224 2014, Vol.35, No.01 食 品 科 学 营 养 卫 生 米 糠 甾 醇 对 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 炎 大 鼠 的 治 疗 作 用 王 一 然 1,2, 贺 兰 3, 刘 进 辉 4, 徐 芳 1,2, 刘 湘 新 4, 贺 建 华 2, * (1. 湖 南 农 业 大 学 食 品 科 学 技 术 学 院, 湖 南 长 沙 410128;2. 湖 南 农 业 大 学 动 物 科 学 技 术 学 院, 湖 南 长 沙 410128; 3. 益 阳 市 赫 山 区 沧 水 铺 人 民 医 院, 湖 南 益 阳 413064; 4. 湖 南 农 业 大 学 动 物 医 学 院, 湖 南 长 沙 410128) 摘 要 : 目 的 : 研 究 米 糠 植 物 甾 醇 对 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 炎 (non-alcoholic steatohepatitis,nash) 大 鼠 的 干 预 治 疗 作 用 方 法 : 实 验 选 用 50 只 健 康 SD 雄 性 大 鼠, 随 机 分 为 正 常 对 照 组 NASH 模 型 组 和 米 糠 甾 醇 低 中 高 3 个 剂 量 组 (65 130 195 mg/kg) 高 脂 饲 料 饲 喂 造 模, 各 实 验 组 同 时 进 行 米 糠 甾 醇 溶 液 灌 胃 干 预 13 周 后 观 察 各 组 大 鼠 肝 组 织 病 理 学 特 点, 测 定 血 清 中 血 脂 总 胆 固 醇 甘 油 三 酯 高 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 低 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 含 量 和 谷 丙 转 氨 酶 谷 草 转 氨 酶 一 氧 化 氮 合 酶 和 超 氧 化 物 歧 化 酶 活 性, 并 比 较 各 组 肝 脏 指 数 和 脾 脏 指 数 结 果 : 肝 脏 组 织 切 片 观 察 到 NASH 模 型 组 有 明 显 的 肝 细 胞 脂 肪 变 性 和 炎 症 聚 集 浸 润, 米 糠 甾 醇 各 治 疗 组 肝 组 织 病 变 呈 现 不 同 程 度 减 轻 NASH 模 型 组 血 清 高 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 含 量 超 氧 化 物 歧 化 酶 一 氧 化 氮 合 酶 谷 丙 转 氨 酶 和 谷 草 转 氨 酶 活 性 与 正 常 对 照 组 相 比, 均 表 现 出 明 显 异 常 ; 米 糠 甾 醇 各 剂 量 组 与 NASH 模 型 组 比 较, 血 清 谷 丙 转 氨 酶 显 著 降 低 (P<0.001) 谷 草 转 氨 酶 / 谷 丙 转 氨 酶 比 值 显 著 升 高 (P<0.01); 低 剂 量 组 血 清 超 氧 化 物 歧 化 酶 (P<0.05) 和 一 氧 化 氮 合 酶 (P<0.001) 显 著 降 低 ; 中 剂 量 组 血 清 高 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 显 著 升 高 (P<0.05) 结 论 : 米 糠 甾 醇 对 大 鼠 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 炎 有 预 防 与 治 疗 作 用 关 键 词 : 米 糠 甾 醇 ; 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 炎 ; 血 脂 ; 抗 氧 化 ; 谷 草 转 氨 酶 / 谷 丙 转 氨 酶 ; 肝 脏 组 织 切 片 Rice Bran Sterol Ameliorates Non-alcoholic Steatohepatitis in Rats WANG Yi-ran 1,2, HE Lan 3, LIU Jin-hui 4, XU Fang 1,2, LIU Xiang-xin 4, HE Jian-hua 2, * (1. College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 3. Cangshuipu Hospital of Heshan District of Yiyang, Yiyang 413064, China; 4. College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China) Abstract: Aim: To investigate the effect of rice bran sterol (RBS) on non-alcoholic steatohepatitis (NASH) in Sprague-Dawley (SD) rats caused by feeding high-fat diet for 13 weeks. Methods: Totally 50 male SD rats were randomly assigned to control group, NASH group and three RBS treatment groups at doses of 65, 130 mg/kg and 195 mg/kg. The NASH group and RBS treatment groups were fed with high-fat diet and the RBS groups were administered with RBS by gavage at the same time. Two percent Tween-80 was added to improve the solubility of RBS. After feeding for 13 weeks, serum total cholesterol (TC), triglyceride (TG), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and the activities of serum glutamic-pyruvic transaminase (ALT), glutamic-oxalacetic transaminease (AST), nitric oxide synthetase (NOS) and superoxide dismutase (SOD) were measured, and organ indexes were compared among groups. Results: Severe steatosis in the NASH group was observed through examining pathological slice of the liver. Serum HDL-C, SOD, NOS, ALT and AST levels in the NASH group significantly abnormal when compared with those in the control group. Serum HDL-C level of the RBS middle-dose group was significantly increased (P < 0.05) and serum ALT levels of all RBS treatment groups were decreased (P < 0.001), while AST/ALT ratio was increased when compared with the NASH group (P < 0.01). Serum SOD and NOS activities in the low-dose group were significantly decreased when compared with those in the NASH group. Conclusion: Moderate dosage of rice bran sterol can ameliorate NASH in rats caused by long-term high-fat diet feeding. Key words: rice bran sterol; non-alcoholic steatohepatitis; serum lipids; antioxidation; glutamic-oxalacetic transaminease/ glutamicpyruvic transaminase ratio; liver tissue slice 中 图 分 类 号 :R151.3 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 :1002-6630(2014)01-0224-05 doi:10.7506/spkx1002-6630-201401044 收 稿 日 期 :2013-01-22 基 金 项 目 : 科 技 部 国 际 科 技 合 作 项 目 (2009DFA32350) 作 者 简 介 : 王 一 然 (1984 ), 女, 硕 士 研 究 生, 研 究 方 向 为 营 养 与 健 康 E-mail:yiran.share@gmail.com * 通 信 作 者 : 贺 建 华 (1963 ), 男, 教 授, 博 士, 研 究 方 向 为 植 物 功 能 成 分 利 用 E-mail:jianhuahy@hunau.net
营 养 卫 生 食 品 科 学 2014, Vol.35, No.01 225 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 病 (non-alcoholic fatty liver disease,nafld) 是 一 种 由 肝 细 胞 脂 肪 变 性 发 展 到 炎 症 肝 纤 维 化 的 一 组 疾 病 随 病 程 进 展 表 现 不 一, 包 括 单 纯 性 脂 肪 肝 (nonalcoholic simple fatty liver,nafl) 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 炎 (non-alcoholic steatohepatitis,nash) 肝 纤 维 化 及 其 肝 硬 化 和 隐 源 性 肝 硬 化 3 个 阶 段 [1] 其 中 NASH 降 低 了 同 患 心 血 管 疾 病 的 NASH 患 者 的 存 活 率, 升 高 了 同 患 Ⅱ 型 糖 尿 病 的 NASH 患 者 罹 患 肝 癌 的 风 险 [2],NAFL 和 NASH 是 一 个 连 续 病 变 过 程, 如 在 NASH 形 成 前 积 极 干 预, 可 预 防 NASH 的 形 成 及 减 少 肝 纤 维 化 及 其 相 关 肝 硬 化 的 发 生 植 物 甾 醇 及 其 衍 生 物 广 泛 应 用 于 食 品 与 美 容 行 业, 因 其 明 显 的 降 脂 降 胆 固 醇 作 用, 近 年 来 更 作 为 营 养 添 加 剂 得 到 人 们 关 注 [3-4] 大 量 研 究 结 果 显 示, 植 物 甾 醇 具 有 预 防 和 治 疗 心 血 管 疾 病 作 用, 而 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 病 是 导 致 心 血 管 疾 病 的 危 险 因 素 [5-6] [7] Xu Zuyuan 等 研 究 发 现 apoe(-/-) 小 鼠 在 长 期 的 植 物 甾 醇 处 理 下, 能 改 变 apoe(-/-) 小 鼠 肝 脏 的 基 因 表 达, 其 作 用 机 制 可 能 [8] 与 植 物 甾 醇 抑 制 胆 固 醇 的 吸 收 有 关 Calpe-Berdiel 等 用 全 基 因 组 测 序 和 聚 合 酶 链 式 反 应 法 研 究 了 植 物 甾 醇 对 apoe(-/-) 小 鼠 的 小 肠 和 肝 脏 的 作 用, 结 果 发 现, 所 有 类 型 小 鼠 的 肠 胆 固 醇 吸 收 都 有 降 低, 而 血 浆 胆 固 醇 的 降 低 只 发 生 于 apoe(-/-) 和 LDLR(-/-) 小 鼠 Hirai [9] 等 用 雌 性 大 鼠 研 究 了 膳 食 脂 肪 和 植 物 甾 醇 对 血 清 脂 肪 酸 成 分 和 脂 蛋 白 胆 固 醇 的 影 响, 结 果 显 示, 添 加 5% 植 物 甾 醇 到 含 10% 黄 油 - 胆 固 醇 膳 食 里, 减 少 了 原 有 总 胆 固 醇 水 平, 升 高 了 高 密 度 脂 蛋 白 与 低 密 度 脂 蛋 白 + 极 低 密 度 脂 蛋 白 的 比 值 米 糠 是 稻 谷 加 工 的 副 产 品, 我 国 年 产 量 约 1 000 万 t, 居 世 界 之 首, 但 比 起 发 达 国 家, 我 国 米 糠 的 经 济 利 用 效 率 仍 有 一 定 差 距 米 糠 油 比 大 豆 油 含 有 更 丰 富 的 植 物 甾 醇, 主 要 成 分 为 谷 甾 醇 豆 甾 醇 和 菜 油 甾 醇 [10-11], 米 糠 油 提 取 的 米 糠 植 物 甾 醇 具 有 众 多 生 物 活 性 作 用, 糠 甾 醇 片 也 是 我 国 特 殊 的 牙 科 用 药, 可 治 疗 牙 周 炎 等 牙 疾 病, 具 有 良 好 消 炎 功 效 鉴 于 米 糠 的 上 述 作 用 和 特 性, 课 题 组 认 为 米 糠 甾 醇 (rice bran sterol,rbs) 可 能 对 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 炎 大 鼠 具 有 干 预 治 疗 作 用 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 与 试 剂 体 质 量 160~190 g 的 健 康 成 年 雄 性 SD 大 鼠 50 只, 购 自 长 沙 市 开 福 区 东 创 实 验 动 物 科 技 服 务 部 ( 编 号 HNACSDC20120324; 许 可 证 号 SCXK( 湘 )2009-0012) 米 糠 甾 醇 ( 纯 度 :75%) 济 宁 安 康 制 药 有 限 责 任 公 司 造 模 用 高 脂 饲 料 配 方 原 料 : 基 础 饲 料 78.9% 猪 油 10% 全 脂 奶 粉 5% 蛋 黄 粉 5% 胆 固 醇 1% 猪 胆 盐 0.1% 基 础 饲 料 长 沙 东 创 实 验 动 物 科 技 服 务 部 ; 猪 油 自 制 ; 全 脂 奶 粉 伊 利 实 业 集 团 股 份 有 限 公 司 ; 蛋 黄 粉 :50% 自 制,50% 购 自 吉 林 金 翼 蛋 业 有 限 责 任 公 司 ; 胆 固 醇 ( 分 析 纯 ) 猪 胆 盐 北 京 索 莱 宝 科 技 有 限 公 司 超 氧 化 物 歧 化 酶 (superoxide dismutase,sod) 一 氧 化 氮 合 酶 (nitric oxide synthase,nos) 试 剂 盒 南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所 ; 甘 油 三 酯 (triglyceride,tg) 总 胆 固 醇 (total cholesterol,tc) 低 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 (low density lipoprotein cholesterol,ldl-c) 高 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 (high density lipoprotein cholesterol, HDL-C) 检 测 试 剂 盒 深 圳 迈 瑞 生 物 医 疗 电 子 股 份 有 限 公 司 ; 谷 丙 转 氨 酶 (alanine aminotransferase,alt) 谷 草 转 氨 酶 (aspartate aminotransferase,ast) 测 试 盒 ( 自 制 ) 1.2 仪 器 与 设 备 KQ2200DV 超 声 波 仪 昆 山 市 超 声 仪 器 有 限 公 司 ; Thermo1510 酶 标 仪 赛 默 飞 世 尔 科 技 ( 中 国 ) 有 限 公 司 ;BS200 全 自 动 生 化 分 析 仪 深 圳 迈 瑞 生 物 医 疗 电 子 股 份 有 限 公 司 ;5417R 低 温 高 速 离 心 机 美 国 Eppendorf 公 司 1.3 方 法 1.3.1 动 物 分 组 与 处 理 SD 系 雄 性 大 鼠, 随 机 分 成 5 组, 每 组 10 只 :Ⅰ 组 为 正 常 对 照 组,Ⅱ 组 为 NASH 模 型 组,Ⅲ 组 Ⅳ 组 和 Ⅴ 组 分 别 为 RBS 低 中 高 剂 量 组 (65 130 195 mg/kg) 美 国 食 品 药 品 监 督 总 局 推 荐 人 每 天 至 少 摄 入 1.3 g 植 物 甾 醇 酯 (0.8 g 植 物 甾 醇 ) [12], 实 验 组 米 糠 甾 醇 低 剂 量 根 据 此 标 准 折 算 (0.8 g/70 kg 6) 适 应 性 饲 喂 7 d 后 开 始 造 模,Ⅰ 组 饲 喂 普 通 饲 料,Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ 组 饲 喂 高 脂 饲 料, 于 造 模 日 开 始,Ⅰ 组 和 Ⅱ 组 灌 服 2% 吐 温 -80 溶 液, 米 糠 甾 醇 各 组 灌 服 含 2% 吐 温 -80 的 米 糠 甾 醇 溶 液 干 预, 连 续 13 周 1.3.2 米 糠 甾 醇 溶 液 的 制 备 米 糠 甾 醇 不 溶 于 水 和 油, 为 增 加 大 鼠 对 米 糠 甾 醇 的 吸 收 利 用, 用 2% 吐 温 -80 溶 液 作 为 米 糠 甾 醇 溶 剂 配 制 方 法 : 精 密 称 取 所 需 剂 量 米 糠 甾 醇 粉 末, 放 入 研 钵 内 不 间 断 研 磨 20 min 后, 边 研 磨 边 缓 慢 加 入 2% 吐 温 -80 溶 剂, 继 续 研 磨 至 充 分 混 匀 将 充 分 研 磨 混 匀 的 米 糠 甾 醇 溶 液 隔 水 放 入 超 声 波 仪, 超 声 0.5 h, 得 米 糠 甾 醇 混 悬 液, 冷 藏 保 存, 每 天 给 大 鼠 灌 胃 前 隔 水 加 热 至 35, 米 糠 甾 醇 溶 液 每 3 d 配 制 一 批 1.3.3 标 本 的 采 集 和 处 理 第 13 周 周 末 最 后 一 次 灌 胃 后, 禁 食 12 h, 称 体 质 量 4% 戊 巴 比 妥 钠 腹 腔 注 射 麻 醉, 使 用 真 空 采 血 管 进 行 心 脏 采 血, 解 剖 取 肝 脏 脾 脏 称 质 量 计 算 其 肝 脏 指 数 和 脾 脏 指 数 采 集 的 血 液 放 4 冰 箱 冷 藏 过 夜, 低 温 离 心 机 3 500 r/min 离 心 10 min, 取 上 层 血 清 放 -70 冷 冻 保 存 备 用 肝 脏
226 2014, Vol.35, No.01 食品科学 营养卫生 在称质量后立即放入4%甲醛溶液固定保存 数周后用石 呈大囊泡性 且大囊泡已融合形成脂囊 胞浆内脂滴将 蜡包埋切片 HE法染色 光镜下观察组织病理学变化 肝细胞核挤至细胞边缘 部分细胞核裂解并可观察到肝 1.3.4 细胞有气球样变形态 且细胞间无间隙 图1b中 指标测定 SOD NOS 实验第13周周末 心脏采血 4 3 500 r/min离心15 min 取上层血清 按试剂盒说明操作 血清血脂指标检测 实验第13周周末 心脏采血 4 3 500 r/min离心15 min 取上层血清 用全自动生 化分析仪检测TC TG LDL-C和HDL-C含量 ALT AST活力的测定按 基础生物化学实验方法和技术 [13] 中方法检测 1.3.5 数据处理方法 结果用 ±s表示 数据均采用SPSS 18软件进行单因 素方差分析并采用Limited Slip Differential LSD 进行 肝脏细胞形态结构正常 细胞核与胞浆完好 肝细胞索 结构清晰完整 血窦清晰 图1c中米糠甾醇低剂量组大 部分细胞形态正常 大多肝细胞胞浆清晰 可观察到的 肝细胞脂肪空泡较少 未观察到炎症的聚集浸润 图1d 中米糠甾醇中剂量组肝细胞脂肪变性程度明显低于NASH 模型组 未观察到炎症的聚集浸润 图1e中米糠甾醇高 剂量组肝细胞脂肪空泡较米糠甾醇低 中剂量组有所增 加 但大部分脂肪空泡还未融合 细胞核形态正常可 见 与图1a比较有明显差异 2.3 各组大鼠血清相关酶活性测定结果 多重比较 P 0.05为差异显著 P 0.01为差异极显著 表1 米糠甾醇对血清酶活性指标的影响 Table 1 2 2.1 结果与分析 肝脏解剖结构观察 正常对照组肝脏表面光滑 颜色深红 边缘清晰 NASH模型组肝脏体积明显肿大 色泽灰黄 肉眼可见明 显粗颗粒感 表面不光滑 米糠甾醇处理各剂量组肝脏 的大体解剖结构相对于NASH模型组都有一定程度改善 但与正常对照组比较仍可见脂肪性病变 2.2 肝脏组织学观察 a b Effect of RBS on serum enzyme activities 测定指标 正常对照组 NASH模型组 ALT活力/ IU/L AST活力/ IU/L 78.33±7.64 283.75±7.50 195±21.80 320.00±7.90 RBS低剂量组 RBS中剂量组 86.00±11.40*** 115.80±9.52*** 271.00±15.17*** 289.00±7.42** RBS高剂量组 131.00±7.42*** 337.00±17.18* AST/ALT比值 3.62±0.45 1.68±0.18 3.19±0.39*** 2.51±0.25** 2.58±0.18** NOS活力/ U/mL SOD活力/ U/mL 30.18±9.36 20.80±0.68 49.15±3.30 22.52±0.83 29.21±5.09*** 21.21±2.06* 45.60±5.65 22.31±0.80 49.23±1.83 22.49±1.04 注. 与正常对照组相比有显著性差异 P 0.05. 与正常对照组 相比有极显著性差异 P 0.01. 与正常对照组相比有高度显著 性 差 异 P 0.001 *. 与 NASH 模 型 组 有 显 著 性 差 异 P 0.05 **. 与 NASH 模型组有极显著性差异 P 0.01 ***. 与 NASH 模型组 有高度显著性差异 P 0.001 下同 如表1所示 与正常对照组比较 NASH模型组 ALT AST极显著升高 P 0.001 AST/ALT比值极 显著下降 P 0.001 与NASH模型组比较 米糠甾 醇各剂量组ALT和米糠甾醇低 中剂量组AST显著降低 P 0.05 P 0.01 P 0.001 米糠甾醇各组 AST/ALT比值明显升高 P 0.01 P 0.001 与正 c d 常对照组比较 NASH模型组NOS和SOD酶活性显著升 高 P 0.001 P 0.05 与NASH模型组比较 米糠甾 醇低剂量组NOS和SOD显著降低 P 0.001 P 0.05 2.4 各组大鼠血清血脂含量测定结果 表2 e Table 2 米糠甾醇对大鼠血清血脂水平的影响 Effect of RBS on serum lipids concentration in rats 测定指标 正常对照组 NASH模型组 RBS低剂量组 RBS中剂量组 RBS高剂量组 HDL-C含量/ mmol/l LDL-C含量/ mmol/l 1.06±0.18 0.83±0.18 0.84±0.20 0.93±0.23 0.96±0.13 1.15±0.20 1.03±0.15* 1.22±0.14* 0.88±0.08 1.11±0.25 TC含量/ mmol/l TG含量/ mmol/l 1.52±0.19 1.32±0.10 1.60±0.03 0.92±0.25 1.94±0.19* 0.95±0.21 2.31±0.26*** 0.97±0.30 1.87±0.17* 0.93±0.37 a. NASH模型组 b.正常对照组 c. RBS低剂 量组 d. RBS中剂量组 e. RBS高剂量组 图1 Fig.1 肝脏组织形态结构 200 Morphological structure of liver tissue ( 200) 如表2所示 与正常对照组比较 NASH模型组 HDL-C显著降低 P 0.01 与NASH模型组比较 米 如图1所示 图1a中可观察到炎症细胞聚集浸润 糠甾 醇 各 组 H D L - C 均 有 升 高 中 剂 量 组 有 统 计 学 意 义 P 0. 0 5 实验发现 在大鼠非酒精性脂肪性肝 肝细胞明显变大肿胀 细胞内脂滴形成的空泡 病肝炎阶段 NASH模型组LDL-C和TC水平与正常对
营 养 卫 生 食 品 科 学 2014, Vol.35, No.01 227 照 组 相 比 无 统 计 学 差 异, 而 米 糠 甾 醇 中 剂 量 组 LDL-C 水 平 和 米 糠 甾 醇 各 剂 量 组 TC 水 平 与 NASH 模 型 组 比 较 显 著 升 高 (P<0.05,P<0.001);NASH 模 型 组 TG 水 平 低 于 正 常 对 照 组 (P<0.05), 米 糠 甾 醇 各 剂 量 组 与 模 型 组 比 较 稍 有 升 高, 但 无 统 计 学 意 义 2.5 各 组 大 鼠 肝 脏 指 数 和 脾 脏 指 数 测 定 结 果 表 3 米 糠 甾 醇 对 大 鼠 器 官 指 数 的 影 响 Table 3 Effect of RBS on organ indexes of rats 测 定 指 标 正 常 对 照 组 NASH 模 型 组 RBS 低 剂 量 组 RBS 中 剂 量 组 RBS 高 剂 量 组 肝 脏 指 数 /(mg/10 g) 2.36±0.12 3.10±0.33 3.08±0.36 3.00±0.25 3.00±0.15 脾 脏 指 数 /(mg/10 g) 0.17±0.03 0.23±0.06 0.19±0.01 0.19±0.03 0.21±0.06 如 表 3 所 示,NASH 模 型 组 肝 脏 指 数 和 脾 脏 指 数, 与 正 常 对 照 组 比 较 都 显 著 升 高 (P<0.001 和 P<0.05), 米 糠 甾 醇 各 剂 量 组 的 肝 脏 指 数 和 脾 脏 指 数 与 NASH 模 型 组 比 较 均 有 下 降, 但 无 统 计 学 意 义 3 讨 论 3.1 米 糠 甾 醇 对 高 脂 饲 喂 大 鼠 肝 脏 组 织 显 微 结 构 的 影 响 肝 脏 是 脂 类 代 谢 的 重 要 器 官, 它 在 脂 类 的 吸 收 运 输 合 成 贮 存 分 解 等 过 程 中 均 起 到 重 要 的 作 用 长 期 摄 入 高 脂 肪 高 热 量 饮 食 会 导 致 肝 脏 脂 肪 代 谢 紊 乱, 严 重 的 脂 肪 肝 可 发 展 为 脂 肪 性 肝 炎 肝 纤 维 化 肝 硬 变 连 续 13 周 给 与 大 鼠 高 脂 饲 料 后, 肝 脏 组 织 显 微 组 织 结 果 显 示 : 正 常 对 照 组 肝 脏 细 胞 形 态 结 构 正 常, 细 胞 核 与 胞 浆 完 好, 肝 细 胞 索 结 构 清 晰 完 整, 血 窦 清 晰 NASH 模 型 组 肝 脏 脂 肪 变 性 严 重, 肝 细 胞 明 显 变 大 肿 胀, 细 胞 内 有 大 量 的 脂 滴 形 成 的 空 泡, 同 时 有 炎 症 细 胞 的 聚 集 浸 润 和 部 分 肝 细 胞 坏 死 给 予 米 糠 甾 醇 的 各 干 预 组 肝 细 胞 脂 肪 病 变 明 显 改 善, 大 部 分 细 胞 呈 小 泡 性 脂 肪 变 性, 无 炎 症 的 聚 集 浸 润 说 明 采 用 米 糠 甾 醇 干 预 后, 可 明 显 减 轻 由 高 脂 饮 食 导 致 的 脂 肪 肝 病 变, 减 缓 大 鼠 非 酒 精 性 脂 肪 肝 病 病 程 3.2 米 糠 甾 醇 对 高 脂 饲 喂 大 鼠 ALT 和 AST 活 性 的 影 响 ALT 主 要 存 在 于 肝 细 胞 浆 内, 其 细 胞 内 浓 度 高 于 血 清 中 1 000~3 000 倍 只 要 有 1% 的 肝 细 胞 坏 死, 就 可 以 使 血 清 酶 增 高 1 倍 因 此,ALT 被 世 界 卫 生 组 织 推 荐 为 肝 功 能 损 害 最 敏 感 的 检 测 指 标 [14] 造 模 13 周 后,NASH 模 型 组 ALT 活 性 大 大 升 高, 与 正 常 对 照 组 比 较, 差 异 极 显 著 (P<0.001) 米 糠 甾 醇 低 中 高 剂 量 组 ALT 活 性 虽 然 都 高 于 正 常 对 照 组, 但 大 大 低 于 NASH 组, 二 者 差 异 极 显 著 (P<0.001) AST 主 要 存 在 于 肝 细 胞 线 粒 体 内, 当 肝 脏 发 生 严 重 坏 死 或 破 坏 时, 才 能 引 起 AST 在 血 清 中 浓 度 偏 高 造 模 13 周 后,NASH 模 型 组 AST 活 性 升 高, 与 正 常 对 照 组 比 较 差 异 极 显 著 (P<0.001), 说 明 长 期 饲 喂 高 脂 饲 料, 可 导 致 肝 细 胞 严 重 的 损 伤 米 糠 甾 醇 低 中 剂 量 组 AST 活 性 低 于 NASH 模 型 组, 二 者 差 异 极 显 著 (P<0.01,P<0.001), 但 米 糠 甾 醇 高 剂 量 组 AST 水 平 高 于 NASH 模 型 组 (P<0.05), 其 原 因 还 需 进 一 步 讨 论 与 NASH 模 型 组 比 较, 米 糠 甾 醇 各 组 AST/ALT 比 值 均 显 著 升 高 (P<0.01,P<0.001), 一 般 认 为 正 常 范 围 内,AST/ALT 比 值 越 大, 肝 脏 越 健 康 [15] 实 验 结 果 表 明 : 一 定 剂 量 范 围 内 的 米 糠 甾 醇 能 显 著 降 低 高 脂 大 鼠 血 清 中 ALT 和 AST 活 性, 对 高 脂 饲 喂 下 的 大 鼠 肝 脏 细 胞 具 有 明 显 的 保 护 作 用 3.3 米 糠 甾 醇 对 高 脂 饲 喂 大 鼠 肝 脏 指 数 和 脾 脏 指 数 的 影 响 NASH 组 大 鼠 肝 脏 指 数 和 脾 脏 指 数 都 比 正 常 对 照 组 显 著 升 高 (P<0.001 和 P<0.05), 肝 脏 质 量 显 著 升 高, 符 合 NASH 病 症 特 点, 作 为 主 要 免 疫 器 官 之 一 的 脾 脏, 其 质 量 增 加 原 因 可 能 是 由 肝 脏 损 伤 累 及 或 肝 脏 炎 症 引 起 的 免 疫 应 答 所 致, 米 糠 甾 醇 各 剂 量 组 脏 器 指 数 比 NASH 模 型 组 均 有 下 降, 但 差 异 无 统 计 学 意 义 3.4 米 糠 甾 醇 对 高 脂 饲 喂 大 鼠 SOD 和 NOS 活 性 的 影 响 实 验 结 果 表 明 :NASH 模 型 组 血 清 SOD 值 与 正 常 对 照 组 比 较 显 著 升 高 (P<0.05), 此 结 果 与 Zhao Jiasheng [16] 等 的 研 究 结 果 一 致,NASH 大 鼠 血 清 SOD 值 显 著 升 高 可 能 是 由 肝 细 胞 坏 死 破 损 后 大 量 SOD 溢 出 入 血 所 致 ; 同 时 某 些 疾 病 也 会 导 致 血 清 抗 氧 化 指 标 升 高, 如 机 体 炎 症 和 免 疫 反 应, 会 产 生 大 量 超 氧 自 由 基, 诱 导 抗 氧 化 酶 的 生 成 [17], 说 明 在 肝 炎 阶 段, 机 体 需 要 更 多 抗 氧 化 酶 来 抵 御 氧 化 损 伤 米 糠 甾 醇 低 剂 量 组 血 清 SOD 值 比 NASH 模 型 组 显 著 降 低 (P<0.05), 中 高 剂 量 组 也 有 所 下 降, 提 示 米 糠 甾 醇 还 具 有 消 炎 和 / 或 清 除 自 由 基 作 用 NO 在 免 疫 系 统 中 发 挥 对 抗 细 菌 病 毒 肿 瘤 细 胞 等 病 原 体 的 作 用, 但 过 量 的 NO 也 会 起 到 毒 性 作 用 内 毒 素 细 胞 因 子 等 能 够 诱 导 巨 噬 细 胞 等 吞 噬 细 胞 激 活 NOS, 合 成 大 量 NO NASH 模 型 组 血 清 NOS 水 平 比 正 常 对 照 组 显 著 上 升 (P<0.001), 说 明 NOS 参 与 了 NASH 的 形 成 发 展 米 糠 甾 醇 低 剂 量 组 NOS 水 平 (29.21±5.09)U/mL 比 NASH 组 显 著 降 低 (P<0.001), 甚 至 低 于 正 常 对 照 组 水 平 (30.18±9.36)U/mL 而 血 清 NOS 的 升 高 与 降 低 在 NAFLD 病 程 不 同 阶 段 对 机 体 具 体 起 到 何 种 作 用, 还 需 进 一 步 研 究 3.5 米 糠 甾 醇 对 高 脂 饲 喂 大 鼠 血 脂 的 影 响 HDL-C 被 称 为 好 胆 固 醇, 有 抗 动 脉 粥 样 硬 化 等 作 用,NASH 模 型 组 血 清 HDL-C 比 正 常 对 照 组 显 著 降 低 (P<0.01),HDL-C 的 降 低 是 糖 尿 病 肝 炎 和 肝 硬 化 等 疾 病 的 典 型 病 症 ; 米 糠 甾 醇 中 剂 量 组 血 清 HDL-C 比 NASH 组 显 著 升 高 (P<0.05), 已 接 近 正 常 对 照 组 水 平, 说 明 该 组 与 NASH 模 型 组 比 较, 清 除 外 周 胆 固 醇 的 能 力 增 加 NASH 模 型 组 血 清 LDL-C 水 平 和 TC 水 平 与 正 常 对 照 组 比 较 无 显 著 差 异,NASH 模 型 组 血 清 TG 水 平 比 正
228 2014, Vol.35, No.01 食 品 科 学 营 养 卫 生 常 对 照 组 显 著 降 低 (P<0.05) 理 论 上 来 说, 高 脂 饲 料 饲 喂 进 行 造 模 时,NASH 模 型 组 其 血 清 TG 和 TC 指 标 应 该 高 于 正 常 对 照 组, 但 据 资 料 报 道 [18], 高 脂 高 胆 固 醇 饮 食 模 型 造 模 过 程 中, 早 期 各 项 血 脂 指 标 逐 步 上 升, 一 般 在 第 28 天 左 右 出 现 高 峰 值, 后 期 可 能 保 持 一 段 时 间 的 稳 定, 之 后 会 随 着 时 间 的 延 长 而 降 低 当 脂 肪 性 肝 病 进 一 步 发 展 到 肝 硬 化 时, 各 项 血 脂 水 平 下 降 越 明 显, 说 明 肝 脏 病 变 越 严 重 [19] [20] 本 研 究 结 果 与 张 志 平 等 研 究 结 果 相 似,NASH 模 型 组 大 鼠 血 清 TG 水 平 与 正 常 对 照 组 比 较 有 所 下 降 本 实 验 时 间 为 91d, 肝 脏 显 微 结 构 观 察 显 示 NASH 模 型 组 肝 脏 脂 肪 变 性 严 重, 伴 随 有 炎 症 细 胞 的 聚 集 浸 润 和 部 分 肝 细 胞 坏 死, 这 可 能 会 导 致 肝 脏 其 合 成 TC 和 TG 的 能 力 降 低, 因 此 也 就 导 致 了 NASH 模 型 组 TC 和 TG 水 平 与 正 常 对 照 组 比 较 无 差 异 甚 至 反 而 降 低 的 结 果, 但 具 体 原 因 还 需 要 进 一 步 研 究 米 糠 甾 醇 各 剂 量 组 血 清 TG 水 平 与 NASH 模 型 组 比 较 无 显 著 差 异, 说 明 米 糠 甾 醇 对 TG 无 明 显 干 预 作 用 米 糠 甾 醇 各 剂 量 组 LDL-C 和 TC 显 著 高 于 NASH 模 型 组 (P<0.05,P<0.001), 此 结 果 进 一 步 提 示 米 糠 甾 醇 对 大 鼠 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 病 可 能 起 到 了 延 缓 病 程 发 展 的 作 用 一 定 剂 量 范 围 内 的 米 糠 甾 醇 能 有 效 预 防 大 鼠 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 炎 参 考 文 献 : [1] FARRELL G C, LARTER C Z. Nonalcoholic fatty liver disease: from steatosis to cirrhosis[j]. Hepatology, 2006, 43(Suppl 1): 99-112. [2] DOWMAN J K., TOMLINSON J W, NEWSOME P N. Pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease[j]. QJM, 2010, 103: 71-83. [3] LING W H, JONES P J H. Dietary phytosterols: a review of metabolism, benefits and side effects[j]. Life Sci, 1995, 57: 195-206. [4] PIIRONEN V, LINDSAY D G, MIETTINEN T A, et al. Plant sterols: biosyn-thesis, biological function and their importance to human nutrition[j]. Sci Food Agric, 2000, 80: 939-966. [5] SILBERNAGEL G, GENSER B, NESTEL P, et al. Plant sterols and atherosclerosis[j]. Curr Opin Lipidol, 2013, 24(1): 12-17. [6] THIRUVAGOUNDER M, KHAN S, SHERIFF D S. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) - is it an emerging risk factor for coronary artery disease?: preliminary study in a local indian population[j]. Sultan Qaboos Univ Med J, 2010, 10(2): 221-226. [7] XU Z, LE K, MOHAMMED M H. Long-term phytosterol treatm ent alters gene expression in the liver of apo E-deficient mice[j]. Journal of Nutritional Biochemistry, 2008, 19: 545-554. [8] CALPE-BERDIEL L, ESCOLÀ-GIL J C, RIBAS V, et al. Changes in intestinal and liver global gene expression in response to a phytosterolenriched diet[j]. Atherosclerosis, 2005, 181(1): 75-85. [9] HIRAI K, OHNO Y, NAKANO T, et al. Effects of dietary fats and phytosterol on serum fatty acid composition and lipoprotein cholesterol in rats[j]. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo), 1984, 30(2): 101-112. [10] DERAKHSHAN-HONARPARVAR M, HAMEDI M M, KH M, et al. Rice bran phytosterols of three widespread iranian cultivars[j]. Agr Sci Tech, 2010, 12: 167-172. [11] 周 宝 兰. 米 糠 油 甾 醇 组 成 的 研 究 [J]. 中 国 粮 油 学 报, 1990, 5(1): 28-35. [12] Federal register 65 FR food labeling: health claims; plant sterol/stanol esters and coronary heart disease. Interim final rule[s]. 2000. [13] 崔 喜 艳. 基 础 生 物 化 学 实 验 方 法 和 技 术 [M]. 北 京 : 中 国 林 业 出 版 社, 2008: 136-139. [14] CHANG Y, RYU S, SUNG E, et al. Higher concentrations of alanine amino-transferase within the reference interval predict nonalcoholic fatty liver disease[j]. Clin Chem, 2007, 53: 686-692. [15] 由 宏, 郝 睿, 赵 公 玲, 等. 白 萝 卜 提 取 物 对 大 鼠 非 酒 精 性 脂 肪 肝 的 药 效 作 用 [J]. 食 品 科 学, 2011, 32(7): 300-304. [16] ZHAO Jiasheng, ZHU Fengshang, LIU Su, et al. Pioglitazone ameliorates nonalcoholic steatohepatitis by down-regulating hepatic nuclear factor-kappa B and cyclooxygenases-2 expression in rats[j]. Chin Med J, 2012, 125(13): 2316-2321. [17] 蔡 艳 俊, 许 昶, 牛 俊 奇, 等. 超 氧 化 物 歧 化 酶 在 乙 型 肝 炎 中 的 临 床 意 义 [J]. 白 求 恩 医 科 大 学 学 报, 1994, 20(6): 591. [18] 张 红 星, 王 琼, 乐 薇, 等. 高 脂 血 症 大 鼠 模 型 建 立 的 动 态 研 究 [J]. 湖 北 中 医 药 大 学 学 报 2011, 13(1): 19-22. [19] JIANG Ming, LIU Fei, XIONG Wujun, et al. Combined MELD and blood lipid level in evaluating the prognosis of decompensated cirrhosis[j]. World J Gastroenterol, 2010, 16(11): 1397-1401. [20] 张 志 平, 尤 婷 婷, 邹 丽 宜, 等. 复 方 丹 参 合 剂 对 长 期 脂 肪 乳 剂 灌 胃 诱 发 的 大 鼠 非 酒 精 性 脂 肪 肝 病 的 影 响 [J]. 南 方 医 科 大 学 学 报, 2008, 28(7): 1109-1113.