前言在诸如离子交换 (IEX) 或体积排阻色谱 (SEC) 法中使用的高盐流动相, 对于不锈钢材质的液相色谱系统而言是一项严峻挑战由于长期使用含盐缓冲液所引发的腐蚀效应, 导致此类液相色谱系统存在损坏的风险其结果就是需要执行繁杂的清洗步骤因此, 强烈建议使用不含铁的系统, 避免受到高盐浓度的

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难湛
5 years ago
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性能验证采用阴离子交换色谱法对蛋白质进行分析 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统用于高盐缓冲液应用领域的可行性应用简报化学和药物分析作者 8 7 6 pl 6.9 a- pl 4.5 Sonja Schneider 安捷伦科技有限公司德国瓦尔德布隆 5 4 3 2 1 pl 6.9 pl 6.24 pl 4.

1 性能验证采用阴离子交换色谱法对蛋白质进行分析 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统用于高盐缓冲液应用领域的可行性应用简报化学和药物分析作者 pl 6.9 a- pl 4.5 Sonja Schneider 安捷伦科技有限公司德国瓦尔德布隆 pl 6.9 pl 6.24 pl 摘要在本应用简报中, 我们展示了利用阴离子交换色谱法, 在使用四种不同的高盐洗脱缓冲液 ( 最大浓度为 2 M) 进行线性和阶梯梯度洗脱条件下, 对四种蛋白质进行分离的相关信息 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统的流路设计中未采用铁 / 钢质材料, 因此可耐受生物分析和生物纯化应用中的严苛条件, 从而保持其出色的 UHPLC 性能使用四种盐 ( 氯化钠 (2 M) 氯化钾 (1 M) 乙酸钠 (1 M) 和四甲基氯化铵 (1 M)) 进行线性梯度洗脱时, 均可获得极高的保留时间和峰面积精确度此外, 使用 2 M 氯化钠作为洗脱缓冲液时, 结果表明保留时间和分离度可保持稳定达 48 小时以上在此类条件下, 采用不锈钢材质的液相色谱系统会面临一些问题, 例如盐引起的腐蚀, 因此需要执行特殊的繁杂的清洗步骤使用 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统则可以完全避免此类清洗步骤, 从而提高生物分析或生物纯化应用的通量和效率

2 前言在诸如离子交换 (IEX) 或体积排阻色谱 (SEC) 法中使用的高盐流动相, 对于不锈钢材质的液相色谱系统而言是一项严峻挑战由于长期使用含盐缓冲液所引发的腐蚀效应, 导致此类液相色谱系统存在损坏的风险其结果就是需要执行繁杂的清洗步骤因此, 强烈建议使用不含铁的系统, 避免受到高盐浓度的影响 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统在样品流路中不含金属成分自动进样器柱温箱和检测器流路中所有的毛细管和接头均完全是不含金属的, 因此, 生物分子只与陶瓷或 PEEK 管线接触这使得用户可以使用高盐含量的缓冲液此外, 相对于 Agilent 126 Infinity 液相色谱系统而言, 该系统可在较宽的 ph 范围 (1-13, 短时间分析可以高达 14) 内保持稳定 1 在本应用简报中, 以阴离子交换色谱 (AEX) 为例, 论证了将 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统用于高盐应用的可行性利用阴离子交换色谱 (AEX) 对四种蛋白质混合物进行分离, 其中使用了四种不同的洗脱盐 : 氯化钠 (2 M NaCl) 氯化钾 (1 M KCl) 乙酸钠 (1 M CH 3 COONa) 和四甲基氯化铵 (1 M [(CH 3 ) 4 N]Cl) 在线性和阶梯梯度条件下, 分别分析了保留时间和峰面积的精确度此外, 还使用 2 M NaCl 洗脱缓冲液考察了保留时间和峰面积的长时间稳定性 (48 小时 ) 实验部分 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统, 包括以下模块 : Agilent 126 Infinity 生物惰性四元泵 (G5611A) Agilent 126 Infinity 高效生物惰性自动进样器 (G5667A) Agilent 126 Infinity DAD VL(G1315D, 配置生物惰性标准流通池,1 mm) Agilent 129 Infinity 柱温箱 (G1316C) 色谱柱 Agilent Bio WAX,NP5, mm, PK 色谱柱软件 Agilent OpenLAB CDS ChemStation,LC 和 LC & MS 系统版, 修订版 C.1.2 [14] 溶剂缓冲液 A: 2 mm Tris,pH 7.6 缓冲液 B: 2 mm Tris,pH M NaCl 1 M KCl 1 M CH 3 COONa 1 M [(CH 3 ) 4 N]Cl 所有试剂均为液相色谱级新制超纯水产自配置.22 µm 膜式终端过滤器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水纯化系统 Tris 购自 Fluka 公司 ( 西格玛奥德里奇, 美国圣路易斯 ) NaCl 购自 VWR 公司 ( 美国宾夕法尼亚州拉德诺 ) [(CH 3 ) 4 N]Cl 和 KCl 购自 Merck KGaA 公司 ( 德国达姆斯塔特 ) CH 3 COONa 购自 J.T. Baker 公司 (VWR, 美国宾夕法尼亚州拉德诺 ) 2

3 色谱条件线性梯度阶梯梯度梯度 1 M 5 1% A 5 1% A 2 7% B 5.1 2% B 25 1% B 1 2% B 1.1 4% B 15 4% B % B 2 6 % B 2.1 1% B 梯度 2 M 5 1% A 5 1% A 2 35% B 5.1 1% B 25 5% B 1 1% B % B 1.1 2% B 15 2% B % B 2 3 % B 2.1 1% B 停止时间 3 25 后运行时间 2 2 温度 25 C 流速.5 ml/ 进样体积 5 µl DAD 28 nm 峰宽.25 (.5 s 响应时间 )(1 Hz) 结果和讨论线性梯度阴离子交换色谱, 使用 2 M NaCl 利用 AEX 在线性梯度条件下, 对四种蛋白质的混合物进行了分离, 缓冲液 B 中使用 2 M NaCl 作为洗脱盐图 1 中所示为线性梯度条件下蛋白质的分离色谱图蛋白质的洗脱顺序主要与其等电点 (pi) 有关其中 a- 乳清蛋白及胰蛋白酶抑制剂的分离与蛋白表面的电荷变化有关, 其未必与总净电荷相等七次运行后测定其保留时间和峰面积相对标准偏差, 即为精确度伴清蛋白中存在不同的异构体, 具体取决于其结合铁的量 2 因此, 选取五个色谱峰对保留时间精确度进行评估相反的是, 伴清蛋白色谱峰不能用于计算峰面积 RSD, 原因在于其异构体未能实现基线分离所有五个色谱峰的保留时间 RSD 均小于.9 % 所评估蛋白质的峰面积 RSD 均小于 1.1% 柱塞杆密封垫清洗液 1% 超纯水每 1.5 清洗.3 蛋白质取自马骨骼肌的肌红蛋白,1753 Da,pI 6.9 (1 mg/ml) 取自鸡蛋清的伴清蛋白,76 Da, 及 6.92 (2 mg/ml) 取自牛奶的 a- 乳清蛋白,14175 Da, (1 mg/ml) 取自大豆的胰蛋白酶抑制剂,21 Da, (1 mg/ml) 所有蛋白质均购自西格玛奥德里奇公司 ( 美国圣路易斯 ) 3

4 阴离子交换色谱, 使用不同类型的盐分离度和选择性受洗脱离子, 即盐类型改变的影响 3 根据所分析蛋白质的不同, 盐可能会对蛋白质洗脱产生不同的色谱影响为了找到针对具体应用的最佳洗脱离子, 可以对多种盐进行测试如果在一个序列中需要测试多于三种盐类型, 那么在方法开发过程中最好选用溶剂选择阀在本应用简报中, 在洗脱缓冲液中评估了四种盐图 2 3 和 4 中所示为线性梯度条件下蛋白质的分离结果, 分别采用 1 M KCl ( 图 2) 1 M CH 3 COONa( 图 3) 和 1 M [(CH 3 ) 4 N]Cl( 图 4) 作为洗脱盐并计算了保留时间和峰面积的 RSD, 其中 n = pl 6.9 pl 6.9 pl 6.24 a- pl 4.5 图 1 线性梯度条件下蛋白质的 AEX 分离色谱图, 采用 2 M NaCl 作为洗脱盐 pl pi 6.9 pi 6.9 a 图 2 线性梯度条件下蛋白质的 AEX 分离色谱图, 采用 1 M KCl 作为洗脱盐 RSD 保留时间肌红蛋白伴清蛋白异构体 A.8.89 伴清蛋白异构体 B.66 不适用 a- 乳清蛋白.81 不适用胰蛋白酶抑制剂 RSD 保留时间肌红蛋白伴清蛋白异构体 A.27 不适用伴清蛋白异构体 B.15 不适用 a- 乳清蛋白胰蛋白酶抑制剂 pi 6.9 pi 6.9 a 图 3 线性梯度条件下蛋白质的 AEX 分离色谱图, 采用 1 M CH3COONa 作为洗脱盐 RSD 保留时间肌红蛋白伴清蛋白异构体 A.48 不适用伴清蛋白异构体 B.23 不适用 a- 乳清蛋白胰蛋白酶抑制剂

5 实验证实保留时间分离度以及峰形和强度的变化与所使用的洗脱盐有关特别是, 伴清蛋白 A 和 B 的分离度在使用不同盐类型时也不同, 其中使用 1 M CH 3 COONa 时的分离度最佳考虑到上述所有因素 ( 最佳分离度最佳峰形和最高强度 ), 且使基线最为平直, 则 1 M KCl 是分离四种蛋白质的最佳选择阶梯梯度使用阶梯梯度 ( 特别是只有一种蛋白质需要分离时 ) 可以加速分离过程, 从而降低缓冲液的消耗量图 5 和 6 中所示为阶梯梯度下的蛋白质分离, 分别使用了 1 M KCl( 图 5) 和 1 M CH 3 COONa( 图 6) 并计算了保留时间和峰面积的 RSD, 其中 n = 7 由于 AEX 色谱柱所需的平衡时间较长, 与线性梯度相比, 阶梯梯度的保留时间和峰面积精密度略差此外, 在梯度阶梯的时间点可观察到负峰, 同样是由于平衡时间不足引起的 pi 6.9 a- pi 图 4 线性梯度条件下蛋白质的 AEX 分离色谱图, 采用 1 M [(CH 3 ) 4 N]Cl 作为洗脱盐 pi 6.9 pi 6.9 a- RSD 保留时间肌红蛋白伴清蛋白异构体 A.35 不适用伴清蛋白异构体 B.33 不适用 a- 乳清蛋白胰蛋白酶抑制剂 RSD 保留时间肌红蛋白伴清蛋白异构体 A.152 不适用伴清蛋白异构体 B.154 不适用 a- 乳清蛋白胰蛋白酶抑制剂图 5 阶梯梯度条件下蛋白质的 AEX 分离色谱图, 采用 1 M KCl 作为洗脱盐 7 pi pi 6.9 a 图 6 阶梯梯度条件下蛋白质的 AEX 分离色谱图, 采用 1 M CH 3 COONa 作为洗脱盐 RSD 保留时间肌红蛋白伴清蛋白异构体 A.16 不适用伴清蛋白异构体 B.158 不适用 a- 乳清蛋白胰蛋白酶抑制剂

6 为了证明在使用高盐缓冲液条件下保留时间和分离度的长期稳定性, 以 2 M NaCl 2 作为洗脱盐对蛋白质分离的情况 ( 线性梯度 ) 进行了长达 48 小时的监测, 请参见 15 图 7 和 8 结果证实在整个时间段内, 保留时间和分离度均保持稳定在所有测试中, 柱塞杆密封垫清洗液 ( 含有 1% 水 ) 每 1.5 分钟启用一次, 清洗.3 分钟, 以去除泵柱塞杆上的盐 () 1 5 a () 图 7 使用 2 M NaCl 时超过 48 小时的保留时间稳定性 a (h) 图 8 使用 2 M NaCl 时超过 48 小时的分离度稳定性 6

7 结论本应用简报论证了 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统是高盐应用的理想选择通过采用阴离子交换色谱法对四种不同蛋白质进行分离, 使用四种不同的洗脱离子 / 盐类型在线性梯度条件下均可获得较高的精确度根据所使用的盐类型, 色谱图中的保留时间分离度峰形和强度随之变化因此, 我们建议测试不同的盐类型, 找到最适宜的一种以实现最佳的样品分离如果需要测试多于三种盐类型, 那么在方法开发过程中最好选用溶剂选择阀当使用 2 M NaCl 作为蛋白质分析的洗脱盐时, 结果证实保留时间和分离度可在超过 48 小时的时间内保持稳定参考文献 1. 分析高 ph 流动相中的化合物 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统用于普通高 ph 应用的可行性安捷伦出版物 CHCN, Mark P. Richards, Tung-Liang Huang (1997). Metalloprotein analysis by capillary isoelectric focusing. Journal of Chromatography B, 69, Jan-Christer Janson & Lars Rydén (1998). Protein purification: principles, high-resolution methods, and applications. John Wiley & Sons. 采用阶梯梯度可缩短分离时间, 并降低缓冲液消耗但是, 需要考虑的是色谱柱需要更长的平衡时间因此, 强烈建议在每次分析之间留有足够的平衡时间, 不论使用的是线性还是阶梯梯度另外一个要点是定期 ( 例如, 每 1.5 分钟清洗.3 分钟 ) 进行密封垫清洗 ( 含有 1% 水 ), 以去除泵柱塞杆上的盐在高盐应用中,Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统和 Agilent Bio WAX,NP5,4.6 x 25 mm,pk 色谱柱均表现出了极高的保留时间和分离度稳定性 7

8 bio-inert 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 2 月 1 日, 中国出版出版号 CHCN

前言仪器间的方法转移对不同行业的所有实验室而言都是一项重要课题 1 尤其对于制药行业中的经验证方法, 仪器间的方法转移是必经过程, 但对于其他行业中的 QA/QC 也同样重要仪器间方法转移的一个示例是将常规液相色谱方法从 Agilent 1100 系列四元液相色谱仪等旧设备转移到 Agilent

前言仪器间的方法转移对不同行业的所有实验室而言都是一项重要课题 1 尤其对于制药行业中的经验证方法, 仪器间的方法转移是必经过程, 但对于其他行业中的 QA/QC 也同样重要仪器间方法转移的一个示例是将常规液相色谱方法从 Agilent 1100 系列四元液相色谱仪等旧设备转移到 Agilent 从 Agilent 1100 系列四元液相色谱仪到 Agilent 1260 Infinity II 液相色谱仪的方法转移抗组胺药物分析的等效性证明应用简报小分子药物作者 Sonja Krieger 安捷伦科技公司 Waldbronn, Germany 摘要对所有实验室而言, 将常规液相色谱方法从原有设备转移到新仪器都是一项重要课题本应用简报介绍了用于抗组胺药物分析的常规液相色谱方法从 Agilent