应用简报 原材料与培养基分析 分离 种未衍生化的多糖和唾液酸 USP 标准品 使用 Agilent AdvanceBio MS Spent Media 色谱柱与 TOF MS 检测 作者 Richard Hurteau 安捷伦科技有限公司 Wilmington, DE, USA 摘要 多糖和唾液酸是生物处理器中所用培养基的常见组分, 需要在治疗性蛋白质 ( 如单克隆抗体 ) 的生产过程中对其进行监测 本应用简报使用采用 HILIC 技术的 Agilent AdvanceBio MS Spent Media 色谱柱分离所用培养基中这些典型组分的 USP 标准品 使用 Agilent 63 飞行时间 (TOF) LC/MS 分析上述化合物, 无需昂贵且耗时的衍生化步骤
前言 多糖和唾液酸在单克隆抗体 (mab) 产品和其他治疗性蛋白质的生产中具有关键作用,,3 传统 HPLC 碳水化合物分离包括 SEC 或阳离子配体交换糖分析柱 它们需要加热到较高温度并与示差折光 (RI) 检测器配合使用, 因为碳水化合物缺少进行紫外检测所需的发色团 在分离碳水化合物混合物时 RI 检测器具有局限性, 因为它们与梯度方法不兼容 蒸发光散射检测器 (ELSD) 也可用于碳水化合物分析, 但也存在某些限制 4 电喷雾电离质谱 (ESI-MS) 比 RI 或 ELSD 检测灵敏度更高 衍生化步骤也用于碳水化合物的 LC/MS 和 GC/MS 分析, 但耗时费力 AdvanceBio MS Spent Media 色谱柱采用亲水相互作用液相色谱 (HILIC) 技术分离复杂的单糖和二糖溶液, 结合高灵敏度的 ESI 检测器, 可直接 快速且准确地表征单糖和二糖, 无需耗时费力的衍生化步骤 AdvanceBio MS Spent Media 色谱柱与 Agilent 6 Infinity II 液相色谱系统配合使用, 以 63 TOF LC/MS 作为检测器 通过对 种 USP 标准品 ( 由 USP 捐赠 ) 的分离来评估该系统的有效性 这些标准品包括单糖 二糖 两组五种异构体和三种唾液酸 实验部分 材料与方法样品 USP 标准品 USP 目录号 半乳糖 ( mg) 877 KDN ( mg)(3- 脱氧 -D- 甘油 -D- 半乳糖 -- 尤罗索尼克酸 ) 348 一水合乳糖 ( mg) 367 乳果糖 ( g) 3683 一水合麦芽糖 ( mg) 37 甘露胺盐酸盐 (3 mg) 376 甘露糖 ( mg) 378 N- 乙酰神经氨酸 ( mg) 669 N- 羟乙酰神经氨酸 ( mg) 9484 蔗糖 ( mg) 63637 塔格糖 ( mg) 6494 木糖 ( g) 7 果糖 ( mg) 864 依匹乳糖 ( mg) 368 右旋葡萄糖 ( mg) 83 溶剂和消耗品液相色谱系统 LC/MS 级甲酸铵 乙腈和氢氧化铵 Agilent 6 Infinity II 生物惰性四元购自 Fisher Scientific 泵 (G64A) 安捷伦样品瓶, 螺口, 棕色, 经认 Agilent 6 Infinity II 生物惰性证, ml,/ 包 样品瓶规格 : multisampler (G668A) 3 mm( mm 瓶盖 )( 部件号 Agilent 6 Infinity II 高容量柱温箱 88-63) (G76A) 安捷伦固定螺口盖, 带 PTFE/ 白色 TOF MS 硅胶隔垫 ( 部件号 9-7) Agilent 63 TOF LC/MS USP 标准品由 USP 捐赠仪器条件 : 缓冲液流速设置为.4 ml/min, 色谱柱柱温 3 C, 冷却器设置为 4 C AdvanceBio MS Spent Media Å,. mm( 部件号 6777-9)
方法开发将 USP 标准品溶于 % 乙腈得到各种标准溶液 采用 ESI 负离子模式, 使用以下缓冲液体系 : mmol/l 甲酸铵,pH 和 % mmol/l 甲酸铵的 9% 乙腈溶液 为了将糖类端基异构体分离成一个峰, 并使糖类带有一个电荷以便进行 TOF MS 检测, 选择 ph 在 ph 条件下, 色谱图中仅存在少量化合物 由于许多化合物的 pka 约为, 将甲酸铵 ph 值升至. 在 ph. 条件下, 可观察到所有化合物 ( 表 和表, 图 4) 将 ph 值调至高于. 可能会缩短色谱柱的使用寿命 结果与讨论 在 6.% 的乙腈中配制每种化合物的混合样品 使用方法 可在 3 分钟内分离所有 种化合物, 该方法采用 8 分钟的平缓梯度 ( 图 3, 表 ) 等度方法无法将混合物分离 MS 参数 电离模式 ESI 负离子模式 气体温度 C 气体流速 L/min 雾化器 4 psi 鞘气温度 3 C 鞘气流速 L/min 毛细管电压 3 V 喷嘴电压 V 锥孔电压 6 V Oct RF Vpp 7 V 采集参数 数据在 GHz 的扩展动态范围下采集 MS 质量数范围 :m/z 表. USP 标准品和保留时间化合物 分子量 保留时间 木糖.3.97 塔格糖 8.6.66 3 果糖 8.6.99 4 甘露糖 8.6 3.68 甘露胺盐酸盐.63 3.74 6 右旋葡萄糖 8.6 3.947 7 半乳糖 8.6 4.4 8 蔗糖 34.3 7.36 9 依匹乳糖 34.3 8.467 一水合麦芽糖 34.3. 乳果糖 34.3. N- 乙酰神经氨酸 39.7.84 3 一水合乳糖 343.3 3.84 4 KDN 68. 3.9 N- 羟乙酰神经氨酸 3.7 4.97 表. 方法 参数 方法 时间 (min) %A %B 3 97 89. 3 97 8 3 37 A = mmol/l 甲酸铵,pH. B = % mmol/l 甲酸铵,pH., 溶于 9% 乙腈 3
右旋葡萄糖 乳糖 4 N- 乙酰神经氨酸 果糖 依匹乳糖 N- 羟乙酰神经氨酸 半乳糖 乳果糖 KDN 甘露糖 麦芽糖 木糖 塔格糖 蔗糖 甘露胺盐酸盐 3 4 6 6 7 8 9 4 6 8 4 图. 单独进样的 6 碳单糖 USP 标准品 图. 单独进样的二糖同分异构体 USP 标准品 图 3. 单独进样的 USP 标准品...9.8.7.6..4.3.... 3. 4.. 6. 7. 8. 木糖塔格糖果糖甘露糖甘露胺盐酸盐右旋葡萄糖半乳糖蔗糖 3 9. 依匹乳糖. 一水合麦芽糖. 乳果糖. N- 乙酰神经氨酸 3. 一水合乳糖 4. KDN. N- 羟乙酰神经氨酸 6 7 8 9 3 4 3 4 6 7 8 9 3 图 4. 分离所有 种 USP 标准品的混合样品 4
结论 6 Infinity II 液相色谱系统 AdvanceBio MS Spent Media 色谱柱和 63 TOF LC/MS 结合使用可快速分析复杂的碳水化合物混合物 该方法具有 ESI-MS 的灵敏度, 无需耗时费力的碳水化合物衍生步骤, 可为目前使用糖类衍生化进行简单碳水化合物 LC/MS 和 GC/MS 分析的所有实验室节省时间和成本, 提高实验室效率 参考文献. Leong, D. S.; et al. Evaluation and Use of Disaccharides as Energy Source in Protein-Free Mammalian Cell Cultures. Sci. Rep. 7, 7, article number 46. Leong, D. S. Z.; et al. Application of Maltose as Energy Source in Protein-Free CHO-K Culture to Improve the Production of Recombinant Monoclonal Antibody. Sci. Rep. 8, 8, article number 437 3. Lin, N.; et al. Chinese Hamster Ovary (CHO) Host Cell Engineering to Increase Sialylation of Recombinant Therapeutic Proteins by Modulating Sialyltransferase Expression. Biotechnol. Prog., 3(), 334 346 4. Webster, G. K.; Jensen, J. S.; Diaz, A. R. An Investigation into Detector Limitations Using Evaporative Light-Scattering Detectors for Pharmaceutical Applications. J. Chromatogr. Sci. 4, 4(9), 484-49. Mitchell, C. R.; et al. Comparison of the Sensitivity of Evaporative Universal Detectors and LC/MS in the HILIC and the Reversed-Phase HPLC Modes. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 9, 877(3), 433-439
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