉淀现象, 但不影响其品质此时, 请使用振荡器等仪器使其混合均匀, 等完全溶解后再使用保存各组分请均保存于 -20 条件下为了保证实验效果, 请在收到产品的一年之内使用完毕

3 1 简介将逆转录 (Reverse Transcription;RT) 反应和 PCR (Polymerase Chain Reaction) 反应组合在一起的 RT-PCR 法能够比较简便和迅速地检测来自多个样品的 RNA, 近年来作为一般的方法被广泛应用于 mrna 表达量高低长度等检测分析和 cdna 克隆中本公司利用基因工程学的方法改造了来自 M-MLV (Molony murine leukemia virus) 的逆转录酶, 去掉了阻碍合成长链 cdna 的 RNase H 活性, 开发出能够大幅度提高 cdna 合成能力的改良型酶 ReverTra Ace ReverTra Ace -α-(code No. FSK-101) 是以 ReverTra Ace 为核心酶的 First strand cdna 合成试剂盒由于本试剂盒包含了 RT 用引物及 Positive Control, 所以能够简单地进行逆转录反应也可以应用于手头上各种 DNA 聚合酶的 PCR 反应模板的制备例如, 通过和 High fidelity PCR 用酶,Long PCR 用酶等的结合, 能够进行目的性更强的 RT-PCR 本产品特征 1. 高 cdna 合成能力本产品中使用的 ReverTra Ace 是具有大幅度提高 cdna 合成能力的改良型酶, 已确认能够合成 14kb 以上的 cdna 2. 高检测灵敏度由于对 ReverTra Ace -α- 进行了最优化处理, 即便带入全量的逆转录反应液也不会对 PCR 反应造成阻碍, 所以可以使用各种 DNA 聚合酶, 在同一个离心管中进行 RT 反应和 PCR 反应 1

4 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 2 RT-PCR 法的原理 RT-PCR 法, 如图 1 所示 : 由从模板 RNA 开始合成 First Strand cdna 的逆转录反应步骤, 和以此 cdna 为模板合成 Second Strand cdna, 并对目的遗传基因片段进行扩增的 PCR 步骤组成 RNA Primer Reverse Transcriptase ReverTra Ace Reverse Transcription (Synthesis of the First Strand cdna) RT ReverTra Ace -α- 3 cdna 5 DNA Polymerase Synthesis of the Second Strand cdna DNA Polymerase Amplification PCR 图 1. RT-PCR 法的原理垂询电话 :

5 3 试剂盒的组成 No 组成成分 FSK 次份 1 ReverTra Ace 100μl 2 RNase lnhibitor(10u/μl) 100μl 3 5 RT Buffer( 含有 25mM MgCl2) 400μl 4 dntp Mixture( 各 10mM) 200μl 5 RNase Free H2O 1200μl 6 Oligo(dT)20(10pmol/μl) 100μl 7 Random Primer (25pmol/μl) 100μl 所有组分请均保存在 -20 条件下组分中的 5 RT Buffer 在溶解时, 可能会出现白色沉淀现象, 但不影响其品质此时, 请使用振荡器等仪器使其混合均匀, 等完全溶解后再使用 [ 添附的引物 ] Oligo(dT) (dt) 20-3 Random Primer 5 -(dn) 9-3 关于这些引物的选择, 请参照后面的添付引物的说明 (P7) 4 操作步骤 1. RNA 的热变性 ( 热变性步骤可消除 RNA 大多数二级结构, 从而使引物更容易结合因此, 对于容易形成高级结构的 RNA 可以提高逆转录的效率 ) RNase Free H2O (11-X)μl Primer( 任选以下一个种类 ) Random Primer * (25 pmol/μl) 1μl Oligo(dT) 20 * * (10 pmol/μl) 1μl 序列特异性下游引物 ** (10 pmol/μl) 1μl RNA( 任选以下一个种类 Yμl) Total RNA (1μg 以下 ) mrna (10~100 ng) 12μl 65,5min. 后, 立即置于冰上 3

6 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 2. 反应液配置 3. 逆转录反应试剂使用量第 1 步变性后的 RNA 溶液 12μl 5 RT Buffer 4μl dntp Mixture ( 各 10 mm) 2μl RNase Inhibitor (10 U/μl) 1μl ReverTra Ace *** 1μl *** Total Volume 20μl (30 10 min.) * min. **** 99 5 min. ***** 4 5 min. 瞬间离心 * 注使用随机引物时, 为了能够充分退火, 请在 30 条件下, 进行 10 分钟的培养 ** 作为模板使用 Positive Control RNA 的时候, 请使用 Control Primer R *** 请注意 : 请务必使用本试剂盒添附的 ReverTra Ace, 使用量 1μl/ 反应如果添加过量, 则不能充分进行热处理, 从而会阻碍 PCR 反应 **** 片段较长时, 可适当延长此步骤时间 (20-60min) ***** 由于逆转录酶在反应后和 cdna 结合, 所以请在 99 下进行 5 分钟的热处理 4. PCR 基本上遵从普通 DNA 聚合酶的使用方法以下介绍一般的使用例试剂使用量 (3. 逆转录反应的 ) 产物 20μl 灭菌蒸馏水 67μl 10 PCR Buffer * 10μl 序列特异性上游引物 (10 pmol/μl) 1μl ** 序列特异性下游引物 (10 pmol/μl) 1μl DNA 聚合酶 (2.5 U/μl) 1μl Total Volume 100μl PCR( 目的片段长度为 1 kb 左右 ) sec sec min. *** (30 循环 ) 取一部分样品, 进行琼脂糖凝胶电泳, 确认目的扩增片段的生成垂询电话 :

7 注 * 若购入的是 Mg 2+ 另外添付的产品, 请添加 Mg 2+ ** 已将序列特异的下游引物用于逆转录反应步骤的情况下, 请以 1μl 灭菌蒸馏水代替本步骤中的该引物 *** 根据使用的酶的不同调整延伸时间使用 Taq 聚合酶时, 如果目的片段长度超过 1 kb, 请以 1min./kb 为基准延长延伸时间 5 添付引物的说明请遵照以下标准, 选择逆转录反应的引物 1 序列特异性下游引物一般情况下, 当使用具有和模板 RNA 有互补性序列的引物时, 有必要事先了解目的片段的序列 2 Oligo(dT)20 只限于在具有 Poly(A)tail 的 mrna 逆转录反应中使用请不要在原核生物的 RNA 以及真核生物的 rrna trna 中使用 3 Random Primer 无论 Poly(A)tail 的有无, 一般情况下都可以使用通过 Random Primer 进行逆转录反应时, 能够利用任何成对的序列特异的引物进行 PCR 反应通过 Random Primer 进行逆转录反应时, 为了让引物充分退火, 请在 30 环境中温育 10 分钟 6 处理 RNA 过程中的注意事项 1. 抑制 RNase 的混入在 RT-PCR 法中, 抑制 RNase 的活性是非常重要的因此, 在避免从使用的器具和试剂中混入 RNase 的同时, 得到纯度较高的 RNA 也非常重要在注意实验环境的同时, 为防止从唾液和汗水带入 RNase, 建议使用口罩手套等防护用品 5

8 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 2. 关于器具类实验器具应尽可能将一次性塑料制品进行高温高压湿热灭菌后再使用使用玻璃器具时, 应进行干热灭菌, 或者在 0.1% Diethylpyrocarbonate (DEPC) 溶液中 37 条件下浸泡 12 小时, 再进行高温高压湿热灭菌 ( 分钟 ) 后使用 7 进行 RT-PCR 过程中的注意事项本产品按可利用 Total RNA trna mrna rrna 作为模板的思路设计但为确保无论在何种条件下都能得到高效的扩增产物, 建议使用纯度较高的 RNA 样品使用本公司的核酸抽提试剂盒 MagExtractor -RNA- (Code No.: NPK-201F) 和磁珠分离专用台架 Magical Trapper(Code No.:MGS-101) 能够在短时间内简便地配制高纯度的 Total RNA 8 参考文献 1. Takagi, M., Nishioka, M., Kakihara, H., Kitabayashi, M., Inoue, H., Kawakami, B., Oka, M., and Imanaka, T., Appl. Environ. Microbiol., 63, (1997) 垂询电话 :

9 9 常见问题 1. 不能确认扩增条带, 且扩增效率较差模板 RNA 引物 PCR 条件其它可能原因纯度不够模板量不够失活有高级结构 Tm 值过低序列不合适引物量太少 Mg 2+ 浓度低退火温度过高延伸时间短热循环仪工作不正常 RNase 的污染逆转录酶的量太多酶失活对策重新配制增加模板量增加 PCR 的循环次数重新配制使用频率较高时, 事先进行少量多管分装在 RT 中使用 Random Primer 将含有除酶以外试剂的 RT 反应液在 65 条件下加热 5min. 后冰浴 5min., 再进行 RT 反应降低退火温度或重新设计引物以不具有 Poly(A) tail 的 RNA 为模板时, 不能使用 Oligo(dT) 20 确认序列是否正确确认引物内或引物之间有无互补的领域确认 PCR 引物对是否没有结合在同一条带上使用和 RT primer 适合的量每一反应使用 10pmole 以上提高 Mg 2+ 浓度 ( 如 :2mM) 探讨 PCR 条件 ( 如 : 降低退火温度 2~5 ) 探讨 PCR 条件 ( 如 : 将延伸时间设置为 1min./kb) 确认热循环仪工作是否正常重新配制模板 RNA 模板 RNA 变性时添加预先准备的 RNase Inhibitor 使用新的试剂每次反应, 使用 1μl 添附的 ReverTra Ace 使用新的试剂 7

10 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 2. 非特异性条带较多模板 RNA 引物 PCR 条件其它可能原因模板量过多基因组 DNA 的污染目的片段以外含有其他可使引物较容易退火的领域序列不合适引物量不合适 Mg 2+ 浓度过高退火温度过低样品间的交叉污染对策减少模板量将没有进行逆转录反应的 Negative Control RNA 同时进行 PCR 进行 DNase I 处理重新设计引物重新设计引物探讨引物用量降低 Mg 2+ 浓度 ( 如 :1mM) 提高退火温度 (2~5 ) 探讨 2 步法 step down PCR 经常更换 TIP 头使用过滤 TIP 头区分配制 RT-PCR 反应液的器具和进行电泳的器具区分配制 RT-PCR 反应液的配制场所和电泳场所垂询电话 :

11 10 相关产品试剂盒组分单卖品品名包装保存 Code No. ReverTra Ace < 高效率逆转录试剂 > 10,000 U TRT ,000U TRT-101T RNase Inhibitor(Recombinant type) 2,500 U -20 SIN mm dntps 各 2μmoles /0.2ml -20 NTP-301 Oligo(dT) 20 1 nmole -20 FSK-201 Random Primer(9mer) 2.5 nmoles -20 FSK-301 RNA 抽提相关试剂及仪器 MagExtractor -RNA- <Total RNA 抽提用试剂盒 > 100 次份 50 次份 4 NPK-201F Magical Trapper < 磁珠分离用台架 > 1 个室温 MGS-101 其他 RT-PCR 试剂盒 RT-PCR Quick Master Mix < 使用 Tth DNA Pol. 的 1-step RT-PCR Kit> ReverTra Dash < ReverTra Ace+KOD Dash 的高效率 RT-PCR Kit> ReverTra -Plus- < ReverTra Ace+KOD -Plus- 的高保真性 RT-PCR Kit> Realtime PCR 相关试剂 ReverTra Ace qpcr RT Kit <Realtime PCR 用 cdna 合成试剂盒 > Realtime PCR Master Mix <Realtime PCR 用 Master Mix(Probe 检测用 )> SYBR Green Realtime PCR Master Mix <Realtime PCR 用 Master Mix(SYBR Green Ⅰ 检测用 )> SYBR Green Realtime PCR Master Mix -plus- < Realtime PCR 用 Master Mix(SYBR GreenⅠ 检测用 )> THUNDERBIRD Probe qpcr Mix < 各种荧光 Probe 荧光 Primer 检测用 Realtime PCR 试剂 > THUNDERBIRD SYBR qpcr Mix < SYBR GreenⅠ 检测用 Realtime PCR 试剂 > 50 次份 -20 PCR 次份 -20 PCR 次份 -20 PCR 次份 -20 FSQ-101 1ml 5 支 -20 QPK-101 1ml 5 支 -20 QPK-201 1ml 5 支 -20 QPK-212 1ml 1 支 1.67ml 3 支 1ml 1 支 1.67ml 3 支 QPS-101T QPS-101 QPS-201T QPS

13 [ 制造销售商 ] 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司上海市浦东新区张杨路 500 号华润时代广场 28 楼 AL 邮编 : 产品内容技术相关咨询 Tel: Fax: tech@bio-toyobo.cn

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实时定量PCR的全套解决方案 11-05 高效率逆转录试剂盒 First Strand cdna Synthesis Kit ReverTra Ace -α- (Code No. FSK-100,FSK-101) 使用说明书科研用 TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN 目录 1 简介...1 2 RT-PCR 法的原理...2 3 试剂盒的组成...3 4 操作步骤...5