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1 使 用 HPLC Online SPE 方 法 分 析 复 方 甘 草 制 剂 中 的 吗 啡 应 用 甘 草, 固 相 萃 取, 二 维 液 相 色 谱, 超 高 效 液 相 色 谱 作 者 肖 尧 李 浪 安 捷 伦 科 技 ( 中 国 ) 有 限 公 司, 北 京, 摘 要 目 的 : 建 立 两 种 复 方 甘 草 制 剂 中 吗 啡 成 分 测 定 的 Online SPE-UHPLC 分 析 方 法, 进 行 定 量 分 析 方 法 : 采 用 Agilent Zorbax Extend C18 柱 (4.6 x 12.5 mm,5 µm) 作 为 Online SPE 柱, 采 用 Agilent Poroshell 120 EC C8 柱 (3.0 x 50 mm,2.7 µm), 以 庚 烷 磺 酸 钠 水 溶 液 (A) 乙 腈 (B) 为 流 动 相, 等 度 洗 脱, 检 测 波 长 为 220 nm; 结 果 : 通 过 Online SPE 方 法 可 以 有 效 去 除 样 品 中 的 基 质 干 扰, 回 收 率 >95%, 重 现 性 良 好, 保 留 时 间 RSD%<1%, 峰 面 积 RSD%<1.5%, 并 且 取 得 准 确 的 定 量 结 果 结 论 : 本 文 所 建 立 的 方 法 分 析 速 度 快, 分 离 效 果 良 好, 比 传 统 SPE 方 法 操 作 简 便, 使 用 成 本 低, 为 复 方 甘 草 制 剂 的 质 量 控 制 提 供 了 一 种 快 速 准 确 低 成 本 的 分 析 方 法
2 引 言 在 2010 版 中 国 药 典 中, 收 载 了 两 种 复 方 甘 草 制 剂 [1], 此 类 制 剂 具 有 止 咳 祛 痰 的 作 用 其 中 的 吗 啡 成 分 是 主 要 药 效 成 分, 也 作 为 质 量 控 制 的 主 要 成 分, 需 要 进 行 定 量 分 析 吗 啡 是 一 种 生 物 碱 类 化 合 物, 具 有 很 强 的 极 性, 在 C18 色 谱 柱 上 很 难 保 留, 所 以 药 典 中 使 用 了 离 子 对 色 谱 法 对 此 成 分 进 行 分 析, 尽 管 如 此, 吗 啡 的 保 留 依 然 很 弱, 在 分 析 过 程 中, 很 容 易 受 到 样 品 基 质 中 弱 保 留 杂 质 的 干 扰, 针 对 此 情 况, 药 典 中 规 定 使 用 固 相 萃 取 (SPE) 方 法 对 样 品 进 行 前 处 理, 这 种 方 法 净 化 效 果 好, 回 收 率 高, 可 以 有 效 去 除 基 质 中 的 干 扰 组 分, 但 是 使 用 成 本 较 高, 并 且 操 作 繁 琐 在 本 章 中, 我 们 开 发 了 一 种 基 于 Agilent 1200 超 高 效 液 相 色 谱 系 统 的 Online SPE 方 法 对 样 品 进 行 前 处 理, 在 提 高 了 样 品 处 理 及 分 析 速 度 的 同 时, 降 低 了 使 用 成 本, 经 过 验 证, 此 方 法 回 收 率 及 重 现 性 良 好, 定 量 准 确, 适 合 对 此 类 制 剂 进 行 定 量 分 析 及 质 量 控 制 实 验 部 分 仪 器 与 试 剂 : Agilent 1260 Infinity 2D-LC 液 相 色 谱 系 统, 配 备 脱 气 机, 四 元 泵 (2 台 ), 自 动 进 样 器, 柱 温 箱 ( 内 置 二 位 六 通 阀 ), 二 极 管 阵 列 检 测 器,SPE 柱 为 Agilent Zorbax Extend C18 保 护 柱 (4.6 x 12.5 mm, 5 µm) 色 谱 柱 为 Agilent Poroshell 120 EC C8 柱 (3.0 x 50 mm, 2.7 µm), 数 据 处 理 软 件 为 Agilent OpenLab CDS ChemStation (Agilent Technologies, Inc. 美 国 ) 庚 烷 磺 酸 钠, 碳 酸 氢 铵 试 剂 ( 色 谱 纯,Sigma 公 司, 美 国 ); 甲 醇, 乙 腈, 磷 酸, 盐 酸 ( 色 谱 纯, 迪 马 科 技, 北 京 ); 超 纯 水 由 MiliQ 纯 水 机 制 备 (Merck-Millipore, 德 国 ); 吗 啡 标 准 品 ( 标 准 品, 国 家 标 准 物 质 中 心 ); 复 方 甘 草 片, 复 方 甘 草 口 服 液 均 购 买 自 本 地 药 店 标 准 品 : 秤 取 吗 啡 对 照 品 10.2 mg, 溶 解 于 10 ml 5% 的 乙 酸 水 溶 液 中, 作 为 储 备 液, 再 用 5% 的 乙 酸 水 溶 液 稀 释 100 倍, 得 含 量 为 10.2 µg/ml 的 工 作 溶 液 样 品 处 理 : 复 方 甘 草 口 服 液 : 量 取 0.5 ml 样 品, 用 5% 的 乙 酸 水 溶 液 稀 释 至 5 ml, 过 0.22 µm 滤 膜, 即 得 复 方 甘 草 片 : 取 复 方 甘 草 片 30 片, 精 密 称 定, 研 细, 精 密 称 取 约 10 片 量, 至 磨 口 锥 形 瓶 中, 精 密 加 水 90 ml, 超 声 提 取 5 min, 精 密 加 稀 盐 酸 5 ml, 超 声 提 取 20 min, 取 出, 放 冷, 过 0.22 µm 滤 膜, 即 得 色 谱 条 件 : 仪 器 配 置 如 图 1 所 示, 通 过 二 位 六 通 阀 分 别 连 接 SPE 柱 和 分 析 柱, 样 品 先 由 泵 1 在 SPE 柱 上 进 行 净 化 ( 如 图 1A), 净 化 完 成 后, 通 过 阀 切 换 流 路 将 样 品 从 SPE 柱 洗 脱 到 分 析 柱 上 ( 如 图 1B), 之 后 阀 切 换 回 图 1A 位 置, 样 品 在 分 析 柱 上 继 续 进 行 分 析 图 1. A:SPE 净 化 B: 切 换 组 分 至 分 析 柱 2
3 Online SPE 条 件 :SPE 柱 :Agilent Zorbax Extend C18 保 护 柱 (4.6 x 12.5 mm,5 µm), 流 动 相 :A= 水 B= 甲 醇,C=0.1% 磷 酸 水 溶 液,D=10 Mmol/L 碳 酸 氢 铵 水 溶 液, 梯 度 洗 脱 时 间 见 表 1, 流 速 :1 ml/min, 柱 温 :30 C, 进 样 量 5 µl 表 1. Online SPE 梯 度 时 间 表 时 间 A B C D 样 品 分 析 条 件, 色 谱 柱 :Agilent Poroshell EC C8 柱 (3.0 x 50 mm, 2.7 µm), 流 动 相 :25 Mmol/L 磷 酸 二 氢 钾 1.25 Mmol/L 庚 烷 磺 酸 钠 水 溶 液 (A): 乙 腈 (B) = 83:17, 等 度 洗 脱, 流 速 :0.4 ml/min, 柱 温 :30 C, 阀 切 换 时 间 设 置 见 表 2: 表 2. 柱 切 换 阀 切 换 时 间 设 置 ( 按 图 1 位 置 ) 时 间 阀 位 置 A B A 结 果 与 讨 论 标 准 品 分 析 结 果 首 先 使 用 上 述 条 件 对 吗 啡 标 准 品 进 行 分 析, 结 果 见 图 2, 从 色 谱 图 中 可 以 看 出, 吗 啡 标 准 品 峰 型 及 保 留 状 况 良 好, 各 项 系 统 适 应 性 参 数 均 可 满 足 中 国 药 典 2010 版 相 关 品 种 项 目 下 的 要 求, 与 空 白 进 样 比 较, 无 影 响 分 析 的 干 扰 峰 方 法 学 考 察 重 现 性, 分 别 对 标 准 品 和 样 品 连 续 重 复 进 样 6 次, 计 算 保 留 时 间 及 峰 面 积 RSD 值, 保 留 时 间 RSD 均 小 于 0.1%, 峰 面 积 RSD 均 小 于 1.5%, 具 体 数 值 见 表 3: 表 3. 重 现 性 结 果 标 准 品 复 方 甘 草 口 服 液 复 方 甘 草 片 保 留 时 间 RSD 0.06% 0.04% 0.07% 峰 面 积 RSD 1.24% 0.44% 1.31% 回 收 率, 用 标 样 直 接 进 样 得 到 的 峰 面 积 与 经 过 Online SPE 方 法 分 析 相 同 标 样 得 到 的 峰 面 积 进 行 比 较 计 算 回 收 率,Online SPE 方 法 的 回 收 率 可 以 达 到 95.6% 图 2. 吗 啡 标 准 品 ( 蓝 ) 及 空 白 ( 红 ) 分 析 结 果 3
4 样 品 分 析 图 3 为 使 用 上 述 Online SPE 方 法 对 复 方 甘 草 口 服 液 和 复 方 甘 草 片 进 行 分 析 的 色 谱 图, 可 以 看 出, 此 方 法 对 样 品 净 化 完 全, 可 以 有 效 的 去 处 基 质 中 的 干 扰 组 分, 分 析 快 速, 可 在 10 分 钟 内 完 成 全 部 分 析 使 用 外 标 法 对 样 品 中 吗 啡 的 含 量 进 行 定 量 分 析, 并 与 标 示 含 量 进 行 比 较, 样 品 定 量 结 果 均 与 标 示 含 量 或 合 理 用 药 量 相 符, 结 果 见 表 4: 表 4. 甘 草 样 品 定 量 结 果 实 测 含 量 标 示 含 量 复 方 甘 草 口 服 液 µg/ml 无 复 方 甘 草 片 0.39 mg/ 片 0.36~0.44 mg/ 片 复 方 甘 草 口 服 液 没 有 标 示 含 量, 根 据 说 明 书 推 荐 使 用 剂 量 ( 每 次 5~10 ml, 每 日 3 次 ) 计 算, 每 次 摄 入 吗 啡 计 量 为 0.49~0.99 mg, 每 日 1.47~2.97 mg 此 用 量 在 正 常 临 床 使 用 剂 量 范 围 之 内, 推 断 含 量 测 定 及 计 算 结 果 应 为 正 确 值 讨 论 在 方 法 开 发 过 程 中, 使 用 10 Mmol/L 碳 酸 氢 铵 溶 液 取 代 了 药 典 当 中 使 用 的 氨 水 溶 液 作 为 SPE 的 上 样 溶 液, 此 溶 液 无 需 调 节 ph, 且 具 有 一 定 缓 冲 能 力, 更 适 合 于 在 线 自 动 分 析 使 用 由 于 使 用 碱 性 溶 液, 所 以 选 择 了 Agilent Zorbax Extend C18 保 护 柱 作 为 Online SPE 柱, 这 种 填 料 的 色 谱 柱 具 有 独 特 的 桥 式 健 合 技 术, 在 高 ph 值 的 分 析 条 件 下 也 可 以 保 持 良 好 的 分 析 效 果 和 柱 寿 命, 可 以 取 代 一 次 性 SPE 小 柱 反 复 使 用, 从 而 降 低 方 法 的 整 体 使 用 成 本 另 外, 由 于 保 护 柱 采 用 了 卡 套 式 设 计, 更 换 方 便, 可 以 提 高 方 法 的 易 用 性 第 二 维 色 谱 柱 依 据 药 典 方 法 使 用 Poroshell EC C8 色 谱 柱, 有 助 于 提 高 吗 啡 的 保 留,Poroshell 色 谱 柱 具 有 和 亚 二 微 米 填 料 色 谱 柱 近 似 的 柱 效, 但 是 反 压 较 低, 所 以 此 方 法 也 可 以 运 行 于 常 规 HPLC 系 统 上 图 3. 样 品 分 析 结 果 A: 复 方 甘 草 口 服 液 ( 蓝 ) 及 空 白 ( 红 );B 复 方 甘 草 片 ( 蓝 ) 及 空 白 ( 红 ) 4
5 在 进 行 流 路 连 接 时, 曾 经 考 虑 过 使 用 反 冲 的 办 法 将 SPE 柱 上 富 集 的 样 品 冲 到 分 析 柱 上 ( 如 图 4), 这 种 连 接 方 法 通 常 可 以 得 到 较 好 的 峰 型 及 较 快 的 分 析 速 度, 但 是 在 这 个 应 用 中, 由 于 分 析 流 路 的 流 动 相 中 含 有 离 子 对 试 剂, 反 冲 到 SPE 柱 上 会 导 致 SPE 柱 难 以 迅 速 平 衡, 所 以 采 用 了 正 冲 的 方 法, 直 接 将 SPE 柱 上 的 收 集 的 组 分 用 冲 洗 到 分 析 柱 上, 这 种 方 法 可 以 在 被 分 析 组 分 冲 洗 到 分 析 柱 上 之 后 切 换 阀, 对 SPE 柱 进 行 冲 洗 和 重 新 平 衡 为 了 防 止 样 品 中 的 干 扰 成 分 残 留 在 SPE 柱 上 导 致 污 染 及 方 法 不 稳 定, 在 被 测 成 分 被 冲 洗 到 分 析 柱 后, 使 用 75% 甲 醇 - 水 冲 洗 SPE 柱, 可 以 保 证 将 SPE 柱 上 强 保 留 的 干 扰 物 冲 洗 干 净, 图 5 为 不 切 阀 的 状 况 下 标 准 品 及 样 品 在 SPE 柱 上 的 净 化 情 况, 可 以 看 出, 在 吗 啡 被 洗 脱 后, 增 加 冲 洗 过 程 可 以 洗 脱 残 留 在 SPE 柱 上 的 污 染 组 分, 避 免 SPE 柱 被 污 染, 使 方 法 更 加 稳 定 图 4. A:SPE 柱 上 样 / 净 化 B: 从 SPE 柱 上 反 冲 目 标 组 分 到 分 析 柱 图 5. 样 品 在 Online SPE 柱 上 的 净 化 A: 标 准 品 ;B 复 方 甘 草 口 服 液 ;C 复 方 甘 草 片 5
6 在 样 品 分 析 周 期 上, 离 线 SPE 方 法 在 对 样 品 进 行 提 取 后 需 要 进 行 一 系 列 的 处 理, 包 括 对 SPE 小 柱 的 活 化, 上 样, 淋 洗 及 洗 脱 等, 需 要 消 耗 大 量 的 时 间 和 溶 剂, 虽 然 仅 需 用 6 分 钟 即 可 结 束 液 相 色 谱 分 析, 但 是 整 个 样 品 分 析 过 程 中, 前 处 理 时 间 占 据 了 绝 大 部 分 时 间 成 为 限 速 步 骤 ;Online SPE 方 法 仅 需 对 样 品 进 行 提 取 过 滤 即 可 进 样, 虽 然 液 相 色 谱 分 析 时 间 为 10 分 钟, 但 是 从 整 个 样 品 分 析 周 期 来 看, 在 线 方 法 可 以 省 去 大 部 分 样 品 前 处 理 时 间, 比 离 线 方 法 大 幅 节 省 时 间, 并 且 降 低 了 溶 剂 的 消 耗 图 6. 离 线 SPE 结 果 与 Online SPE 结 果 A: 离 线 SPE 结 果 ;B:Online SPE 结 果 6
7 结 论 本 文 开 发 了 一 个 快 速 高 效 低 成 本 的 Online SPE 方 法 用 于 分 析 复 方 甘 草 制 剂 中 的 吗 啡 成 分, 方 法 稳 定, 回 收 率 良 好, 可 以 有 效 去 除 此 类 样 品 中 的 基 质 干 扰 成 分, 取 得 准 确 的 定 性 定 量 结 果, 比 起 传 统 的 离 线 SPE 方 法, 节 省 了 样 品 前 处 理 时 间, 缩 短 了 整 个 样 品 分 析 周 期, 可 以 提 高 实 验 室 工 作 效 率, 同 时, 可 以 降 低 样 品 分 析 的 成 本, 提 高 实 验 室 工 作 的 自 动 化 程 度, 适 合 于 此 类 样 品 的 日 常 分 析 工 作 参 考 文 献 1 中 国 药 典 委 员 会. 中 国 药 典 2010 版 ( 第 一 部 ), 北 京, 2010,574 更 多 信 息 本 文 仅 代 表 典 型 的 结 果 更 多 有 关 我 们 产 品 和 服 务, 请 访 问 我 们 的 网 站 : 7
8 安 捷 伦 对 本 资 料 可 能 存 在 的 错 误 或 由 于 提 供 展 示 或 使 用 本 资 料 所 造 成 的 间 接 损 失 不 承 担 任 何 责 任 本 资 料 中 的 信 息 说 明 和 指 标 如 有 变 更, 恕 不 另 行 通 知 安 捷 伦 科 技 ( 中 国 ) 有 限 公 司, 年 3 月 26 日, 中 国 印 刷 CHCN
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