应用简报生物 QC 检测使用 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱分析合成多肽杂质作者 Veronica Qin 安捷伦科技有限公司摘要通常, 使用 UV 检测的多肽色谱分离是通过 C18 柱以及三氟乙酸 (TFA) 改性的流动相完成, 这种方法可以改善分

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暂凤
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1 应用简报生物 QC 检测使用 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱分析合成多肽杂质作者 Veronica Qin 安捷伦科技有限公司摘要通常, 使用 UV 检测的多肽色谱分离是通过 C18 柱以及三氟乙酸 (TFA) 改性的流动相完成, 这种方法可以改善分离度, 但同时会抑制质谱 (MS) 信号甲酸 (FA) 是用于 MS 检测的首选流动相改性剂, 但它可能会导致传统 C18 柱无法达到最佳分离效果本应用简报介绍了通过单一液相色谱方法, 采用 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱分离合成多肽杂质, 并使用 UV 或 MS 进行检测本方法使用 FA 作为流动相改性剂, 可以提供足够的分离度以鉴定并定量多肽杂质

2 前言大多数多肽药物是通过固相多肽合成进行生产合成多肽相关的杂质可能来自原料生产过程, 或者在生产或储存过程中因降解而产生 1 传统上, 使用反相色谱柱实现多肽分离, 并以 TFA 作为流动相改性剂,UV 作为检测器然而, 由于 TFA 会抑制 MS 信号, 因此它并不是 MS 的理想选择在 LC/MS 方法中鉴定杂质峰时,FA 是首选的流动相改性剂, 但它会导致传统 C18 柱无法达到最佳分离效果 TFA (pka =.23) 可以降低 ph 值, 使未烷基化的硅醇基位点质子化, 不留下与带正电荷的多肽相互作用的负电荷此外,TFA 阴离子能够与带正电荷的多肽相互作用, 有利于形成良好的峰形与此相反,FA (pka = 3.77) 的酸性比 TFA 弱, 无法将 ph 降低到使所有硅醇基位点质子化 FA 与带正电荷的多肽之间的相互作用较弱, 因此硅醇基与多肽之间的相互作用并不会完全被阻断与使用 TFA 作为流动相改性剂相比,FA 会导致峰展宽拖尾分离度以及峰容量降低之前我们已经证明 AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱具有混合带电表面固定相, 与其他厂家色谱柱相比, 使用 FA 作为改性剂时可提供更高的峰容量和更好的分离度 2 本应用简报介绍了可进行 UV 或 MS 检测的单一液相色谱方法, 并使用 FA 作为流动相改性剂分离合成多肽杂质它适用于使用 LC/MS 进行峰鉴定, 通过 LC/UV 进行定量和质量控制, 使 LC/UV 和 LC/MS 之间的方法转移更加容易实验部分材料合成多肽三氟醋酸比伐卢定水合物购自 Selleckchem, 与.1% 甲酸水溶液复溶至 1 mg/ml 液相色谱条件色谱柱参数柱温 6 ºC 流动相流速梯度后运行时间进样量质谱条件离子源参数 Agilent 129 Infinity II 液相色谱仪液相色谱系统 Agilent 129 Infinity 液相色谱仪包括如下配置 : Agilent 129 Infinity 二元泵 (G422A) Agilent 129 Infinity 自动进样器 (G4226A) Agilent 129 Infinity 柱温箱 (G1316C) Agilent 126 Infinity II 二极管阵列检测器 (DAD) (G7115A) Agilent AdvanceBio Peptide Plus, mm( 部件号 ) A).1% 甲酸水溶液 B).1% 甲酸乙腈溶液.4 ml/min 时间 (min) %B 分钟 5 µl (UV);1 µl (MS) 气体温度 35 ºC 干燥气流速雾化器气体 Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 双安捷伦喷射流 1 L/min 3 psi 鞘气温度 275 ºC 鞘气流速毛细管电压喷嘴电压碎裂电压锥孔电压 Oct 1 RF Vpp 质量数范围 MS 扫描速率 ( 质谱图 / 秒 ) 8 MS/MS 扫描速率 ( 质谱图 / 秒 ) 3 采集模式碰撞能量 12 L/min 4 V V 125 V 65 V 75 V m/z 1 17 (MS);m/z 5 17 (MS/MS) 正, 扩展动态范围 (2 GHz) 3.6*(m/z)/

3 质谱系统 Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 数据处理 Agilent OpenLab 2.2 CDS 处理 LC/UV 数据 LC/MS 数据由 Agilent MassHunter BioConfirm B.7. 和 B.9. 软件进行处理, 该软件具有预测插入缺失以及各种修饰的能力, 包括合成多肽的各种定制修饰 MS/MS 谱图用于确认合成多肽及其杂质的身份结果与讨论三氟醋酸比伐卢定 (Angiomax 或 Angiox, Medicines 公司生产 ) 是具有 2 个氨基酸的合成多肽 ( 凝血酶抑制剂 ), 能够可逆地抑制凝血酶它用于治疗肝素诱导的血小板减少症并且预防血栓的形成 3 比伐卢定的氨基酸序列为 :D-Phe-Pro- Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp- Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu (FPRPGGGGNGDFEEIPEEYL), 单一同位素质量数为 Da 图 1 和 2 展示了比伐卢定多肽样品的分离谱图, 其中使用 FA 作为流动相改性剂, 并通过 UV 和 MS 进行检测如表 1 所示,LC/MS/MS 用于鉴定谱图中的几个主要杂质峰时, 具有非常低的质量误差常见的杂质包括缺失序列插入序列失水, 并且在此多肽序列中,Asn 可能会在生产或储存过程中发生脱酰胺基化在 UV 谱图中可能遗漏一些强度较低的峰, 例如杂质峰 6, 但是通过 MS 检测, 可以鉴定其为 Asn 之后额外增加了一个 Asn 的比伐卢定衍生物 (mau) 保留时间 (min) 图 1. 比伐卢定多肽样品分离的 UV 谱图 3

4 采集时间 (min) 图 2. 比伐卢定多肽样品的总离子流色谱图表 1. 比伐卢定多肽和杂质的峰鉴定峰质量数 (Da) 峰归属目标质量数 (Da) 质量数误差 (ppm) 杂质 Glu 缺失杂质 Glu 缺失主峰产品杂质 Gly 缺失杂质失水杂质脱酰胺基化杂质 Asn 插入

5 图 3 展示了杂质峰 1 ( 图 3A) 和 2 ( 图 3B) 的代表性 MS 谱图杂质峰 A 和 2 都对应丢失了一个 Glu 的缺失序列利用 MS/MS 谱图, 我们可以确定峰 1( 图 4A) 对应缺失序列 E18del: (M+2H) +2 FPRPGGGGNGDFEEIPEYL, 碎片离子 b 15 证实存在 E14, 碎片离子 y 4 证实不存在 E18 峰 2( 图 4B) 对应缺失序列 (M+3H) +3 E14del:FPRPGGGGNGDFEIPEEYL, 碎片离子 b 14 和 b 17 可作为支持性证据通过 UV 检测, 可以计算比伐卢定多肽和杂质的峰面积及百分比用于定量 ( 结果在表 2 中示出 ) B (M+2H) (M+3H) 图 3. A) 峰 1 的 MS 谱图 ;B) 峰 2 的 MS 谱图 5

6 结论本研究为 LC/UV 和 LC/MS 工作流程开发了一种单一方法, 使用 AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱和流动相改性剂 FA 进行合成多肽分析在 LC/MS 和 LC/UV 之间转移方法时可以节省时间和成本参考文献 A Y y 4 F P R P G G G G N G D F E E I P E Y L y y b Eggen, I.; et al. Control strategies for synthetic therapeutic peptide APIs part III: manufacturing process considerations. Pharmtech.com 214, 38(5), polypeptide.com/web/upload/ medias/ c41f34cef2. pdf 2. Hurteau, R. Separation of peptide standards using formic acid as a mobile phase additive( 使用甲酸作为流动相添加剂分离多肽标准品 ), 安捷伦科技公司应用简报, Seybert, A. L.; Coons, J. C.; Zerumsky, K. Treatment of heparin-induced thrombocytopenia: is there a role for bivalirudin? Pharmacotherapy 26, 26(2), 查找当地的安捷伦客户中心 : 免费专线 : , ( 手机用户 ) 联系我们 : LSCA-China_8@agilent.com B Y F P R P G G G G N G D F E I P E E Y L b b 17 b b b b 图 4. A) 峰 1 的 MS/MS 谱图 ;B) 峰 2 的 MS/MS 谱图表 2. 比伐卢定多肽和杂质的 UV 定量峰峰面积百分比 (%) 杂质杂质产品杂质杂质杂质在线询价 : 本文中的信息说明和指标如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 9 月 7 日, 中国出版 ZHCN

材料与方法曲妥单抗购自当地药店并遵照制造商的使用说明进行储存 DL- 二硫苏糖醇 (DTT) 碘乙酰胺 (IAA) 甲酸和 LC/MS 级溶剂购自 Sigma-Aldrich 高品质测序级胰蛋白酶 ( 部件号 ) 来自安捷伦科技公司胰蛋白酶酶解在用胰蛋白酶酶解 mab 曲妥单抗之前, 在变性条件

材料与方法曲妥单抗购自当地药店并遵照制造商的使用说明进行储存 DL- 二硫苏糖醇 (DTT) 碘乙酰胺 (IAA) 甲酸和 LC/MS 级溶剂购自 Sigma-Aldrich 高品质测序级胰蛋白酶 ( 部件号 ) 来自安捷伦科技公司胰蛋白酶酶解在用胰蛋白酶酶解 mab 曲妥单抗之前, 在变性条件用于肽谱分析分离的不同类型反相色谱柱的比较技术概述前言基于 LC/MS 的肽谱分析已成为生物分子表征的必备工具复杂胰蛋白酶酶解物中含有肽特征的混合物, 因此用于 LC/MS 分析的反相 (RP) 色谱柱选择对肽分离具有重要的作用数据记录表明, 酸条件下的 LC/MS 肽谱分析分离得到的峰形较宽, 峰容量较低, 且结构相似肽的分离度较差因此, 要实现成功的肽谱分析分离, 正确选择反相色谱柱至关重要

应用简报 生物 QC 检测 使用 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱分析合成多肽杂质 作者 Veronica Qin 安捷伦科技有限公司 摘要 通常, 使用 UV 检测的多肽色谱分离是通过 C18 柱以及三氟乙酸 (TFA) 改性的流动相完成, 这种方法可以改善分

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