SEC 方法开发中的流动相优化

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声备宫
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1 应用简报制药与生物制药 SEC 方法开发中的流动相优化作者 Richard Hurteau 安捷伦科技有限公司 Wilgton, DE, USA 摘要单克隆抗体 (mab) 产品的聚集会影响其作为治疗药物的疗效体积排阻色谱 (SEC) 是一种高效检测治疗性蛋白质和多肽中的聚集体的方法本应用简报介绍了使用 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱表征标准蛋白质混合物中的单体二聚体和聚集体过程中的方法优化

2 前言单克隆抗体产品, 例如 mab 抗体药物偶联物 (ADC) Fc- 融合蛋白抗体片段及其他治疗性蛋白质和多肽, 能够治疗许多疾病 mab 产品在生物制药行业中的应用正快速增长预计到 22 年全球销售额将达到 1 亿美元 1 治疗性蛋白质的制造和生产是一个极其复杂的过程, 该过程可能包括 5 多个关键工艺步骤 2 mab 产品在生产过程中的聚集对其疗效和安全性具有不利影响, 并将导致药物审批失败 3,4,5 因此, 在生物制药行业中, 蛋白质和多肽中的聚集体含量是一项关键质量属性 (CQA) SEC 被视为检测治疗性蛋白质和多肽中的单体二聚体聚集体和降解产物的金标准分析方法 3 AdvanceBio SEC 色谱柱填充以高度均匀的 2.7 µm 颗粒填料, 包含低结合带聚合物涂层的硅胶固定相, 可实现高效分离和最小的非特异性相互作用这些色谱柱能够与许多具有不同浓度的缓冲液和盐的流动相配合使用优化缓冲液和盐浓度是最大程度提高色谱柱分离效果的关键部分, 其目的在于避免造成峰拖尾峰变形分离度不佳的次级相互作用以及由流动相引起的蛋白质聚集 3 也可将色谱柱串联使用以提高分离度本应用简报展示了色谱分析中不同流动相组成对各种大小的蛋白质以及色谱柱固定相的影响流动相中不使用异丙醇来减小次级相互作用, 因为这对 AdvanceBio SEC 色谱柱而言并不需要材料与方法样品源自人血清的 IgG,Sigma, I456-1MG SigmaMAb 抗体药物偶联物 (ADC) 模拟物,Sigma,MSQC8-.5MG 源自牛胰腺的胰岛素,Sigma,I55 源自牛心的细胞色素 C,Sigma, C3131-5MG 凝胶过滤标准品,Bio-Rad, 源自牛血清的 IgG,Sigma,I964 源自马心的肌红蛋白,Sigma, M1882 普鲁兰多糖标准品试剂盒 SAC-1, 安捷伦部件号 PL29-1 安捷伦样品瓶, 螺口, 棕色, 经认证,2 ml,1/ 包样品瓶规格 :12 32 mm ( 带 12 mm 瓶盖 ) ( 部件号 ) 安捷伦蓝色固定螺口盖, PTFE/ 白色硅橡胶隔垫,1/ 包瓶盖尺寸 :12 mm ( 部件号 ) 色谱柱 Agilent AdvanceBio SEC 3 Å, mm, 2.7 µm ( 部件号 PL ) Agilent AdvanceBio SEC 13 Å, mm, 2.7 µm ( 部件号 PL ) 液相色谱系统 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元泵 (G5611A) Agilent 126 Infinity 生物惰性自动进样器 (G5667A) 用于 Agilent 12 ALS/ 馏分收集器的恒温器 (G133B) Agilent 129 Infinity 柱温箱 (G1316C) Agilent 126 Infinity DAD 检测器 (G1315C) 仪器条件缓冲液流速设置为 1 ml/, 柱温 C, 冷却器设置为 4 C, 检测波长 22 nm 2

3 结果与讨论优化磷酸盐缓冲液浓度为考察不同磷酸钠缓冲液浓度对 mab 产品及其他蛋白质色谱分析的影响, 开展了一系列实验对下列样品采用 ph 为 7. 的各种浓度的磷酸钠 ( 不含氯化钠 ): 人 IgG ADC 模拟化合物胰岛素和细胞色素 C 使用下列浓度的磷酸盐缓冲液 : 和 6 mmol/l 取 1 微升 1 mg/ml 溶液进样分析还使用了 1 mmol/l 磷酸盐缓冲液, 但是该缓冲液会导致系统超压及色谱柱损坏, 因此不建议采用图 1 展示了人 IgG 的色谱图使用 4 mmol/l 或 6 mmol/l 的磷酸盐缓冲液得到的色谱分离结果较差, 随着磷酸盐缓冲液浓度降低,IgG 单体的峰变得更尖锐 ( 图 1) 在 4 mmol/l 或 6 mmol/l 磷酸盐浓度下, 出现了较大的聚集体峰, 表明流动相引起 IgG 样品发生聚集 ( 见图 1 中约 4. 分钟处的峰 ), 造成错误结果随着磷酸盐缓冲液浓度从 6 mmol/l 降至 1 mmol/l, 单体的拖尾因子减小 ( 表 1) 磷酸盐缓冲液浓度降低时,IgG 单体和二聚体之间的峰分离度增加 ( 表 2) 利用 15 mmol/l 磷酸盐缓冲液获得了最低的拖尾因子和最高的分离度这是用于 IgG 样品分析的推荐条件 ( 表 1 和表 2) mmol/l 磷酸盐 mmol/l 磷酸盐 mmol/l 磷酸盐 mmol/l 磷酸盐 mmol/l 磷酸盐图 1. 不同磷酸盐浓度下的 IgG 分离结果表 1. 拖尾因子 vs. 磷酸盐浓度化合物 MW (kda) pi IgG ADC 164 不适用不适用不适用胰岛素细胞色素 C 不适用表 2. 单体 - 二聚体分离度 vs. 磷酸盐浓度化合物 MW (kda) pi IgG 表 3. 不同磷酸盐浓度下的保留时间化合物 MW (kda) pi IgG ADC 164 不适用不适用不适用胰岛素细胞色素 C

4 采用 6 mmol/l 磷酸盐缓冲液时, 分裂的 ADC 峰较宽并发生拖尾, 并且次级相互作用造成保留时间略有延长 ( 表 3 和图 2) 随着磷酸盐缓冲液浓度降低, 观察到拖尾因子减小峰形和峰大小得到改善 ( 表 1 和图 2), 因此 15 mmol/l 至 5 mmol/l 磷酸盐是首选的缓冲液范围 mmol/l 磷酸盐 mmol/l 磷酸盐 mmol/l 磷酸盐 mmol/l 磷酸盐 mmol/l 磷酸盐图 2. 不同磷酸盐浓度下的 ADC 色谱图 4

5 据文献报道, 在胰岛素分析中难以获得高质量色谱图, 特别是胰岛素 SEC 色谱分析中存在的与拖尾峰和伸舌峰相关的问题 6 采用 6 mmol/l 和 4 mmol/l 磷酸盐缓冲液时, 观察到胰岛素峰变形且回收率较差在较低的磷酸盐浓度下观察到更高更尖锐的峰, 表明这些缓冲液浓度更有利 ( 图 3) 磷酸盐缓冲液浓度在 5 15 mmol/l 范围内时, 拖尾因子保持恒定 ( 表 1), 但是在 5 mmol/l 和 1 mmol/l 磷酸盐缓冲液下同样测得保留时间漂移 ( 表 3) 这一结果表明存在次级相互作用, 并表明 15 mmol/l 磷酸盐是首选的流动相 4 6 mmol/l 磷酸盐 mmol/l 磷酸盐 mmol/l 磷酸盐 mmol/l 磷酸盐 mmol/l 磷酸盐图 3. 不同磷酸盐浓度下的胰岛素色谱图表 4. 拖尾因子 vs. 15 mmol/l 磷酸盐缓冲液和不同的 NaCl 浓度化合物 MW (kda) pi IgG ADC 164 不适用不适用 1.51 不适用胰岛素细胞色素 C 表 5. 在 15 mmol/l 磷酸盐 ph mmol/l NaCl 条件下,IgG 单体和二聚体之间的分离度化合物 MW (kda) pi IgG

6 使用细胞色素 C 重复该实验细胞色素 C 的色谱图不同于所研究的其他蛋白质, 其在较高的磷酸盐浓度下具有较小的拖尾因子更出色的峰形和更高的峰面积 ( 图 4 和表 1), 表明这些浓度下的次级相互作用较小这一结果表明,4 mmol/l 或 6 mmol/l 磷酸盐缓冲液是分析细胞色素 C 的首选流动相 mmol/l 磷酸盐 mmol/l 磷酸盐 mmol/l 磷酸盐 mmol/l 磷酸盐图 4. 不同磷酸盐缓冲液浓度下的细胞色素 C 色谱图 6

7 优化磷酸盐缓冲液中的氯化钠浓度开展的另一组实验使用 15 mmol/l 的恒定磷酸盐缓冲液浓度 (ph 7.), 该浓度和 ph 过往被选择用于大多数蛋白质的分析, 并采用和 5 mmol/l 的氯化钠浓度以及与前一组实验相同的化合物 IgG 在各种条件下均存在聚集体, 并且聚集体峰的大小随 NaCl 浓度的增加 ( 从 5 mmol/l 至 5 mmol/l) 而增加, 表明盐浓度的提高导致 IgG 发生聚集 ( 图 5) 对于 15 mmol/l 磷酸盐缓冲液, 不建议在流动相中加入盐 mmol/l NaCl mmol/l NaCl IgG 聚集体峰最大 15 mmol/l NaCl mmol/l NaCl mmol/l NaCl 图 5. 在 15 mmol/l 磷酸盐缓冲液和不同 NaCl 浓度下的 IgG 色谱图 7

8 在各种盐浓度下,ADC 模拟物的色谱峰类似在整个盐浓度范围内, 拖尾因子几乎保持恒定 ( 图 6 和表 4) 各种氯化钠浓度下的峰形和拖尾因子类似, 表明将氯化钠加入流动相中的影响可忽略不计 mmol/l NaCl mmol/l NaCl mmol/l NaCl mmol/l NaCl 图 6. 在 15 mmol/l 磷酸盐缓冲液和不同 NaCl 浓度下的 ADC 色谱图 8

9 5 mmol/l 盐浓度下胰岛素峰发生变形, 而在 2 mmol/l 至 5 mmol/l 盐浓度下具有更出色的峰形 ( 图 7) 将盐加入磷酸盐缓冲液中并未改善峰形, 表明无需将盐加入 15 mmol/l 磷酸盐中 3 5 mmol/l NaCl mmol/l NaCl mmol/l NaCl mmol/l NaCl mmol/l NaCl 图 7. 在 15 mmol/l 磷酸盐和不同 NaCl 浓度下的胰岛素色谱图 9

10 5 mmol/l 至 1 mmol/l NaCl 浓度范围内得到的细胞色素 C 的峰类似 ( 图 8) 随着盐浓度降低, 拖尾因子不断增加 ( 表 4), 并且随着盐浓度从 1 mmol/l 降至 mmol/l, 保留时间开始延长 ( 表 6), 表明存在次级相互作用这说明含有 15 5 mmol/l NaCl 的 15 mmol/l 磷酸盐是首选流动相组成 mmol/l NaCl mmol/l NaCl mmol/l NaCl mmol/l NaCl mmol/l NaCl 图 8. 在 15 mmol/l 磷酸盐缓冲液和不同 NaCl 浓度下的细胞色素 C 色谱图表 6. 在 15 mmol/l 磷酸盐和不同 NaCl 浓度下的保留时间化合物 MW (kda) pi IgG ADC 164 不适用不适用不适用胰岛素细胞色素 C

11 串联色谱柱 : 柱长柱长应基于分离度和通量需求来确定图 9 展示了随 AdvanceBio SEC 3 Å 柱长增加而得到的 Bio-Rad 凝胶过滤标准品分离结果, 其中柱长变化为 : mm mm 和两根串联的 mm 色谱柱分离度随柱长增加而提高, 但同时分析时间延长且系统压力升高 mm 压力 12.3 bar Rs = mm 压力 bar Rs = 两根 mm 色谱柱串联使用压力 33.1 bar Rs = 3.12 图 9. 采用不同长度的 AdvanceBio SEC 3 Å 色谱柱得到的 Bio-Rad 凝胶过滤标准品的色谱分离结果 11

12 串联色谱柱 : 孔径单独使用 AdvanceBio SEC 13 Å 和 AdvanceBio SEC 3 Å 色谱柱以及将这两根色谱柱串联, 对 Bio-Rad 凝胶过滤标准品进行分离当色谱柱串联使用时, 卵清蛋白和肌红蛋白之间的分离度增加 ( 图 1), 原因可能是由于总柱长增加混合物中最大的蛋白质被 13 Å 色谱柱排除, 因为该色谱柱的孔径相对于这些蛋白质分子过小还单独使用 13 Å 和 3 Å AdvanceBio SEC 色谱柱以及将这两根色谱柱串联, 对源自牛血清的 IgG 以及肌红蛋白进行分析利用 AdvanceBio SEC 13 Å 无法分离分子量较大的 IgG (15 kda) 和二聚体, 而使用 AdvanceBio SEC 3 Å 则能够将其分离在两根串联使用的色谱柱上分析样品时, 并未改善单体和二聚体之间的分离度 ( 图 11) AdvanceBio SEC 13Å 卵清蛋白 / 肌红蛋白分离度 = AdvanceBio SEC 3Å AdvanceBio SEC 3Å + 13Å 卵清蛋白 / 肌红蛋白分离度 = 卵清蛋白 / 肌红蛋白分离度 = 图 1. 单独使用 13 Å 和 3 Å 色谱柱以及串联使用这两根色谱柱分离 Bio-Rad 凝胶过滤标准品 12

13 还单独利用这两根色谱柱分离较小的肌红蛋白分子, 并发现在两根串联的色谱柱上运行样品能够改善分离度 ( 图 12), 尽管这一改善可能是由于柱长的增加在最后一组实验中, 单独使用 AdvanceBio SEC 13 Å 和 3 Å 色谱柱以及将两根色谱柱串联使用来分析多糖仅在两根色谱柱串联使用时, 分子较大的多糖才表现出一定程度的分离 ( 图 13) AdvanceBio SEC 13Å IgG 单体 / 二聚体分离度 = 不适用 AdvanceBio SEC 3Å IgG 单体 / 二聚体分离度 = AdvanceBio SEC 3Å + 13Å IgG 单体 / 二聚体分离度 = 图 11. 单独使用 13 Å 和 3 Å 色谱柱以及串联使用这两根色谱柱分离源自牛血清的 IgG AdvanceBio SEC 13Å AdvanceBio SEC 3Å AdvanceBio SEC 3Å + 13Å 肌红蛋白单体 / 二聚体分离度 = 1.49 肌红蛋白单体 / 二聚体分离度 = 1.61 肌红蛋白单体 / 二聚体分离度 = 图 12. 单独使用 13 Å 和 3 Å 色谱柱以及串联使用这两根色谱柱分离肌红蛋白 13

14 nriu nriu 部分排除 AdvanceBio SEC 13Å nriu AdvanceBio SEC 3Å + 13Å 图 13. 单独使用 AdvanceBio SEC 3 Å 和 13 Å 色谱柱以及串联使用这两根色谱柱分离多糖样品结论流动相优化是方法开发过程中一个关键的基本因素, 其目的在于建立有效减小蛋白质和色谱柱之间次级相互作用的分析程序, 因为这些次级相互作用可能导致峰拖尾峰变形样品回收率差和分离度不佳此外, 流动相优化还可最大程度减少造成错误结果的蛋白质聚集在选择缓冲液时, 应使用最少量的必需缓冲液, 并且仅在需要时添加盐这将减小腐蚀和磨损风险, 并延长色谱柱的寿命将 AdvanceBio SEC 色谱柱与经过优化的方法结合使用, 是表征单体二聚体和聚集体的一套完整工具, 这些表征是生物制药行业中的关键质量属性参考文献 1. Ecker, D. M.; Jones, S. D.; Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market, MAbs 215, 7(1), Lagassé, H. A. D.; et al. Recent advances in (therapeutic protein) drug development, F1Res 217, 6, Hong, P.; Koza, S.; Bouvier, E. S. P. Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates, J. Liq. Chromatogr. and Relat. Technol. 212, 35(2), Aggregation of Monoclonal Antibody Products: Formation and Removal, BioPharm International 213, Mar 1, 26(3) 5. ADC Targets Fail Because of Aggregation Problems, Pharmaceutical Technology Editors, PharmTech 217, Nov Yu, C. M.; Mun, S.; Wang, N. H. Phenomena of insulin peak fronting in size exclusion chromatography and strategies to reduce fronting, J. Chrom. A 28, 1192(1), 查找当地的安捷伦客户中心 : 免费专线 : , ( 手机用户 ) 本文中的信息说明和指标如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 8 月 7 日, 中国出版 ZHCN 联系我们 : LSCA-China_8@agilent.com 在线询价 :

前言一些单克隆抗体 (mab) 和蛋白质在溶液中容易自发聚集在许多生物制药应用中, 必须在各种条件下精确地表征和定量此类聚集的程度体积排阻色谱 (SEC) 是一种表征和定量蛋白质聚集体的强大技术, 但是准确测量需要在适合天然蛋白质确证的条件下具有优异的色谱性能为通过改善特定蛋白质的色谱峰形提

前言一些单克隆抗体 (mab) 和蛋白质在溶液中容易自发聚集在许多生物制药应用中, 必须在各种条件下精确地表征和定量此类聚集的程度体积排阻色谱 (SEC) 是一种表征和定量蛋白质聚集体的强大技术, 但是准确测量需要在适合天然蛋白质确证的条件下具有优异的色谱性能为通过改善特定蛋白质的色谱峰形提优化和执行蛋白质聚集体研究的完整工作流程将体积排阻色谱与方法开发和光散射相结合应用简报生物治疗药物和生物仿制药作者 Andy Coffey 和 Matthew Rain 安捷伦科技公司摘要本应用简报介绍了一套完整的聚集体分析工作流程, 它能够 : 优化单克隆抗体高性能体积排阻色谱 (SEC) 的流动相条件表征包括单体二聚体和高阶聚集体等物质的聚集特征我们使用安捷伦缓冲液顾问软件自动进行复杂的