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- 靠谭 丁
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1 2016 年 6 月 第 26 卷 第 6 期 中 国 比 较 医 学 杂 志 CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVE MEDICINE June, 2016 Vol. 26 No. 6 研 究 报 告 两 种 不 同 的 酒 精 摄 入 方 式 诱 导 的 小 鼠 酒 精 性 肝 损 伤 模 型 比 较 1 肖 娟,2, 张 瑞 芬 2, 黄 菲 2, 刘 磊 2, 邓 媛 元 2, 马 永 轩 2, 刘 冬 3, 张 名 位 2 1, 孙 远 明 (1. 华 南 农 业 大 学 食 品 学 院, 广 州 ; 2. 广 东 省 农 业 科 学 院 蚕 业 与 农 产 品 加 工 研 究 所 / 农 业 部 功 能 食 品 重 点 实 验 室 / 广 东 省 农 产 品 加 工 重 点 实 验 室, 广 州 ; 3. 深 圳 职 业 技 术 学 院, 深 圳 ) 摘 要 目 的 筛 选 一 种 简 便 稳 定 可 靠 的 酒 精 性 肝 损 伤 模 型 方 法 通 过 酒 精 灌 胃 或 给 予 Lierber DeCarli 酒 精 液 体 饲 料 8 周 来 建 立 酒 精 性 肝 损 伤 小 鼠 模 型 实 验 期 间 记 录 小 鼠 精 神 状 态 摄 食 量 和 体 重 变 化,HE 染 色 进 行 病 理 学 分 析, 分 析 血 清 谷 丙 转 氨 酶 (ALT) 谷 草 转 氨 酶 ( AST) γ 谷 氨 酰 转 移 酶 ( γ GT) 碱 性 磷 酸 酶 ( AKP) 活 性, 血 清 和 肝 脏 总 胆 固 醇 (TC) 甘 油 三 酯 (TG) 含 量 等 肝 损 伤 指 标 结 果 造 模 8 周 后, 两 种 方 式 均 导 致 小 鼠 肝 脏 脂 质 聚 集 等 组 织 病 理 学 变 化, 血 清 ALT AST AKP 活 性 血 清 和 肝 脏 TG 含 量 均 显 著 提 高, 提 示 出 现 明 显 肝 损 伤 酒 精 灌 胃 导 致 小 鼠 精 神 状 态 差, 并 显 著 减 轻 体 重, 而 酒 精 液 体 饲 料 对 小 鼠 精 神 状 态 和 体 重 影 响 小 酒 精 液 体 饲 料 模 型 肝 脏 指 数 和 血 清 TC 水 平 显 著 增 加, 而 且 血 清 ALT AST 活 性 血 清 和 肝 脏 TG 含 量 及 肝 脏 脂 质 聚 集 等 组 织 病 理 学 变 化 幅 度 大 于 酒 精 灌 胃 模 型, 提 示 前 者 的 肝 损 伤 程 度 比 后 者 严 重 结 论 Lieber DeCarli 酒 精 液 体 饲 料 模 型 优 于 酒 精 灌 胃 模 型 Lieber DeCarli 酒 精 液 体 饲 料 模 型 相 对 酒 精 灌 胃 模 型 更 适 合 用 于 酒 精 性 肝 损 伤 分 子 机 制 的 研 究 和 防 治 药 物 的 筛 选 关 键 词 酒 精 性 肝 损 伤 ;Lierber DeCarli 酒 精 液 体 饲 料 ; 灌 胃 ; 模 型, 动 物 ; 中 图 分 类 号 R 33 文 献 标 识 码 A 文 章 编 号 (2016) doi: j. issn Comparison of two mouse models of alcoholic liver disease induced by oral ethanol gavage or Lierber DeCarli ethanol liquid diet XIAO Juan 1, 2, ZHANG Rui fen 2, HUANG Fei 2, LIU Lei 2, DENG Yuan yuan 2, MA Yong xuan 2, LIU Dong 3, ZHANG Ming wei 2, SUN Yuan ming 1 (1. College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou , China; 2. Sericultural & Agri Food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Functional Foods, Ministry of Agriculture / Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing, Guangzhou ; 3. Shenzhen Polytechnic, Shenzhen ) Abstract Objective To select a simple, stable and reliable mouse model of alcoholic liver disease. Methods The mouse models of alcoholic liver disease were induced by oral gavage ethanol or Lierber DeCarli ethanol liquid diet for 8 weeks. The food intake and body weight were recorded. Pathological changes were examined using HE staining. Liver [ 基 金 项 目 ] 国 家 自 然 科 学 基 金 青 年 科 学 基 金 项 目 (NSFC ); 广 东 省 自 然 科 学 基 金 博 士 启 动 项 目 (2014A ); 深 圳 市 科 技 计 划 基 础 研 究 项 目 (JCYJ ); 广 东 省 省 级 科 技 计 划 项 目 (2016B ) [ 作 者 简 介 ] 肖 娟 ( ), 女, 博 士 后, 研 究 方 向 : 植 物 活 性 物 质 与 功 能 食 品 [ 通 讯 作 者 ] 孙 远 明 ( ), 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 研 究 方 向 : 食 品 安 全 检 测
2 12 中 国 比 较 医 学 杂 志 2016 年 6 月 第 26 卷 第 6 期 Chin J Comp Med, June 2016,Vol. 26. No. 6 injury was assessed by the activities of serum ALT, AST, AKP and γ GT, and serum and hepatic TC and TG. Results After modeling, both models showed significantly increased activities of serum ALT, AST, AKP, and contents of serum and hepatic TG (P < 0 05), indicating the successful development of alcoholic steatohepatitis. However, oral ethanol gavage led to body weight loss and weak mental state. Ethanol liquid diet less affected the body weight and mental state. Ethanol liquid diet enhanced liver to body weight ratio and serum TC, but oral gavage of ethanol did not. The changes of serum ALT, AST, serum and hepatic TG, and hepatic steatosis in the ethanol liquid diet models were more severe than those in the oral gavage ethanol models, suggesting that Lierber DeCarli ethanol liquid diet led to more serious liver injury than oral gavage ethanol. Conclusions Lierber DeCarli ethanol liquid diet model is better than oral gavage ethanol model, and is more suitable for studies on mechanisms and evaluation of hepato protective drugs for alcoholic liver disease. Key words Alcoholic liver disease; Lierber DeCarli ethanol liquid diet; Alcohol; Oral gavage; Mouse model 流 行 病 学 研 究 表 明, 全 球 酒 精 性 肝 病 发 病 率 逐 年 升 高, 该 病 已 成 为 肝 脏 疾 病 中 仅 次 于 病 毒 性 肝 炎 的 第 二 大 病 因 [1], 其 致 死 率 已 经 远 超 过 乳 腺 癌 肠 癌 和 前 列 腺 癌 等 癌 症 疾 病 [2,3] 为 此, 酒 精 性 肝 损 伤 成 为 近 年 来 国 内 外 学 者 研 究 的 焦 点 之 一 [4] 目 前 对 酒 精 性 肝 损 伤 的 研 究 主 要 集 中 于 探 讨 其 致 病 机 理 预 防 措 施 以 及 防 治 药 物 的 筛 选 等 [5,6] 稳 定 可 靠 的 酒 精 性 肝 损 伤 动 物 模 型 是 研 究 其 致 病 机 理 和 防 治 措 施 的 基 础 和 必 备 条 件 国 内 外 常 用 的 酒 精 性 肝 损 伤 模 型 主 要 有 3 种, 酒 精 灌 胃 模 型 Lieber DeCarli 酒 精 液 体 饲 料 模 型 和 Tsukamato French 模 型 [7] Tsukamato French 模 型 对 实 验 技 术 和 实 验 动 物 的 要 求 严 格 费 用 昂 贵, 故 难 以 推 广 使 用 [8] 酒 精 灌 胃 模 型 Lieber DeCarli 酒 精 液 体 饲 料 模 型 均 能 较 好 的 复 制 出 酒 精 性 脂 肪 肝, 但 两 种 模 型 的 动 物 精 神 状 态 肝 损 伤 程 度 等 是 否 有 差 异 尚 不 清 楚 [7] 本 文 主 要 以 小 鼠 的 精 神 状 态 体 重 和 肝 损 伤 程 度 等 为 指 标 来 比 较 酒 精 灌 胃 和 Lieber DeCarli 酒 精 液 体 饲 料 诱 导 的 酒 精 性 肝 损 伤 小 鼠 模 型 的 差 异, 以 筛 选 稳 定 可 靠 的 动 物 模 型, 为 酒 精 性 肝 损 伤 的 基 础 研 究, 特 别 是 植 物 活 性 成 分 对 其 改 善 作 用 的 评 价 提 供 稳 定 可 靠 的 动 物 模 型 1 材 料 和 方 法 1 1 实 验 动 物 SPF 级 雄 性 C57BL / 6 小 鼠 60 只, 体 重 18 ~ 22 g (8 周 龄 ) 来 源 于 中 山 大 学 ( 大 学 城 ) 实 验 动 物 中 心 SCXK( 粤 ) 动 物 饲 养 于 中 山 大 学 实 验 动 物 中 心 SYXK( 粤 ) 屏 障 环 境 动 物 房 ( 室 温 22 ± 1, 相 对 湿 度 为 55% ~ 60%,12 h 光 照 / 12 h 黑 暗 ) 动 物 组 织 取 材 中, 按 实 验 动 物 使 用 的 3Rs 原 则 给 予 人 道 的 关 怀 小 鼠 适 应 性 喂 养 1 周 后, 按 体 质 量 随 机 分 为 正 常 对 照 组 (normal control) 酒 精 灌 胃 组 ( oral ethanol gavage) 对 照 液 体 饲 料 组 (control liquid diet ) 和 酒 精 液 体 饲 料 组 ( ethanol liquid diet), 每 组 15 只 正 常 对 照 组 和 酒 精 灌 胃 组 小 鼠 5 只 / 笼, 以 全 价 营 养 颗 粒 饲 料 饲 养, 自 由 进 食 及 饮 水 ; 对 照 液 体 饲 料 和 酒 精 液 体 饲 料 组 小 鼠 3 只 / 笼, 分 别 给 予 对 照 液 体 饲 料 和 酒 精 液 体 饲 料, 饲 料 现 配 现 用, 每 天 记 录 摄 食 量, 酒 精 液 体 饲 料 组 小 鼠 自 由 进 食, 对 照 液 体 饲 料 组 小 鼠 饲 料 给 予 量 为 前 1 d 酒 精 液 体 饲 料 组 的 平 均 摄 食 量 1 2 试 剂 与 仪 器 Lieber DeCarli 高 脂 肪 型 酒 精 液 体 饲 料 ( 含 4% (w / v) 酒 精 ; 饲 料 热 量 组 成 为 蛋 白 质 热 量 18% 酒 精 热 量 28% 其 他 碳 水 化 合 物 热 量 19% 脂 肪 热 量 35% )( 代 码 :TP 4030B) 及 其 对 照 液 体 饲 料 ( 不 含 酒 精 ; 饲 料 热 量 组 成 为 蛋 白 质 热 量 18% 碳 水 化 合 物 热 量 47%, 脂 肪 热 量 35% )( 代 码 :TP 4030BC) 购 于 南 通 特 洛 菲 饲 料 科 技 有 限 公 司 ALT AST γ GT AKP TC 和 TG 试 剂 盒 均 购 于 南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所 高 速 / 冷 冻 离 心 机 ( Thermo, 美 国 ), - 80 低 温 冰 箱 ( Thermo, 美 国 ), 低 速 离 心 机 ( Thermo, 美 国 ), 酶 标 仪 ( Tecan, 瑞 士 ), 差 相 荧 光 倒 置 显 微 镜 (Leica, 德 国 ) 1 3 实 验 方 法 酒 精 肝 损 伤 小 鼠 模 型 建 立 : 酒 精 灌 胃 诱 导 酒 精 肝 损 伤 小 鼠 模 型 建 立 : 酒 精 灌 胃 组 的 酒 精 适 应 期 为 1 周, 酒 精 灌 胃 剂 量 由 0 5 g / (kg 体 重 ) 逐 步 增 加 到 6 g / (kg 体 重 ); 其 造 模 期 为 8 周,1 ~ 4 周 剂 量 为 6 g / ( kg 体 重 ), 5 ~ 8 周 剂 量 为 5 g / ( kg 体 重 ) [9-11] 正 常 对 照 组 灌 胃 等 量 的 蒸 馏 水 酒 精 或 蒸 馏 水 灌 胃 量 为 0 1 ml / 10(g 体 重 ) Lieber DeCarli 酒 精 液 体 饲 料 酒 精 肝 损 伤 小 鼠 模 型 建 立 : 酒 精 液 体 饲 料 组 先 经 过 液 体 饲 料 适 应 期 (3 d) 后, 再 根 据 小 鼠 酒 精 性 脂 肪 肝 模 型 的 建 立 方 法
3 中 国 比 较 医 学 杂 志 2016 年 6 月 第 26 卷 第 6 期 Chin J Comp Med, June 2016,Vol. 26. No ( 经 典 法 ) 说 明 书 进 行 酒 精 适 应 期 (4 d, 第 1 ~ 4 d 酒 精 液 体 饲 料 与 对 照 液 体 饲 料 混 合 的 比 例 分 别 为 1: 4 2:3 3:2 和 4:1), 然 后 进 入 造 模 期, 以 酒 精 液 体 饲 [12 - 料 喂 养 造 模 8 周 14] 取 材 : 小 鼠 禁 食 12 h 后, 乙 醚 麻 醉 小 鼠, 摘 眼 球 取 血, 处 死 小 鼠, 肝 脏 用 冰 生 理 盐 水 漂 洗 滤 纸 吸 干 水 后, 切 取 1 cm 3 肝 脏 固 定 于 4% 多 聚 甲 醛, 用 于 HE 染 色 ; 剩 余 肝 脏 迅 速 分 装 后 - 80 冻 存 血 液 4 放 置 1 ~ 1 5 h 后 r / min 离 心 15 min 后, 取 上 清 液 立 刻 用 于 指 标 测 定 指 标 测 定 : 血 清 ALT AST γ GT AKP 活 性, TC 和 TG 含 量 : 血 清 ALT AST 采 用 赖 氏 法,γ GT AKP 采 用 比 色 法,TC 和 TG 采 用 甘 油 激 酶 磷 酸 甘 油 氧 化 酶 过 氧 化 物 酶 比 色 法, 操 作 严 格 按 试 剂 盒 说 明 书 进 行 肝 脏 TC 和 TG 含 量 : 取 200 mg 湿 肝 脏, 加 入 9 倍 体 积 的 氯 仿 甲 醇 (2 1) 溶 液 [15], 制 备 匀 浆, 离 心 后 取 10 μl 上 清 液 检 测, 采 用 甘 油 激 酶 磷 酸 甘 油 氧 化 酶 过 氧 化 物 酶 比 色 法, 按 试 剂 盒 说 明 书 进 行 操 作 HE 染 色 观 察 肝 组 织 病 理 学 形 态 : 按 常 规 方 法 制 作 石 蜡 切 片 并 进 行 HE 染 色, 光 镜 下 观 察 肝 脏 形 态 变 化 1 4 统 计 学 方 法 数 据 以 平 均 值 ± 标 准 偏 差 表 示, 采 用 SPSS 16 0 软 件, 进 行 t 检 验 (P < 0 05) 2 结 果 与 分 析 2 1 精 神 状 态 及 死 亡 率 实 验 过 程 中 正 常 对 照 组 及 对 照 液 体 饲 料 组 小 鼠 精 神 状 态 好, 食 欲 佳, 皮 毛 有 光 泽 酒 精 灌 胃 组 小 鼠 酒 醉 现 象 严 重 应 激 反 应 严 重 精 神 萎 靡 活 动 减 少 反 应 迟 钝 皮 毛 无 光 泽, 在 造 模 期 第 4 周 死 亡 3 只 酒 精 液 体 饲 料 组 小 鼠 也 有 酒 醉 现 象, 但 比 酒 精 灌 胃 组 小 鼠 要 轻 微, 无 应 激 反 应, 精 神 状 态 和 反 应 均 较 正 常, 动 物 未 出 现 死 亡 2 2 体 重 正 常 对 照 组 小 鼠 体 重 持 续 增 长 图 1( A), 酒 精 灌 胃 组 小 鼠 体 重 缓 慢 增 长, 从 造 模 期 第 4 周 开 始, 正 常 对 照 组 小 鼠 体 重 显 著 高 于 酒 精 灌 胃 组 小 鼠 ( P < 0 05) 对 照 液 体 饲 料 组 和 酒 精 液 体 饲 料 组 体 重 缓 慢 增 长 后 趋 于 平 衡 图 1(B), 在 造 模 期 第 2 周 至 造 模 期 第 6 周, 对 照 液 体 饲 料 组 体 重 显 著 高 于 酒 精 液 体 饲 料 组 ( P < 0 05), 在 造 模 期 第 7 周 至 造 模 期 第 8 周, 对 照 液 体 饲 料 组 小 鼠 与 酒 精 液 体 饲 料 组 小 鼠 体 重 差 异 无 显 著 性 ( P > 0 05) 结 果 表 明, 酒 精 灌 胃 显 著 减 轻 小 鼠 体 重, 而 酒 精 液 体 饲 料 对 小 鼠 体 重 影 响 小 2 3 摄 食 量 整 个 饲 养 过 程 中, 正 常 对 照 组 与 酒 精 灌 胃 组 小 鼠 摄 食 量 差 异 无 显 著 性 ( 图 2); 对 照 液 体 饲 料 组 和 酒 精 液 体 饲 料 组 小 鼠 摄 食 量 差 异 无 显 著 性, 表 明 酒 精 灌 胃 和 酒 精 液 体 饲 料 对 小 鼠 摄 食 量 无 显 著 影 响 2 4 肝 脏 组 织 病 理 学 形 态 变 化 从 图 3 中 可 见, 正 常 对 照 组 小 鼠 肝 小 叶 结 构 清 晰, 肝 细 胞 索 由 中 央 静 脉 向 四 周 呈 放 射 状 排 列 ; 酒 精 灌 胃 组 小 鼠 部 分 肝 细 胞 出 现 脂 肪 变 性, 大 部 分 脂 肪 空 泡 小, 少 数 脂 肪 空 泡 大 对 照 液 体 饲 料 组 小 鼠 肝 小 叶 结 构 清 晰, 肝 细 胞 索 由 中 央 静 脉 向 四 周 呈 放 射 状 排 列, 少 量 肝 细 胞 出 现 脂 肪 变 性, 脂 肪 空 泡 细 小 ; 而 酒 精 液 体 饲 料 组 小 鼠 大 量 肝 细 胞 出 现 脂 肪 变 性, 脂 肪 空 泡 大, 其 余 的 大 部 分 肝 细 胞 变 性 肿 胀, 胞 浆 内 充 满 小 的 脂 肪 空 泡, 高 倍 镜 下 可 观 察 到 肝 细 胞 细 胞 核 浓 缩 和 核 溶 解, 以 及 炎 性 细 胞 浸 润 与 酒 精 灌 胃 组 相 比, 酒 精 液 体 饲 料 组 小 鼠 肝 脏 脂 质 聚 集 程 度 明 显 增 加 2 5 肝 脏 指 数 与 正 常 对 照 组 相 比, 酒 精 灌 胃 组 小 鼠 肝 脏 指 数 差 异 无 显 著 性 ( 表 1) 与 对 照 液 体 饲 料 组 相 比, 酒 精 液 体 饲 料 组 小 鼠 肝 脏 指 数 显 著 提 高 27 62% (P < 0 05)( 表 2), 提 示 酒 精 液 体 饲 料 组 小 鼠 肝 脏 出 现 肿 胀 脂 质 聚 集 等 变 化, 该 结 果 与 肝 脏 组 织 病 理 学 形 态 变 化 结 果 相 互 印 证 2 6 小 鼠 血 清 ALT AST γ GT AKP 活 性 与 正 常 对 照 组 相 比, 酒 精 灌 胃 组 小 鼠 血 清 ALT AST AKP 活 性 均 显 著 提 高 (P < 0 05), 提 高 幅 度 分 别 为 28 09% % 43 60% ( 表 1), 提 示 肝 脏 出 现 损 伤 与 对 照 液 体 饲 料 组 相 比, 酒 精 液 体 饲 料 组 小 鼠 血 清 ALT AST 和 AKP 活 力 均 显 著 提 高 (P < 0 05 ), 提 高 幅 度 分 别 为 86 41% % 34 78% ( 表 2), 提 示 肝 脏 出 现 损 伤 对 比 肝 功 能 特 征 指 标 血 清 ALT AST 活 性 的 变 化 程 度, 可 发 现 酒 精 液 体 饲 料 组 的 变 化 幅 度 大 于 酒 精 灌 胃 组, 提 示 酒 精 液 体 饲 料 诱 导 的 肝 脏 损 伤 可 能 比 酒 精 灌 胃 诱 导 的 肝 脏 损 伤 更 严 重
4 14 中 国 比 较 医 学 杂 志 2016 年 6 月 第 26 卷 第 6 期 Chin J Comp Med, June 2016,Vol. 26. No. 6 注 :# 表 示 差 异 有 显 著 性 (P < 0 05) 图 1 酒 精 灌 胃 (A) 和 Lierber DeCarli 酒 精 液 体 饲 料 (B) 诱 导 的 酒 精 性 肝 损 伤 小 鼠 模 型 体 重 变 化 Note. #: Significantly reduced body weight (P < 0 05). Fig. 1 Changes of body weight of the oral ethanol gavage model ( A) and Lierber DeCarli ethanol liquid diet model (B) 2 7 小 鼠 血 清 及 肝 脏 TG 和 TC 含 量 与 正 常 对 照 组 相 比, 酒 精 灌 胃 组 小 鼠 血 清 TG 和 肝 脏 TG 含 量 均 显 著 提 高 ( 表 1 ) ( P < 0 05 ), 提 高 幅 度 分 别 为 23 80% 和 11 40%, 但 是, 两 组 小 鼠 的 血 清 TC 和 肝 脏 TC 含 量 差 异 无 显 著 性, 提 示 灌 胃 酒 精 诱 导 的 酒 精 肝 损 伤 模 型 表 现 出 一 定 的 肝 损 伤 与 对 照 液 体 饲 料 组 相 比, 酒 精 液 体 饲 料 组 小 鼠 血 清 TG TC 和 肝 脏 TG 含 量 均 显 著 提 高 ( P < 0 05 ), 提 高 幅 度 为 32 13% 21 90% 和 14 47% ( 表 2), 提 示 酒 精 液 体 饲 料 能 导 致 一 定 程 度 的 肝 损 伤 酒 精 液 体 饲 料 组 小 鼠 血 清 TC 显 著 增 加, 而 酒 精 灌 胃 组 该 指 标 无 显 著 变 化 对 比 小 鼠 血 清 TG 和 肝 脏 TG 含 量 变 化 程 度, 可 发 现 酒 精 液 体 饲 料 组 的 变 化 幅 度 略 大 于 酒 精 灌 胃 组 提 示 酒 精 液 体 饲 料 诱 导 的 肝 脏 损 伤 可 能 比 酒 精 灌 胃 诱 导 的 肝 脏 损 伤 更 严 重 该 结 果 与 肝 脏 病 理 变 化 相 互 印 证 图 2 酒 精 灌 胃 (A) 和 Lierber DeCarli 酒 精 液 体 饲 料 (B) 诱 导 的 酒 精 性 肝 损 伤 小 鼠 模 型 摄 食 量 变 化 Fig. 2 Changes of food intake of the oral ethanol gavage model ( A) and Lierber DeCarli ethanol liquid diet model (B) 3 讨 论 稳 定 可 靠 的 动 物 模 型 是 研 究 ALD 的 分 子 机 制 和 防 治 措 施 的 基 础 酒 精 灌 胃 和 Lieber DeCarli 酒 精 液 体 饲 料 诱 导 的 ALD 模 型 均 为 国 内 外 公 认 的 ALD 模 型 [7] 酒 精 灌 胃 模 型 操 作 简 便, 能 够 控 制 酒 精 摄 入 量, 可 维 持 血 中 有 效 酒 精 浓 度, 容 易 复 制 酒 精 性 脂 肪 肝 和 肝 炎, 但 动 物 易 产 生 应 激 反 应, 死 亡 率 高 Lieber DeCarli 酒 精 液 体 饲 料 诱 导 的 ALD 模 型 是 使 动 物 能 主 动 饮 用 酒 精 液 体 饲 料, 可 复 制 出 酒 精 性 脂 肪 肝 和 肝 炎, 其 优 点 是 试 验 者 能 够 通 过 配 对 喂 养 主 动 控 制 能 量 摄 入, 保 持 各 组 间 的 能 量 平 衡, 排 除 营 养 摄 入 即 摄 入 能 量 不 均 对 实 验 的 结 果 的 影 响 [11,16] 本 实 验 利 用 酒 精 灌 胃 和 Lieber DeCarli 酒 精 液 体 饲 料 诱 导 小 鼠 酒 精 性 肝 损 伤, 造 模 8 周, 肝 脏 出 现 明 显 脂 质 聚 集, 小 鼠 血 清 ALT AST AKP 活 性, 血 清 TG 和 肝 脏 TG 含 量 均 显 著 提 高, 这 些 都 符 合 早 期 酒 [2, 精 性 肝 损 伤 的 变 化 特 点 3], 表 明 酒 精 灌 胃 组 和 酒 精 液 体 饲 料 组 小 鼠 均 出 现 明 显 酒 精 性 脂 肪 肝 但 是, 酒 精 灌 胃 组 小 鼠 酒 醉 现 象 严 重 精 神 状 态 差 ; 酒
5 15 中国比较医学杂志 2016 年 6 月第 26 卷第 6 期 Chin J Comp Med June 2016 Vol 26 No 6 图 3 酒精灌胃和 Lierber DeCarli 酒精液体饲料诱导的 酒精性肝损伤小鼠模型肝脏组织病理形态变化 HE 染色 200 标尺 100 μm Fig 3 Histological changes of the liver tissues in the oral ethanol gavage and Lierber DeCarli ethanol liquid diet mouse models HE staining 200 Bar 100 μm 表 1 酒精灌胃诱导的酒精性肝损伤小鼠模型肝脏指数 血清 ALT AST γ GT 和 AKP 活性 血清和肝脏中甘油三酯和总胆固醇水平的变化 x ± s Tab 1 Changes of the liver to body weight ratio serum ALT AST γ GT and AKP activities serum and hepatic TG and TC contents in the oral ethanol gavage models 指标 Indexs 肝脏指数 Liver to body weight ratio 谷丙转氨酶 ALT U L 谷草转氨酶 AST U L 酒精灌胃组 Oral ethanol 3 34 ± 0 33 3 59 ± 0 33 29 39 ± 3 82 37 65 ± 9 66 28 09 10 72 ± 2 86 22 55 ± 3 83 110 32 3 24 ± 0 74 3 68 ± 0 89 γ 谷氨酰转移酶 γ GT U L 碱性磷酸酶 AKP U L 59 79 ± 10 32 85 85 ± 14 51 43 60 0 94 ± 0 12 1 16 ± 0 21 23 80 2 58 ± 0 38 2 75 ± 0 46 11 98 ± 1 26 13 34 ± 1 47 4 90 ± 0 75 5 58 ± 0 88 血清甘油三酯 Serum TG mmol L 血清总胆固醇 Serum TC mmol L 肝甘油三酯 Hepatic TG mg g liver 肝总胆固醇 Hepatic TC mg g liver 变化幅度 Change 正常对照组 Normal control 注 表示在 0 05 水平上差异有显著性 P 0 05 Note means a significant difference P 0 05 11 40
6 16 中 国 比 较 医 学 杂 志 2016 年 6 月 第 26 卷 第 6 期 Chin J Comp Med, June 2016,Vol. 26. No. 6 精 液 体 饲 料 组 小 鼠 也 有 酒 醉 现 象, 但 比 酒 精 灌 胃 组 小 鼠 要 轻 微, 无 应 激 反 应, 精 神 状 态 和 反 应 均 较 正 常, 这 有 可 能 是 因 为 酒 精 灌 胃 所 用 的 酒 精 浓 度 高 (50% 酒 精 ), 对 小 鼠 的 刺 激 大, 而 酒 精 液 体 饲 料 中 酒 精 的 浓 度 仅 为 4%, 对 小 鼠 的 刺 激 很 微 弱, 因 此 从 精 神 状 态 上 来 看 酒 精 液 体 饲 料 模 型 优 于 酒 精 灌 胃 模 型 本 实 验 中 酒 精 液 体 饲 料 诱 导 的 ALD 模 型 未 出 现 死 亡, 而 酒 精 灌 胃 的 第 4 周 小 鼠 死 亡 3 只 研 究 表 明 酒 精 灌 胃 剂 量 低 无 法 诱 导 酒 精 性 脂 肪 肝 形 成, 而 剂 量 高 易 导 致 大 量 动 物 死 亡 [7] 灌 胃 5 g / (kg 体 重 ) 或 6 g / (kg 体 重 ) 酒 精 ( 酒 精 浓 度 40% ~ 52% )8 周 成 功 诱 导 酒 精 性 脂 肪 肝 形 成 [9, 10],Zeng [11] 等 研 究 表 明 4 g / kg 体 重 酒 精 灌 胃 8 周 不 能 导 致 小 鼠 肝 损 伤 ( 脂 肪 肝 ) 的 发 生 因 此, 本 实 验 中 酒 精 灌 胃 剂 量 在 1 ~ 4 周 为 6 g / (kg 体 重 ), 在 出 现 小 鼠 死 亡 后, 酒 精 灌 胃 剂 量 调 整 为 5 g / ( kg 体 重 ) 灌 胃 酒 精 显 著 减 轻 小 鼠 体 重, 由 于 灌 胃 酒 精 对 摄 食 量 无 显 著 影 响, 那 么 体 重 的 减 少 很 可 能 是 由 于 高 浓 度 酒 精 刺 激 影 响 胃 肠 道 的 消 化 吸 收 功 能 造 成 的 [17, 18] ; 而 酒 精 液 体 饲 料 对 小 鼠 体 重 影 响 小, 很 可 能 是 因 为 进 行 了 配 对 喂 养, 使 得 酒 精 液 体 饲 料 组 与 其 对 照 组 的 能 量 摄 入 保 持 一 致, 这 体 现 了 Lieber DeCarli 酒 精 液 体 饲 料 模 型 的 优 点 对 照 液 体 饲 料 组 肝 脏 HE 染 色 结 果 显 示 有 少 量 Tab. 2 脂 质 聚 集, 原 因 是 对 照 液 体 饲 料 是 高 脂 肪 型 饲 料, 食 用 时 间 较 长 的 情 况 下 小 鼠 肝 脏 会 有 少 量 脂 质 聚 集, 因 此 造 模 时 间 一 般 不 超 过 8 周 [7] Ge et al. [13] 和 Wang et al. [14] 的 研 究 也 发 现 造 模 8 周 后,HE 染 色 和 油 红 O 染 色 显 示 对 照 液 体 饲 料 组 小 鼠 肝 脏 有 轻 微 脂 质 聚 集 比 较 酒 精 灌 胃 组 和 液 体 酒 精 饲 料 相 对 各 自 对 照 组 的 变 化 程 度 发 现 :(1) 液 体 酒 精 饲 料 模 型 肝 脏 指 数 显 著 增 加, 血 清 TC 水 平 显 著 提 高, 而 酒 精 灌 胃 模 型 这 两 个 指 标 无 显 著 变 化 (2) 两 个 模 型 的 血 清 ALT AST 活 性 血 清 和 肝 脏 TG 含 量 均 显 著 变 化, 但 液 体 酒 精 饲 料 模 型 的 变 化 幅 度 大 于 酒 精 灌 胃 模 型 (3) 液 体 酒 精 饲 料 模 型 的 肝 脏 脂 质 聚 集 等 病 理 变 化 比 酒 精 灌 胃 模 型 的 严 重 提 示 Lieber DeCarli 酒 精 液 体 饲 料 模 型 优 于 酒 精 灌 胃 模 型 因 此, 从 精 神 状 态 体 重 和 肝 损 伤 程 度 等 方 面 来 看,Lieber DeCarli 酒 精 液 体 饲 料 模 型 优 于 酒 精 灌 胃 模 型 4 结 论 Lieber DeCarli 酒 精 液 体 饲 料 诱 导 的 酒 精 肝 损 伤 小 鼠 模 型 精 神 状 态 良 好, 肝 脏 指 数 显 著 增 加, 血 清 TC 水 平 显 著 提 高, 血 清 ALT AST 活 性 血 清 和 肝 脏 TG 含 量 及 肝 脏 脂 质 聚 集 等 组 织 病 理 学 变 化 幅 表 2 Lierber DeCarli 酒 精 液 体 饲 料 诱 导 的 酒 精 性 肝 损 伤 小 鼠 模 型 肝 脏 指 数 血 清 ALT AST γ GT 和 AKP 活 性, 血 清 和 肝 脏 中 甘 油 三 酯 和 总 胆 固 醇 水 平 的 变 化 ( x ± s) Changes of the liver to body weight ratio, serum ALT, AST, γ GT and AKP activities, serum and hepatic TG and TC contents in the Lierber DeCarli ethanol liquid diet models 指 标 Indexs 肝 脏 指 数 Live to body weight ratio / % 谷 丙 转 氨 酶 ALT / U / L 谷 草 转 氨 酶 AST / U / L γ 谷 氨 酰 转 移 酶 γ GT / U / L 碱 性 磷 酸 酶 AKP / U / L 血 清 甘 油 三 酯 Serum TG / mmol / L 血 清 总 胆 固 醇 Serum TC / mmol / L 肝 甘 油 三 酯 Hepatic TG / mg / g liver 肝 总 胆 固 醇 Hepatic TC / mg / g liver 注 表 示 在 0 05 水 平 上 差 异 有 显 著 性 (P < 0 05) Note. means a significant difference (P < 0 05). 对 照 液 体 饲 料 组 Control liquid diet 酒 精 液 体 饲 料 组 Ethanol liquid diet 变 化 幅 度 / % Change / % 3 00 ± ± % ± ± % ± ± % 3 14 ± ± ± ± % 0 92 ± ± % 2 58 ± ± % ± ± % 8 06 ± ± 1. 67
7 中 国 比 较 医 学 杂 志 2016 年 6 月 第 26 卷 第 6 期 Chin J Comp Med, June 2016,Vol. 26. No 度 大 于 酒 精 灌 胃 诱 导 的 酒 精 肝 损 伤 小 鼠 模 型 相 对 酒 精 灌 胃,Lieber DeCarli 酒 精 液 体 饲 料 对 动 物 精 神 状 态 影 响 小 易 于 形 成 酒 精 脂 肪 肝, 因 此 更 适 合 用 于 酒 精 性 肝 病 分 子 机 制 的 研 究 和 防 治 药 物 的 筛 选 参 考 文 献 : [ 1 ] Mann RE, Smart RQ, Govoni R. The epidemiology of alcoholic liver disease[ J]. Alcohol Res Health,2003,27(3): [ 2 ] Schwartz JM, Reinus JF. Prevalence and natural history of alcoholic liver disease [ J]. Clin Liver Dis,2012,16 ( 4 ): [ 3 ] Arteel G, Marsano L, Mendez BF, et al. Advances in alcoholic liver disease[ J]. Best Pract Res Cl Ga,2003,17(4): [ 4 ] Beier JI, Arteel GE, McClain CJ. Advances in alcoholic liver disease[ J]. Curr Gastroenterol Rep,2011,13(1): [ 5 ] 张 彦 芬, 秘 尧, 何 奇 龙, 等. FH / Wjd 大 鼠 酒 精 性 肝 损 伤 模 型 探 讨 [J]. 中 国 实 验 动 物 学 报,2014,22(5): [ 6 ] Ding R B, Tian K, Huang L L, et al. Herbal medicines for the prevention of alcoholic liver disease: A review [ J ]. J Ethnopharmacol,2012,144(3): [ 7 ] Brandon Warner E, Schrum LW, Schmidt CM, et al. Rodent models of alcoholic liver disease: Of mice and men[ J]. Alcohol, 2012,46(8): [ 8 ] Nanji AA,French SW. Animal models of alcoholic liver disease focus on the intragastric feeding model[ J]. Alcohol Res Health, 2003,27(4): [ 9 ] Park H Y, Choi H D, Eom H, et al. Enzymatic modification enhances the protective activity of citrus flavonoids against alcohol induced liver disease [ J]. Food Chem,2013,139 ( 1-4): [10] Ren Y,Deng F,Zhu H,et al. Effect of epigallocatechin 3 gallate on iron overload in mice with alcoholic liver disease[ J]. Mol Biol Rep,2011,38(2): [11] 曾 涛, 姜 璐 璐, 张 翠 丽, 等. 两 种 Lieber DeCarli 液 体 饲 料 诱 导 的 小 鼠 酒 精 性 肝 损 伤 模 型 的 建 立 [ J]. 毒 理 学 杂 志,2012,26 (4): [12] Bull Otterson L,Feng W,Kirpich I,et al. Metagenomic analyses of alcohol induced athogenic alterations in the intestinal microbiome and the effect of Lactobacillus rhamnosus GG treatment[ J]. PLoS One,2013,8(1): e [13] Ge X, Lu Y, Leung T M, et al. Milk osteopontin, a nutritional approach to prevent alcohol induced liver Injury [ J ]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2013, 304 ( 10 ): G929 - G939. [14] Wang Y, Kirpich I, Liu Y, et al. Lactobacillus rhamnosus GG treatment potentiates intestinal hypoxia inducible factor, promotes intestinal integrity and ameliorates alcohol induced liver injury [ J]. Am J Pathol,2011,179(6): [15] 曾 涛, 谢 克 勤, 张 翠 丽, 等. 氯 仿 / 甲 醇 匀 浆 测 定 肝 脏 甘 油 三 酯 含 量 [J]. 卫 生 研 究,2008,37(5): [16] 方 志 红, 崔 剑 巍, 曹 健 美, 等. Lieber DeCarli 酒 精 性 肝 损 伤 模 型 的 复 制 [J]. 中 西 医 结 合 学 报,2006,4(6): [17] You M, Fischer M, Deeg MA, et al. Ethanol induces fatty acid synthesis pathways by activation of sterol regulatory element binging protein ( SPEBP) [ J]. J Biol Chem,2002,277 ( 32 ): [18] Zeng T, Xie KQ. Ethanol and liver: recent advances in the mechanisms of ethanol induced hepatosteatosis [ J ]. Arch Toxicol,2009,83(12): 修 回 日 期
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