图 1 八种糖 UPLC 分离检测色谱图 Fructose Sorbose 表 2 八种糖标准品分离分析数据 Glucose

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1 ACQUITY UPLC-ELSD 测定奶粉和牛奶中八种糖的 赵淑军沃特世科技有限公司 关键词 : 超高效液相色谱奶粉牛奶 Fructose( 果糖 ) Sorbose( 山梨糖 ) Glucose( 葡萄糖 ) Sucrose( 蔗糖 ) Maltose( 麦芽糖 ) Lactose( 乳糖 ) Maltotriose( 麦芽三糖 ) Maltotetraose( 麦芽四糖 ) 实验方法 材料 试剂和仪器乙腈为色谱纯, 三乙胺为优级纯, 实验用水为超 纯水 (18MΩ,TOC 3ppb),ACQUIT Y UPLC 超高效液相色谱 系统,Acquity ELSD 检测器,(FILT ER MIX ER(425µl,P/N ), 可不用 ) 色谱条件液相系统 : 色谱柱 : 沃特世 (Waters ) ACQUIT Y U PLC 配 ACQUITY ELSD 蒸发光散射检测器 ACQUITY UPLC BEH Amide 2.1mm 100mm, 1.7 µm,p/n: 柱温 : 35 分析时间 : 进样量 : 流动相 A: 18 min 5µl( 样品进样 2ul) 水 流动相 B: 0.2TEA 乙腈溶液 ; 梯度洗脱 弱洗溶剂 : 乙腈 / 水 =90/10,800µl 强洗溶剂 : 乙腈 / 水 =10/90,500µl 进样方式 : 不充满定量环 ( 使用针溢出 ) ELSD 条件 增益 : 500 数据率 : 10pps 喷雾器模式 : 冷却 漂移管温度 : 55 气体压力 : 30psi 实验室试验温度 : 20 实验室试验湿度 : 45 工作电源 : 220V 稳定电源 梯度方法见下表 : 表 1 检测梯度表 时间 /(min) 流量 /(ml/min) A B 曲线 初始 数据处理系统 Empower 2 前处理方法称取 2.0 g 奶粉样品或 5ml 液态奶样品, 加入 20mL ( 对于液态奶添加 15ml)1/1 的乙腈水溶液溶解, 手摇 震荡混匀, 然后涡旋混匀 2 分钟, 室温下 8000r/min 离 心 15 分钟, 取上清液过 0.2um 滤膜 ; 对于某些样品由 于糖很高, 所以过滤后的样品可能需要用乙腈 / 水 =70/30 的溶液稀释一定倍数后, 进样检测 结果与讨论 标准配制八种糖标准分别称取 10mg, 用 1/1 的乙腈水定容至 1ml, 然后用乙腈 / 水 =70/30 的溶液稀释配制各个浓度的标准品, 进行实验 八种糖 UPLC 分离检测色谱图及数据图 1 是八种糖 50ppm 混合标准品用 UPLC(ACQUITY UPLC BEH Amide 色谱柱 ) 分离,ELSD 检测的色谱图, 按照顺序分别是 :Fructose( 果糖 ) Sorbose( 山梨糖 ) Glucose( 葡萄糖 ) Sucrose( 蔗糖 ) Maltose( 麦芽糖 ) Lactose( 乳糖 ) Maltotriose( 麦芽三糖 ) Maltotetraose( 麦芽四糖 ); 包括 5 种单糖和 3 种多糖 有关数据见下表

2 图 1 八种糖 UPLC 分离检测色谱图 Fructose Sorbose 表 2 八种糖标准品分离分析数据 Glucose Sucrose Maltose Lactose Maltotriose Maltotetraose 方法的检出限如图 2 所示, 为 5ppm 的混标色谱图, 此浓度下按保 留时间顺序八种糖的信噪比分别达到 和 3,( 进样量 10µl): 可见, 八种糖中 Fructose( 果糖 ) Sorbose( 山梨 糖 ) Glucose( 葡萄糖 ) Maltose( 麦芽糖 ) Maltotriose ( 麦芽三糖 ) 和 Maltotetraose( 麦芽四糖 ) 的检测限为 5ppm; 此浓度下 Lactose( 乳糖 ) 可达到定量限, 而 Sucrose ( 蔗糖 ) 的定量限可以到达 2ppm USP 分离度 s/n Fructose 找到 58 Sorbose 找到 Glucose 找到 Sucrose 找到 Mattose 找到 Lactose 找到 Fructose Sorbose Glucose Sucrose Maltose Lactose Maltotriose Maltotetraose Mattotriose 找到 Mattotetraose 找到 其中较难分离的 Fructose( 果糖 ) 和 Sorbose( 山梨糖 ) Maltose( 麦芽糖 ) 和 Lactose( 乳糖 ) 均分别达到 的分离度 图 2 5ppm 的混标色谱图 图 3 Fructose 工作曲线和方程 图 4 Sorbose 工作曲线和方程 图 5 Glucose 工作曲线和方程 图 6 Sucrose 工作曲线和方程 21

3 图 7 Maltose 工作曲线和方程 图 8 Lactose 工作曲线和方程 图 9 Maltotriose 工作曲线和方程 图 10 Maltotetraose 工作曲线和方程 方法的线性相关性浓度分别为 mg/ L 的八种糖标准品依次进样, 进样量均为 5µ L, 外标法定量 以峰 A 的 lg 值为纵坐标, 浓度 C 的 lg 值为横坐标进行线性回归, 得到 8 种糖的线性方程 复相关系数和线性曲线图如图 3- 图 10 所示, 在 mg/l 范围 8 种糖均具有良好的 lg-lg 线性关系 实际样品检测结果从市场取某一奶粉样品, 进行实际提取实验, 进样检测, 色谱图及结果数据见图 11 所示, 可以看出此样品中含有蔗糖 乳糖 麦芽三糖和麦芽四糖四种糖成分, 同时发现蔗糖和乳糖的相当高, 已经超出检测器的响应范围 ; 因此将此样品稀释 100 倍后再次进样检测, 结果数据见图 12 由图 1 1 和 1 2 的数据可以知道此奶粉中含有蔗糖 16.8mg/g 乳糖 mg/g 麦芽三糖和麦芽四糖的分别只有 1.9mg/g 1.3 mg/g 某液态奶提取后, 稀释 100 倍检测结果见图 13 重现性首先用 50ppm 混合标准 6 次连续重复进样, 考察标准 品在本方法下的稳定性, 见图 14 所示重叠色谱图, 重复数据见表 3 表 4 提取奶粉实际样品, 由于乳糖较高, 将其稀释了 100 倍, 然后在不同天次连续 3 天进样检测, 考察本方法对于实际样品日间的重现性情况, 如图 15 所示是该实际样品 3 天内 3 次进样的重叠色谱图, 由图可见该方法对实际样品在日间具有较好的重现性 结论 本方法建立了用 Waters UPLC-ELSD 系统检测奶粉和牛奶实际样品中 Fructose( 果糖 ) Sorbose( 山梨糖 ) Glucose ( 葡萄糖 ) Sucrose( 蔗糖 ) Maltose( 麦芽糖 ) Lactose( 乳糖 ) Maltotriose( 麦芽三糖 ) Maltotetraose( 麦芽四糖 )8 种常见糖的的定量分析方法 方法的检出限 : 有 6 种糖达到 5µg/g, 另外两种糖 Sucrose 和 Lactose 在 5µg/g 下的信噪比可达到 24 和 12 使用 ACQUITY UPLC BEH Amide 色谱柱和三乙胺流动相体系,8 种糖均实现基线分离, 可以用于奶粉和牛奶中常见这 8 种糖的测定 参考资料 Waters ACQUITY UPLC BEH Amide Columns Care & Use,P/N:

4 Sucrose Lactose Maltotriose Maltotetraose Lactose 积分类型 Fructose 丢失 Sorbose 丢失 Glucose 丢失 Sucrose BB ug/g Maltose 丢失 Lactose BB ug/g Maltotriose BB ug/g ( 微伏秒 ) 积分 类型 Fructose 丢失缺失 Sorbose 丢失缺失 Glucose 丢失缺失 Sucrose 丢失缺失 Maltose 丢失缺失 Lactose BB ug/g 找到 Maltotriose 丢失缺失 Maltotetraose 丢失缺失 Maltotetraose BB ug/g 图 13 液态奶提取样品稀释 100 倍色谱图及结果数据 图 11 奶粉提取样品色谱图及结果数据 Sucrose Lactose ( 微伏 * 秒 ) 积分类型 Fructose 丢失缺失 Sorbose 丢失缺失 Glucose 丢失缺失 Sucrose BB ug/g 找到 Maltose 丢失缺失 Lactose BB ug/g 找到 Maltotriose 丢失缺失 Maltotetraose 丢失缺失 图 14 50ppm 标准品 6 次连续进样重叠色谱图 图 12 奶粉提取样品稀释 100 倍色谱图及结果数据

5 表 3 8 种分析物标准 6 次连续进样重现性表 组份结果 组份摘要 : 样品组名 采集日期 Fructose Sorbose Glucose Sucrose Maltose Lactose Maltotriose Maltotetraose 1 tang_ :05:13 CST tang_ :24:09 CST tang_ :08:23 CST tang_ :46:15 CST tang_ :49:28 CST tang_ :27:19 CST Meen Std.Dev RSD Sucrose Lactose 图 15 实际奶粉提取样品日间重叠色谱图 Fructose 样品组名采集日期 表 4 8 种分析物标准 6 次连续进样峰重现性表组份结果组份摘要 : Sorbose Glucose Sucrose Maltose Lactose Maltotriose Maltotetraose 1 tang_ :05:13 CST tang_ :24:09 CST tang_ :08:23 CST tang_ :46:15 CST tang_ :49:28 CST tang_ :27:19 CST Meen Std.Dev RSD

4. 前处理方法 称取 2.0g 奶粉样品或 5ml 液态奶样品, 加入 20mL( 对于液态奶添加 15ml)1/1 的乙腈水溶液溶解, 手摇震荡混匀, 然后均质混匀 2 分钟, 室温下 8000r/min 离心 15 分钟, 取上清液过 0.2um 滤膜 ; 对于某些样品由于糖含量很高, 所以过

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