表 1. 所分析的 1 种激素的分子式和结构包括同质量异构体对的信息激素分子式结构激素分子式结构醛固酮 1 - 脱氧皮质酮 1 皮质醇 1 雄烯二酮 1 可的松 1 雌酮 1 皮质酮 1 1α- 羟基黄体酮 1 - 脱氧皮质醇 1 二氢睾酮 (DT) 1 β- 雌二醇 1 孕酮 1 睾酮 1

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曹镫麻
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1 使用 Agilent Bond Elut Plexa SPE 和 L/MS/MS 测定血清中的激素应用简报生物分析, 制药, 临床研究作者 Megan Juck 和 William Long 安捷伦科技有限公司摘要本研究开发出一种用于测定血清中的 1 种激素及其相应的内标的方法首先使用 Agilent Bond Elut Plexa 固相萃取 (SPE) ( mg, 1 ml) 小柱从血清中萃取激素在 Agilent InfinityLab Poroshell P- 色谱柱 (.1 mm,. µm) 上将激素分离, 随后通过液相色谱 - 串联质谱联用系统 (L/MS/MS) 进行分析在正负离子电喷雾电离 (ESI) 模式下使用 1 mm 氟化铵流动相分析激素, 以改善两种模式下的激素响应总体回收率在 % 至 1% 范围内, 相对标准偏差 (RSD) 介于.% 和.% 之间本应用简报证明了 Bond Elut Plexa SPE 小柱能够简便且高效地测定血清中的激素前言本研究开发出一种用聚合物固相萃取 (SPE) 测定血清中的类固醇激素的方法表 1 列出了分析的 1 种激素的结构和化学式 Agilent Bond Elut Plexa 具有独特的聚合物架构, 且有羟基化无保留性不含酰胺的表面蛋白质和脂类极少结合到聚合物表面, 使得样品更干净, 并降低了基质干扰效应非极性 PS-DVB 内核非常适合保留激素等小分子本应用简报证明了 Bond Elut Plexa SPE 小柱的简便易用性和有效性

2 表 1. 所分析的 1 种激素的分子式和结构包括同质量异构体对的信息激素分子式结构激素分子式结构醛固酮 1 - 脱氧皮质酮 1 皮质醇 1 雄烯二酮 1 可的松 1 雌酮 1 皮质酮 1 1α- 羟基黄体酮 1 - 脱氧皮质醇 1 二氢睾酮 (DT) 1 β- 雌二醇 1 孕酮 1 睾酮 1 同质量异构体对 : 醛固酮和可的松 - 脱氧皮质酮和 1α- 羟基黄体酮 - 脱氧皮质醇和皮质酮

3 实验部分试剂与化学品所有试剂均为 PL 级或更高等级甲醇购自 oneywell (Muskegon, MI, USA) 水经由 EMD Millipore Milli-Q Integral 系统 (Darmstadt, Germany) 纯化试剂级甲酸 (FA, 部件号 G-) 来自安捷伦科技公司氟化铵购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, M, USA) - 脱氧皮质酮 d 购自 Toronto Research hemicals (Toronto, ntario, anada) 所有其他激素和内标均购自 Sigma- Aldrich 血清 (D Mass Spect Gold, MSG) 购自 Golden West Biologicals, Inc. (Temecula, A, USA) 血清在使用前保存于下仪器与材料 Eppendorf 移液器和连续分液器浓缩蒸发系统涡旋器和多管涡旋器 (VWR, Radnor, PA, USA) Agilent Vac Elut SPS 多管装置, 配备可容纳 1 个 1 mm 试管的收集架 ( 部件号 1) Agilent Bond Elut Plexa, mg,1 ml 直管柱 ( 部件号 1) 安捷伦质谱分析用的棕色螺纹口玻璃样品瓶, 带书写签 ( 部件号 1-1) 安捷伦固定螺口盖, 带 PTFE/ 红色硅胶隔垫 ( 部件号 1-) 将该液相色谱系统与配备安捷伦喷射流电喷雾离子化技术的 Agilent A 三重四极杆 L/MS/MS 系统联用采用 Agilent Massunter 工作站软件进行所有的数据采集和分析样品前处理激素混标和激素内标混合物分别采用甲醇制备表列出了各种分析物及其相应内标的浓度各种内标与其相应的分析物具有相同的浓度例如, 激素混标中醛固酮的浓度为 ng/ml, 激素混合内标中醛固酮 -d 的浓度也是 ng/ml 表. 显示了激素和内标浓度内标的加标浓度与母分析物浓度相同分析物 / 内标醛固酮 / 醛固酮 d 皮质醇 / 皮质醇 d 可的松 / 可的松 d 皮质酮 / 皮质酮 d - 脱氧皮质醇 /- 脱氧皮质醇 d β- 雌二醇 /β- 雌二醇 d 睾酮 / 睾酮 d - 脱氧皮质酮 /- 脱氧皮质酮 d 雄烯二酮 / 雄烯二酮 1 雌酮 / 雌酮 d 1α- 羟基黄体酮 /1α- 羟基黄体酮 d DT/DT d 孕酮 / 孕酮 d 标准品浓度, 各浓度 (ng/ml) 安捷伦样品瓶内插管, µl, 去活玻璃, 带聚合物支脚 ( 部件号 11-) 仪器采用 Agilent 1 Infinity 液相色谱系统进行分析, 其中包括 : Agilent 1 Infinity 二元泵 (GA) 配备 Agilent 1 F/ALS 温控装置 (G1B) 的 Agilent 1 Infinity 高性能自动进样器 (GA) Agilent 1 Infinity 柱温箱 (G)

4 样品预处理在施用 SPE 方案之前, 将 µl.% 甲酸 (FA) 水溶液加入到 1 µl 血清中向样品中添加 µl 激素混标和 µl 激素内标混合物 β- 雌二醇 β- 雌二醇 d 雌酮雌酮 d DT 和 DT d 的最终浓度为 1 ng/ml 血清中的所有其他激素和内标的最终浓度均为 1 ng/ml 对样品进行涡旋混合和离心以除去所有血清颗粒 SPE 之后, 在下将收集的洗脱液氮吹干, 然后复溶于 1 µl / 甲醇 / 水中对样品进行涡旋混合, 并将其转移至带玻璃内衬管的样品瓶中进行 L/MS/MS 分析 SPE 方案活化 :1 ml 甲醇 +.% FA 平衡 :1 ml 水 +.% FA 上样 : 经预处理的血清样品淋洗 :1 ml % 甲醇水溶液干燥 : 分钟 ( 最低 1 英寸汞柱 ) 洗脱 *:. ml 甲醇 * 执行重力洗脱洗脱液流停止后施加低真空 (< 英寸汞柱, - 秒 ), 收集所有洗脱液图 1. 使用 Agilent Bond Elut Plexa mg, 1 ml 小柱测定激素的 SPE 方案仪器条件参数 PL 色谱柱 : 保护柱 : 流动相 : 值 Agilent InfinityLab Poroshell P-,.1 mm mm,. µm( 部件号 -) Agilent InfinityLab Poroshell P-, UPL 保护柱,.1 mm mm,. µm ( 部件号 1-) A) 1 mm 氟化铵水溶液 B) 乙腈 (AN). ml/min 流速 : 柱温 : 自动进样器温度 : 进样量 : 1 µl 进样针清洗 : 1:1:1:1 乙腈 / 甲醇 / 异丙醇 / 水, 含.% 甲酸梯度 : 时间 (min) %B 停止时间 : 后运行时间 : 1 分钟 1 分钟 MS 电喷雾电离 (ESI) 干燥气温度 : 干燥器流速 : L/min 雾化器压力 : psi 鞘气温度 : 鞘气流速 : L/min 毛细管电压 : 正离子模式, V; 负离子模式, V 喷嘴电压 : 正离子模式, V; 负离子模式,1 V Delta EMV (+): V Delta EMV ( ): V

5 表. 目标分析物的 L/MS/MS dmrm 参数和保留时间分析物 RT (min) 母离子 (m/z) 碎裂电压 (V) 定量离子 (m/z) E (V) 子离子定性离子 (m/z) E (V) 电离模式醛固酮正离子皮质醇正离子可的松正离子皮质酮正离子 - 脱氧皮质醇正离子 β- 雌二醇负离子睾酮正离子 - 脱氧皮质酮正离子雄烯二酮正离子雌酮负离子 1α- 羟基黄体酮正离子 DT 正离子孕酮正离子表. 内标的 L/MS/MS dmrm 参数和保留时间分析物 RT (min) 母离子 (m/z) 碎裂电压 (V) 子离子定量离子 (m/z) E (V) 电离模式醛固酮 d 正离子皮质醇 d 正离子可的松 d 正离子皮质酮 d 正离子 - 脱氧皮质醇 d 正离子 β- 雌二醇 d 负离子睾酮 d 正离子 - 脱氧皮质酮 d 正离子雄烯二酮正离子雌酮 d 负离子 1α- 羟基黄体酮 d 正离子 DT d 正离子孕酮 d 正离子

响应 1 1. 1. 1. 1. 1. 1. 1. 1. 1.1 1. A 峰归属 1. 醛固酮 (1 ng/ml). 皮质醇 (1 ng/ml). 可的松 (1 ng/ml). 皮质酮 (1 ng/ml). - 脱氧皮质醇 (1 ng/ml). β- 雌二醇 (1 ng/ml). 睾酮 (1 ng/ml). - 脱氧皮质酮 (1 ng/ml). 雄烯二酮 (1 ng/ml) 1.

6 响应 A 峰归属 1. 醛固酮 (1 ng/ml). 皮质醇 (1 ng/ml). 可的松 (1 ng/ml). 皮质酮 (1 ng/ml). - 脱氧皮质醇 (1 ng/ml). β- 雌二醇 (1 ng/ml). 睾酮 (1 ng/ml). - 脱氧皮质酮 (1 ng/ml). 雄烯二酮 (1 ng/ml) 1. 雌酮 (1 ng/ml). 1α- 羟基黄体酮 (1 ng/ml) 1. DT (1 ng/ml) 1. 孕酮 (1 ng/ml) 响应 B 图. 所分析的血清中 1 种激素的最终 dmrm 色谱图 (A), 其中放大图 (B) 显示 β- 雌二醇和雌酮浓度列于图例中

7 响应 1 1. A 峰归属 1. 醛固酮 d (1 ng/ml). 皮质醇 d (1 ng/ml). 可的松 d (1 ng/ml). 皮质酮 d (1 ng/ml). - 脱氧皮质醇 d (1 ng/ml). β- 雌二醇 d (1 ng/ml). 睾酮 d (1 ng/ml). - 脱氧皮质酮 d (1 ng/ml). 雄烯二酮 1 (1 ng/ml) 1. 雌酮 d (1 ng/ml). 1α- 羟基黄体酮 d (1 ng/ml) 1. DT d (1 ng/ml) 1. 孕酮 d (1 ng/ml) 1 B 响应图. 所分析的血清中的 1 种激素内标的最终 dmrm 色谱图 (A), 其中放大图 (B) 显示 β- 雌二醇 d 和雌酮 d 浓度列于图例中

8 结果与讨论 SPE 优化在开发 SPE 方法时, 重要的是使用足够强的清洗溶剂去除基质干扰物, 同时确保目标分析物仍然保留在小柱上通过收集并分析由各种候选清洗溶剂 (1% 水 1% 甲醇水溶液 % 甲醇水溶液等 ) 得到的清洗洗脱液, 可测定激素损失经过评估后, 选择 % 甲醇水溶液作为本方案的最佳清洗溶剂与清洗步骤一样, 也可以对洗脱溶剂进行优化洗脱步骤的目标是选择一种最佳溶剂, 该溶剂极性强到足以洗脱所有目标分析物, 同时又不会洗脱在 SPE 过程中可能保留在吸附剂上的基质干扰物本应用简报对 % 甲醇水溶液 % 甲醇水溶液 1% 甲醇和 / 甲醇 / 乙腈洗脱溶剂进行了评估使用 1% 甲醇洗脱溶剂得到的激素回收率最高, 因此将其用于本应用中 L/MS/MS 优化在初始 L/MS/MS 方法开发过程中, 分析了种激素 : 醛固酮皮质醇可的松皮质酮 - 脱氧皮质醇雄烯二酮 - 脱氧皮质酮睾酮 1α- 羟基黄体酮 DT( 负离子模式 ) 和黄体酮随后将两种负离子模式分析物 (β- 雌二醇和雌酮 ) 加入该方法中, 但它们不包括在方法开发的色谱图中对 Agilent InfinityLab Poroshell 1 E- 色谱柱 (.1 mm,. µm) 与 Agilent InfinityLab Poroshell 1 E-1 色谱柱 (.1 mm,. µm) 进行比较 ( 图 ) E- 所具有的较短的烷基链为激素提供了稍短的保留时间, 同时仍可分离所有同质量异构体对条件流动相 A: 水 +.1% 甲酸流动相 B: 甲醇 +.1% 甲酸梯度程序 : min: 流动相 B 由 % 增至 %.1 min:% 流动相 B, 保持 1 A B 响应响应 Agilent InfinityLab Poroshell 1 E-,.1 mm mm,. µm 1 Agilent InfinityLab Poroshell 1 E-1,.1 mm mm,. µm 总运行时间 : 1 min + 1 min 后运行时间流速 :. ml/min 进样量 : 1 µl, 1 1 峰归属 1. 醛固酮. 皮质醇. 可的松. 皮质酮. - 脱氧皮质醇. 雄烯二酮. - 脱氧皮质酮. 睾酮. 1α- 羟基黄体酮 1. DT. 孕酮图. 使用 Agilent InfinityLab Poroshell 1 E- 和 E-1 色谱柱得到的种激素 (1 ng/ml) 的分离和保留时间的比较在生成该色谱图后将 β- 雌二醇和雌酮加入最终方法中, 因此这两种化合物不包括在此色谱图中

9 还对含甲酸 (.1%) 氢氧化铵 (.%, p 1.) 和氟化铵 (p.) 的流动相进行了评估 ( 图 -) 含氢氧化铵 (.%) 的高 p 流动相被证明能够提高负离子模式下分析的激素的电离 [1] 氟化铵被证明能够改善正负离子模式下的响应 [,] 大多数硅胶基液相色谱柱都不建议使用 p 高于或的流动相, 因此本研究使用 Agilent InfinityLab Poroshell P- 色谱柱进行评估该色谱柱能够在 p 高达的条件下保持稳定, 还具有与 InfinityLab Poroshell 1 E- 色谱柱非常相似的选择性因此, 利用 InfinityLab Poroshell P- 色谱柱对氢氧化铵和氟化铵这两种类型的流动相进行方法优化, 并选为最终的分析方法氟化铵 (1 mm) 流动相可得到最高的分析物响应, 因此将其用于最终色谱方法中条件流动相 A:.1% 甲酸水溶液或.% 氢氧化铵水溶液流动相 B: 甲醇梯度程序 : min: 流动相 B 由 % 增至 % - min: 流动相 B 由 % 增至 % 总运行时间 : 1 min + 1 min 后运行时间流速 :. ml/min 进样量 : 1 µl 响应 % 氢氧化铵水溶液.1% 甲酸水溶液峰归属 1. 醛固酮. 皮质醇. 可的松. 皮质酮. - 脱氧皮质醇. 雄烯二酮. - 脱氧皮质酮. 睾酮. 1α- 羟基黄体酮 1. DT. 孕酮图. 使用 Agilent InfinityLab Poroshell P-,.1 mm mm,. µm 色谱柱并以.1% 甲酸水溶液 ( 绿色迹线 ) 和.% 氢氧化铵水溶液 ( 红色迹线 ) 作为流动相得到的 1 ng/ml 激素样品的色谱图为便于对比, 采用相同的 L/MS/MS 梯度生成这些色谱图后加入 β- 雌二醇和雌酮, 因此这两种化合物不包括在该色谱图中

10 条件流动相 A: 1 mm 氟化铵水溶液或.% 氢氧化铵水溶液流动相 B: 甲醇梯度程序 : min: 流动相 B 由 % 增至 % - min: 流动相 B 由 % 增至 % 总运行时间 : 1 min + 1 min 后运行时间流速 :. ml/min 进样量 : 1 µl 响应 mm 氟化铵水溶液.% 氢氧化铵水溶液峰归属 1. 醛固酮. 皮质醇. 可的松. 皮质酮. - 脱氧皮质醇. 雄烯二酮. - 脱氧皮质酮. 睾酮. 1α- 羟基黄体酮 1. DT. 孕酮图. 使用 1 mm 氟化铵水溶液 ( 黑色迹线 ) 和.% 氢氧化铵水溶液 ( 红色迹线 ) 得到的 1 ng/ml 激素样品的总离子流色谱图使用 Agilent InfinityLab Poroshell P-,.1 mm mm,. µm 为便于对比, 采用相同的 L/MS/MS 梯度生成这些色谱图后加入 β- 雌二醇和雌酮, 因此这两种化合物不包括在该色谱图中 1

11 响应 DT, 1 ng/ml 1 mm 氟化铵水溶液.% 氢氧化铵水溶液.1% 甲酸水溶液图. 利用以下三种流动相得到的 DT(1 ng/ml; 负离子模式 ) 的 MRM 叠加色谱图 :1 mm 氟化铵水溶液 ( 黑色 ),.% 氢氧化铵水溶液 ( 红色 ) 和.1% 甲酸水溶液 ( 绿色 ) 使用 Agilent InfinityLab Poroshell P-,.1 mm mm,. µm 梯度条件列于图和图的说明中回收率与重现性使用上述 SPE 方案萃取预加标血清样品和空白样品, 评估回收率和重现性在血清样品中预加标浓度为 1 ng/ml 的 β- 雌二醇雌酮和 DT 其余 1 种激素的预加标浓度为 1 ng/ml 使用 SPE 方案对空白样品和加标血清样品进行萃取在最终吹干之后, 在空白样品中后加标浓度为 1 和 1 ng/ml 的标准品, 如前文所述比较预加标样品和后加标样品 (n = ) 的平均峰面积, 测定百分回收率和 RSD 值表. 列出了百分回收率和 RSD 值 ( 在括号内示出 ), n = 分析物加标浓度 (ng/ml) % 回收率 (RSD) 醛固酮 1 (.) 皮质醇 1 1 (.) 可的松 1 (.) 皮质酮 1 (.1) - 脱氧皮质醇 1 (.) β- 雌二醇 1 1 (.) 睾酮 1 (.) - 脱氧皮质酮 1 1 (.) 雄烯二酮 1 (.) 雌酮 1 (.) 1α- 羟基黄体酮 1 1 (.) DT 1 (.) 孕酮 1 (.)

12 结论本研究开发出一种使用 Agilent Bond Elut Plexa SPE 小柱测定血清中的 1 种激素及其相应内标的方法通过加入 1 mm 氟化铵, 在 Agilent 三重四极杆 L/MS/MS 的正负离子模式下, 分析物的响应均获得很大增加采用 Agilent InfinityLab Poroshell P- (.1 mm mm,. µm) 色谱柱可快速完成分析, 使三对同质量异构体得到基线分离, 获得更高重现性的积分和定量此外, 该色谱柱适用的 p 范围较宽, 是方法开发的理想色谱柱本文所述的方法提供了优异的回收率 (%-1%) 和较低的 RSD 值 (.%-.%) Agilent Bond Elut Plexa SPE 产品几乎无需方法开发, 且简便易用, 因此是生物分析的理想选择参考文献 1. Fu, R.; Zhai, A. Determination of ormones in Drinking Water by L/MS/MS Using an Agilent InfinityLab Poroshell P olumn (EPA )( 使用 Agilent InfinityLab Poroshell P 色谱柱和 L/MS/MS 测定饮用水中的激素 (EPA )); 应用简报, 安捷伦科技公司, 出版号 1-EN, 1. indle, R. Improved Analysis of Trace ormones in Drinking Water by L/MS/MS (EPA ) using the Agilent Triple Quadrupole L/MS( 使用 Agilent 三重四极杆液质联用系统和 L/MS/MS 改善饮用水中痕量激素的分析 (EPA )); 应用简报, 安捷伦科技公司, 出版号 1-EN, 1. Fiers, T.; asetta, B.; Bernaert, B.; Vandersypt, E.; Debock, M.; Kaufman, J. Development of a highly sensitive method for the quantification of estrone and estradiol in serum by liquid chromatography tandem mass spectrometry without derivatization. Journal of hromatography B. 1, -, - 更多信息查找当地的安捷伦客户中心 : 免费专线 : --,--( 手机用户 ) 联系我们 : LSA-hina_@agilent.com 在线询价 : 这些数据仅代表典型的结果有关我们的产品与服务的详细信息, 请访问我们的网站仅限研究使用不可用于诊断目的安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任本资料中的信息说明和指标如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司,1 1 年月日, 中国印刷 1-ZN

前言多种氨基酸以百万分之一 (ppm) 和十亿分之一 (ppb) 级的水平广泛存在于植物材料中之前的研究中发现 1, 使用配备低 ph 与正离子模式质谱检测的亲水相互作用色谱 (HILIC) 模式分析未衍生化氨基酸, 能够获得出色的分离度与灵敏度本应用简报对这些条件进一步优化, 以对植物中的氨

前言多种氨基酸以百万分之一 (ppm) 和十亿分之一 (ppb) 级的水平广泛存在于植物材料中之前的研究中发现 1, 使用配备低 ph 与正离子模式质谱检测的亲水相互作用色谱 (HILIC) 模式分析未衍生化氨基酸, 能够获得出色的分离度与灵敏度本应用简报对这些条件进一步优化, 以对植物中的氨应用简报食品检测代谢组学农药化学环境使用 LC/MS 检测通过亲水相互作用色谱 (HILIC) 对植物基质中的未衍生化氨基酸进行定量分析作者 Yuxiong Huang Weiwei Li 和 Arturo Keller 美国加州大学圣塔芭芭拉分校 Tarun Anumol 和 Adam Bivens 安捷伦科技公司摘要本应用简报介绍了一种使用三重四极杆液质联用系统定量分析多种未衍生化氨基酸的方法