Agilent 1260 Infinity GPC/SEC 系 统 已 经 过 验 证

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2 Agilent 1260 Infinity GPC/SEC 系 统 已 经 过 验 证

3 液 相 色 谱 手 册 液 相 色 谱 柱 与 方 法 开 发 指 南

4 目 录 前 言 5 色 谱 的 基 本 概 念 6 柱 效 (N) 7 保 留 因 子 (k) 8 选 择 性 或 分 离 因 子 (α) 8 分 离 度 (R s ) 9 压 力 10 van Deemter 曲 线 11 梯 度 方 程 11 液 相 色 谱 仪 基 本 原 理 13 泵 液 相 色 谱 系 统 的 心 脏 14 压 力 范 围 14 Agilent 1200 Infinity 系 列 泵 的 能 力 范 围 15 溶 剂 混 合 16 延 迟 体 积 18 柱 外 体 积 18 自 动 进 样 器 操 纵 工 作 流 程 自 动 化 体 系 的 大 脑 19 固 定 样 品 环 和 流 通 式 自 动 进 样 器 19 进 样 精 度 和 准 确 度 21 灵 活 性 和 样 品 容 量 21 进 样 周 期 21 交 叉 污 染 22 新 型 进 样 方 法 和 自 动 化 23 柱 温 箱 产 生 热 量 的 肌 肉 23 检 测 器 感 知 器 官 24 检 测 器 灵 敏 度 26 线 性 范 围 26 数 据 采 集 速 率 27 HPLC 柱 的 选 择 28 HPLC 模 式 29 色 谱 柱 选 择 的 基 本 信 息 : 常 规 柱 30 高 效 液 相 色 谱 (HPLC) 柱 31 UHPLC 柱 32 表 面 多 孔 填 料 柱 32 LC/MS 柱 33 凝 胶 渗 透 色 谱 (GPC) 柱 体 积 排 阻 色 谱 柱 (SEC) 柱 和 凝 胶 过 滤 色 谱 (GFC) 柱 34 生 物 表 征 柱 34 色 谱 柱 特 性 35 硅 胶 35 键 合 相 35 聚 合 物 35 孔 径 36 粒 径 36 色 谱 柱 规 格 37 卡 套 柱 系 统 38 性 能 的 关 键 : 色 谱 柱 的 配 置 和 设 置 41 减 少 柱 外 体 积 的 重 要 性 42 实 现 完 美 的 接 头 连 接 43 接 头 连 接 要 求 43 不 可 调 金 属 接 头 43 可 调 手 紧 式 接 头 45 Agilent A-Line 接 头 次 重 复 连 接 后 的 稳 定 性 47 与 不 同 品 牌 色 谱 柱 的 兼 容 性 47 进 样 量 47 2

5 设 置 数 据 采 集 速 率 48 驻 留 体 积 及 其 对 色 谱 的 影 响 49 测 量 系 统 的 驻 留 体 积 51 评 估 驻 留 体 积 的 影 响 53 驻 留 体 积 与 分 析 时 间 54 螯 合 物 54 ph 和 流 动 相 改 性 剂 55 梯 度 操 作 56 优 化 色 谱 柱 的 再 平 衡 57 色 谱 柱 老 化 59 键 合 相 流 失 59 清 洗 反 相 硅 胶 柱 59 清 洗 正 相 硅 胶 柱 61 清 洗 反 相 聚 合 物 柱 61 方 法 开 发 62 方 法 开 发 : 从 何 处 入 手 63 模 式 选 择 63 选 择 色 谱 柱 和 填 料 规 格 66 选 择 固 定 相 67 反 相 色 谱 的 方 法 开 发 67 反 相 色 谱 固 定 相 的 选 择 67 反 相 色 谱 流 动 相 的 选 择 70 流 动 相 操 作 70 流 动 相 和 流 动 相 改 性 剂 问 题 排 查 70 流 动 相 混 合 71 流 动 相 脱 气 71 用 流 动 相 改 性 剂 控 制 ph 71 UV 检 测 器 常 用 的 缓 冲 液 73 LC/MS 的 考 虑 因 素 74 流 动 相 改 性 剂 问 题 排 查 76 问 题 排 查 实 例 : 基 线 漂 移 76 问 题 排 查 实 例 : 高 ph 造 成 的 峰 展 宽 和 峰 分 裂 78 问 题 排 查 实 例 : 流 动 相 改 性 剂 和 选 择 性 78 轻 松 可 靠 的 ph 测 试 79 优 化 反 相 色 谱 条 件 80 等 度 优 化 81 梯 度 优 化 84 用 于 反 相 色 谱 的 聚 合 物 色 谱 柱 86 反 相 色 谱 的 等 度 方 法 开 发 上 手 步 骤 指 南 87 从 常 规 柱 向 高 效 柱 进 行 方 法 转 移 的 技 巧 89 自 动 化 方 法 开 发 工 具 91 其 它 HPLC 模 式 的 方 法 开 发 93 HILIC 93 正 相 色 谱 95 离 子 交 换 色 谱 97 凝 胶 渗 透 色 谱 / 体 积 排 阻 色 谱 98 液 质 联 用 仪 基 本 原 理 99 什 么 是 LC/MS? 99 LC/MS 可 提 供 哪 些 信 息? 100 液 质 联 用 仪 的 类 型 101 单 四 极 杆 仪 器 101 三 重 四 极 杆 仪 器 101 飞 行 时 间 和 四 极 杆 飞 行 时 间 仪 器 101 匀 场 离 子 淌 度 系 统 102 MS/MS 碎 裂 化 合 物, 获 得 额 外 的 特 异 性 102 化 合 物 的 电 离 103 电 喷 雾 电 离 103 转 下 页 3

6 大 气 压 化 学 电 离 103 大 气 压 光 电 离 103 利 用 LC/MS 开 发 方 法 的 技 巧 104 ESI-MS 的 溶 剂 选 择 104 APCI-MS 和 APPI-MS 的 溶 剂 选 择 105 离 子 对 色 谱 与 质 谱 联 用 系 统 的 溶 剂 选 择 105 样 品 前 处 理 106 基 质 组 分 106 浓 度 问 题 106 关 于 离 子 抑 制 的 注 意 事 项 106 使 用 配 备 高 效 色 谱 柱 的 LC/MS 时 的 注 意 事 项 107 灵 敏 度 的 提 升 107 质 谱 扫 描 速 率 108 系 统 扩 散 108 LC/MS 软 件 109 扫 描 类 型 比 较 TIC EIC 和 SIM 109 个 人 化 合 物 数 据 库 与 谱 库 110 色 谱 结 果 的 保 护 112 可 扩 展 性 113 使 用 高 纯 度 级 别 溶 剂 的 重 要 性 116 UHPLC 的 特 殊 考 虑 116 在 线 过 滤 器 117 低 体 积 在 线 过 滤 器 117 保 护 柱 118 溶 剂 饱 和 柱 118 色 谱 柱 入 口 筛 板 118 色 谱 柱 保 护 和 保 存 118 最 大 限 度 地 延 长 柱 寿 命 118 保 存 注 意 事 项 120 疏 通 色 谱 柱 120 色 谱 柱 变 坏 时 的 快 速 检 查 120 确 保 方 法 在 全 球 范 围 内 都 重 现 121 提 高 方 法 的 耐 用 性 121 有 关 驻 留 体 积 的 提 示 122 快 速 故 障 排 查 指 南 123 有 效 排 查 故 障 的 要 点 123 有 用 的 参 考 资 料 129 美 国 药 典 指 定 填 料 129 溶 剂 相 溶 性 135 流 动 相 改 性 剂 的 UV 截 止 波 长 138 固 相 萃 取 吸 附 剂 139 SPE 吸 附 剂 条 件 140 其 它 推 荐 的 读 物 141 其 它 安 捷 伦 资 源 141 词 汇 表 142 索 引 169 安 捷 伦 液 相 色 谱 色 谱 柱 175 安 捷 伦 毛 细 管 和 接 头 181 安 捷 伦 液 相 色 谱 仪 器 用 灯 186 安 捷 伦 溶 剂 安 全 盖 188 安 捷 伦 在 线 过 滤 器 190 Agilent 1200 Infinity 系 列 液 相 色 谱 产 品 组 合 191 采 用 智 能 化 系 统 模 拟 技 术 (ISET) 的 Agilent 1290 Infinity II 液 相 色 谱 192 备 注 194 4

7 前 言 从 何 说 起 呢? 液 相 色 谱 是 一 个 庞 大 而 复 杂 的 话 题, 但 也 是 一 个 我 们 永 不 会 失 去 兴 趣 的 话 题 遍 及 世 界 各 地 的 色 谱 工 作 者 正 在 使 用 HPLC 技 术, 确 保 我 们 食 物 和 水 的 安 全 开 发 挽 救 生 命 的 药 物 保 护 我 们 的 环 境 保 卫 公 共 健 康, 而 这 仅 仅 是 其 应 用 的 一 角 您 对 色 谱 技 术 了 解 得 越 多, 您 能 应 用 这 一 神 奇 技 术 所 能 做 的 工 作 就 越 多 如 今, 有 更 多 的 色 谱 柱 和 填 料 供 您 选 择, 以 适 应 日 益 广 泛 的 应 用 需 求 安 捷 伦 现 在 有 2000 多 种 色 谱 柱 可 供 选 择, 覆 盖 了 最 广 泛 的 应 用 和 条 件 这 就 增 加 了 根 据 您 的 需 要 选 择 最 适 用 色 谱 柱 的 机 会 帮 助 您 得 到 最 好 的 液 相 色 谱 结 果 是 我 们 承 诺 的 一 部 分, 因 此, 我 们 编 制 了 这 本 液 相 色 谱 柱 选 择 手 册, 其 中 包 含 了 大 量 的 提 示 和 技 巧, 让 您 的 工 作 更 轻 松 更 高 效 另 外, 我 们 还 以 40 多 年 积 累 的 经 验 为 基 础, 为 您 提 供 色 谱 柱 和 接 头 日 常 使 用 中 常 见 的 问 题 提 供 建 议 本 指 南 涵 盖 了 液 相 色 谱 中 的 主 要 色 谱 柱, 重 点 是 反 相 高 效 液 相 色 谱 如 何 使 用 本 指 南 : 为 便 于 查 询, 各 章 节 有 不 同 颜 色 标 记 附 加 的 词 汇 表 非 常 全 面 虽 然 限 于 篇 幅, 我 们 没 能 收 录 本 书 中 的 每 个 词 汇 术 语, 但 仍 不 失 为 良 好 的 资 源 虽 然 本 书 也 涉 及 了 其 它 技 术, 但 重 点 是 反 相 HPLC 5

8 色 谱 的 基 本 概 念 我 们 都 还 记 得 在 学 校 里 学 习 数 学 的 感 觉, 总 是 想 知 道 怎 么 把 它 用 到 实 际 生 活 中 去 科 学 家 们 要 比 专 业 人 员 学 习 更 多 的 数 学, 本 章 将 告 诉 我 们 其 中 的 原 因 这 里, 我 们 将 简 要 概 述 一 下 色 谱 概 念 所 涉 及 的 公 式 和 理 论 对 这 些 概 念 的 理 解 将 帮 助 您 获 得 最 好 的 结 果, 并 在 遇 到 问 题 时 进 行 排 查 我 们 将 从 以 下 的 性 能 基 本 概 念 开 始 : 柱 效 保 留 选 择 性 分 离 度 压 力 这 些 都 是 理 解 如 何 优 化 结 果 成 功 开 发 方 法 的 关 键 我 们 还 将 探 讨 一 些 较 复 杂 的 概 念 : van Deemter 曲 线 梯 度 方 程 这 两 项 内 容 对 方 法 开 发 也 很 重 要 6

9 柱效 (N) 柱效用于比较不同色谱柱的性能 柱效可能是描述色谱柱性能引用频率最高的参数 以理论塔板数 N 表示 柱效 保留时间 峰底宽 方程 1. 柱效方程 保留时间 半峰宽 方程 2. 计算柱效的变换方程 塔板数高的色谱柱柱效更高 理论塔板数高的色谱柱与理论塔板数低的色谱柱相比 在给定保留时间内的 色谱峰更窄 柱效 N = 16 (tr/wt)2 对于色谱峰 B 16 (4.5 分钟/0.9 分钟) 2 = 400 塔板数 k = (tr-t0)/t0 保留 检测器响应 ka = (2.5-1)/1 = 1.5 kb = (4.6-1)/1 = 3.6 kc = (6.2-1)/1 = 5.2 选择性 (C-B) α = k2/k1 α = kc/kb = 5.2/3.6 = 1.44 α = 1.44 选择性 (B-A) α = k2/k1 α = kb/ka = 3.6/1.5 = 2.4 图 1. 柱效的色谱示意图 α = 2.4 7

10 如 果 我 们 在 约 4σ 峰 宽 处 做 切 线, 并 测 量 t w 距 离, 就 可 以 用 方 程 1 计 算 色 谱 峰 B 的 理 论 塔 板 数,N = 16 (t R /t W ) 2 有 时,4σ 峰 宽 很 难 测 量 ( 如, 基 线 噪 音 较 大 时 ), 可 以 使 用 变 换 方 程 ( 方 程 2), 测 量 半 峰 宽 (w 1/2 ):N = 5.54 (t R /w 1/2 ) 2 高 柱 效 的 好 处 很 大, 即 使 选 择 性 较 低 也 可 以 分 离 窄 峰 柱 效 受 柱 参 数 ( 内 径 柱 长 粒 度 ) 洗 脱 液 类 型 ( 特 别 是 粘 度 ) 流 速 或 平 均 线 速 度 的 影 响 柱 效 还 受 化 合 物 及 其 保 留 的 影 响 常 使 用 每 米 理 论 塔 板 数 (N/m) 进 行 色 谱 柱 的 比 较, 但 需 要 在 相 同 的 色 谱 温 度 条 件 和 峰 保 留 (k) 下 进 行 对 于 α 较 小 的 固 定 相, 柱 效 对 分 离 更 为 重 要 保 留 因 子 (k) 过 去 称 为 容 量 因 子 或 k (k 值 ), 保 留 因 子 是 指 样 品 组 分 停 留 在 固 定 相 中 相 对 其 驻 留 在 流 动 相 中 的 时 间 之 比 用 保 留 时 间 除 以 峰 不 保 留 时 间 (t 0 ) 进 行 计 算 样 品 峰 的 保 留 时 间 保 留 因 子 峰 不 保 留 时 间 方 程 3. 保 留 因 子 方 程 选 择 性 或 分 离 因 子 (α) 分 离 因 子 是 对 两 个 色 谱 峰 之 间 时 间 或 距 离 的 最 大 测 量 值 如 果 α = 1, 则 两 个 色 谱 峰 具 有 相 同 的 保 留 时 间 并 共 洗 脱 选 择 性 因 子 第 一 个 峰 的 保 留 因 子 第 二 个 峰 的 保 留 因 子 方 程 4. 选 择 性 方 程 8

11 选 择 性 因 子 的 定 义 是 容 量 因 子 之 比 在 图 1 中, 您 会 看 到, 峰 A 和 峰 B 之 间 的 选 择 性 比 峰 B 和 峰 C 的 选 择 性 更 好 图 中 提 供 了 计 算 说 明 改 变 流 动 相 或 固 定 相 都 可 以 改 变 选 择 性 温 度 也 是 调 节 选 择 性 的 一 个 因 素 分 离 度 (R s ) 分 离 度 代 表 色 谱 柱 分 离 目 标 峰 的 能 力, 因 此, 分 离 度 越 高, 两 峰 之 间 越 容 易 得 到 基 线 分 离 从 方 程 5 中 可 以 看 出, 分 离 度 与 柱 效 选 择 性 和 保 留 值 相 关 可 以 通 过 改 善 这 些 因 素 来 提 高 分 离 度 方 程 5. 分 离 度 方 程 在 图 2 中, 我 们 可 以 看 到 每 个 参 数 在 分 离 过 程 中 的 不 同 作 用 所 有 这 些 参 数 都 呈 效 应 递 减 趋 势 即 取 值 越 大, 对 分 离 度 的 影 响 就 越 小 如 果 将 柱 长 加 倍, 将 得 到 更 多 的 理 论 塔 板 数, 但 分 离 时 间 也 将 延 长 2 倍, 而 分 离 度 只 能 得 到 2 的 平 方 根 即 1.4 倍 的 提 高 如 果 要 对 色 谱 峰 进 行 定 量, 那 么 分 离 度 最 小 应 等 于 1 分 离 度 要 达 到 0.6, 才 能 分 辨 两 个 等 高 峰 间 的 峰 谷 如 需 建 立 耐 用 方 法, 理 想 分 离 度 值 一 般 应 大 于 等 于 1.7 基 线 分 离 并 确 保 最 准 确 定 量 结 果 的 分 离 度 应 为 1.6 9

12 选择性对分离度的影响主要是通过 改变键合相 改变流动相 塔板数是最容易增加的 分离度 增加 N 增加选择性 增加 k 塔板数 选择性 图 2. 分离度为选择性 柱效和保留值的函数 压力 压力方程 方程 6 包含影响系统压力的 5 个重要参数 溶剂粘度 (h) 流速 (F) 柱长 (L) 色谱柱半径 (r) 和填料粒径 (dp) 熟悉压力方程将能很好地理解这些重要参数对系统压力的影响 压力的改变 粘度 流速 柱长 柱渗透性 柱半径 粒径 方程 6. 压力方程 从公式中可以看出 粒径 (dp) 稍微降低就会对反压造成明显影响 10

13 van Deemter 曲 线 van Deemter 方 程 是 将 柱 效 作 为 线 速 度 (u) 或 流 速 的 函 数 对 柱 效 ( 用 H 表 示, 见 方 程 7) 进 行 评 价 H 称 为 塔 板 高 度, 或 理 论 塔 板 高 度, 用 柱 长 (L) 除 以 理 论 塔 板 数 进 行 计 算 我 们 的 目 标 是 得 到 小 塔 板 高 度 可 以 通 过 使 用 较 小 填 料 色 谱 柱 优 化 线 速 度, 以 及 使 用 低 粘 度 流 动 相, 更 有 效 地 实 现 这 一 目 标 随 着 粒 径 减 小, 优 化 线 速 度 将 增 大 方 程 7. van Deemter 方 程 塔 板 高 度 (H) 大 粒 径 填 料 小 粒 径 填 料 总 曲 线 :van Deemter 传 质 阻 力 纵 向 扩 散 涡 流 扩 散 线 速 度 (u) 塔 板 高 度 越 小, 塔 板 数 越 大, 色 谱 分 离 度 将 越 大 图 3. van Deemter 方 程 图 示 我 们 经 常 通 过 绘 制 van Deemter 曲 线 评 价 不 同 色 谱 柱 的 性 能, 并 理 解 如 何 根 据 方 法 进 行 线 速 度 的 优 化 (u opt ) 梯 度 方 程 当 样 品 中 存 在 各 种 类 型 的 组 分 时, 我 们 很 难 用 等 度 洗 脱 ( 即, 恒 定 流 动 相 组 成 ) 在 适 当 时 间 内 让 所 有 组 分 都 得 到 分 离 梯 度 洗 脱 是 一 个 随 时 间 提 高 流 动 相 强 度 的 过 程, 最 终 使 分 析 速 度 更 快 峰 形 和 定 量 结 果 更 好 通 过 梯 度 洗 脱, 峰 宽 通 常 将 更 窄, 并 保 持 恒 定 ( 有 关 梯 度 洗 脱 的 更 多 信 息, 请 参 见 第 55 页 ) 梯 度 方 程 ( 方 程 8) 显 示 了 影 响 分 析 的 关 键 因 素, 如 果 忽 视 它 们, 可 能 会 给 色 谱 分 离 带 来 问 题 该 方 程 显 示 了 流 速 (F) 梯 度 时 间 (t G ) 梯 度 范 围 (DF) 和 柱 体 积 (V M ) 对 保 留 因 子 的 影 响 切 记, 为 保 持 保 留 因 子 恒 定, 如 需 改 变 分 母 则 需 按 比 例 改 变 分 子, 反 之 亦 然 11

14 增 加 保 留 因 子 k ( 或 k*, 在 梯 度 中 ) 是 提 高 分 离 度 的 简 便 途 径, 但 如 图 2 所 示, 它 并 不 如 增 加 柱 效 和 选 择 性 更 有 效 如 通 过 延 长 梯 度 时 间 增 加 保 留 因 子, 将 使 分 析 时 间 延 长, 如 方 程 8 所 示 梯 度 时 间 流 速 梯 度 保 留 值 色 谱 柱 死 体 积 常 数 B 溶 剂 体 积 变 化 方 程 8. 梯 度 方 程 在 梯 度 方 程 中,S 为 常 数, 与 所 分 离 的 分 子 大 小 有 关 小 分 子 的 S 值 约 为 4 到 6, 多 肽 和 蛋 白 质 的 S 介 于 10 到 1000 之 间 现 在, 经 常 使 用 不 同 尺 寸 的 色 谱 柱, 或 使 其 更 短 ( 例 如, 为 实 现 更 高 通 量 ), 或 使 用 窄 内 径 柱 ( 如, 用 于 质 谱 检 测 ) 必 须 按 比 例 缩 短 梯 度 时 间 (t G ) 或 减 小 流 速 (F), 以 补 偿 柱 体 积 的 减 少 使 用 相 同 色 谱 柱 时, 如 果 想 保 持 相 同 的 梯 度 斜 率 和 k* 值, 则 需 在 梯 度 时 间 (t G ) 内 按 比 例 调 整 梯 度 组 成 (DF) 改 变 速 率 或 流 速 (F) 使 用 安 捷 伦 方 法 转 移 软 件 是 将 方 法 转 移 到 不 同 规 格 色 谱 柱 时 的 绝 佳 方 法 登 录 输 入 液 相 色 谱 方 法 转 移 器 (LC Method Translator) 搜 索 得 到 方 法 转 移 器 12

15 液 相 色 谱 仪 基 本 原 理 HPLC 或 UHPLC 分 离 分 析 物 混 合 物 和 检 测 各 种 化 合 物 采 用 的 典 型 液 相 色 谱 系 统 由 四 个 核 心 组 件 组 成 本 章 将 介 绍 这 些 组 件, 并 着 重 介 绍 它 们 最 重 要 且 最 关 键 的 方 面 在 操 作 或 选 择 液 相 色 谱 系 统 时 对 这 些 方 面 的 慎 重 考 量, 有 助 于 我 们 获 得 稳 定 一 致 的 结 果 和 实 现 效 率 最 大 化 典 型 液 相 色 谱 系 统 中 的 每 个 组 件 或 模 块 在 分 离 和 检 测 过 程 中 都 各 自 发 挥 着 它 们 独 有 的 功 能, 而 这 些 功 能 都 同 等 重 要 为 了 描 述 这 些 功 能, 我 们 将 按 照 系 统 流 路 的 顺 序 ( 从 泵 到 进 样 器 和 色 谱 柱, 再 到 检 测 器 ) 进 行 介 绍, 见 图 4 色 谱 柱 泵 自 动 进 样 器 检 测 器 一 维 色 谱 图 泵 泵 自 动 进 样 器 色 谱 柱 检 测 器 ( 可 选 ) 阀 ( 进 样 器 ) 色 谱 柱 检 测 器 二 维 色 谱 图 图 4. 典 型 现 代 液 相 色 谱 系 统 的 组 件 13

16 Agilent 1290 Infinity II 液 相 色 谱 系 统 新 型 Agilent 1290 Infinity II 液 相 色 谱 系 统 代 表 UHPLC 的 未 来, 其 拥 有 安 捷 伦 提 供 的 无 与 伦 比 的 可 靠 性 和 稳 定 性, 采 用 了 突 破 性 技 术, 能 够 最 大 程 度 地 提 高 您 的 业 务 效 率 分 析 效 率 最 大 化 : 无 可 比 拟 的 分 离 和 检 测 性 能, 可 提 供 最 高 质 量 的 分 析 数 据, 让 您 对 结 果 充 满 信 心 仪 器 效 率 最 大 化 : 最 高 的 样 品 容 量 最 快 的 进 样 周 期 以 及 前 所 未 有 的 可 用 性 使 仪 器 在 任 何 应 用 中 均 可 实 现 最 高 通 量 泵 液 相 色 谱 系 统 的 心 脏 在 将 流 动 相 输 送 入 系 统 之 前, 泵 将 以 恒 定 的 比 例 ( 等 度 ) 或 变 化 的 比 例 ( 梯 度 ) 混 合 溶 剂 在 梯 度 模 式 下, 泵 逐 渐 提 升 流 动 相 中 第 二 种 组 分 所 占 的 百 分 比 我 们 将 流 动 相 的 第 二 种 组 分 称 为 溶 剂 B, 它 的 洗 脱 强 度 比 流 动 相 的 第 一 种 组 分 ( 溶 剂 A) 更 高 许 多 泵 还 设 有 脱 气 单 元, 用 于 去 除 溶 解 在 溶 剂 中 的 空 气 溶 剂 脱 气 有 助 于 减 少 检 测 器 基 线 波 动 ( 例 如 基 线 漂 移 和 噪 音 ) 压 力 范 围 HPLC 和 UHPLC 的 泵 输 送 流 动 相, 使 其 通 过 装 填 有 固 定 相 的 色 谱 柱 泵 必 须 在 50 bar 至 1300 bar 的 高 压 下 输 送 流 动 相 才 能 克 服 色 谱 柱 中 的 固 定 相 产 生 的 阻 力 标 准 HPLC 色 谱 柱 一 般 装 填 5 µm 硅 胶 基 质 颗 粒 对 于 50 mm 至 300 mm 长 内 径 为 4.6 mm 的 标 准 HPLC 色 谱 柱 而 言, 采 用 能 够 在 400 bar 的 压 力 下 输 送 液 流 的 泵 通 常 就 已 足 够 相 比 之 下, 现 代 UHPLC 所 用 的 色 谱 柱 颗 粒 可 达 到 2 µm 以 下 采 用 小 粒 径 的 全 多 孔 颗 粒 ( 小 于 2 µm) 且 内 径 较 小 ( 小 于 2.1 mm) 柱 长 较 长 ( 例 如 300 mm) 的 色 谱 柱 要 求 泵 具 有 1000 bar 或 更 高 的 输 送 压 力 分 析 型 液 相 色 谱 应 用 常 用 的 典 型 流 速 介 于 100 µl/min 和 10 ml/min 之 间 我 们 根 据 泵 的 能 力 范 围 ( 定 义 为 流 速 和 耐 压 能 力 的 组 合 ) 对 其 进 行 分 类 14

17 Agilent 1200 Infinity 系 列 泵 的 能 力 范 围 Agilent 1290 Infinity II 高 速 泵 在 高 达 2 ml/min 的 流 速 下 可 耐 压 1300 bar, 在 高 达 5 ml/min 的 流 速 下 可 耐 压 800 bar, 见 图 5 表 1 展 示 了 各 种 泵 适 用 的 色 谱 柱 类 型 bar Infinity II 1290 Infinity /1260 Infinity HPLC 200 bar 10 ml/min 1220 / 1260 Infinity VL ml/min 图 5. 典 型 现 代 液 相 色 谱 系 统 组 件 色 谱 柱 类 型 颗 粒 HPLC 3-5µm HPLC 表 面 多 孔 UHPLC < 2µm (STM) UHPLC 表 面 多 孔 色 谱 柱 柱 长 /mm Short Long 色 谱 柱 内 径 /mm 最 大 压 力 /bar 安 捷 伦 色 谱 柱 类 型 多 种 Poroshell µm 1290 高 速 泵 bar 1290 全 能 泵 bar RRHD RRHD RRHT RRHD RRHD RRHT Poroshell µm Poroshell µm 1260 Bin/600 bar 2) 1260Q/1220G bar 1) 2) 1) 常 规 液 相 色 谱 400 bar 2) 2) 2) 2) 3) 3) 图 示 说 明 最 好 良 好 可 接 受 不 适 用 1) 由 于 延 迟 体 积 的 原 因 2) 由 于 延 迟 体 积 和 压 力 的 原 因 3) 由 于 压 力 的 原 因 STM 短 型 : 亚 2 µm 颗 粒, 长 mm STM 长 型 : 亚 2 µm 颗 粒, 长 mm HPLC:3-5 µm 颗 粒 表 1. 色 谱 柱 填 料 应 用 条 件 指 南 15

18 溶 剂 混 合 除 了 输 送 流 动 相, 泵 还 必 须 以 高 准 确 度 和 高 精 度 混 合 溶 剂 泵 必 须 能 够 为 等 度 洗 脱 提 供 比 例 精 确 恒 定 的 溶 剂, 还 必 须 能 够 将 两 种 或 更 多 种 溶 剂 混 合 成 为 比 例 随 时 间 变 化 的 溶 剂 梯 度 泵 精 确 混 合 溶 剂 和 提 供 可 重 现 流 速 的 能 力 决 定 了 泵 的 保 留 时 间 重 现 性 保 留 时 间 是 液 相 色 谱 的 基 本 参 数 之 一, 它 能 指 示 采 用 特 定 的 色 谱 柱 和 流 动 相 组 合 进 行 分 离 时, 物 质 的 保 留 特 性 我 们 通 常 使 用 两 种 不 同 类 型 的 泵, 根 据 泵 混 合 溶 剂 的 方 式 来 区 分 它 们 四 元 泵 在 低 压 下 混 合 溶 剂 最 多 四 条 溶 剂 管 线 通 向 多 通 道 阀, 按 预 设 的 比 例 进 行 混 合 采 用 这 种 方 式, 泵 能 够 形 成 二 元 三 元 和 四 元 梯 度 溶 剂 混 合 在 泵 的 低 压 侧 进 行, 见 图 6 对 溶 剂 进 行 适 当 的 脱 气 对 于 防 止 溶 剂 配 比 和 混 合 过 程 中 形 成 气 泡 至 关 重 要 通 常, 泵 利 用 内 置 单 元 或 外 部 单 元 对 溶 剂 进 行 脱 气, 然 后 利 用 高 压 泵 腔 将 混 合 好 的 溶 剂 ( 流 动 相 ) 输 送 至 进 样 器 脱 气 单 元 阻 尼 器 比 例 阀 伺 服 驱 动 的 串 联 式 双 活 塞 泵 图 6. 用 于 低 压 梯 度 混 合 的 溶 剂 输 送 系 统 的 示 意 图, 显 示 了 脱 气 单 元 比 例 阀 和 泵 腔 自 动 进 样 器 二 元 泵 在 泵 的 高 压 侧 混 合 溶 剂, 通 常 只 能 混 合 两 种 溶 剂 二 元 泵 的 主 要 优 势 在 于, 当 溶 剂 组 分 之 一 所 占 的 比 例 较 小 时, 它 能 够 更 准 确 更 精 密 地 混 合 溶 剂 此 类 混 合 可 在 溶 剂 梯 度 开 始 和 结 束 时 提 供 高 精 度 的 溶 剂 组 成, 见 图 7 高 压 混 合 二 元 泵 的 另 一 个 优 势 是 延 迟 体 积 较 小 我 们 将 延 迟 体 积 定 义 为 混 合 点 到 色 谱 柱 梯 度 启 始 处 之 间 的 流 动 相 体 积 缩 小 延 迟 体 积 有 利 于 加 快 运 行 速 度 和 缩 短 分 析 时 间 对 于 高 压 混 合 而 言, 脱 气 不 再 是 一 个 问 题, 因 为 溶 剂 在 混 合 时 处 于 加 压 状 态 16

19 脱 气 单 元 阻 尼 器 阻 尼 器 混 合 器 通 道 A 通 道 B 泵 自 动 进 样 器 图 7. 用 于 高 压 梯 度 混 合 的 溶 剂 输 送 系 统 的 示 意 图, 显 示 了 用 于 生 成 二 元 洗 脱 液 梯 度 的 两 个 溶 剂 通 道 与 二 元 泵 相 比, 四 元 泵 更 灵 活, 因 为 它 们 不 仅 能 提 供 二 元 梯 度, 还 能 提 供 三 元 和 四 元 梯 度 另 外, 四 元 泵 还 能 向 流 动 相 中 在 线 混 入 添 加 剂 低 压 混 合 泵 的 价 格 通 常 较 低, 因 为 它 们 只 有 一 个 泵, 而 高 压 混 合 则 需 要 两 个 泵, 见 表 2 等 度 泵 四 元 泵 二 元 泵 溶 剂 混 合 不 混 合 低 压 混 合 高 压 混 合 梯 度 无 梯 度, 仅 等 度 二 元 三 元 和 四 元 梯 度 仅 二 元 梯 度 延 迟 体 积 无 梯 度, 无 延 迟 体 积 延 迟 体 积 较 大 延 迟 体 积 较 小 脱 气 机 必 须 脱 气 建 议 脱 气 梯 度 混 合 性 能 无 梯 度 中 心 处 性 能 良 好, 梯 度 两 端 性 能 较 差 (1290 Infinity II 全 能 泵 除 外 ) 性 能 极 佳 表 2. 液 相 色 谱 泵 的 不 同 混 合 原 理 比 较 17

20 延 迟 体 积 我 们 将 延 迟 体 积 或 滞 后 体 积 定 义 为 流 动 相 混 合 点 到 色 谱 柱 柱 头 之 间 的 系 统 体 积 延 迟 体 积 会 显 著 影 响 分 析 速 度 会 影 响 延 迟 体 积 的 主 要 系 统 组 件 包 括 样 品 混 合 器 和 阻 尼 器 连 接 毛 细 管 进 样 器 的 液 压 容 积 和 热 交 换 器 的 体 积 因 此, 泵 和 进 样 器 的 设 计 会 极 大 影 响 分 析 速 度 现 代 UHPLC 泵 经 过 专 门 设 计, 力 求 在 不 影 响 混 合 性 能 的 前 提 下 最 大 程 度 减 小 延 迟 体 积 Agilent 1290 Infinity II 全 能 泵 和 高 速 泵 的 延 迟 体 积 Agilent 1290 Infinity II 全 能 泵 与 市 面 上 的 其 他 四 元 泵 均 不 同 此 款 泵 的 混 合 性 能 与 高 压 混 合 泵 相 当, 而 且 在 较 低 和 较 高 的 溶 剂 比 例 下 均 能 形 成 高 重 现 性 的 梯 度 相 比 之 下,Agilent 1290 Infinity II 高 速 泵 具 有 极 低 的 延 迟 体 积, 有 利 于 缩 短 运 行 时 间 Agilent 1290 Infinity II 泵 采 用 的 新 技 术 可 最 大 程 度 减 小 延 迟 体 积 Agilent Jet Weaver 和 Inlet Weaver 混 合 器 可 确 保 有 效 混 合 小 体 积 溶 剂,Agilent 1290 Infinity II 全 能 泵 和 高 速 泵 则 采 用 了 主 动 阻 尼 技 术, 在 混 合 过 程 中 将 流 动 相 的 压 缩 特 性 也 考 虑 在 内 这 种 可 实 现 皮 升 水 平 精 密 计 量 的 主 动 阻 尼 技 术 取 代 了 物 理 阻 尼 器 柱 外 体 积 我 们 将 柱 外 体 积 定 义 为 进 样 点 与 检 测 器 出 口 之 间 的 系 统 体 积 导 致 柱 外 体 积 产 生 的 主 要 因 素 包 括 毛 细 管 热 交 换 器 连 接 件 和 接 头, 以 及 检 测 器 流 通 池 如 果 柱 外 体 积 过 大, 会 导 致 样 品 扩 散 和 分 析 物 谱 带 展 宽, 进 而 导 致 分 离 度 下 降 和 灵 敏 度 降 低 使 用 毛 细 管 柱 接 头 或 者 在 系 统 中 安 装 色 谱 柱 时 尤 其 需 要 注 意 接 头 使 用 不 当 常 常 会 导 致 意 料 之 外 且 通 常 不 易 被 察 觉 的 死 体 积, 这 可 能 会 严 重 影 响 分 离 效 果 使 用 小 内 径 (2.1 mm 或 更 小 ) 的 色 谱 柱 进 行 等 度 分 离 时, 必 须 慎 重 考 虑 柱 外 体 积 和 毛 细 管 的 内 径 Agilent A-line Quick Connect 快 速 连 接 色 谱 柱 接 头 采 用 精 心 设 计 的 系 统 以 及 用 户 友 好 的 接 头 ( 例 如 Agilent A-line Quick Connect 快 速 连 接 色 谱 柱 接 头 ), 可 基 本 上 消 除 死 体 积, 让 液 相 色 谱 分 析 更 加 稳 定, 并 且 不 受 用 户 操 作 水 平 的 影 响 18

21 自动进样器 操纵工作流程自动化体系的 大脑 自动液体进样器 又称自动进样器 现在已经取代了手动进样器 因为它们能够在无需用户干预的前提下以 高准确度和高精度进样多个样品 分析型自动进样器 例如那些用于 HPLC 的进样器 可进样的样品体积通 常在 100 nl 至 100 µl 之间 通过一些改动 我们可以提高这些自动进样器可进样的样品量 从而将它们应 用于高度稀释的样品或半制备分析 在 UHPLC 分析中 自动进样器注入的样品量通常较少 因为此类系统 采用小内径色谱柱 为了实现良好的分离 必须避免色谱柱过载 固定样品环和流通式自动进样器 自动进样器可采用两种不同的设计方案 固定样品环和流通式自动进样器 在固定样品环设计中 样品被 吸入或推入一个样品环中 然后该样品环被切换到样品流路中 见图 8 泵 辅助溶剂 计量装置 废液 针座 自动进样器 色谱柱 6 7 废液 图 8. 采用固定样品环设计的自动进样器 图中所示为样品环被切换到样品流路中的状态 在流通式自动进样器中 流动相将通过样品环以及计量装置和进样针 流通式设计的主要优势在于其进样 量范围更灵活 见图 9 在固定样品环设计中 用户通常必须使样品环过载才能达到最高的重现性 用户 也可以部分填充样品环 但是这种方法的重现性较差 如果用户需要使用固定样品环自动进样器注入较小 或较大体积的样品 通常必须更换样品环 19

22 泵 样品环 计量装置 废液 针座 自动进样器 色谱柱 图 9. 采用流通式设计的自动进样器 显示液流如何将样品输送入色谱柱中 流通式设计的另一个优势是交叉污染较低 交叉污染是指前一次分析的样品组分出现在下一次运行的色谱 图中的现象 这是由于某些组分粘附到了系统表面 管线 接头或色谱柱材料上 并在下一次分析中被洗 脱下来 在流通式自动进样器设计中 整个梯度将会冲洗自动进样器的所有液压部件 这样可确保在色谱 运行过程中高效地清洁计量装置 样品环和进样针的内表面 表 3 总结了固定样品环和流通式自动进样器 之间的差异 固定样品环自动进样器 流通式自动进样器 原理 样品环被切入和切出溶剂流 样品环 进样针和计量装置被切入和切出溶剂流 样品浪费 高 因为样品环须过量填充 无 不更换硬件前提下的 低 可以部分填充样品环 但精度较低 高 进样量灵活性 进样量线性 差 因为必须使用不同的样品环 极佳 延迟体积 低 高 交叉污染 中等 低 因为在梯度运行过程中将冲洗所有的流路部件 表 3. 固定样品环和流通式自动进样器对比 在 HPLC 或 UHPLC 应用中 为了获得高质量的结果 我们必须考虑多个关键的自动进样器参数 后面的章 节将介绍这些参数 20

23 进 样 精 度 和 准 确 度 要 在 运 行 之 间 获 得 良 好 的 定 量 重 现 性, 进 样 精 度 至 关 重 要 进 样 精 度 是 指 自 动 进 样 器 在 多 次 运 行 中 保 持 相 同 进 样 量 的 能 力 另 一 方 面, 进 样 准 确 度 则 描 述 了 自 动 进 样 器 达 到 预 设 的 进 样 量 绝 对 值 的 能 力 现 代 UHPLC 仪 器 的 进 样 精 度 通 常 可 达 到 小 于 0.15% RSD 灵 活 性 和 样 品 容 量 如 今, 实 验 室 在 提 高 样 品 通 量 和 降 低 总 成 本 方 面 面 临 着 极 大 的 压 力 另 外,UHPLC 仪 器 也 越 来 越 多 地 应 用 于 多 用 户 环 境, 或 是 在 高 通 量 模 式 下 运 行 由 于 自 动 进 样 器 是 样 品 的 入 口 端, 因 此 该 模 块 需 要 使 用 灵 活 的 样 品 容 器 以 支 持 不 同 的 工 作 流 程, 还 要 避 免 造 成 干 扰 或 产 生 重 组 样 品 的 需 求 用 于 此 类 环 境 的 自 动 进 样 器 必 须 能 够 支 持 多 种 形 式 的 样 品 容 器 另 一 方 面, 通 常 需 要 采 用 大 型 进 样 器 装 置 来 满 足 高 容 量 要 求, 由 于 占 用 的 台 面 空 间 较 大, 通 常 会 导 致 成 本 升 高 Agilent 1200 Infinity 系 列 自 动 进 样 器 Agilent Infinity 系 列 的 大 多 数 自 动 进 样 器 均 采 用 流 通 式 设 计, 具 有 卓 越 的 灵 活 性 新 型 Agilent 1290 Infinity II Multisampler 的 完 美 设 计 仅 占 用 极 小 的 台 面 空 间, 同 时 很 好 地 解 决 了 灵 活 性 和 高 样 品 容 量 问 题 用 户 可 使 用 不 同 的 样 品 抽 屉, 并 且 可 对 样 品 抽 屉 进 行 配 置 和 更 改 以 满 足 用 户 的 当 前 需 求 Agilent 1290 Infinity II Multisampler 的 样 品 容 量 已 进 行 优 化 设 计, 使 用 384 孔 微 量 滴 定 板 时, 通 过 单 模 块 堆 叠 即 可 实 现 6000 个 样 品 以 上 的 容 量 进 样 周 期 进 样 周 期 是 液 相 色 谱 分 析 中 容 易 被 忽 视 的 一 个 参 数 现 在, 借 助 新 型 UHPLC 仪 器 和 亚 2 µm 颗 粒 色 谱 柱 技 术, 运 行 时 间 可 缩 短 为 1 分 钟 以 下, 甚 至 仅 30 秒, 而 且 不 会 影 响 分 离 度 从 前 一 次 运 行 结 束 到 吸 取 样 品 并 最 终 进 样 开 始 下 一 次 运 行 所 需 的 时 间 已 接 近 甚 至 超 出 上 述 运 行 时 间 受 高 载 样 量 的 限 制 以 及 鉴 于 快 速 获 得 结 果 的 需 要, 我 们 必 须 将 非 生 产 性 的 额 外 时 间 降 至 最 低 新 型 自 动 进 样 器 设 计 在 前 一 次 运 行 过 程 中 即 开 始 下 一 次 进 样 操 作, 并 将 这 种 运 行 方 式 与 快 速 自 动 装 置 相 结 合, 能 够 很 好 地 满 足 上 述 要 求 这 样 可 最 大 程 度 减 少 运 行 的 额 外 时 间, 将 其 缩 短 至 10 秒 以 下 21

24 交 叉 污 染 近 年 来, 液 相 色 谱 的 检 测 限 已 经 大 幅 降 低 ( 尤 其 是 与 高 端 质 谱 检 测 相 结 合 时 ) 甚 至 浓 度 极 低 的 杂 质 也 可 轻 松 检 出 要 想 达 到 极 低 的 检 测 限, 必 须 使 用 纯 净 的 溶 剂 和 洁 净 的 仪 器 前 一 次 分 析 中 分 离 和 检 测 的 化 合 物 不 应 出 现 在 下 一 次 或 后 续 的 分 析 中, 否 则 会 影 响 样 品 序 列 的 结 果 和 定 量 分 析 自 动 进 样 器 必 须 精 心 设 计, 力 求 最 大 程 度 减 少 交 叉 污 染 在 自 动 进 样 器 中, 进 样 针 和 针 座 之 间 的 接 口 至 关 重 要 粘 着 力 强 的 化 合 物 容 易 吸 附 到 这 些 部 件 的 表 面, 而 除 去 这 些 痕 量 的 化 合 物 可 能 是 一 项 繁 琐 的 工 作 必 须 对 材 料 表 面 进 行 设 计, 消 除 它 们 与 非 极 性 分 析 物 之 间 的 相 互 作 用 连 接 部 件 时 应 非 常 小 心, 以 避 免 任 何 死 体 积 ( 即 使 非 常 小 ), 以 及 避 免 产 生 任 何 划 痕 或 磨 损, 防 止 其 造 成 机 械 影 响 使 用 强 溶 剂 进 行 进 样 针 清 洗 程 序 通 常 有 助 于 大 幅 减 少 交 叉 污 染 大 多 数 现 代 自 动 进 样 器 均 配 备 有 内 置 的 进 样 针 清 洗 站, 用 于 在 吸 入 样 品 并 将 其 转 移 到 进 样 口 之 前 对 进 样 针 的 外 表 面 进 行 清 洗 如 果 不 进 行 适 当 清 洗, 进 样 针 的 外 表 面 将 成 为 交 叉 污 染 的 主 要 来 源 利 用 Agilent 1200 Infinity 系 列 Multisampler 消 除 交 叉 污 染 新 型 Agilent 1200 Infinity 系 列 Multisampler 具 有 更 先 进 的 交 叉 污 染 消 除 功 能 该 系 列 的 自 动 进 样 器 可 配 置 多 重 清 洗 功 能, 该 功 能 不 仅 能 够 清 洁 进 样 针 的 外 表 面, 还 能 有 效 反 冲 针 座 ( 交 叉 污 染 的 第 二 大 主 要 来 源 ), 可 选 择 的 外 部 清 洗 溶 剂 多 达 三 种 利 用 多 重 清 洗 功 能, 洗 必 泰 的 交 叉 污 染 值 可 降 低 至 10 ppm 以 下, 这 使 得 Multisampler 成 为 了 高 端 三 重 四 极 杆 质 谱 仪 的 理 想 之 选 清 洗 进 样 针 内 部 应 用 流 通 式 原 理 充 分 清 洗 进 样 针 内 部, 确 保 洗 脱 液 的 一 致 性 清 洗 进 样 针 外 部 可 设 置 进 样 针 外 的 清 洗 程 序, 提 供 多 达 3 种 外 部 清 洗 溶 剂 供 您 选 择 主 动 式 针 座 反 冲 可 选 择 3 种 外 部 溶 剂 反 冲 针 座 22

25 新 型 进 样 方 法 和 自 动 化 自 动 进 样 器 不 仅 能 够 用 作 简 单 的 进 样 装 置, 用 于 在 无 用 户 干 预 的 情 况 下 引 入 样 品, 它 们 还 具 有 处 理 和 制 备 样 品 或 者 执 行 并 行 任 务 以 节 省 时 间 等 多 种 功 能 另 外, 现 代 自 动 进 样 器 都 采 用 针 对 许 多 经 验 不 足 的 用 户 而 设 计 的 防 呆 界 面 组 合, 让 这 些 用 户 只 需 提 交 样 品 即 可 完 成 分 析, 它 们 同 时 也 是 智 能 的 样 品 组 织 器, 能 够 根 据 企 业 优 先 级 来 安 排 连 续 分 析 运 行 自 动 进 样 器 还 可 帮 助 您 对 独 立 操 作 进 行 编 程 利 用 该 功 能, 您 可 以 混 合 样 品 添 加 内 标 或 执 行 稀 释 步 骤 例 如, 在 氨 基 酸 分 析 中, 您 可 以 利 用 自 动 进 样 器 直 接 进 行 自 动 衍 生 化 Agilent 1200 Infinity 系 列 Multisampler 的 双 针 头 功 能 将 进 样 器 的 功 能 扩 展 到 简 单 进 样 功 能 之 外 的 另 一 个 例 子 是 1200 Infinity 系 列 Multisampler 全 新 的 双 针 头 功 能 两 个 进 样 针 样 品 环 组 件 能 够 以 多 种 不 同 方 式 使 用 在 两 个 经 过 校 准 且 具 有 类 似 容 量 的 进 样 针 之 间 切 换 还 有 助 于 进 一 步 提 高 通 量 第 二 个 进 样 针 在 前 一 次 运 行 还 在 进 行 的 过 程 中 即 可 开 始 进 样 针 清 洗 和 样 品 吸 入 操 作, 如 此 一 来, 前 一 次 运 行 完 成 之 后 即 可 立 即 进 样 或 者, 两 个 进 样 针 可 配 备 不 同 尺 寸 的 样 品 环, 从 而 交 替 地 执 行 小 体 积 进 样 ( 用 于 UHPLC 分 析 ) 和 大 体 积 进 样 ( 用 于 传 统 方 法 或 富 集 分 析 ), 而 不 会 由 于 延 迟 体 积 较 大 而 影 响 分 析 速 度 利 用 双 针 头 配 置, 用 户 还 能 在 特 定 工 作 流 程 中 为 特 定 样 品 或 标 样 保 留 一 个 进 样 针, 从 根 本 上 消 除 产 生 交 叉 污 染 的 可 能 性 柱 温 箱 产 生 热 量 的 肌 肉 柱 温 箱 是 液 相 色 谱 系 统 中 一 个 经 常 被 低 估 的 组 件, 但 事 实 上 该 模 块 对 于 确 保 分 离 柱 运 行 环 境 的 稳 定 性 和 获 得 可 重 现 的 结 果 而 言 至 关 重 要 当 实 验 室 的 室 温 在 一 天 之 中 会 发 生 变 化 或 者 需 要 将 方 法 从 一 个 场 所 转 移 至 另 一 个 场 所 时, 稳 定 的 环 境 尤 其 重 要 温 度 会 影 响 保 留 因 子 k, 还 会 影 响 样 品 的 分 离 度 温 度 还 是 方 法 开 发 过 程 要 使 用 的 参 数 之 一 柱 温 箱 可 以 是 简 单 的 柱 温 箱, 或 者 是 能 够 将 色 谱 柱 周 围 加 热 到 预 设 温 度 ( 通 常 高 达 80 C) 的 加 热 器 现 代 柱 温 箱 配 备 有 溶 剂 热 交 换 器, 还 可 将 溶 剂 加 热 到 预 设 温 度 进 行 方 法 开 发 时, 我 们 可 以 使 用 帕 尔 帖 型 柱 温 箱, 因 为 此 类 装 置 能 够 更 快 速 地 改 变 温 度, 而 温 度 是 开 发 色 谱 方 法 时 可 以 改 变 的 参 数 之 一 另 外, 帕 尔 帖 型 柱 温 箱 不 仅 能 够 加 热 溶 剂 和 色 谱 柱 环 境, 还 能 冷 却 色 谱 柱 或 维 持 定 义 的 室 温 左 右 的 稳 定 温 度 大 多 数 应 用 都 在 约 40 C 下 进 行 分 离 在 较 高 的 温 度 下, 保 留 时 间 将 缩 短, 可 实 现 更 快 速 的 洗 脱 在 较 低 的 温 度 下, 保 留 时 间 通 常 会 增 加, 在 反 相 分 离 中 尤 其 如 此 UHPLC 应 用 通 常 采 用 较 高 的 温 度, 目 的 是 降 低 溶 剂 粘 度 以 及 降 低 由 小 颗 粒 和 高 流 速 引 起 的 背 压 因 此, 用 于 UHPLC 的 柱 温 箱 通 常 需 加 热 至 高 达 100 C 或 更 高 的 温 度 23

26 柱 温 箱 是 一 个 需 要 用 户 频 繁 干 预 的 液 相 色 谱 模 块 用 户 需 要 不 同 的 选 择 性 或 需 要 达 到 更 出 色 的 分 离 度 时, 必 须 连 接 或 移 除 色 谱 柱 柱 温 箱 通 常 还 可 容 纳 多 根 色 谱 柱 和 / 或 阀, 以 支 持 自 动 化 的 方 法 开 发 色 谱 柱 切 换 富 集 或 交 替 色 谱 柱 再 生 等 功 能 为 确 保 柱 温 箱 便 于 用 户 操 作, 以 及 避 免 安 装 色 谱 柱 时 出 错 ( 如 产 生 死 体 积 或 导 致 泄 漏 ), 易 用 性 具 有 重 要 的 意 义 Agilent 1290 Infinity II 高 容 量 柱 温 箱 的 灵 活 性 和 易 用 性 Agilent 1290 Infinity II 高 容 量 柱 温 箱 让 用 户 在 几 秒 钟 内 即 可 轻 松 安 装 色 谱 柱 热 交 换 器 和 带 有 多 根 毛 细 管 的 阀 Agilent A-line Quick Connect 快 速 连 接 色 谱 柱 接 头 避 免 了 在 色 谱 柱 连 接 中 意 外 引 入 微 小 泄 漏 点 的 可 能 性 检 测 器 感 知 器 官 液 相 色 谱 系 统 中 可 整 合 各 种 类 型 的 检 测 器 最 常 用 的 检 测 器 类 型 是 光 吸 收 型 检 测 器 荧 光 检 测 器 示 差 折 光 检 测 器 蒸 发 光 散 射 检 测 器 和 质 谱 检 测 器 本 章 将 重 点 介 绍 光 吸 收 型 检 测 器, 因 为 超 过 三 分 之 二 的 液 相 色 谱 系 统 都 采 用 此 类 检 测 器 不 同 类 型 的 检 测 器 在 灵 敏 度 选 择 性 和 线 性 范 围 方 面 各 有 差 异 灵 敏 度 定 义 了 检 测 器 可 检 出 的 最 低 化 合 物 浓 度 选 择 性 决 定 了 检 测 器 对 特 定 化 合 物 的 特 异 性 线 性 范 围 是 特 定 化 合 物 的 一 个 浓 度 范 围, 在 该 范 围 内 检 测 器 可 提 供 线 性 的 响 应 信 号 检 测 器 还 分 为 破 坏 性 检 测 器 和 无 损 检 测 器 紫 外 吸 收 检 测 器 荧 光 检 测 器 和 示 差 折 光 检 测 器 属 于 无 损 检 测 器 通 过 检 测 池 的 化 合 物 将 保 持 其 完 整 性, 并 且 可 以 进 行 回 收 相 反, 蒸 发 光 散 射 检 测 器 和 质 谱 检 测 器 则 属 于 破 坏 性 检 测 器, 因 为 化 合 物 在 检 测 过 程 中 将 被 破 坏 通 过 紫 外 吸 收 光 度 法 进 行 定 量 分 析 的 基 础 是 朗 伯 - 比 尔 定 律 吸 光 度 A 是 通 过 洗 脱 介 质 前 后 的 光 强 度 对 数 之 比, 它 与 吸 光 化 合 物 的 浓 度 C 光 程 d 和 摩 尔 吸 光 系 数 [ 的 乘 积 成 正 比 l0l=a=[cd 现 代 HPLC 和 UHPLC 中 应 用 最 广 泛 的 检 测 器 类 型 是 基 于 对 紫 外 线 (UV) 和 可 见 光 的 吸 收 此 类 检 测 器 对 许 多 化 合 物 具 有 较 高 的 灵 敏 度, 但 前 提 是 化 合 物 必 须 能 够 吸 收 190 nm 至 600 nm 范 围 内 的 紫 外 或 可 见 光 24

27 光 吸 收 型 检 测 器 可 采 用 两 种 光 学 技 术 第 一 种 是 采 用 直 接 光 学 元 件, 具 有 目 标 波 长 的 光 将 通 过 检 测 池, 然 后 由 单 个 光 电 二 极 管 捕 获 产 生 的 光 线 配 备 直 接 光 学 元 件 的 光 吸 收 型 检 测 器 被 称 为 固 定 波 长 检 测 器, 见 图 10 第 二 种 是 采 用 反 向 光 学 元 件, 波 长 在 190 nm 至 600 nm 内 的 所 有 光 线 都 将 通 过 流 通 池 产 生 的 光 线 将 由 光 栅 分 离 为 其 组 成 波 长, 然 后 由 光 电 二 极 管 阵 列 采 集 所 得 的 光 谱 信 息 配 备 反 向 光 学 元 件 和 光 电 二 极 管 阵 列 的 光 吸 收 型 检 测 器 被 称 为 二 极 管 阵 列 检 测 器, 见 图 11 二 极 管 阵 列 检 测 器 不 仅 能 够 在 多 个 波 长 下 进 行 检 测, 还 能 生 成 UV 光 谱 用 于 明 确 鉴 定 特 定 的 化 合 物 氘 灯 滤 光 片 组 件 狭 缝 镜 1 光 栅 镜 2 样 品 二 极 管 流 通 池 分 束 器 参 考 二 极 管 检 测 器 (VWD) MCT 图 10. 配 备 直 接 光 学 元 件 的 可 变 波 长 检 测 器 的 检 测 原 理 光 栅 狭 缝 二 极 管 阵 列 氘 灯 流 通 池 检 测 器 (DAD) MCT 图 11. 配 备 反 向 光 学 元 件 的 二 极 管 阵 列 检 测 器 的 检 测 原 理 25

28 检 测 器 灵 敏 度 检 测 限 (LOD) 是 指 信 号 能 够 与 检 测 器 噪 音 区 分 的 最 低 化 合 物 浓 度, 见 图 12 LOD 取 决 于 信 号 高 度 和 检 测 器 噪 音, 并 且 根 据 其 比 值 进 行 计 算 :H 信 号 = 3 h 噪 音 信 号 噪 音 图 12. 配 备 直 接 光 学 元 件 的 可 变 波 长 检 测 器 的 检 测 原 理 在 UV 检 测 中, 信 号 高 度 取 决 于 化 合 物 特 有 的 吸 光 系 数 光 程 峰 扩 散 和 检 测 波 长 检 测 器 噪 音 取 决 于 许 多 因 素, 例 如, 光 强 度 泵 脉 动 电 子 元 件 噪 音 数 据 采 集 速 率 RI 效 应 温 度 流 速 和 流 通 池 设 计 增 加 光 程 而 保 持 流 通 池 内 部 体 积 不 变, 同 时 尽 可 能 保 持 最 低 水 平 的 检 测 器 噪 音, 可 获 得 最 高 的 灵 敏 度 与 老 式 流 通 池 ( 检 测 池 的 流 路 通 常 采 用 锥 形 设 计 ) 相 比, 现 代 检 测 器 配 备 的 流 通 池 已 经 能 够 实 现 全 内 反 射 线 性 范 围 当 您 需 要 在 较 宽 的 浓 度 范 围 内 进 行 定 量 分 析 时, 检 测 器 的 线 性 范 围 非 常 重 要 当 目 标 化 合 物 具 有 显 著 不 同 的 浓 度 和 UV 响 应 时, 线 性 范 围 也 非 常 重 要 在 分 析 含 有 大 量 主 要 组 分 和 微 量 杂 质 的 样 品 时 可 能 会 遇 到 上 述 情 况 对 于 此 类 样 品, 我 们 必 须 同 时 采 集 所 有 化 合 物 的 定 量 信 息 目 前 的 液 相 色 谱 UV 检 测 器 具 有 4 到 5 个 数 量 级 的 线 性 范 围 使 用 可 在 单 次 分 析 中 定 量 分 析 低 浓 度 和 高 浓 度 化 合 物 的 检 测 方 案 可 显 著 扩 展 这 一 线 性 范 围 该 方 法 有 助 于 同 时 定 量 分 析 主 要 组 分 微 量 组 分 及 其 杂 质 ( 如 固 定 剂 量 复 方 药 ) 由 于 无 需 进 行 系 列 稀 释 和 多 次 运 行, 可 节 省 大 量 时 间 和 成 本 26

29 数据采集速率 数据采集速率是检测器每秒能够采集的数据点的数量 常规 UV 检测器的数据采集速率高达 20 Hz 足以用 于标准 HPLC 分析 但 UHPLC 分析要求更高的数据采集速率 因为它需要在快速运行中对窄峰进行精确的定 量分析 配备最大光强流通池的安捷伦二极管阵列检测器 安捷伦最大光强高灵敏度流通池采用了光流波导技术 尽管光程达 60 mm 但扩散体积仅为 4 µl 见图 13 Agilent 1290 Infinity II 二极管阵列检测器采用了这种流通池 因此其灵敏度比之前的检测器高出 10 倍 见图 14 Agilent 1290 Infinity II 二极管阵列检测器的另一个功能是能够以 240 Hz 的速率采集数据 可确保在仅耗时几秒的快速运行中获得出 色的定量结果 安捷伦高动态范围检测解决方案显著扩展了线性检测范围 见图 15 通过结合分别具有短光程和长光 程的两个检测器 该解决方案通过单次分析即可同时定量分析低浓度和高浓度样品组分 灵敏度比之前的型号高 n 倍 图 13. 配备最大光强流通池的 1260/1290 Infinity DAD 中的光流波导 1050 系列 1100 系列 1200 系列 图 14. DAD 检测灵敏度的发展史 1260/1290 Infinity DAD 的问 世将灵敏度提高了 10 倍以上 灵敏度提高 30 倍 检测器噪音低 10 倍 线性水平的上限提高了 3 倍 信号 0倍 了3 宽 围拓 AD RD D 将H 性范 的线 之前的 DAD 浓度 图 15. 利用 1200 Infinity 系列 DAD-HDR 解决方案扩展线性范围 27

30 HPLC 柱 的 选 择 色 谱 柱 的 选 择 一 半 是 科 学, 一 半 是 艺 术 我 们 之 所 以 这 么 说, 是 因 为 这 里 有 一 些 确 定 的 明 了 标 准 : 与 应 用 相 适 合 的 色 谱 柱 固 定 相 与 系 统 压 力 限 相 适 应 的 规 格 等 等 在 多 数 情 况 下, 预 定 义 方 法 可 能 规 定 了 特 定 的 固 定 相 或 色 谱 柱 规 格, 所 以, 选 择 色 谱 柱 必 须 符 合 这 些 规 格, 确 保 来 自 可 靠 的 高 质 量 色 谱 柱 供 应 商 ( 我 们 推 荐 安 捷 伦, 您 也 可 以 选 择 别 的 品 牌 ) 此 外, 方 法 开 发 可 能 更 有 技 巧, 在 这 个 过 程 中 要 测 试 各 种 固 定 相 和 流 动 相 的 性 能, 以 获 得 符 合 您 应 用 需 求 的 选 择 性 本 节 首 先 要 回 顾 一 些 基 本 概 念 : HPLC 模 式 常 见 的 HPLC 柱 填 料 接 下 来, 我 们 再 来 专 门 讨 论 现 在 最 常 用 的 主 要 色 谱 柱 类 型 及 其 特 点 : HPLC 柱 UHPLC 柱 表 面 多 孔 填 料 柱 LC/MS 柱 凝 胶 渗 透 色 谱 (GPC) 柱 体 积 排 阻 色 谱 (SEC) 柱 和 凝 胶 过 滤 色 谱 (GFC) 柱 生 物 表 征 色 谱 柱 28

31 我 们 还 将 解 释 一 些 关 键 柱 参 数 的 重 要 性 : 填 料 硅 胶 键 合 相 聚 合 物 孔 径 粒 径 柱 规 格 在 本 节 的 最 后, 我 们 将 对 现 有 卡 套 式 色 谱 柱 进 行 概 要 介 绍, 包 括 保 护 柱 半 制 备 柱, 以 及 制 备 和 生 产 柱 本 节 资 料 应 与 包 含 更 多 色 谱 柱 固 定 相 和 选 择 性 信 息 的 方 法 开 发 一 节 ( 第 61 页 ) 中 色 谱 柱 选 择 部 分 结 合 使 用 HPLC 模 式 在 开 始 评 估 色 谱 柱 之 前, 最 重 要 的 工 作 是 要 确 定 HPLC 模 式 目 前 有 很 多 常 用 的 HPLC 模 式 或 技 术 : 反 相 HILIC 正 相 离 子 交 换 体 积 排 阻 调 查 显 示, 一 般 而 言 95% 的 色 谱 工 作 者 都 在 其 工 作 中 使 用 反 相 色 谱, 基 于 这 一 原 因, 本 手 册 将 把 这 项 技 术 作 为 重 点 除 此 之 外, 本 手 册 也 会 涉 及 其 它 的 技 术, 指 出 其 主 要 差 别, 并 介 绍 获 取 更 多 信 息 的 来 源 如 需 了 解 各 种 模 式 之 间 差 异 的 更 多 信 息, 请 参 见 第 页 29

32 色 谱 柱 选 择 的 基 本 信 息 : 常 规 柱 液 相 色 谱 柱 采 用 不 锈 钢 或 聚 合 物 制 成, 也 有 极 为 罕 见 的 玻 璃 柱, 柱 中 填 充 键 合 硅 胶 或 聚 合 物 填 料 有 多 种 尺 寸 规 格 可 供 选 择, 以 适 应 色 谱 工 作 者 及 其 使 用 的 不 同 需 求 从 用 于 高 通 量 LC/MS 的 短 柱 窄 径 柱, 到 50 mm 内 径 的 制 备 柱, 制 备 柱 填 充 内 径 最 大 可 达 600 mm, 适 用 于 小 规 模 制 备 放 大 和 生 产 色 谱 柱 规 格 影 响 着 灵 敏 度 和 柱 效, 决 定 着 柱 载 样 量 例 如, 小 内 径 色 谱 柱 与 大 内 径 柱 相 比, 提 高 了 灵 敏 度, 但 降 低 了 载 样 量 现 代 不 锈 钢 分 析 柱 (1 到 4.6 mm 内 径,20 到 250 mm 柱 长 ) 使 用 非 常 低 或 零 死 体 积 的 接 头 色 谱 柱 填 料 被 柱 两 端 的 不 锈 钢 筛 板 挡 住 来 自 HPLC 的 液 流 入 口 筛 板 HPLC 柱 ( 灰 色 ) 出 口 筛 板 液 流 流 出 至 检 测 器 硅 胶 填 料 图 16. 色 谱 柱 示 意 图 液 流 方 向 色 谱 柱 结 构 材 料 HPLC 色 谱 柱 类 型 色 谱 柱 内 径 (mm) 填 料 类 型 填 料 粒 径 (µm) 应 用 不 锈 钢 分 析 柱 硅 胶, 聚 合 物 传 统 定 量 分 析 分 析 型 溶 剂 节 省 柱 3 硅 胶 降 低 溶 剂 消 耗 分 析 型 窄 径 柱 硅 胶 降 低 溶 剂 消 耗 分 析 型 微 径 柱 1 硅 胶, 聚 合 物 3-5 提 高 灵 敏 度, 可 分 析 ng 到 µg 的 样 品 分 析 型 毛 细 管 柱 硅 胶, 聚 合 物 3-5 可 分 析 pg 到 ng 的 样 品 分 析 型 纳 升 柱 硅 胶, 聚 合 物 3 可 分 析 < 1 pg 的 样 品 制 备 或 半 制 备 柱 硅 胶, 聚 合 物 5-50 样 品 纯 化 表 4. 液 相 色 谱 柱 的 一 些 性 能 指 标 转 下 页 30

33 色 谱 柱 结 构 材 料 色 谱 柱 类 型 色 谱 柱 内 径 (mm) 填 料 类 型 填 料 粒 径 (µm) 应 用 LC/MS UHPLC/MS 不 锈 钢 分 析 柱 3 硅 胶 与 安 捷 伦 MS 流 量 匹 配 的 良 好 选 择 分 析 型 窄 径 柱 和 微 径 柱 硅 胶, 聚 合 物 需 要 更 高 选 择 性 或 需 要 特 殊 检 测 器 时 石 英 分 析 型 毛 细 管 柱 硅 胶, 聚 合 物 使 用 MS 检 测 器 UHPLC 不 锈 钢 分 析 柱 4.6 Silica 分 析 型 溶 剂 节 省 柱 3 Silica 分 析 型 窄 径 柱 2.1 Silica 用 于 所 有 快 速 和 高 分 离 度 的 分 析 应 用 制 备 柱 不 锈 钢 制 备 柱 聚 合 物 化 合 物 分 离 生 产 柱 不 锈 钢 生 产 柱 10 cm 到 聚 合 物 化 合 物 生 产 100 cm 注 : 某 些 生 物 HPLC 柱 提 供 PEEK 管 线, 确 保 样 品 流 路 中 无 金 属 使 用 ZORBAX 快 速 分 离 高 通 量 (RRHT) 1.8 µm 色 谱 柱 以 及 Poroshell µm 色 谱 柱, 压 力 上 限 可 达 600 bar 使 用 ZORBAX 超 高 压 快 速 高 分 离 度 (RRHD) 色 谱 柱,1.8 µm, 压 力 上 限 可 达 1300 bar 高 效 液 相 色 谱 (HPLC) 柱 硅 胶 是 正 相 HPLC 常 用 的 固 定 相, 也 是 许 多 化 学 键 合 固 定 相 的 支 持 剂 硅 胶 表 面 覆 盖 着 强 极 性 的 硅 醇 基, 在 非 极 性 流 动 相 中 与 样 品 分 子 发 生 相 互 作 用, 也 可 以 作 为 化 学 键 合 的 反 应 位 点 正 相 HPLC 适 用 于 在 水 中 不 溶 解 的 分 析 物 和 有 机 正 相 溶 剂, 与 反 相 HPLC 中 常 用 的 某 些 缓 冲 液 相 比, 对 质 谱 更 为 友 好 但 是, 这 种 技 术 有 时 保 留 时 间 的 重 现 性 较 差, 因 为 水 或 质 子 有 机 溶 剂 ( 含 有 氢 氧 键 或 氮 氢 键 ) 改 变 了 硅 胶 的 水 合 状 态 反 相 HPLC 中 就 不 会 发 生 这 种 问 题, 因 此 成 为 了 主 要 的 HPLC 技 术 在 反 相 色 谱 系 统 中, 硅 胶 颗 粒 被 化 学 改 性 为 非 极 性 或 疏 水 性, 流 动 相 采 用 极 性 液 体 31

34 UHPLC 柱 超 高 压 液 相 色 谱 (UHPLC) 一 般 指 在 超 过 400 bar (6000 psi) 压 力 ( 这 一 压 力 是 过 去 几 十 年 来 常 见 的 最 大 系 统 操 作 压 力 ) 下 操 作 的 液 相 色 谱 通 常,UHPLC 柱 装 填 小 粒 径 填 料 (< 3 µm), 与 常 规 HPLC 柱 填 充 的 3 到 5 µm 填 料 相 比, 在 速 度 分 离 度 和 柱 效 方 面 有 很 大 优 势 但 是, 从 压 力 方 程 ( 第 9 页 的 方 程 6) 可 以 看 出, 填 料 粒 径 越 小, 流 动 相 通 过 色 谱 柱 所 需 要 的 反 压 就 越 大, 因 此,UHPLC 柱 采 用 了 在 400 bar (6000 psi) 以 上 压 力 下 工 作 的 设 计 安 捷 伦 为 UHPLC 提 供 了 三 种 类 型 的 色 谱 柱 : 在 600 bar 以 内 操 作 的 ZORBAX 快 速 分 离 高 通 量 (RRHT) 1.8 µm 粒 径 柱 填 充 2.7 µm 表 面 多 孔 填 料 的 Poroshell 120 柱 ( 也 可 以 在 600 bar 以 内 操 作 ) 和 ZORBAX 超 高 压 快 速 高 分 辨 率 (RRHD) 1.8 µm 柱, 在 1300 bar 下 稳 定 UHPLC 可 以 得 到 非 常 快 的 分 离 速 度 一 般 情 况 下, 10 分 钟 之 内 完 成 的 UHPLC 分 离 为 快 速,1 分 钟 内 完 成 的 分 离 常 称 为 超 快 速 另 一 方 面, 使 用 1.8 µm 填 料 UHPLC 柱, 提 高 了 柱 效 和 峰 容 量 分 析 柱 最 长 150 mm, 内 径 最 大 4.6 mm 现 在 可 以 获 得 差 不 多 300% 的 峰 容 量, 这 对 于 改 善 从 新 药 发 现 到 食 品 安 全 和 环 境 应 用 ( 如 农 药 筛 查 ) 中 的 许 多 复 杂 分 离 非 常 有 用 ZORBAX 超 高 压 快 速 高 分 辨 率 (RRHD) 柱 表 面 多 孔 填 料 柱 近 来 表 面 多 孔 填 料 (SPP) 柱 在 小 粒 径 填 料 中 比 早 先 的 薄 壳 型 填 料 柱 更 受 青 睐 如 图 17 所 示,Agilent Poroshell µm 填 料 包 括 一 个 实 心 核 ( 直 径 1.7 µm) 和 覆 盖 在 外 的 多 孔 硅 胶 层 ( 厚 0.5 µm) Poroshell 120 与 常 规 全 多 孔 柱 相 比, 能 够 为 色 谱 工 作 者 提 供 方 法 开 发 的 明 显 优 势 由 于 扩 散 仅 发 生 在 多 孔 外 壳, 而 实 心 核 没 有, 所 以 与 同 样 粒 径 的 全 多 孔 填 料 相 比, 柱 效 有 所 提 高 事 实 上,2.7 µm SPP 可 提 供 能 与 1.8 µm 全 多 孔 颗 粒 色 谱 柱 媲 美 的 柱 效, 而 4 µm SPP 的 柱 效 大 约 是 全 多 孔 5 µm 颗 粒 色 谱 柱 的 两 倍 由 于 压 力 间 接 地 与 粒 径 成 比 例, 因 此 粒 径 较 大 的 2.7 µm SPP 色 谱 柱 产 生 的 压 力 远 低 于 亚 2 µm 色 谱 柱, 让 色 谱 工 作 者 能 够 提 高 流 速 并 加 快 分 析 速 度, 同 时 获 得 出 色 的 分 离 度 Poroshell 120 柱 装 配 2 µm 筛 板, 这 一 点 非 常 重 要, 这 样 使 其 对 于 较 脏 的 样 品 具 有 更 高 的 忍 耐 性, 而 不 会 像 装 配 更 小 筛 板 的 色 谱 柱 那 样 容 易 堵 塞 样 品 过 滤 32

35 1.7 µm 实心核 0.5 µm 多孔壳 图 17. Poroshell µm 填料 生物分子 例如蛋白质和肽 的分离具有一定的挑战性 因为它们扩散较慢 所以我们通常都必须保持较低 的流速以防止峰展宽 安捷伦提供多种基于表面多孔颗粒的色谱柱 Poroshell µm 颗粒 0.25 µm 多孔层 300Å 孔径 AdvanceBio RP-mAb 3.5 µm 颗粒 0.25 µm 多孔层 450Å 孔径 AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 2.7 µm 颗粒 0.5 µm 多孔层 120Å 孔径 AdvanceBio 糖谱分析色谱柱 2.7 µm 颗粒 0.5 µm 多孔层 120Å 孔径 AdvanceBio 寡核苷酸色谱柱 2.7 µm 颗粒 0.5 µm 多孔层 100Å 孔径 该技术缩短了扩散距离 能够对 500 Da 至 1000 kda 的生物分子进行快速 HPLC 分离 LC/MS 柱 根据不同的样品类型 有许多种色谱柱适用于 LC/MS 对于简单的分析样品 使用短柱 高分离度 可以 缩短分析时间 实现高通量 LC/MS 如果需要更高分离度 则可使用较长的色谱柱 流速也是影响色谱柱选择的因素 LC/MS 系统一般操作流速范围为 1 µl/min 到 1 ml/min 因而 要进行高 灵敏度 快速分析 宜选择较小内径柱 如安捷伦的溶剂节省柱 3.0 mm 内径 窄径柱 2.1 mm 内径 和毛细管柱与纳流柱 见第 29 页 表 4 键合相的最好选择是高效并封端的 C18 键合相 在宽 ph 范围内稳定 与 LC/MS 使用的挥发性流 动相添加剂 包括甲酸和乙酸 兼容 Agilent 6400 系列三重四极杆液质联用系统是药物 ADME/DMPK 研究 生物标记物验证 临床研究 食品安全 法医学 毒理学以及环境分析的定量领 域的可靠选择 Agilent 6400 系列三重四极杆液质联用系统 33

36 凝 胶 渗 透 色 谱 (GPC) 柱 体 积 排 阻 色 谱 柱 (SEC) 柱 和 凝 胶 过 滤 色 谱 (GFC) 柱 以 分 子 大 小 为 基 础 的 分 离 通 常 采 用 体 积 排 阻 色 谱 (SEC) 进 行 这 种 色 谱 类 型 在 分 离 聚 合 物, 包 括 生 物 聚 合 物 时 使 用 通 常 用 来 表 征 聚 合 物 分 子 量 及 分 子 量 分 布 色 谱 柱 一 般 采 用 不 锈 钢, 填 充 凝 胶, 交 联 键 合 聚 合 物 或 孔 径 经 过 严 格 控 制 的 硅 胶 颗 粒 分 离 机 理 与 其 他 色 谱 类 型 不 同, 溶 质 颗 粒 与 固 定 相 间 不 应 有 化 学 相 互 作 用, 而 是 依 据 分 子 在 溶 液 中 的 大 小 而 进 行 的 我 们 用 凝 胶 渗 透 色 谱 (GPC) 描 述 有 机 聚 合 物 ( 如 塑 料 ) 在 有 机 溶 剂 中 的 分 离, 而 使 用 水 相 SEC 描 述 主 要 使 用 水 相 流 动 相 对 水 溶 性 有 机 聚 合 物 ( 如 聚 乙 烯 醇 ) 和 水 溶 性 生 物 聚 合 物 ( 如 蛋 白 质 核 酸 和 多 糖 ) 进 行 的 分 离 凝 胶 过 滤 色 谱 (GFC) 以 前 用 来 描 述 生 物 聚 合 物 ( 如 蛋 白 质 ) 在 低 压 下 的 分 离 GPC/SEC 仪 器 色 谱 柱 和 标 准 品 我 们 向 您 推 荐 GPC/SEC 的 综 合 指 南, 安 捷 伦 的 凝 胶 渗 透 色 谱 和 体 积 排 阻 色 谱 说 明 ( 出 版 号 EN) 生 物 表 征 柱 生 物 色 谱 柱, 或 生 物 柱, 是 分 离 生 物 化 合 物 ( 如 蛋 白 质 和 多 肽 寡 核 苷 酸 和 多 聚 核 苷 酸, 以 及 其 它 生 物 分 子 和 复 合 物, 包 括 病 毒 颗 粒 ) 的 色 谱 柱 生 物 柱 在 设 计 上 大 大 减 少 或 消 除 了 样 品 与 填 料 之 间 的 不 可 逆 或 非 特 异 性 结 合, 并 保 留 了 其 生 物 功 能 ( 酶 活 性 ) 通 常, 在 生 物 柱 上 样 品 不 能 与 活 性 金 属 接 触 因 此 生 物 柱 可 以 用 聚 合 物 ( 如 PEEK) 石 英 和 玻 璃 内 衬 不 锈 钢 或 外 镀 金 属 部 件 制 成, 以 使 色 谱 柱 具 有 生 物 兼 容 性 生 物 色 谱 柱 系 列 34

37 色 谱 柱 特 性 硅 胶 硅 胶 是 理 想 的 色 谱 填 料, 数 十 年 来 是 键 合 相 HPLC 柱 的 主 要 基 础 填 料 硅 胶 为 刚 性 颗 粒, 可 抵 抗 液 流 造 成 的 挤 压, 当 填 料 粒 径 在 5 µm 或 更 低 时, 需 要 加 更 高 压 力 的 情 况 下 显 得 尤 为 重 要 其 极 大 的 比 表 面 积 能 够 满 足 HPLC 和 UHPLC 所 需 的 吸 附 容 量, 填 料 表 面 的 硅 醇 基 或 Si-OH 基 团 是 功 能 性 碳 链 的 理 想 键 合 位 点 毫 不 奇 怪, 用 作 柱 填 料 的 硅 胶 颗 粒 有 各 种 粒 径 纯 度 和 酸 性 最 现 代 的 填 料 是 B 型 硅 胶, 痕 量 金 属 含 量 极 低, 比 以 前 的 A 型 硅 胶 酸 性 更 低 低 酸 性 硅 胶 意 味 着 碱 性 分 析 物 与 硅 胶 表 面 硅 醇 基 的 相 互 作 用 更 小, 有 助 于 改 善 峰 形 用 高 纯 度 硅 胶 制 成 的 色 谱 柱, 是 目 前 色 谱 工 作 者 最 常 选 择 的 柱 子 键 合 相 反 相 色 谱 最 常 用 的 键 合 相 是 C18( 十 八 烷 基 硅 烷 化,ODS) 这 只 是 硅 胶 颗 粒 表 面 众 多 连 接 烷 烃 或 碳 链 类 型 的 一 种 其 它 常 用 的 线 性 烷 烃 硅 烷 化 固 定 相 选 择 还 有 C8 和 C4 苯 基, 包 括 苯 基 己 基 与 联 苯 和 AQ CN 以 及 PFP 固 定 相, 能 够 提 供 与 直 链 烷 烃 固 定 相 明 显 不 同 的 选 择 性, 以 实 现 成 功 分 离 还 有 不 断 增 加 的 针 对 某 些 高 水 相 流 动 相 或 其 它 应 用 的 键 合 相 选 择 一 般 来 说, 较 大 的 溶 质, 如 蛋 白 质, 最 好 用 键 合 到 大 孔 硅 胶 ( 孔 径 :300Å) 的 短 链 反 相 柱 (C3 CN 二 醇 ) 分 离 多 肽 和 小 分 子 用 长 链 柱 (C8 C18) 分 离 但 在 许 多 情 况 下, 这 种 规 律 并 不 适 用 因 此, 最 好 在 开 始 时 选 择 处 于 疏 水 谱 中 间 位 置 的 固 定 相 ( 如 C8), 然 后 根 据 初 步 分 离 结 果 和 样 品 的 溶 解 性, 再 采 用 疏 水 性 更 强 或 亲 水 性 更 强 固 定 相 还 可 以 考 虑 其 它 选 择, 如 离 子 交 换 凝 胶 过 滤 / 体 积 排 阻 或 HILIC 色 谱 我 们 将 在 后 面 第 页 讨 论 这 些 内 容 聚 合 物 当 需 要 在 非 常 低 和 高 的 ph 下 使 用 色 谱 柱 时, 除 了 硅 胶 基 质 填 料 还 可 以 选 择 聚 合 物 填 料 聚 合 物 填 料 是 小 规 模 色 谱 分 析 的 理 想 选 择, 特 别 是 LC/MS, 因 为 其 化 学 性 质 稳 定, 不 会 出 现 可 溶 性 物 质 或 发 生 沉 淀 例 如, RLRP-S 柱 中 所 用 的 反 相 球 形 聚 合 物 填 料, 是 以 带 天 然 疏 水 性 表 面 的 聚 苯 乙 烯 / 二 乙 烯 基 苯 共 聚 物 为 基 质 的 用 聚 合 物 颗 粒 作 为 反 相 色 谱 填 料 不 需 要 键 合 相 对 这 种 刚 性 的 多 孔 颗 粒 可 以 进 行 涂 层 和 衍 生 化, 加 上 各 种 功 能 基, 包 括 弱 和 强 阳 离 子 和 阴 离 子 交 换 剂 35

38 孔 径 孔 径 的 选 择 取 决 于 待 分 析 组 分 的 分 子 量 对 于 小 分 子 的 反 相 分 离, 选 择 小 孔 径 (60-120Å) 填 料 柱 对 于 小 分 子 和 多 肽, 使 用 Å, 对 于 聚 合 多 肽 和 多 数 蛋 白 质 选 择 Å 和 1000Å, 对 于 分 子 量 很 高 的 蛋 白 和 疫 苗 选 择 4000Å 对 于 GPC/SEC 分 离, 分 离 的 分 子 量 范 围 一 般 会 和 孔 径 信 息 一 起 给 出, 以 便 选 择 合 适 的 色 谱 柱 这 些 信 息 与 色 谱 柱 选 择 一 起 列 于 表 中 粒 径 HPLC 柱 在 很 长 的 一 段 时 期 内 都 采 用 5 µm 作 为 标 准 粒 径, 直 到 二 十 世 纪 九 十 年 代 中 期 3.5 µm 粒 径 柱 才 在 方 法 开 发 中 得 以 广 泛 使 用 近 来, 随 着 对 更 快 速 度 和 / 或 更 高 分 离 度 需 求 的 增 加, 色 谱 工 作 者 开 始 使 用 填 充 亚 2-3 µm 粒 径 填 料, 包 括 安 捷 伦 生 产 的 1.8 µm 填 料 使 用 这 些 填 料 可 在 更 短 的 色 谱 柱 上 获 得 更 快 的 高 分 离 度 分 离 3.5 µm 粒 径 柱 是 在 常 规 操 作 压 力 下 操 作 的, 可 以 在 所 有 液 相 色 谱 仪 上 使 用, 包 括 400 bar 操 作 压 力 上 限 的 仪 器 1.8 µm 短 柱 (50 mm 及 更 短 ) 可 以 在 优 化 的 标 准 液 相 色 谱 仪 上 使 用, 而 长 柱 则 需 要 更 高 压 力 的 液 相 色 谱 仪 ( 如, 快 速 分 离 液 相 色 谱 或 UHPLCs), 在 600 到 1300 bar 压 力 范 围 下 操 作 近 来, 我 们 开 发 了 更 新 的 技 术 ( 如 表 面 多 孔 填 料 ), 性 能 类 似 于 亚 2 µm 柱, 但 产 生 的 反 压 较 低, 从 而 使 其 能 够 在 常 规 HPLC 上 使 用 ( 表 面 多 孔 填 料, 见 第 31 页 ) 如 果 色 谱 柱 的 填 料 粒 径 减 小 一 半, 塔 板 数 将 增 加 一 倍 ( 假 设 柱 长 保 持 不 变 ) 但 如 果 粒 径 减 半, 柱 反 压 则 将 增 大 4 倍 (~1/d 2 p ) 如 果 柱 长 加 倍, 塔 板 数 和 分 析 时 间 也 会 加 倍 随 着 柱 长 增 加, 反 压 将 呈 线 性 增 加 例 如, 一 根 填 充 3.5 µm 填 料 的 2.1 x 100 mm 柱, 理 论 塔 板 数 大 约 为 , 这 一 柱 效 足 以 使 许 多 样 品 得 到 分 离 如 果 将 粒 径 从 3.5 µm 减 小 到 1.8 µm, 同 样 是 2.1 x 100 mm 柱, 其 柱 效 将 增 加 一 倍, 约 为 理 论 塔 板 数 但 是, 该 色 谱 柱 产 生 的 反 压 将 比 填 充 3.5 µm 填 料 的 柱 子 大 4 倍 我 们 通 常 并 不 需 要 塔 板 数 的 色 谱 柱, 所 以, 可 以 把 柱 长 减 半 到 50 mm, 得 到 期 望 的 塔 板 数 柱 效 用 这 种 较 短 的 色 谱 柱, 分 析 时 间 将 缩 短 一 半, 反 压 也 仅 为 3.5 µm 填 料 粒 径 100 mm 色 谱 柱 的 两 倍 36

39 色 谱 柱 规 格 多 年 来, 用 于 分 析 方 法 开 发 推 荐 最 多 的 色 谱 柱 规 格 都 是 5 µm 填 料 粒 径 的 4.6 x 150 mm 或 4.6 x 100 mm 色 谱 柱 如 果 需 要 更 高 的 分 离 度, 则 推 荐 使 用 4.6 x 250 mm 色 谱 柱 但 现 在 随 着 色 谱 柱 选 择 范 围 的 扩 大, 我 们 推 荐 使 用 3.5 µm 4.6 x 100 mm 色 谱 柱, 或 2.7 µm 表 面 多 孔 填 料 色 谱 柱 作 为 分 析 方 法 开 发 的 起 点 在 方 法 开 发 过 程 中, 色 谱 柱 内 径 ( 如 2.1 或 3.0 mm) 的 选 择 也 要 适 应 应 用 目 标 ( 如 灵 敏 度 溶 剂 消 耗 ) 或 与 某 些 仪 器 类 型 相 兼 容 ( 毛 细 管 纳 流 或 制 备 柱 ) 当 需 要 提 高 灵 敏 度 或 样 品 量 极 为 有 限 时, 使 用 纳 流 柱 毛 细 管 柱 或 微 径 柱 样 品 量 低 于 1 pg 时, 使 用 纳 流 柱, 流 速 为 nl/min 样 品 量 在 pg 到 ng 范 围 内 时, 使 用 毛 细 管 柱, 流 速 为 4 µl/min 左 右 样 品 量 为 ng 到 µg 时, 使 用 微 径 柱, 流 速 一 般 为 40 µl/min 左 右 应 用 目 标 柱 内 径 (mm) 极 高 灵 敏 度 LC/MS 多 肽 和 蛋 白 质 0.1, 极 高 灵 敏 度 样 品 量 有 限 LC/MS 多 肽 和 蛋 白 质 0.3, 0.5 高 灵 敏 度 样 品 量 有 限 LC/MS 1.0 节 省 溶 剂 ; 特 殊 的 低 体 积 仪 器 2.1 特 殊 检 测 器, 如 MS 2.1 高 灵 敏 度 样 品 量 有 限 2.1 节 省 溶 剂 ; 标 准 HPLC 仪 器 LC/MS 3.0 标 准 分 离 4.6 小 规 模 (mg) 制 备 性 分 离 9.4 中 等 规 模 制 备 分 离 (100 mg 到 g) 或 半 制 备 21.2 大 规 模 实 验 室 制 备 性 分 离 ( 最 多 100 g) 30, 50 中 试 和 生 产 100 mm 到 1 m 表 5. 应 用 与 柱 内 径 在 需 要 建 立 常 规 方 法 时, 应 考 虑 将 柱 尺 寸 降 至 分 析 方 法 和 仪 器 可 容 许 的 最 小 规 格 ; 较 小 的 色 谱 柱 通 常 价 格 比 较 便 宜, 溶 剂 消 耗 也 较 少 在 某 些 例 子 中, 如 果 柱 尺 寸 减 小 一 半, 灵 敏 度 将 提 高 4 到 5 倍 ( 假 设 进 样 质 量 保 持 不 变 ) 例 如, 在 优 化 的 液 相 色 谱 上, 使 用 2.1 mm 内 径 柱 进 样 时, 色 谱 峰 的 峰 高 将 比 使 用 4.6 mm 内 径 柱 及 同 样 进 样 量 时 提 高 3 到 5 倍 如 果 仪 器 针 对 低 体 积 柱 进 行 了 优 化, 只 要 保 持 流 量 线 速 度 不 变, 减 少 色 谱 柱 直 径 不 会 对 柱 效 理 论 塔 板 数 反 压 带 来 明 显 影 响 37

40 用 不 同 的 方 法 开 发 柱 数 据, 可 以 很 容 易 计 算 出 较 短 色 谱 柱 是 否 能 得 到 与 长 柱 同 样 的 结 果 通 过 简 单 计 算 得 出 的 结 论 将 为 您 节 省 大 量 时 间 可 以 使 用 安 捷 伦 的 方 法 转 换 软 件 ( 登 录 搜 索 LC 方 法 转 换 软 件 ) 帮 助 您 完 成 计 算 卡 套 柱 系 统 卡 套 柱 芯 是 安 装 在 已 有 的 柱 硬 件 上, 所 以 卡 套 系 统 具 有 经 济 灵 活 的 特 点 分 析 系 统 的 卡 套 式 柱 芯 是 预 填 充 的, 而 制 备 和 半 制 备 应 用 则 可 以 用 购 买 的 散 装 填 料 填 充 柱 芯 类 型 特 点 优 点 分 析 柱 和 分 析 / 保 护 柱 组 合 安 捷 伦 HPLC 卡 套 式 柱 芯 可 倒 装 柱 端 接 头, 添 加 保 护 柱 经 济 延 长 了 柱 寿 命 可 快 速 更 换 色 谱 柱 可 使 用 2, 3, 4 和 4.6 mm 柱 芯 ChromSep: 包 含 柱 套 分 析 柱 芯 和 保 护 柱 的 独 立 系 统 ZORBAX 快 速 分 离 和 快 速 分 离 高 通 量 卡 套 柱 : 1.8 和 3.5 µm 填 料 的 独 立 系 统 保 护 柱 ZORBAX 卡 套 型 保 护 柱 : 独 立 式 卡 套 柱 芯 的 两 端 都 有 独 特 的 滤 垫 和 筛 板 有 各 种 柱 长 和 内 径 组 合 有 各 种 填 料 的 柱 芯 和 保 护 柱 无 需 特 殊 工 具 适 用 于 高 通 量 LC/MS LC/MS/MS 和 组 合 分 离 填 充 Eclipse XDB,pH 范 围 2-9 填 充 StableBond, 低 ph 条 件 下 使 用 单 支 销 售 或 三 支 套 装 高 效 独 立 低 死 体 积 柱 芯 设 计 独 特 的 高 聚 物 柱 芯, 在 与 金 属 表 面 连 接 时 无 渗 漏 接 头 可 重 复 使 用 有 助 于 防 止 阻 塞 模 块 式 灵 活 性 经 济 使 用 方 便 适 用 于 各 种 分 析 类 型 适 用 于 各 种 分 析 类 型 低 流 失 适 用 于 各 种 分 析 类 型 密 封 耐 压 高 达 340 bar 无 需 垫 圈 适 合 与 1/16 英 寸 LC 接 头 连 接 表 6. 卡 套 系 统 转 下 页 38

41 柱 芯 类 型 特 点 优 点 半 制 备 保 护 柱 ZORBAX 半 制 备 保 护 柱 的 卡 套 : 独 立 式 ZORBAX 和 Agilent Prep 卡 套 型 制 备 柱 与 保 护 柱 : 独 立 式 和 内 置 式 选 件 制 备 轴 向 压 缩 制 备 柱 和 装 柱 机 : 能 提 供 动 态 轴 向 压 缩 和 静 态 锁 定 轴 向 压 缩 的 独 立 系 统 简 单 低 死 体 积 组 件 设 计 独 特 的 聚 苯 基 砜 管 线, 在 与 金 属 表 面 连 接 时 无 渗 漏 可 重 复 使 用 的 接 头 简 单 低 死 体 积 组 件 可 重 复 使 用 的 接 头 用 于 内 部 和 外 部 保 护 柱 的 硬 件 选 件 适 用 于 实 验 室 级 和 生 产 级 纯 化, 有 三 种 高 质 量 和 高 容 量 的 柱 规 格 可 供 选 择, 内 径 最 高 可 达 24 英 寸 移 动 式 装 柱 机 使 用 压 缩 空 气 几 分 钟 内 快 速 安 装 和 卸 载 密 封 耐 压 高 达 2000 psi (135 bar, 13.5 MPa) 无 需 垫 圈 适 合 连 接 至 1/16 英 寸 LC 接 头 延 长 了 柱 寿 命 可 快 速 更 换 色 谱 柱 可 与 21.2 和 30 mm 内 径 柱 配 合 使 用 很 方 便 地 从 克 级 放 大 到 几 公 斤 级 可 在 各 处 使 用 在 危 险 环 境 下 安 全 使 用 效 率 最 高 Dynamax 制 备 卡 套 柱 和 保 护 柱 : 独 立 的 动 态 轴 向 压 缩 系 统 模 块 式 设 计, 接 头 可 重 复 使 用 降 低 了 硬 件 成 本 10, 21.4 和 41.4 mm 内 径 便 于 放 大 一 体 式 保 护 柱 选 件 延 长 了 复 杂 样 品 制 备 的 柱 寿 命 生 产 聚 合 物 型 PLRP-S, PL-SAX 和 PL-SCX 各 种 孔 径 和 粒 径, 得 到 高 样 品 通 量 良 好 的 化 学 和 热 稳 定 性 可 实 现 适 当 净 化 适 合 生 产 过 程 硬 件 的 稳 定 填 充 方 法 提 高 效 率 延 长 柱 寿 命 提 高 填 充 柱 性 能 39

42 保护柱卡套 内径 (mm) 固定相 卡套柱卡套 保护柱芯 一体化系统 2.0 Asahipak 卡套 3.0 LiChrospher Nucleosil 4.6 Purospher 柱型 柱芯/保护柱芯系统兼容性指南* Superspher ZORBAX 标准接头 快速分离柱卡套 保护柱 独立 2.1 ZORBAX 卡套 无保护柱卡套 4.6 ZORBAX 半制备保护柱 独立 卡套 9.4 ZORBAX 21.2 ZORBAX 半制备柱 PrepHT 无图片 保护柱芯 Agilent Prep * 独立保护柱芯可用于安捷伦提供的所有卡套柱和标准接头色谱柱 表 7. 卡套柱/保护柱卡套系统兼容性指南 40

43 性 能 的 关 键 : 色 谱 柱 的 配 置 和 设 置 在 许 多 关 于 色 谱 的 论 著 中 论 述 的 性 能 的 关 键 比 我 们 这 里 所 涉 及 的 要 多 得 多 我 们 的 目 的 是 强 调 常 被 忽 视 或 容 易 造 成 混 淆 的 几 个 方 面 让 我 们 从 系 统 和 机 理 问 题 开 始 : 减 少 柱 外 体 积 进 行 良 好 的 连 接 进 样 理 解 并 测 量 系 统 延 迟 体 积 为 获 得 高 效 柱 设 置 数 据 采 集 速 率 接 下 来, 我 们 再 把 话 题 转 向 色 谱 分 析 和 方 法 开 发 过 程 中 需 要 做 的 其 他 一 些 工 作 : 了 解 螯 合 化 合 物 ph 的 影 响 使 用 梯 度 洗 脱 优 化 色 谱 柱 的 再 平 衡 在 本 节 的 最 后, 我 们 还 将 了 解 一 下 在 应 用 过 程 中 您 可 能 需 要 做 的 几 项 工 作 : 色 谱 柱 老 化 色 谱 柱 清 洗 反 相 ( 硅 胶 基 质 与 聚 合 物 固 定 相 ) 和 正 相 41

44 减 少 柱 外 体 积 的 重 要 性 柱 外 体 积 是 指 额 外 或 外 部 ( 相 对 于 色 谱 柱 ) 体 积, 是 系 统 的 一 部 分, 尤 其 是 各 LC 部 件 色 谱 柱 之 间 的 连 接 管 线 体 积 进 样 体 积 和 流 通 池 体 积 色 谱 柱 越 大, 柱 体 积 (V m ) 就 越 大, 减 少 柱 外 体 积 的 重 要 性 就 越 显 得 没 那 么 高 但 是, 如 果 您 使 用 的 是 较 小 的 高 效 柱, 如 Poroshell 120 和 亚 -2 µm 粒 径 柱, 您 就 要 尽 可 能 地 减 少 柱 外 体 积, 以 免 其 影 响 您 的 色 谱 结 果 不 必 要 的 柱 外 体 积 可 能 导 致 柱 效 损 失, 有 时 还 会 造 成 拖 尾 下 面 的 例 子 就 显 示 了 柱 外 体 积 的 影 响 ( 图 18) 只 有 10 µl 柱 外 体 积 时, 用 4.6 x 30 mm 小 柱 得 到 了 良 好 分 离 使 用 同 样 的 柱 子, 加 上 一 段 管 线, 形 成 50 µl 的 柱 外 体 积, 对 两 张 色 谱 图 的 前 三 个 峰 进 行 比 较 可 以 看 出, 色 谱 峰 变 宽 分 离 度 降 低 在 向 系 统 中 添 加 体 积 不 明 的 管 线 时, 这 种 情 况 经 常 发 生 添 加 一 段 太 长 的 管 线, 或 内 径 较 大 的 短 管 时, 会 使 高 柱 效 色 谱 柱 的 分 离 变 差 所 以, 了 解 您 所 使 用 管 线 的 内 径 和 增 加 了 多 少 体 积 非 常 重 要 另 外, 如 果 您 使 用 的 是 较 小 体 积 的 色 谱 柱, 需 要 使 用 微 量 或 半 微 量 流 通 池 标 准 流 通 池 会 增 大 柱 外 体 积 原 则 上, 系 统 的 最 大 柱 外 体 积 ( 管 线 体 积 进 样 体 积 和 检 测 器 体 积 ) 不 应 超 过 柱 体 积 的 10% 10 µl 柱 外 体 积 50 µl 柱 外 体 积 峰 归 属 1. 苯 丙 氨 酸 苯 基 -3,6- 二 氧 -2- 哌 嗪 醋 酸 3. 天 冬 氨 酰 - 苯 丙 氨 酸 4. 阿 斯 巴 甜 分 析 条 件 色 谱 柱 : StableBond SB-C18, 4.6 x 30 mm, 3.5 µm 流 动 相 : 含 0.1%TFA 的 H 2 O: 乙 腈 = 85:15 流 速 : 1.0 ml/min 温 度 : 35 C 图 18. 管 线 体 积 对 色 谱 性 能 的 影 响 安 捷 伦 销 售 的 毛 细 管 套 装, 包 含 各 种 规 格 的 毛 细 管 管 线 和 Swagelok 接 头, 您 可 以 根 据 最 小 的 合 适 长 度 配 备 连 接 和 管 线 体 积 管 线 带 有 彩 色 标 记, 以 区 分 管 线 内 径 在 您 改 用 高 效 色 谱 柱 时, 要 用 窄 内 径 红 色 管 线 (0.12 mm 内 径 ) 进 行 连 接, 而 不 能 用 常 规 HPLC 仪 器 上 常 用 的 0.17 mm 内 径 绿 色 管 线 42

45 实 现 完 美 的 接 头 连 接 使 用 HPLC 和 UHPLC 的 色 谱 工 作 者 常 常 面 临 峰 拖 尾 峰 展 宽 峰 分 叉 以 及 交 叉 污 染 等 问 题 的 挑 战 引 起 这 些 问 题 的 一 个 常 见 原 因 是 管 线 连 接 不 当, 这 一 原 因 通 常 容 易 被 忽 视, 因 此 在 故 障 排 除 方 面 需 要 花 费 大 量 时 间 管 线 连 接 中 的 死 体 积 或 微 漏 可 能 严 重 影 响 色 谱 分 析 的 性 能 和 重 现 性, 采 用 现 代 UHPLC 和 快 速 液 相 色 谱 柱 时 尤 其 如 此 接 头 连 接 要 求 接 头 连 接 对 分 析 物 的 峰 形 具 有 重 要 影 响 理 想 的 接 头 连 接 应 具 备 以 下 特 性 : 管 线 与 接 口 之 间 无 死 体 积 在 超 高 压 和 高 温 下 始 终 避 免 泄 漏 优 异 的 长 期 使 用 稳 定 性, 防 止 管 线 滑 动 简 便 易 用 不 可 调 金 属 接 头 UHPLC 中 最 常 用 的 接 头 为 2 件 式 或 3 件 式 不 可 调 金 属 接 头, 其 组 装 后 即 处 于 不 可 调 的 固 定 状 态 [3] 由 于 不 同 的 色 谱 柱 硬 件 制 造 商 采 用 不 同 的 色 谱 柱 末 端 接 头 设 计 ( 图 19), 因 此 每 个 品 牌 的 色 谱 柱 都 需 要 各 自 装 配 一 组 管 线 和 接 头 这 样 可 确 保 杆 长 (stem length, 即 密 封 垫 圈 底 部 与 管 线 末 端 之 间 的 距 离 ) 实 现 完 全 匹 配 ( 图 20) 43

46 Waters DŽ ݥ AcquityDž 图 19. HPLC 中使用的色谱柱接头 如果杆长过短 将产生死体积 从而导致峰形变差 分离度下降以及交叉污染 图 20 如果杆长过长 则密封垫圈不能正确就位并容易发生泄漏 图 20 此外 使用扳手时传统接头和密封垫圈通常被拧得过 紧 导致接头永久性卡死在色谱柱中 A 杆长过长 泄漏 B 杆长过短 死体积 C 正确安装的管线 无死体积 图 20. 接头连接正确与错误方式对比 44

47 可 调 手 紧 式 接 头 为 解 决 传 统 接 头 的 问 题, 我 们 开 发 出 了 可 与 不 同 色 谱 柱 兼 容 的 可 调 手 紧 式 接 头 这 些 接 头 通 常 配 备 聚 合 物 ( 如 PEEK) 密 封 垫 圈, 而 密 封 垫 圈 不 会 永 久 性 连 接 至 管 线, 因 此 接 头 可 以 重 复 使 用 然 而, 许 多 此 类 接 头 仍 有 诸 多 弊 端, 例 如 : 不 借 助 工 具 无 法 获 得 1300 bar 的 超 高 压 需 要 遵 循 严 格 的 精 确 扭 矩 或 转 向 角 范 围 操 作 指 南 以 免 拧 得 过 紧 每 次 重 新 连 接 后 都 需 要 检 查 是 否 存 在 泄 漏 经 常 需 要 重 新 拧 紧 接 头 如 果 聚 合 物 密 封 垫 圈 未 能 充 分 夹 紧 管 线, 后 者 可 能 在 超 高 压 或 压 力 循 环 中 从 接 头 处 滑 落, 产 生 死 体 积 Agilent A-Line 接 头 Agilent A-Line UHPLC 接 头 克 服 了 这 些 缺 陷, 实 现 了 可 重 现 的 无 泄 漏 色 谱 柱 连 接 A-Line 接 头 包 括 两 种 类 型 A-Line Quick Connect 快 速 连 接 接 头 ( 图 21A) 适 用 于 色 谱 柱 连 接, 能 够 在 1300 bar 下 实 现 密 封 连 接, 且 无 需 使 用 扳 手 A-Line Quick Turn 接 头 ( 图 21B) 适 用 于 各 种 流 路 连 接, 包 括 色 谱 柱 入 口 / 出 口 阀 及 其 他 连 接 这 种 接 头 通 过 手 拧 即 可 在 高 达 600 bar 的 压 力 下 保 持 密 封 ( 取 决 于 用 户 和 连 接 位 置 ), 采 用 扳 手 则 可 达 到 1300 bar 图 21. Agilent A-Line 接 头 A. Quick Connect 快 速 连 接 接 头,B. Quick Turn 接 头 45

48 两类接头均采用创新的内置弹簧式设计 图 22 确保始终将管线推入接口底部 可实现可重现的零死体积连 接 从而获得一致的色谱性能 通过弹簧即可调节杆长 因此这两类接头均可兼容所有类型的液相色谱柱 此 外 A-Line Quick Connect 快速连接接头采用独特的压杆驱动设计 使弹簧组件 包括压杆 施加恒定压力将密 封垫圈压到管线上 以避免管线滑动 无需使用任何工具 只需施加很小的力即可拧紧接头以用于 1300 bar (18850 psi) 压力之下 用户只需用手拧紧螺帽直至感觉到阻力 然后按下压杆即可 图 23 图 22. Agilent A-Line 接头独特的内置弹簧式设计 用手拧紧蓝色螺帽直至感觉到阻力 按下压杆 紧实压力高达 1300 bar 图 23. Agilent A-Line Quick Connect 快速连接接头的安装 46

49 200 次 重 复 连 接 后 的 稳 定 性 为 评 估 Agilent A-Line Quick Connect 快 速 连 接 接 头 的 重 复 使 用 性 和 稳 定 性, 我 们 将 该 接 头 断 开 并 重 新 连 接 了 200 次 该 接 头 连 接 在 经 过 200 次 重 新 连 接 后 仍 未 产 生 死 体 积 和 泄 漏 与 不 同 品 牌 色 谱 柱 的 兼 容 性 不 同 色 谱 柱 制 造 商 的 接 头 连 接 设 计 各 不 相 同, 接 头 的 杆 长 不 当 将 导 致 泄 漏 或 峰 形 不 佳 为 评 估 Agilent A-Line 接 头 对 不 同 品 牌 色 谱 柱 的 兼 容 性, 如 需 了 解 更 多 有 关 在 实 际 操 作 中 如 何 进 行 连 接 的 技 巧, 请 查 看 液 相 色 谱 故 障 排 除 系 列 以 获 取 详 细 信 息 : 您 还 可 查 看 峰 展 宽 视 频 有 关 Agilent A-Line 的 更 多 信 息, 请 访 问 : 进 样 量 进 样 量 对 于 分 析 结 果 而 言 非 常 重 要 如 果 进 样 量 过 大, 色 谱 柱 可 能 会 过 载, 从 而 导 致 峰 展 宽, 常 见 的 结 果 是 伸 舌 峰, 在 某 些 情 况 下 也 可 能 引 起 峰 拖 尾 图 24 展 示 了 采 用 1 µl 2 µl 5 µl 和 10 µl 进 样 量 得 到 的 分 析 结 果, 我 们 可 以 看 到 色 谱 峰 随 着 进 样 量 的 增 加 而 变 宽 5σ 2 50 µl 10 µl 40 µl 1 µl 1 µl 2 µl 5 µl 10 µl 条 件 色 谱 柱 : 流 速 : 柱 温 : 流 动 相 : 检 测 器 : 稀 释 剂 : ZORBAX SB-C18, mm, 1.8 µm 1 ml/min 45 C 30-65% 乙 腈 2.5 分 钟 处 250 nm UV 甲 醇 样 品 : 对 羟 基 苯 甲 酸 甲 酯 对 羟 基 苯 甲 酸 丙 酯 和 对 羟 基 苯 甲 酸 丁 酯 图 24. 载 样 量 比 较 确 定 进 样 量 之 后, 还 需 确 保 进 样 溶 剂 与 流 动 相 足 够 相 近, 以 减 少 谱 带 展 宽 或 分 叉 47

50 进 样 溶 剂 和 体 积 都 对 峰 形 有 影 响 在 这 个 例 子 ( 图 25) 中, 甲 醇 溶 剂 中 苯 甲 酸 酯 样 品 进 样 5 µl, 显 示 已 开 始 出 现 峰 带 变 宽 的 现 象 了 反 相 柱 规 格 为 3 x 50 mm, 仪 器 采 用 低 扩 散 配 置 进 样 10 µl, 峰 形 已 经 明 显 不 对 称 了 在 反 相 LC 中, 如 使 用 100% 有 机 溶 剂 或 100% 强 溶 剂 ( 本 例 中 为 甲 醇 ), 大 体 积 进 样 时, 将 使 色 谱 峰 过 早 洗 脱 出 色 谱 柱, 导 致 峰 变 形 如 需 解 决 这 个 问 题 可 以 对 分 析 物 进 行 蒸 发 浓 缩, 从 而 减 少 进 样 体 积 或 者 进 样 溶 剂 改 为 用 水 稀 释, 与 流 动 相 更 为 兼 容, 即 使 进 样 体 积 较 大 也 不 会 出 现 峰 变 形 42 µl 117 µl(10 µl 进 样 ) (1 µl 进 样 ) 1 µl 进 样 2 µl 进 样 5 µl 进 样 10 µl 进 样 分 析 条 件 色 谱 柱 : ZORBAX SB-C18, mm, 1.8 µm 流 速 : 1 ml/min 温 度 : 45 C 流 动 相 : 30-65% 乙 腈,2.5 分 钟 检 测 : 250 nm UV 样 品 : 苯 甲 酸 甲 酯 苯 甲 酸 丙 酯 和 苯 甲 酸 丁 酯 稀 释 溶 剂 : 甲 醇 图 25. 溶 剂 效 应 : 使 用 强 稀 释 溶 剂,1-10 µl 进 样 设 置 数 据 采 集 速 率 使 用 小 体 积 色 谱 柱 时, 数 据 采 集 速 率 是 人 为 峰 展 宽 的 常 见 原 因 对 于 快 速 洗 脱 的 色 谱 峰, 要 确 保 在 色 谱 峰 上 收 集 到 足 够 的 数 据 点, 数 据 系 统 才 能 准 确 测 定 出 峰 宽 峰 面 积 和 保 留 时 间 如 果 得 到 的 数 据 点 太 少 ( 如, 低 数 据 采 集 速 率 ), 色 谱 峰 就 会 显 得 比 其 实 际 要 宽 您 应 该 检 查 数 据 采 集 速 率, 确 保 其 设 置 正 确, 以 优 化 色 谱 结 果 图 26 说 明 了 数 据 采 集 速 率 的 影 响 如 果 您 对 现 在 的 色 谱 柱 和 梯 度 条 件 使 用 安 捷 伦 方 法 转 移 器, 转 移 器 将 估 算 出 您 所 用 条 件 下 的 期 望 峰 宽 值 (5σ) 这 一 信 息 对 初 始 方 法 设 置 会 有 帮 助 48

51 分 析 条 件 色 谱 柱 : Poroshell 120 EC-C18, mm 仪 器 : 1200 SL 2 µl 流 通 池 流 速 : 2.00 ml/min 样 品 : 2 µl 进 样 流 动 相 : 乙 腈 : 水 = 60:40 4-5% 15% 图 26. 不 同 数 据 采 集 速 率 对 Poroshell 120 EC-C x 100 mm 上 峰 柱 效 影 响 的 比 较 这 里, 我 们 测 定 了 柱 效, 可 以 看 出, 柱 效 随 采 集 速 率 的 增 大 而 增 加 可 以 通 过 将 检 测 器 设 置 和 / 或 时 间 常 数 调 节 到 不 影 响 信 噪 比 的 最 快 数 值, 对 数 据 采 集 速 率 进 行 优 化 用 化 学 工 作 站 中 的 峰 宽 控 制 可 为 您 的 分 析 选 择 峰 宽 或 响 应 时 间 化 学 工 作 站 软 件 中 峰 宽 的 定 义 是, 半 峰 高 处 的 宽 度 将 峰 宽 设 置 为 样 品 中 色 谱 峰 所 期 望 的 最 窄 值 可 以 不 用 更 快 的 响 应 时 间, 以 免 导 致 基 线 噪 音 增 大 驻 留 体 积 及 其 对 色 谱 的 影 响 低 压 混 合 系 统 的 驻 留 体 积 等 于 从 比 例 阀 经 泵 和 其 它 系 统 组 件 到 柱 头 的 体 积 总 和 ( 见 图 27) 高 压 混 合 系 统 的 驻 留 体 积 等 于 从 各 溶 剂 首 次 接 触, 经 两 个 计 量 泵 再 到 柱 头 的 体 积 总 和 ( 见 图 28) 比 例 阀 计 量 泵 自 动 进 样 器 图 27. 驻 留 体 积 : 低 压 混 合 四 元 泵 49

52 计 量 泵 A 自 动 进 样 器 计 量 泵 B 图 28. 驻 留 体 积 : 高 压 混 合 二 元 泵 在 梯 度 分 离 中, 驻 留 体 积 使 梯 度 开 始 时 出 现 一 段 等 度 时 间, 相 当 于 驻 留 体 积 除 以 流 速 驻 留 体 积 太 大 的 仪 器 不 能 进 行 窄 径 梯 度 分 离 使 用 窄 径 柱 时, 仪 器 配 置 至 关 重 要 进 行 窄 径 (2.1 mm 内 径 ) 和 微 径 (1 mm 和 < 1 mm 内 径 ) 柱 优 化 时, 必 须 使 驻 留 体 积 和 柱 外 体 积 最 小 化 图 29 中 的 色 谱 图 例 说 明 了 驻 留 体 积 对 分 析 结 果 的 影 响 请 注 意, 前 面 的 洗 脱 峰 较 宽 问 题 在 于 驻 留 体 积 使 前 面 的 峰 出 峰 较 晚, 基 本 上 是 被 等 梯 度 洗 脱 的 如 果 这 种 情 况 影 响 了 分 离 或 检 测, 就 需 要 减 少 驻 留 体 积 或 使 用 另 外 的 系 统 峰 归 属 1. 非 那 西 汀 2. 托 美 汀 3. 酮 洛 芬 4. 非 诺 洛 芬 5. 布 洛 芬 6. 保 泰 松 7. 甲 灭 酸 8. 氟 芬 那 酸 图 29. 驻 留 体 积 对 梯 度 色 谱 结 果 的 影 响 分 析 条 件 色 谱 柱 : 流 动 相 : ZORBAX 快 速 分 离 Eclipse XDB-C8 A:0.1% TFA 水 B:0.1% TFA 乙 腈 温 度 : 35 C 梯 度 : 例 1: 在 6 分 钟 内 B 由 15% 升 至 60%, 流 速 1.0 ml/min 例 2: 在 6 分 钟 内 B 由 30% 升 至 75%, 流 速 0.2 ml/min 50

53 测 量 系 统 的 驻 留 体 积 首 先 将 色 谱 柱 替 换 为 一 段 短 HPLC 不 锈 钢 管 线 流 动 相 组 成 如 下 :A 水 ( 无 UV 吸 收 ),B 0.2% 丙 酮 的 水 溶 液 ( 有 UV 吸 收 ) 检 测 波 长 265 nm 以 1mL/min 的 流 速 运 行 梯 度,B 在 10 分 钟 的 时 间 内 由 0 升 至 100% 记 录 后 打 印 出 梯 度 曲 线 ( 如 图 30) 检 测 器 响 应 梯 度 变 化 图 30. 计 算 驻 留 ( 延 迟 ) 体 积, 步 骤 1 用 尺 子 在 纸 上, 或 在 PowerPoint 中 插 入 线 段, 在 平 行 于 x 或 y 轴 的 下 列 点 上 划 线 : 1. 流 动 相 中 含 90% B 的 零 信 号 点 % B 的 最 稳 定 信 号 点 3. 在 2.0 分 钟 处 做 垂 线, 图 形 如 图 31 所 示 图 31. 计 算 驻 留 ( 延 迟 ) 体 积, 步 骤 2 51

54 三 条 线 段 添 加 完 毕 后, 再 添 加 两 条 线 段 计 算 梯 度 步 骤 50% 处 的 响 应 值, 本 例 中 为 24.5 mau, 在 图 上 划 一 条 水 平 线 然 后 再 划 一 条 垂 线, 与 50% 响 应 线 及 所 见 的 检 测 器 信 号 相 交 新 图 形 见 图 32 时 间 (50%) - 时 间 ( 步 骤 ) 流 速 = 驻 留 体 积 图 32. 计 算 驻 留 ( 延 迟 ) 体 积, 步 骤 3 沿 x 轴 至 50% B 垂 线 处 ( 在 此 处 的 响 应 是 50%), 确 定 时 间, 并 尽 可 能 准 确 假 设 流 速 为 500 µl/min, 时 间 如 有 0.1 分 钟 的 误 差, 估 算 出 的 延 迟 体 积 将 会 有 50 µl 的 误 差 在 本 例 中, 我 们 估 算 50% 响 应 的 时 间 为 4.04 分 钟 计 算 驻 留 体 积 的 简 单 公 式 是, 时 间 (50%) 时 间 ( 步 骤 ) 流 速 = 驻 留 体 积, 在 本 例 中,( ) 分 钟 500 µl/min = 1020 µl 这 一 测 量 是 在 Agilent 1200 RRLC 系 统 (1200 SL) 上 完 成 的, 用 一 根 内 径 为 mm( 英 寸 ) 的 100 cm PEEK 限 流 器 使 反 压 达 到 340 bar, 以 水 作 为 流 量 输 送 压 缩 性 补 偿 的 特 殊 溶 剂 该 系 统 包 括 标 准 混 合 器 和 脉 冲 阻 尼 器, 以 及 自 动 进 样 器, 采 用 普 通 流 路 ( 而 不 是 旁 路 模 式 ), 再 连 接 上 述 的 限 流 器 和 3 mm 2 µl 流 通 池 52

55 评 估 驻 留 体 积 的 影 响 在 不 同 驻 留 体 积 的 仪 器 上 运 行 同 一 方 法, 可 以 得 到 不 同 的 结 果, 如 图 33 所 示 驻 留 体 积 较 小 的 仪 器 驻 留 体 积 较 大 的 仪 器 图 33. 驻 留 体 积 和 分 离 度 在 这 一 例 子 中, 驻 留 体 积 最 小 和 最 大 的 系 统 都 没 有 得 到 好 的 结 果 这 个 方 法 很 可 能 是 在 驻 留 体 积 处 于 中 等 范 围 的 仪 器 上 开 发 的 要 了 解 驻 留 体 积 对 您 的 梯 度 分 离 有 什 么 影 响, 可 以 在 梯 度 运 行 初 期 延 长 或 缩 短 等 度 运 行 时 间 以 进 行 观 察 要 在 驻 留 体 积 较 小 的 系 统 上 模 拟 较 大 驻 留 体 积, 可 在 梯 度 程 序 初 始 时 设 置 一 段 等 度 时 间, 相 当 于 两 个 驻 留 体 积 之 差 ( 用 ml 表 示 ) 除 以 流 速 ( 以 ml/min 表 示 ) 要 模 拟 较 小 的 驻 留 体 积, 必 须 修 改 进 样 器 程 序, 使 进 样 延 迟 时 间 等 于 相 同 的 驻 留 时 间 有 些 仪 器 有 这 种 功 能, 而 其 它 的 则 没 有 如 果 要 把 方 法 转 移 到 另 一 实 验 室 的 不 同 仪 器 上, 记 录 方 法 开 发 所 用 仪 器 的 驻 留 体 积, 以 及 驻 留 体 积 对 分 离 有 何 影 响 非 常 重 要 53

56 驻 留 体 积 与 分 析 时 间 驻 留 体 积 还 包 括 进 样 器 体 积, 所 以, 将 进 样 器 的 内 体 积 和 周 围 的 连 接 管 线 降 至 最 低 非 常 重 要 大 多 数 安 捷 伦 自 动 进 样 器 都 提 供 了 旁 路 模 式 选 项, 或 带 有 自 动 延 迟 体 积 减 少 (ADVR) 功 能, 在 样 品 从 样 品 定 量 环 中 冲 出 后, 将 进 样 器 切 换 回 上 样 位 置 根 据 您 选 择 的 进 样 器, 最 多 可 将 系 统 中 的 体 积 减 少 300 µl 标 准 的 安 捷 伦 1200SL 或 1260 Infinity 二 元 梯 度 仪 器 的 起 始 延 迟 体 积 大 约 为 1100 µl, 通 过 更 换 较 小 内 径 管 线 使 用 自 动 进 样 器 旁 路 功 能 并 拆 除 混 合 器 和 阻 尼 器, 可 减 少 至 280 µl 左 右 可 以 通 过 重 叠 进 样 缩 短 快 速 梯 度 分 离 的 分 析 时 间 在 重 叠 进 样 中, 自 动 进 样 器 在 之 前 的 分 析 过 程 中 吸 取 样 品, 一 旦 系 统 准 备 就 绪 即 可 进 样 这 一 功 能 可 以 将 每 次 分 析 的 时 间 缩 短 30 秒 左 右 如 果 您 正 在 进 行 的 是 快 速 梯 度 组 合 化 学 分 析, 则 最 多 可 节 省 1/3 的 分 析 时 间 如 果 您 要 用 非 常 小 的 色 谱 柱 ( 如 毛 细 管 和 微 径 柱 ) 进 行 大 量 梯 度 分 析,280 µl 的 延 迟 体 积 就 显 得 太 高 了 这 时 就 极 有 必 要 使 用 安 捷 伦 毛 细 管 液 相 色 谱 仪 配 合 这 些 色 谱 柱 了 不 要 忘 记, 使 柱 外 体 积 最 低 和 选 择 适 当 的 样 品 进 样 稀 释 剂 同 样 重 要 这 将 有 助 于 最 大 限 度 地 减 少 峰 展 宽 和 分 离 度 的 降 低 另 外, 正 如 我 们 先 前 讨 论 过 的 一 样, 还 要 确 保 正 确 设 置 检 测 器 响 应 时 间, 在 快 速 洗 脱 峰 上 获 得 足 够 的 数 据 点 ( 后 面 还 要 讨 论 这 个 问 题 ) 否 则, 可 能 会 出 现 变 形 的 人 为 宽 峰 螯 合 物 某 些 分 析 物 具 有 易 于 与 金 属 进 行 螯 合 的 结 构 筛 板 或 柱 壁 上 的 金 属 可 能 与 其 发 生 相 互 所 用, 形 成 螯 合 物 用 磷 酸 冲 洗 有 助 于 解 决 这 一 问 题 这 里 介 绍 一 种 判 断 是 否 存 在 金 属 问 题 的 好 办 法 带 有 孤 对 电 子 的 化 合 物, 加 一 个 金 属 离 子 可 以 形 成 环 状 结 构, 这 可 能 导 致 不 重 复 保 留 或 产 生 峰 形 问 题 ( 图 34) 水 杨 醛 六 元 环 络 合 物 8- 羟 基 喹 啉 五 元 环 络 合 物 a-benzoinoxomine 五 元 环 络 合 物 图 34. 评 估 化 合 物 是 否 有 螯 合 问 题 54

57 在 本 例 中, 磷 酸 冲 洗 有 益 于 解 决 这 一 问 题 注 意, 在 前 面 的 色 谱 图 中, 化 合 物 2 拖 尾 因 子 较 高 ( 图 35) 经 过 酸 洗 后, 我 们 得 到 了 一 个 较 尖 锐 的 色 谱 峰, 化 合 物 2 的 拖 尾 因 子 得 到 了 改 善 ZORBAX StableBond 柱 可 以 接 受 1% 的 磷 酸 冲 洗, 因 为 该 色 谱 柱 采 用 了 在 酸 性 条 件 下 稳 定 的 设 计 如 果 您 使 用 的 是 Eclipse-XDB Eclipse Plus, 或 其 它 为 中 等 ph 范 围 而 设 计 的 封 端 柱, 酸 浓 度 应 减 为 0.5% 酸 洗 之 前 酸 洗 之 后 mL 1% 磷 酸 分 析 条 件 色 谱 柱 : ZORBAX SB-Phenyl, 4.6 x 150 mm 进 样 量 : 5 µl 流 动 相 : 75% 25 mm 磷 酸 铵 缓 冲 液 : 25% 乙 腈 流 速 : 1.0 ml/min 温 度 : 室 温 图 35. 用 磷 酸 冲 洗 恢 复 产 生 螯 合 化 合 物 的 柱 性 能 ph 和 流 动 相 改 性 剂 流 动 相 的 ph 和 样 品 会 对 方 法 开 发 产 生 很 大 影 响 ( 如 需 了 解 更 多 信 息 可 参 见 流 动 相 操 作 和 方 法 开 发 等 章 节 ) 应 尽 可 能 避 免 使 用 极 端 ph 不 论 是 过 高 或 过 低 因 为 在 这 种 极 端 条 件 下 工 作 将 缩 短 色 谱 柱 的 寿 命 检 查 一 下 您 所 用 色 谱 柱 的 推 荐 ph 范 围, 以 确 定 最 佳 ph 范 围 大 多 数 分 离 在 ph 2 到 8 之 间 进 行 酸 性 和 碱 性 ( 可 离 子 化 ) 分 析 物 的 保 留 对 ph 非 常 敏 感, 常 随 ph 改 变 而 发 生 显 著 变 化 评 估 分 离 的 最 佳 ph 是 方 法 开 发 的 重 要 内 容, 详 见 方 法 开 发 一 节 55

58 梯 度 操 作 样 品 越 复 杂, 使 用 梯 度 洗 脱 方 法 的 可 能 性 就 越 大 梯 度 洗 脱 对 极 性 差 异 大 或 高 分 子 量 的 化 合 物 ( 如 多 肽 和 蛋 白 质 ) 非 常 有 用 虽 然 等 度 洗 脱 方 法 使 用 方 便, 但 由 于 峰 宽 随 保 留 时 间 延 长 而 增 大, 后 洗 脱 的 峰 会 变 宽 梯 度 洗 脱 缩 短 了 后 洗 脱 峰 的 保 留 时 间, 可 以 解 决 这 个 问 题 梯 度 洗 脱 的 优 点 包 括, 由 于 梯 度 压 缩 效 应 得 到 窄 峰 由 于 不 断 增 加 色 谱 柱 洗 脱 溶 剂 的 强 度, 从 而 降 低 了 污 染 物 的 堆 积 图 36 显 示 了 等 度 与 梯 度 洗 脱 方 法 的 比 较 使 用 等 度 洗 脱 分 离 时, 用 70 分 钟 也 没 有 将 8 种 除 草 剂 化 合 物 完 全 分 开, 并 且 组 分 1 和 组 分 2 共 洗 脱 降 低 有 机 相 比 例 可 以 分 离 峰 1 和 峰 2, 但 保 留 时 间 无 法 接 受, 并 且 峰 8 的 检 出 限 也 无 法 接 受 使 用 20-60% 的 梯 度, 在 30 分 钟 内 即 可 分 离 全 部 8 个 组 分, 并 具 有 相 等 的 检 测 限 如 果 提 高 起 始 梯 度 洗 脱 液 的 有 机 相 百 分 比, 分 析 时 间 还 可 以 进 一 步 缩 短 如, 可 以 进 行 有 机 相 25-65% 的 梯 度 洗 脱 反 相 色 谱 的 梯 度 分 离 可 以 用 2 到 4 种 流 动 相 组 分 完 成 在 二 元 梯 度 中 为 A 和 B A 溶 剂 较 弱 ( 常 为 水 或 缓 冲 溶 液 ), 使 分 析 物 缓 慢 地 从 色 谱 柱 上 洗 脱 下 来 B 溶 剂 较 强, 使 分 析 物 的 洗 脱 速 度 更 快 B 是 可 与 水 混 溶 的 有 机 溶 剂, 如 乙 腈 (ACN) 甲 醇 (MeOH) 四 氢 呋 喃 (THF), 或 异 丙 醇 (IPA) 梯 度 洗 脱 方 法 开 发 应 从 测 试 开 始 以 下 是 建 立 梯 度 洗 脱 方 法 的 关 键 步 骤 : 1. 先 进 行 测 试, 在 一 定 时 间 内 有 机 相 的 浓 度 从 5-10% 之 间 线 性 梯 度 变 化 至 100% 如 果 缓 冲 液 与 溶 剂 B 不 互 溶 的 话, 梯 度 中 有 机 相 的 浓 度 上 限 为 70% 2. 用 最 后 的 比 例 持 续 洗 脱 一 段 时 间, 确 保 所 有 样 品 组 分 都 已 洗 出 3. 查 看 色 谱 图, 以 确 定 恰 当 的 起 始 梯 度 组 成 和 梯 度 曲 线 大 多 数 梯 度 洗 脱 分 离 都 是 用 线 性 梯 度 完 成 的, 即 有 机 相 组 成 的 变 化 速 率 保 持 恒 定 但 也 可 以 用 其 它 类 型 的 梯 度 例 如, 根 据 所 需 要 的 分 离 和 保 留 时 间, 某 些 梯 度 程 序 在 不 同 时 间 的 斜 率 不 同, 或 A 和 B 的 相 对 浓 度 发 生 急 剧 变 化 如 需 了 解 更 多 梯 度 洗 脱 的 内 容 和 实 例, 请 参 见 方 法 开 发 一 节 如 需 缩 短 分 离 时 间 改 善 色 谱 峰 形 的 检 测, 应 保 持 梯 度 简 单 ( 使 用 较 短 的 梯 度 时 间 ) 并 使 用 较 短 的 色 谱 柱 (50-75 mm) 56

59 峰归属 1. 丁噻隆 2. 扑灭通 3. 扑草净 4. 阿特拉津 5. 噻草平 6. 扑灭津 7. 敌稗 8. 异丙草甲胺 分析条件 色谱柱 流动相 流速 温度 图 36. 等度和梯度分析的比较 ZORBAX SB-C8 4.6 x 150 mm, 5 µm A 含 0.1% TFA 的水溶液 ph 2 B 乙腈 1.0 ml/min 35 C 优化色谱柱的再平衡 在方法开发或转换过程中 要保证足够的色谱柱平衡时间 保留时间才可重现 从葡萄汁的梯度分析分离 图 37 中可以看出 色谱柱死体积和色谱柱的再平衡消耗的时间 梯度曲线 压力曲线 橙皮苷 梯度曲线 A. 初始的等度维持 B. 线性梯度洗脱 C. 高有机相冲洗 D. 再平衡 分析条件 LC 配备 DAD 的 Agilent 1290 Infinity 色谱柱 Agilent RRHD SB-C x 150 mm, 1.8 µm 部件号 温度 1 µl 葡萄汁过 0.2 um 滤膜 40 C 检测 UV, 276 nm 溶剂 A 水 溶剂 B 乙腈 进样 = 1 个柱死体积 Vm 图 37. 梯度实例 : 葡萄汁分析 这是在前面的梯度运行后 回到初始流动相条件所用的时间 在本例中 再平衡时间为 1.4 分钟 相当于该 柱的 4 个柱体积 57

60 找 出 色 谱 图 中 基 线 第 一 次 波 动 的 时 间, 将 这 段 时 间 ( 以 min 表 示 ) 乘 以 流 速 ( 以 ml/min 表 示 ), 即 为 死 体 积 的 ml 数 也 可 以 用 安 捷 伦 方 法 转 换 器 计 算 死 体 积 依 据 经 验 来 看, 在 方 法 开 发 过 程 中, 需 要 用 10 个 柱 体 积 进 行 平 衡, 但 对 于 已 建 立 的 方 法, 平 衡 时 间 可 以 估 算 并 缩 短, 如, 在 本 例 中 为 4 个 柱 体 积 平 衡 时 间 的 最 小 值 是 经 过 反 复 摸 索 确 定 的, 通 过 重 复 运 行 梯 度 并 记 录 保 留 的 改 变 如 果 经 过 多 次 进 样 结 果 都 能 重 复, 如 图 38, 平 衡 时 间 就 足 够 了 时 间 进 样 1 进 样 2 进 样 3 进 样 4 进 样 5 进 样 6 分 析 条 件 LC: 色 谱 柱 : 进 样 : 温 度 : 40 C 检 测 器 : UV, 276 nm 溶 剂 A: 水 溶 剂 B: 乙 腈 样 品 : 葡 萄 汁 带 DAD 的 Agilent 1290 Infinity Agilent RRHD SB-C x 150 mm, 1.8 µm PN µl 葡 萄 汁 过 0.2 µm 滤 膜 图 38. 确 认 色 谱 平 衡 重 叠 图 为 什 么 要 反 复 实 验 不 断 摸 索 呢? 固 定 相 通 过 再 平 衡 回 到 起 始 条 件 的 速 度 不 同 快 慢 程 度 取 决 于 所 用 的 流 动 相 溶 剂 缓 冲 液 和 梯 度 范 围 这 就 是 方 法 开 发 时 建 议 使 用 10 个 柱 体 积 的 原 因, 这 样 可 以 确 保 固 定 相 已 达 到 再 平 衡, 能 够 进 行 下 一 次 运 行 只 要 能 够 完 成 您 所 需 要 的 分 离, 都 可 以 考 虑 缩 短 再 平 衡 的 时 间 由 于 平 衡 体 积 包 括 仪 器 的 驻 留 体 积, 而 该 体 积 可 能 随 仪 器 的 不 同 而 不 同 驻 留 体 积 对 等 梯 度 方 法 的 保 留 没 有 影 响, 但 在 梯 度 方 法 中, 却 对 保 留 有 显 著 影 响 如 果 您 不 清 楚 系 统 的 驻 留 体 积, 则 可 能 会 出 现 严 重 问 题, 因 为 您 的 驻 留 体 积 可 能 比 柱 体 积 还 大 如 果 您 要 将 梯 度 方 法 从 一 台 仪 器 转 移 到 另 一 台 仪 器 上, 由 于 两 个 系 统 的 驻 留 体 积 不 同, 保 留 时 间 则 会 发 生 偏 移 流 路 体 积 越 相 近, 保 留 时 间 的 吻 合 程 度 就 越 高 提 示 : 可 以 通 过 观 察 在 线 信 号 窗 的 压 力 曲 线 变 化 进 行 确 认 压 力 随 流 动 相 组 成 变 化 而 变 化 当 压 力 曲 线 回 到 初 始 值 时, 色 谱 柱 差 不 多 就 达 到 再 平 衡 了 58

61 提 示 : 您 需 要 了 解 您 系 统 的 驻 留 时 间! 方 法 见 50 页 查 看 您 的 系 统 说 明 书 或 向 安 捷 伦 技 术 支 持 寻 求 帮 助 见 本 书 中 安 捷 伦 资 源 一 节 色 谱 柱 老 化 在 您 使 用 色 谱 柱 时, 会 用 其 分 析 各 种 目 标 物 使 用 各 种 流 动 相 并 分 离 不 同 的 样 品 基 质, 经 过 长 时 间 的 使 用, 色 谱 柱 会 受 到 这 些 物 质 的 影 响 发 生 一 些 微 妙 的 变 化, 从 而 引 起 保 留 的 改 变 在 使 用 新 色 谱 柱 时 保 留 其 测 试 样 品 色 谱 图 非 常 重 要, 在 使 用 一 段 时 间 后 进 行 比 较, 就 能 发 现 性 能 上 的 变 化 如 果 分 离 度 下 降 导 致 不 能 进 行 良 好 定 量, 这 根 色 谱 柱 就 应 该 丢 弃 并 更 换 了 键 合 相 流 失 虽 然 色 谱 柱 污 染 是 硅 胶 基 色 谱 柱 性 能 下 降 的 最 常 见 原 因 之 一, 但 随 时 间 推 移 发 生 的 键 合 相 流 失 也 会 改 变 保 留 如 果 在 流 动 相 中 使 用 了 某 种 不 兼 容 溶 剂, 键 合 相 可 能 从 硅 胶 基 体 上 脱 离 下 来, 导 致 分 离 度 和 保 留 时 间 的 改 变, 并 增 加 了 峰 拖 尾 在 ph 2 以 下 键 合 相 的 流 失 最 为 严 重 可 以 通 过 使 用 稳 定 键 合 相 色 谱 柱 减 小 这 种 影 响, 或 在 ph 2 到 ph 7 之 间 60 C 以 下 操 作 在 高 ph 条 件 下, 硅 胶 基 质 将 发 生 溶 解, 从 而 导 致 填 料 流 失, 形 成 空 洞 峰 形 变 差 如 果 一 定 要 在 ph 值 大 于 9 的 条 件 下 进 行 分 析, 应 确 保 使 用 适 合 这 种 工 作 条 件 的 特 殊 键 合 相 色 谱 柱 或 可 以 轻 松 耐 受 高 ph 流 动 相 的 聚 合 物 类 色 谱 柱 如 需 确 定 色 谱 柱 是 否 已 损 坏, 应 该 监 测 并 观 察 其 容 量 因 子 选 择 性 和 拖 尾 因 子 的 变 化 这 同 时 也 有 助 于 您 预 测 何 时 需 要 更 换 色 谱 柱 清 洗 反 相 硅 胶 柱 有 时, 可 以 通 过 清 洗 色 谱 柱 缓 解 柱 压 高 或 峰 拖 尾 问 题 在 清 洗 色 谱 柱 之 前, 我 们 建 议 断 开 色 谱 柱 与 检 测 器 的 连 接, 让 清 洗 溶 剂 流 入 烧 杯 或 其 它 容 器 中 在 某 些 情 况 下, 可 反 冲 色 谱 柱 进 行 清 洗 使 污 染 物 从 柱 中 流 出 在 进 行 此 项 操 作 前, 应 向 色 谱 柱 厂 商 咨 询, 或 查 阅 色 谱 柱 所 附 说 明 书 清 洗 色 谱 柱 需 要 使 用 比 流 动 相 更 强 的 溶 剂 清 洗 分 析 柱 时, 每 种 溶 剂 至 少 应 使 用 10 个 柱 体 积 ( 见 图 39) 清 洗 反 相 柱 的 步 骤 如 下 清 洗 完 成 后, 按 厂 商 建 议 的 液 流 方 向 装 回 色 谱 柱 柱 压 过 高 问 题 可 能 不 是 柱 阻 塞 造 成 的, 而 是 系 统 中 的 密 封 垫 损 坏, 以 及 颗 粒 沉 积 在 在 线 滤 头 上 造 成 的, 在 清 洗 色 谱 柱 前, 应 尝 试 更 换 在 线 滤 头 59

62 不要试图更换色谱柱的进样口筛板 因为现在填充色谱柱采用的是高效工艺 这样做可能为色谱柱带 来不可恢复的损坏 ዹ ओ ዹ ओ 2.5mLx -65% 没有装填的柱体积 = 1.5 ml = 1 个柱体积 图 39. 计算柱体积 提示 为避免沉淀 如果系统中不含非挥发性缓冲液 在纯有机溶剂进入系统之前 首先用不含缓冲 液的水相流动相进行冲洗 反冲或清洗色谱柱的步骤 1. 断开色谱柱与检测器的连接 将管线留在色谱柱末端 将其放入接收液体的烧杯中 2. 先用不含缓冲液盐的流动相冲洗 水/有机相 3. 然后用 100% 有机相 甲醇和乙腈 冲洗 4. 检查压力是否回归正常 如果没有 再进行下一步操作 5. 丢弃色谱柱或考虑用更强的条件清洗 75% 乙腈/25% 异丙醇 % 异丙醇 % 二氯甲烷 * % 己烷* * 无论是使用己烷还是二氯甲烷 使用之前或恢复使用反相流动相之前必须用异丙醇进行冲洗 60

63 缓 冲 液 盐 可 能 发 生 沉 淀 并 造 成 色 谱 柱 内 反 压 发 生 这 种 情 况 时, 应 用 热 水 缓 慢 通 入 色 谱 柱, 以 去 除 沉 淀 含 丙 醇 的 冲 洗 溶 液 因 粘 度 增 大 将 产 生 更 高 的 操 作 压 力 在 清 洗 过 程 中 需 要 降 低 流 速, 以 保 持 安 全 的 操 作 压 力 清 洗 正 相 硅 胶 柱 对 于 正 相 色 谱 柱 只 能 使 用 有 机 溶 剂, 如 果 您 的 色 谱 柱 是 传 统 的 分 析 型 4.6 x 250 mm 色 谱 柱, 那 么 每 种 溶 剂 至 少 需 要 用 50 ml( 相 当 于 20 个 柱 体 积 ) 尝 试 下 列 强 度 递 增 的 溶 剂 进 行 清 洗 : 1. 50% 甲 醇 :50% 氯 仿 % 醋 酸 乙 酯 清 洗 正 相 模 式 色 谱 柱 还 取 决 于 样 品 类 型 如 果 用 这 些 溶 剂 的 清 洗 效 果 不 佳, 请 与 安 捷 伦 联 系, 以 便 我 们 可 以 根 据 您 的 应 用 和 样 品 基 质 推 荐 更 有 效 的 溶 剂 清 洗 反 相 聚 合 物 柱 当 使 用 聚 合 物 类 反 相 柱 时, 我 们 强 烈 建 议 流 动 相 中 最 少 含 有 1% 的 有 机 改 性 剂 长 期 使 用 100% 水 相 洗 脱 液 后 再 使 用 有 机 流 动 相 时 可 能 影 响 柱 效, 同 时 也 不 能 用 100% 的 水 相 缓 冲 液 冲 洗 色 谱 柱 可 以 进 行 反 向 冲 洗, 如 果 起 始 压 力 高, 可 降 低 流 速 下 面 是 反 相 聚 合 物 柱 的 清 洗 步 骤 : 1. 使 用 当 前 流 动 相 运 行 清 洗 梯 度, 再 用 高 比 例 有 机 溶 剂 (95%) 清 洗 数 个 柱 体 积 重 复 2 到 3 次 由 于 缓 冲 液 可 能 在 高 有 机 相 中 发 生 沉 淀, 因 此 如 果 您 的 流 动 相 含 缓 冲 液, 有 机 相 比 例 不 要 超 过 70%, 或 者 在 清 洗 之 前 用 不 含 缓 冲 液 的 流 动 相 将 缓 冲 液 清 洗 掉 2. 尝 试 使 用 较 高 强 度 的 有 机 改 性 剂, 如 TFA, 去 除 发 生 疏 水 键 合 的 污 染 物 3. 有 时 用 含 1.0% TFA 的 水 / 乙 腈 (v/v) 可 以 去 除 多 肽 或 蛋 白 污 染 物 4. 用 强 酸 和 强 碱 ( 包 括 1 M 氢 氧 化 钠 ) 适 当 清 洗 而 不 会 发 生 热 降 解 提 示 : 过 滤 样 品 将 增 加 色 谱 柱 的 使 用 寿 命, 也 可 减 少 仪 器 磨 损 61

64 方 法 开 发 如 果 您 还 没 有 建 立 HPLC 方 法, 要 进 行 稳 定 而 重 复 的 分 析, 就 需 要 进 行 方 法 开 发 了 具 备 进 行 成 功 方 法 开 发 的 技 能, 对 解 决 将 来 可 能 遇 到 的 复 杂 分 析 极 有 帮 助 在 本 章 中, 首 先 我 们 将 向 您 介 绍 对 所 有 HPLC 模 式 都 适 用 的 概 要 性 的 内 容 : 方 法 开 发 的 关 键 步 骤 模 式 选 择 色 谱 柱 填 料 和 规 格 固 定 相 的 选 择 接 下 来, 我 们 将 着 重 介 绍 反 相 方 法 的 开 发 : 反 相 色 谱 固 定 相 的 选 择 反 相 色 谱 流 动 相 的 选 择 流 动 相 操 作 要 点 涉 及 流 动 相 和 流 动 相 改 性 剂 的 故 障 排 查 实 例 用 流 动 相 改 性 剂 控 制 ph 与 ph 相 关 的 故 障 排 查 实 例 聚 合 物 色 谱 柱 的 反 相 方 法 开 发 将 常 规 柱 上 的 现 有 方 法 转 移 到 表 面 多 孔 填 料 柱 的 要 点 方 法 开 发 的 步 骤 指 南 自 动 化 方 法 开 发 62

65 本 章 的 最 后, 我 们 还 将 讨 论 其 它 HPLC 模 式 的 方 法 开 发 : HILIC 正 相 色 谱 离 子 交 换 色 谱 凝 胶 渗 透 / 体 积 排 阻 色 谱 LC/MS 方 法 开 发 : 从 何 处 入 手 方 法 开 发 的 总 体 目 标 是 在 尽 可 能 短 的 时 间 内 优 化 目 标 物 的 分 离 度 当 您 开 始 考 虑 进 行 方 法 开 发 时, 最 好 先 回 顾 一 下 分 离 度 的 关 键 影 响 因 素 可 以 复 习 色 谱 基 本 概 念 一 章 ( 第 5-11 页 ) 典 型 的 方 法 开 发 流 程 包 含 以 下 步 骤, 同 时 也 是 本 章 内 容 的 主 线 : 1. 选 择 分 离 模 式 2. 选 择 色 谱 柱 和 填 料 规 格 3. 选 择 固 定 相 填 料 4. 选 择 流 动 相 溶 剂 5. 如 果 分 离 模 式 需 要, 调 节 流 动 相 的 ph 6. 进 行 等 度 或 梯 度 初 步 实 验, 以 确 定 边 界 条 件 7. 优 化 实 验 条 件 模 式 选 择 您 应 该 做 的 第 一 件 事 就 是 选 择 HPLC 模 式 通 常 分 离 模 式 是 由 以 下 因 素 决 定 的 : 目 标 物 的 类 型 和 溶 解 度 目 标 物 分 子 量 (MW) 样 品 基 质 以 及 可 使 用 的 固 定 相 和 色 谱 柱 图 40 和 41 根 据 化 合 物 分 子 量 和 将 使 用 的 溶 剂, 列 出 了 评 价 分 离 模 式 最 佳 选 择 的 步 骤 63

66 溶 剂 分 离 模 式 己 烷 使 用 未 修 饰 硅 胶 的 正 相 色 谱 ( 吸 附 ) 使 用 键 合 相 硅 胶 的 正 相 色 谱 有 机 相 甲 醇 和 甲 醇 : 水 或 乙 腈 和 乙 腈 : 水 反 相 (RP) HILIC( 对 于 在 反 相 条 件 下 弱 保 留 的 物 质 ) 分 子 量 < 2000 THF 凝 胶 渗 透 ( 小 分 子 ) 非 离 子 型 反 相 HILIC( 对 于 在 反 相 条 件 下 弱 保 留 的 物 质 ) 水 相 离 子 型 使 用 离 子 控 制 的 反 相 色 谱 使 用 离 子 对 试 剂 的 反 相 色 谱 使 用 未 修 饰 硅 胶 的 反 相 色 谱 离 子 交 换 有 机 相 凝 胶 渗 透 分 子 量 > 2000 水 相 凝 胶 过 滤 使 用 大 孔 填 料 的 离 子 交 换 色 谱 使 用 大 孔 填 料 的 反 相 色 谱 图 40. 按 溶 剂 和 分 离 模 式 选 择 LC 和 LC/MS 色 谱 柱 64

67 分 子 大 小 溶 剂 化 合 物 类 型 分 离 机 制 小 水 相 / 有 机 相 脂 类 银 离 子 络 合 多 环 芳 烃 有 机 酸 单 糖 和 二 糖 低 聚 糖 糖 醇 正 相 碱 性 极 性 氢 键 结 合 位 置 异 构 体 芳 香 族 化 合 物 或 结 构 相 似 物 强 极 性 极 端 条 件 反 相 C18 配 位 相 互 所 用 反 相 离 子 对 配 位 相 互 所 用 正 相 氨 基 离 子 交 换 配 位 相 互 作 用 和 离 子 交 换 配 位 相 互 所 用 正 相 氨 基 / 氰 基 / 二 醇 极 性 反 相 C8 或 C18 或 HILIC 反 相 C18 离 子 抑 制 反 相 C8 或 C18 反 相 C8 反 相 苯 基 / 苯 基 - 己 基 / 二 苯 基 反 相 其 它 或 HILIC 反 相 聚 合 物 有 机 相 非 极 性 正 相 Si 极 性 正 相 氨 基 / 氰 基 / 二 醇 图 41. 按 分 析 物 和 分 离 机 制 选 择 LC 和 LC/MS 色 谱 柱 有 时, 一 组 特 定 分 析 物 可 以 用 一 种 以 上 的 模 式 分 离 例 如, 离 子 型 化 合 物 可 以 用 树 脂 或 硅 胶 基 色 谱 柱 进 行 离 子 交 换 色 谱 分 离, 也 可 以 用 反 相 柱 进 行 反 相 离 子 对 分 配 色 谱 分 离 许 多 色 谱 工 作 者 都 是 以 反 相 HPLC 开 始 分 离, 因 为 反 相 色 谱 已 发 表 了 许 多 应 用 文 章 可 供 参 考 用 反 相 色 谱 可 以 分 析 非 极 性 非 离 子 型 离 子 型 和 极 性 化 合 物, 选 择 适 当 的 流 动 相 和 分 析 条 件, 有 时 整 个 分 析 都 可 以 仅 用 这 一 种 模 式 完 成 继 反 相 色 谱 之 后, 我 们 还 将 在 本 章 的 最 后 讨 论 其 它 分 离 模 式 65

68 选 择 色 谱 柱 和 填 料 规 格 图 42 显 示 了 评 价 色 谱 柱 固 定 相 和 色 谱 柱 规 格 时 考 虑 的 部 分 参 数 要 进 行 高 通 量 分 析, 小 粒 径 短 柱 ( 如 亚 2 µm) 是 最 佳 选 择 如 果 您 要 对 包 含 多 种 组 分 的 样 品 进 行 复 杂 的 分 离, 可 以 选 择 填 充 小 粒 径 填 料 的 长 柱, 切 记, 这 种 色 谱 柱 的 操 作 压 力 可 能 会 显 著 增 加 如 果 您 要 进 行 质 谱 分 析, 窄 内 径 柱 ( 如 2.1 mm 内 径 ) 是 最 佳 选 择, 因 为 与 质 谱 检 测 器 联 用 需 要 较 低 流 速 制 备 色 谱 常 使 用 填 充 较 大 粒 径 填 料 (5 或 10 µm) 的 大 内 径 柱 对 于 这 种 色 谱 柱, 高 流 速 正 好 与 制 备 柱 的 流 量 需 求 相 匹 配 填 料 的 孔 径 非 常 重 要, 因 为 待 测 分 子 必 须 与 多 孔 结 构 相 匹 配, 才 能 与 固 定 相 发 生 相 互 作 用 较 小 孔 径 的 填 料 ( 孔 径 80 到 120Å) 最 适 合 分 离 分 子 量 2000 以 下 的 小 分 子 对 于 分 子 量 超 过 2000 的 较 大 分 子, 需 要 使 用 较 大 孔 填 料 ; 例 如, 分 离 蛋 白 质 的 常 用 孔 径 是 300Å 对 大 多 数 分 离 来 说, 都 可 以 使 用 不 锈 钢 柱 硬 件 但 是, 如 果 您 要 分 析 的 是 可 能 与 金 属 表 面 发 生 相 互 所 用 的 敏 感 分 子, 如 某 些 类 型 的 生 物 分 子, 则 需 要 使 用 PEEK 或 玻 璃 内 衬 不 锈 钢 等 柱 材 料 对 于 痕 量 阳 离 子 的 分 离, PEEK 柱 的 惰 性 最 高 请 注 意,PEEK 柱 的 压 力 上 限 为 400 bar HPLC 色 谱 柱 固 定 相 色 谱 柱 规 格 表 面 类 型 孔 径 填 料 粒 径 长 度 内 径 化 学 性 质 化 学 寿 命 / 灵 敏 度 保 留 因 子 物 理 性 质 柱 效 速 度 图 42. 部 分 色 谱 柱 及 固 定 相 影 响 66

69 选 择 固 定 相 有 包 含 各 种 分 离 模 式 的 多 种 固 定 相 可 供 选 择 许 多 色 谱 工 作 者 都 以 最 通 用 的 十 八 烷 基 硅 烷 化 (C18) 固 定 相 开 始 进 行 反 相 色 谱 分 离, 尤 其 是 对 小 分 子 的 分 离 下 面 我 们 将 着 重 讨 论 反 相 分 离 的 问 题, 本 章 后 面 部 分 再 涉 及 其 它 分 离 模 式 反 相 色 谱 的 方 法 开 发 反 相 色 谱 是 到 目 前 为 止 最 通 用 的 HPLC 方 法 大 约 占 所 有 方 法 的 60%, 将 近 95% 的 色 谱 工 作 者 都 在 使 用 在 反 相 色 谱 中, 分 析 物 在 极 性 流 动 相 和 非 极 性 固 定 相 之 间 分 配 与 正 相 色 谱 相 反 通 常, 分 析 物 与 疏 水 固 定 相 之 间 发 生 非 极 性 非 特 异 性 相 互 作 用, 即, 样 品 分 配 入 固 定 相 我 们 使 用 C18 C8 苯 基 或 C3 等 固 定 相, 产 生 极 性 差 异 和 / 或 基 于 分 子 芳 香 结 构 的 差 异 极 性 较 强 的 分 析 物 比 非 极 性 分 析 物 在 反 相 固 定 相 中 的 保 留 弱 保 留 与 分 析 物 的 疏 水 性 基 本 上 成 正 比 具 有 大 疏 水 基 团 和 带 较 长 烷 烃 链 的 同 系 物, 比 结 构 中 带 极 性 基 团 的 分 子 ( 如 氨 基 羟 基 ) 保 留 更 强 如 果 有 一 系 列 脂 肪 酸, 如 C12 C14 C16 和 C18, 则 C12 保 留 最 弱,C18 保 留 最 强 流 动 相 主 要 由 两 部 分 组 成 : 1. 水, 可 含 缓 冲 液, 或 用 酸 或 碱 调 节 ph 2. 可 与 水 混 溶 的 有 机 溶 剂 反 相 色 谱 有 多 种 用 途, 有 时 在 同 一 色 谱 分 析 中 就 可 以 分 离 非 极 性 极 性 可 离 子 化 的 和 离 子 型 分 子 一 般 来 说, 对 于 可 离 子 化 的 化 合 物, 为 了 增 加 保 留 和 改 善 峰 形, 我 们 会 在 流 动 相 中 加 入 改 性 剂, 以 抑 制 离 子 化, 减 弱 其 极 性, 使 其 保 留 更 强 反 相 色 谱 固 定 相 的 选 择 下 面 我 们 要 讨 论 如 何 开 发 反 相 方 法 图 43 显 示 了 如 何 根 据 特 定 分 析 物 的 分 子 量 选 择 合 适 固 定 相 的 一 般 流 程 首 先, 必 须 选 择 孔 径, 以 确 保 目 标 分 子 能 够 进 入 填 料, 在 孔 隙 中 与 疏 水 固 定 相 发 生 相 互 作 用 然 后, 选 择 固 定 相, 多 数 情 况 下 是 从 C18 固 定 相 开 始 根 据 方 法 的 最 终 目 标 不 同, 可 以 选 择 常 规 分 析 柱, 如 果 需 要 进 行 高 通 量 分 析, 可 以 选 择 快 速 分 析 反 相 色 谱 柱 67

70 小 分 子 分 子 量 < 2000 大 分 子 分 子 量 > Å 填 料 孔 径 300Å 首 先 根 据 待 分 析 物 的 分 子 大 小 选 择 填 料 的 孔 径 通 常 小 分 子 可 轻 易 扩 散 进 出 Å 孔 径 的 填 料, 但 较 大 的 多 肽 和 蛋 白 质 则 不 能 基 于 这 个 原 因, 建 议 用 300Å 孔 径 的 填 料 (300SB) 进 行 多 肽 和 蛋 白 质 的 等 度 或 梯 度 分 离 Eclipse Plus C18 起 始 色 谱 柱 键 合 相 StableBond 300SB-C18 对 于 大 多 数 样 品 来 说, 建 议 将 C18 作 为 开 始 分 析 的 固 定 相, 因 为 其 可 以 最 大 限 度 地 保 留 中 等 极 性 到 非 极 性 化 合 物 如 果 用 C18 固 定 相 不 能 优 化 分 离 度, 或 您 要 分 析 的 是 蛋 白 质, 或 用 常 规 反 相 溶 剂 很 难 从 C18 上 洗 脱 的 强 疏 水 化 合 物, 可 以 考 虑 使 用 短 链 固 定 相 小 分 子 大 分 子 标 准 分 析 快 速 分 析 标 准 分 析 快 速 分 析 Eclipse Plus C18 Poroshell 120 EC-C18 ZORBAX 300SB-C18 ZORBAX 300SB-C x 150 mm, 3.5 µm 4.6 x 100 mm, 2.7 µm 4.6 x 150 mm, 5 µm 4.6 x 50 mm, 3.55 µm 部 件 号 ( 表 面 多 孔 型 ) 部 件 号 部 件 号 Poroshell 120 EC-C18 部 件 号 Poroshell 300SB-C x 7.5 mm, 2.7 µm 部 件 号 ZORBAX 超 高 压 快 速 高 分 离 度 Eclipse Plus C18, 1200 bar 2.1 x 75 mm, 5 µm 部 件 号 x 50 mm, 1.8 µm 部 件 号 图 43. 反 相 色 谱 : 固 定 相 选 择 概 览 大 多 数 色 谱 工 作 者 是 从 C18 固 定 相 开 始, 但 如 图 44 所 示, 如 果 C18 不 能 进 行 有 效 分 离, 其 它 固 定 相 也 可 以 提 供 不 同 的 选 择 性 在 本 例 中, 我 们 在 含 不 同 亚 2 µm 填 料 的 快 速 分 离 高 通 量 短 柱 上 分 离 了 心 血 管 药 物, 使 用 含 70% 磷 酸 盐 缓 冲 液 (ph 3.0) 和 30% 乙 腈 的 等 度 缓 冲 流 动 相 68

71 虽 然, 所 有 色 谱 柱 都 使 样 品 中 的 5 种 药 物 得 到 了 完 全 或 部 分 分 离, 但 SB-CN 柱 不 仅 分 离 度 足 够, 而 且 分 离 速 度 最 快 峰 归 属 1. 心 得 乐 2. Diisopyridamide 3. 心 得 安 4. 双 嘧 达 莫 5. 地 尔 硫 卓 分 析 条 件 色 谱 柱 : ZORBAX RRHT, 4.6 x 50 mm, 1.8 µm 流 动 相 : A:25 mm NaH 2 PO 4, ph 3.0 B: 乙 腈 流 动 相 组 成 : 30% B 流 速 : 2.0 ml/min 温 度 : 30 C 检 测 : UV 240 nm 样 品 : 心 血 管 药 物 图 44. 反 相 色 谱 中 键 合 相 的 选 择 性 差 异 原 则 上, 应 该 选 择 符 合 样 品 需 求 的 固 定 相 疏 水 性 小 分 子 应 首 选 较 长 链 烷 烃 键 合 相, 如 C18 如 果 在 C18 固 定 相 上 保 留 过 强, 再 选 择 较 短 链 的 C8 或 C3 固 定 相 C8 固 定 相 与 C18 具 有 相 似 的 选 择 性, 但 保 留 稍 弱 对 于 疏 水 性 很 强 的 分 子, 最 好 使 用 短 链 固 定 相, 如 C3 如 果 待 分 析 物 分 子 具 有 芳 香 结 构, 在 烷 烃 固 定 相 上 不 能 完 全 分 离, 可 以 使 用 芳 香 键 合 相, 如 苯 基 或 二 苯 基 在 本 例 中, 目 标 分 析 物 具 有 强 极 性, 在 一 般 的 反 相 色 谱 填 料 上 不 保 留 或 保 留 很 弱, 可 以 考 虑 换 一 种 HPLC 分 离 模 式, 用 亲 水 相 互 作 用 色 谱 (HILIC)( 参 见 92 页 的 HILIC 部 分 ) 如 果 在 方 法 开 发 过 程 中, 必 须 使 用 高 ph 条 件, 就 要 选 择 为 高 ph 下 操 作 而 设 计 的 固 定 相, 如 Extend-C18, 或 聚 合 物 固 定 相, 如 PLRP-S 短 链 固 定 相 在 高 ph 值 下 不 稳 定, 可 能 发 生 硅 胶 溶 解 69

72 反 相 色 谱 流 动 相 的 选 择 一 般 来 说, 反 相 LC 的 流 动 相 包 括 水 和 作 为 改 性 剂 的 乙 腈 或 甲 醇 不 太 常 用 的 改 性 剂 还 有 四 氢 呋 喃 (THF) 和 异 丙 醇 我 们 建 议 一 定 要 使 用 色 谱 级 以 上 的 溶 剂 和 改 性 剂 对 于 UHPLC, 安 捷 伦 建 议 只 使 用 LC/MS 级 以 上 的 溶 剂 选 择 性 差 异 和 样 品 的 保 留 都 会 因 流 动 相 不 同 而 明 显 改 变 样 品 溶 解 度 也 很 可 能 不 同, 需 要 使 用 特 殊 的 溶 剂 或 多 种 溶 剂 在 反 相 色 谱 中, 流 动 相 中 水 相 的 ph 和 离 子 强 度 在 开 发 对 条 件 微 小 变 化 不 敏 感 的 耐 用 方 法 中 非 常 重 要 对 于 离 子 型 化 合 物, 典 型 样 品 的 保 留 随 ph 改 变 而 明 显 变 化 在 这 类 反 相 系 统 中, 控 制 ph 对 于 保 留 和 选 择 性 的 稳 定 非 常 重 要 通 常 在 ph 2 到 4 条 件 下, 保 留 时 间 对 ph 的 微 小 改 变 稳 定 性 最 高, 因 此 建 议 将 这 一 ph 范 围 作 为 大 多 数 样 品 方 法 开 发 的 起 始 ph, 包 括 碱 性 化 合 物 和 一 般 的 弱 酸 考 虑 到 重 现 性, 所 用 的 ph 应 高 于 或 低 于 待 分 离 溶 质 pk a 或 pk b 上 下 一 个 ph 单 位 您 可 能 不 清 楚 分 析 物 的 pk a, 因 此, 测 试 一 种 以 上 流 动 相 ph 可 提 供 最 好 结 果 大 多 数 反 相 柱 都 可 以 在 ph 2-8 条 件 下 使 用, 为 您 的 分 离 选 择 最 佳 流 动 相 ph 提 供 了 较 宽 的 范 围 请 注 意, 测 定 流 动 相 ph 时, 要 在 水 相 与 有 机 改 性 剂 混 合 之 前 在 水 相 中 进 行 测 定, 以 确 保 得 到 准 确 而 可 重 复 的 结 果 流 动 相 操 作 当 您 开 始 启 用 刚 从 包 装 盒 中 取 出 的 新 柱 时, 只 能 使 用 与 柱 内 装 运 溶 剂 兼 容 的 溶 剂 为 防 止 缓 冲 液 在 色 谱 柱 内 沉 淀, 反 相 操 作 时 不 能 将 缓 冲 液 泵 入 用 100% 有 机 溶 剂 装 运 的 色 谱 柱 我 们 的 建 议 是, 先 用 不 含 缓 冲 液 的 流 动 相 平 衡 色 谱 柱, 然 后 再 用 含 缓 冲 液 的 流 动 相 平 衡 氰 基 和 氨 基 柱 都 既 可 以 使 用 正 相 溶 剂, 也 可 以 使 用 反 相 溶 剂, 因 此, 在 平 衡 前 需 要 检 查 您 的 溶 剂 是 否 与 装 运 溶 剂 混 溶 如 果 想 把 一 根 正 相 柱 变 为 反 相 柱, 要 先 用 彼 此 混 溶 的 溶 剂 冲 洗, 如 异 丙 醇 然 后 再 用 您 的 流 动 相 平 衡 溶 剂 的 混 溶 性 图 表 见 有 用 的 参 考 资 料 一 章 请 注 意, 流 动 相 是 可 能 使 HPLC 柱 产 生 问 题 的 潜 在 来 源 为 避 免 这 些 问 题, 请 查 看 134 页 参 考 资 料 一 章 中 的 常 用 溶 剂 性 质 及 混 溶 性 信 息 流 动 相 和 流 动 相 改 性 剂 问 题 排 查 在 图 45 的 实 例 中, 开 始 在 一 根 较 旧 的 色 谱 柱 ( 柱 1) 上 进 行 分 析, 性 能 尚 可 但 色 谱 操 作 者 改 用 一 根 新 柱 ( 柱 2) 进 行 分 离, 关 键 组 分 的 分 离 度 明 显 变 差, 于 是 便 认 为 新 柱 较 差 当 色 谱 操 作 者 用 新 配 制 的 流 动 相 缓 冲 液 进 行 分 析 时, 分 离 度 又 恢 复 了 正 常, 见 右 侧 的 色 谱 图 在 本 例 中, 问 题 就 出 在 溶 剂 瓶 中 坏 了 的 TFA 或 磷 酸 上 这 些 溶 剂 使 用 了 一 段 时 间 后, 已 产 生 了 变 化 或 被 污 染 在 下 一 章 中, 我 们 还 将 讨 论 更 多 使 用 缓 冲 液 或 流 动 相 改 性 剂 方 面 的 问 题 使 用 与 流 动 相 相 同 的 溶 剂 进 行 样 品 配 置 非 常 重 要 从 30 页 的 例 子 中 可 以 看 出, 当 进 样 溶 剂 比 流 动 相 强 时, 可 能 出 现 峰 变 宽 或 分 裂 70

73 柱 1 柱 2 柱 2 新 配 制 流 动 相 图 45. 流 动 相 的 变 化 可 能 对 结 果 有 显 著 影 响 流 动 相 混 合 有 时, 流 动 相 会 因 为 实 验 室 中 的 混 合 方 式 而 不 同 例 如, 如 果 要 配 制 甲 醇 / 水 = 50/50 的 混 合 溶 剂, 应 先 量 取 各 自 的 体 积, 分 别 置 于 洁 净 的 玻 璃 容 器 中, 然 后 再 将 其 混 合, 因 为 甲 醇 和 水 混 合 溶 剂 的 总 体 积 大 于 各 自 体 积 之 和 如 果 在 同 一 个 容 器 中 混 合, 混 合 溶 剂 的 总 体 积 就 会 不 同 因 此, 这 两 份 以 不 同 方 式 配 制 的 流 动 相 组 成 存 在 差 异 流 动 相 脱 气 流 动 相 脱 气 也 很 重 要 在 流 路 中, 溶 解 在 溶 剂 中 的 气 体 可 能 逸 出, 形 成 气 泡, 并 有 可 能 干 扰 泵 或 检 测 器 的 性 能 幸 运 的 是, 现 在 大 多 数 液 相 色 谱 系 统 都 配 备 在 线 脱 气 机, 但 如 果 脱 气 机 被 设 为 旁 路, 没 有 脱 气 机 或 不 能 正 常 工 作, 一 定 要 通 氦 气, 或 用 其 它 方 法 脱 气 用 流 动 相 改 性 剂 控 制 ph 流 动 相 ph 对 色 谱 分 离 的 影 响 有 多 种 方 式 根 据 您 所 分 析 的 化 合 物,pH 可 能 影 响 选 择 性 峰 形 和 保 留 如 果 是 非 极 性 较 强 或 中 性 的 化 合 物,pH 对 分 离 度 和 保 留 的 影 响 一 般 不 明 显 图 46 显 示 了 一 个 ph 是 如 何 影 响 分 离 度 的 简 单 实 例 左 侧, 是 一 个 分 别 在 ph 3 和 7 条 件 下 分 离 的 非 极 性 样 品 的 例 子 请 注 意, 两 张 色 谱 图 没 有 区 别 可 以 看 出, 中 间 的 极 性 化 合 物 在 C18 柱 上 保 留 较 弱 请 注 意,pH 对 两 个 化 合 物 的 保 留 时 间 和 峰 形 几 乎 没 有 影 响 71

74 如 果 是 可 离 子 化 的 化 合 物, 如 酸 或 碱, 可 以 看 出 保 留 因 子 和 选 择 性 随 ph 改 变 变 化 非 常 明 显 请 看 右 侧 中 苯 甲 酸 和 苯 酰 苯 胺 的 例 子, 保 留 因 子 随 ph 改 变 而 变 化 苯 酰 苯 胺 是 中 性 化 合 物, 保 留 几 乎 不 变, 而 苯 甲 酸 的 保 留 在 ph 从 3 变 为 7 时 变 化 非 常 明 显 在 ph 7 条 件 下, 大 大 高 于 苯 甲 酸 的 pk a, 苯 甲 酸 是 以 阴 离 子 的 形 式 存 在 这 种 偏 离 子 形 态 与 水 相 流 动 相 的 亲 和 性 较 好, 比 ph 3 时 从 色 谱 柱 中 洗 脱 更 快, 在 ph 3 条 件 下, 其 主 要 是 以 离 子 抑 制 形 式 存 在 非 极 性 萘 二 氢 苊 极 性 苯 甲 醇 硝 基 苯 可 离 子 化 苯 甲 酸 苯 酰 苯 胺 可 离 子 化 的 化 合 物 酸 和 碱 的 保 留 和 选 择 性 随 ph 变 化 而 发 生 明 显 改 变 图 46. ph 与 分 离 度 在 开 发 可 离 子 化 分 析 物 的 分 析 方 法 时, 重 要 的 是 要 清 楚 非 离 子 化 形 态 的 分 析 物 比 离 子 化 形 态 的 分 析 物 保 留 更 好 如 果 是 酸 性 分 析 物, 应 选 择 低 ph 缓 冲 液 流 动 相, 以 防 止 分 析 物 离 子 化 了 解 分 析 物 的 pk a, 才 能 够 有 效 地 选 择 流 动 相 ph 缓 冲 范 围 应 在 其 缓 冲 液 离 子 pk 值 的 +/-1 ph 单 位, 使 流 动 相 的 优 化 具 有 一 定 的 灵 活 性 例 如, 醋 酸 盐 的 pk a 为 4.8, 缓 冲 范 围 从 ph 甲 酸 盐 的 酸 性 较 大, 缓 冲 范 围 为 ph 如 果 您 的 酸 性 分 析 物 在 低 ph 下 不 能 发 生 离 子 化, 还 可 以 选 择 其 它 缓 冲 液 如 需 了 解 有 关 缓 冲 液 的 更 多 信 息, 可 参 见 137 页 上 的 图 表 对 于 碱 性 化 合 物 而 言, 在 高 ph 条 件 下 才 能 得 到 其 非 离 子 化 形 态, 但 这 对 色 谱 柱 不 利 但 许 多 碱 性 化 合 物 在 低 ph 条 件 下 的 保 留 就 已 经 足 够 了 因 此, 虽 然 非 离 子 化 形 态 能 得 到 更 高 的 保 留, 但 这 对 与 所 有 的 碱 性 化 合 物 并 不 是 实 用 和 必 要 的 * 一 般 而 言, 非 离 子 化 一 词 可 与 离 子 抑 制 一 词 互 换 72

75 另 一 个 影 响 酸 性 和 碱 性 化 合 物 保 留 的 问 题 是 在 中 性 ph 条 件 下 硅 胶 表 面 的 硅 醇 基 可 能 发 生 离 子 化 通 常, 这 些 硅 醇 基 都 发 生 去 质 子 化, 带 负 电 荷 从 而 使 带 正 电 荷 的 碱 性 离 子 保 留 更 强 这 会 导 致 离 子 交 换 相 互 作 用, 一 种 次 级 相 互 作 用 由 于 与 反 相 柱 之 间 发 生 了 相 互 作 用 而 不 是 分 配, 导 致 峰 展 宽 或 峰 拖 尾 这 种 情 况 在 低 ph 条 件 下 不 会 发 生, 这 也 是 反 相 色 谱 中 酸 性 流 动 相 更 适 合 分 离 离 子 型 化 合 物 的 另 一 个 原 因 缓 冲 液 选 择 要 点 : 成 功 的 HPLC 分 离 不 必 完 全 抑 制 离 子 化 通 常, 在 流 动 相 缓 冲 容 量 足 够 的 情 况 下,90% 的 抑 制 即 可 流 动 相 的 缓 冲 容 量 与 配 制 的 摩 尔 浓 度, 以 及 洗 脱 液 的 ph 与 缓 冲 离 子 pk 的 接 近 程 度 有 关 通 常 在 高 于 或 低 于 缓 冲 离 子 pk 1 个 ph 单 位 内, 可 以 起 到 缓 冲 效 果 常 用 缓 冲 液 pk 和 ph 范 围 参 见 参 考 资 料 一 章 第 110 页 上 的 图 表 色 谱 操 作 者 也 可 以 选 择 非 缓 冲 的 流 动 相 进 行 ph 调 节 这 对 于 酸 性 分 析 物 而 言 也 不 是 不 常 用 的, 用 单 一 的 酸 溶 液 进 行 色 谱 分 离, 酸 的 浓 度 应 足 以 使 ph 比 需 要 值 低 得 多 对 于 碱 性 物 质 的 分 离, 选 择 是 比 较 有 限 的 TEA( 三 乙 胺 ) 不 能 完 全 溶 于 水, 而 且 pk (11) 很 高, 氨 本 身 可 以 完 全 溶 于 水, 但 对 大 多 数 色 谱 柱 来 说 pk 值 过 高 UV 检 测 器 常 用 的 缓 冲 液 缓 冲 液 的 选 择 对 检 测 方 式 有 很 大 影 响 对 于 使 用 UV 检 测 器 的 色 谱 操 作 者 来 说, 在 目 标 波 长 下 缓 冲 液 应 完 全 透 光 缓 冲 液 的 UV 截 止 波 长 最 好 低 于 220 nm 许 多 常 用 的 缓 冲 液 都 符 合 UV 透 光 率 的 要 求, 尤 其 是 色 谱 级 或 以 上 的 缓 冲 液 例 如, 磷 酸 及 其 盐 类 具 有 良 好 的 低 UV 透 光 率, 和 乙 腈 一 起, 成 为 许 多 方 法 开 发 工 作 者 的 首 选 对 碱 的 分 离, 可 以 选 择 TEA- 磷 酸 盐 磷 酸 盐 在 有 机 相 比 例 高 的 溶 剂 中 溶 解 度 较 低, 针 对 这 一 缺 陷, 建 议 磷 酸 盐 缓 冲 液 与 有 机 溶 剂 混 合 时, 有 机 相 不 要 超 过 70% 所 幸 这 些 需 要 离 子 化 控 制 的 化 合 物 通 常 极 性 都 较 强, 不 需 要 用 高 比 例 有 机 溶 剂 对 其 进 行 洗 脱, 甚 至 在 其 离 子 抑 制 状 态 醋 酸 盐 正 如 甲 酸 盐 和 TEA 一 样, 在 240 nm 以 下 波 长 都 有 UV 背 景 吸 收, 很 难 在 210 nm 以 下 达 到 有 效 使 用 浓 度 由 于 方 法 开 发 工 作 者 都 依 赖 于 UV 检 测, 通 常 是 从 低 UV 波 长 开 始 获 取 2D 通 道 和 3D 光 谱 图, 所 以 乙 腈 / 磷 酸 盐 组 合 可 以 满 足 方 法 开 发 的 许 多 需 要 提 示 : 在 参 考 资 料 一 章, 第 137 页, 我 们 用 列 出 了 常 用 流 动 相 改 性 剂 的 UV 截 止 表 随 着 波 长 降 低, 逐 渐 接 近 改 性 剂 的 UV 截 止 波 长, 您 将 会 发 现 检 测 方 面 的 问 题 73

76 LC/MS 的 考 虑 因 素 当 使 用 质 谱 检 测 器,LC/MS 离 子 源 时, 极 其 重 要 的 一 点 是 流 动 相 中 不 能 含 非 挥 发 性 物 质, 有 时 甚 至 样 品 中 也 不 能 有, 这 样 做 是 因 为 某 些 物 质 会 在 离 子 源 中 变 干, 可 以 防 止 流 动 相 雾 化 时 污 染 离 子 源 例 如, 溶 剂 前 沿 中 有 一 定 量 样 品 基 质 中 的 无 机 盐, 可 能 进 入 离 子 源 由 于 用 LC/UV 进 行 的 方 法 开 发 可 能 以 后 还 需 要 应 用 于 LC/MS, 所 以 许 多 工 作 者 不 再 使 用 磷 酸 磷 酸 盐 不 挥 发 的 反 离 子, 以 及 在 离 子 源 中 可 造 成 离 子 抑 制 的 挥 发 性 改 性 剂 (TFA 和 TEA 就 是 最 常 见 的 例 子 ) 因 此, 如 今 的 趋 势 是 使 用 甲 酸 盐 和 醋 酸 盐, 及 其 挥 发 性 铵 盐, 成 为 主 要 的 离 子 改 性 剂 虽 然 它 们 能 完 全 溶 解 于 有 机 溶 剂, 具 有 挥 发 性 和 高 色 谱 级 或 质 谱 级 纯 度, 但 却 不 能 在 低 波 长 下 使 用 光 学 检 测 器 (UV 或 二 极 管 阵 列 UV) 改 性 剂 必 须 加 入 水 相 和 有 机 相 中, 有 机 相 中 改 性 剂 的 浓 度 略 低 ( 通 常 为 水 相 中 浓 度 的 85%), 因 为 有 机 溶 剂 的 吸 收 性 质 不 同 另 外,ELSD( 蒸 发 光 散 射 检 测 器 ) 也 需 要 完 全 挥 发 的 流 动 相, 可 以 代 替 UV 和 / 或 RID( 示 差 折 光 检 测 器 ) 进 行 许 多 分 析, 不 再 使 用 常 用 的 前 -MS 改 性 剂 浓 缩 试 剂 1 分 子 量 密 度 2 大 致 强 度 摩 尔 浓 度 (M) 当 量 浓 度 (N) 配 制 1000 ml 3 溶 液 需 要 的 体 积 (ml) 1 M 1 N 醋 酸 (CH 3 COOH) % 甲 酸 (HCOOH) % 氢 氧 化 铵 (NH 4 OH) % 基 于 原 子 量 表 (32 C = 12) 2. 代 表 值,w/w%. 3. 精 确 到 0.5 ml 4. 相 当 于 28.0% w/w NH 3 表 8. 用 于 LC/MS 的 流 动 相 改 性 剂 使 用 Agilent Captiva 增 强 型 注 射 式 过 滤 器 过 滤 样 品, 萃 取 物 含 量 低, 经 认 证, 可 用 于 液 相 质 谱 图 47. 注 射 式 过 滤 器 74

77 有 关 ph 的 几 点 注 意 事 项 : 离 子 抑 制 形 态 下 的 分 析 物 具 有 更 好 的 保 留 ( 例 如, 低 ph 下 的 酸 和 高 ph 下 的 碱 ) 在 中 性 和 较 高 ph 下, 硅 胶 上 的 硅 醇 基 发 生 离 子 化, 增 加 了 碱 性 分 析 物 的 保 留 ( 例 如, 可 能 发 生 离 子 交 换 相 互 作 用 ) 在 方 法 开 发 过 程 中, 可 选 择 流 动 相 ph 对 保 留 和 选 择 性 进 行 优 化 为 延 长 柱 寿 命, 避 免 使 用 极 端 ph 值 极 高 或 极 低 可 以 使 用 缓 冲 液 帮 助 调 节 ph 值 缓 冲 液 可 以 保 持 ph 不 变, 提 高 重 现 性 选 择 流 动 相 改 性 剂 时, 一 定 要 考 虑 检 测 器 与 UV 检 测 器 匹 配 良 好 的 改 性 剂 不 一 定 与 MS 检 测 器 兼 容 Eclipse Plus 可 在 宽 ph 范 围 (ph 2-9) 内 使 用 其 它 选 择 包 括, 高 ph(poroshell HPH,Extend-C18, 聚 合 物 型 固 定 相 ) 和 低 ph(stablebond 和 聚 合 物 型 固 定 相 ) 当 混 合 醋 酸 三 乙 胺 或 磷 酸 三 乙 胺 时, 应 先 加 入 磷 酸 盐 或 醋 酸 盐, 然 后 再 加 入 三 乙 胺, 因 为 纯 三 乙 胺 可 能 不 溶 于 水 混 合 缓 冲 液 的 良 好 习 惯 : 1. 使 用 正 常 工 作 的 ph 计 按 照 目 标 ph 值 校 正 ph 计 用 ph 计 对 ph 进 行 可 靠 的 测 量 非 常 重 要 2. 确 保 试 剂 尽 可 能 新 鲜 3. 先 把 固 体 溶 解 在 非 常 接 近 终 体 积 的 液 体 中 调 节 ph 到 目 标 值 后, 再 添 加 液 体 使 溶 液 达 到 目 标 体 积 4. ph 调 节 应 在 加 入 有 机 溶 剂 之 前 的 水 相 中 进 行, 加 入 有 机 溶 剂 后 再 测 ph 不 可 靠 5. 缓 冲 液 配 制 完 成 后, 在 HPLC 系 统 上 使 用 之 前 要 进 行 过 滤, 去 除 水 或 盐 中 可 能 存 在 的 颗 粒 大 多 数 HPLC 应 用 都 使 用 0.45 µm 滤 膜,UHPLC 则 使 用 0.22 µm 滤 膜 提 示 : 某 些 盐, 如 醋 酸 铵 和 甲 酸 铵, 吸 湿 性 较 强, 如 果 将 其 长 期 放 在 试 剂 架 上, 开 瓶 并 使 用 较 长 时 间 后, 将 吸 收 水 分 所 以, 在 方 法 开 始 时 最 好 实 验 确 定 这 些 盐 的 不 同 摩 尔 浓 度, 确 保 方 法 对 这 类 不 可 避 免 的 波 动 具 有 足 够 的 耐 受 性 75

78 流 动 相 改 性 剂 问 题 排 查 可 尝 试 改 变 流 动 相 ph 以 确 定 峰 形 或 保 留 的 问 题 是 否 是 次 级 相 互 作 用 造 成 的 添 加 三 氟 醋 酸 (TFA) 会 有 帮 助, 但 请 记 住, 混 合 溶 剂 中 多 加 任 何 成 分 都 可 能 增 加 出 错 机 率 在 添 加 前 应 先 尝 试 使 用 低 ph 使 用 ph 改 性 流 动 相 出 发 点 的 关 键 是 保 持 简 单 大 家 喜 欢 用 乙 腈 的 原 因 之 一 是 乙 腈 具 有 低 UV 截 止 波 长 190 nm 而 甲 醇 是 205 nm,thf 是 212 nm 实 际 上 THF 在 215 nm 处 已 具 有 较 强 的 吸 收, 很 难 在 梯 度 中 使 用 ( 注 意, 不 含 氧 的 新 鲜 THF 很 好, 但 很 难 保 持 开 瓶 一 段 UV 吸 收 极 易 升 高 ) 根 据 您 采 用 的 梯 度 范 围,THF 的 吸 收 波 动 可 能 高 达 2 AU 但 在 较 高 的 波 长 下, 如 254 nm, 将 不 会 发 生 这 一 问 题 认 真 考 虑 溶 剂 的 选 择 和 改 性 剂 非 常 重 要 1% 醋 酸 的 UV 截 止 波 长 是 230 nm,0.1% TFA 是 205 nm 更 多 信 息 可 参 见 第 5 页 的 色 谱 基 本 概 念 过 去, 许 多 色 谱 操 作 者 都 使 用 磷 酸 盐 缓 冲 液 或 稀 磷 酸 无 论 在 酸 性 还 是 在 中 性 ph 条 件 下, 都 有 非 常 好 的 UV 透 光 率 但 是 磷 酸 盐 可 能 发 生 溶 解 度 问 题, 而 且 是 非 挥 发 性 的, 因 此 并 不 适 合 在 质 谱 中 使 用 使 用 磷 酸 盐 缓 冲 液 时 应 避 免 浓 度 超 过 mm, 特 别 是 在 有 机 相 比 例 较 高 的 流 动 相 中, 否 则 可 能 发 生 沉 淀 在 流 动 相 A 和 B 中 最 好 含 有 同 样 浓 度 的 缓 冲 液 或 改 性 剂 换 言 之, 在 梯 度 洗 脱 过 程 中, 只 有 有 机 相 溶 剂 浓 度 发 生 改 变 才 能 得 到 最 好 的 色 谱 结 果 当 然, 也 有 例 外 有 时 您 可 能 不 需 要 使 用 缓 冲 液, 磷 酸 就 足 够 了 问 题 排 查 实 例 : 基 线 漂 移 对 某 些 流 动 相 来 说, 改 性 剂 在 水 中 的 吸 收 与 在 乙 腈 中 不 同, 当 进 行 梯 度 洗 脱 时 可 能 出 现 漂 移 ( 图 48), TFA 就 是 这 种 情 况 使 用 TFA 时, 可 尝 试 在 溶 剂 A 中 使 用 0.1% TFA, 而 在 溶 剂 B 中 使 用 0.09% 左 右 的 TFA 在 图 49 中, 流 动 相 A 和 B 中 都 含 有 0.1% TFA 时, 用 215 nm 检 测, 进 行 梯 度 洗 脱 时 基 线 向 上 漂 移 如 果 降 低 B 中 的 TFA 浓 度, 如 0.09%, 可 以 使 基 线 平 稳, 从 而 解 决 了 这 一 问 题 使 用 较 高 波 长, 如 254 nm, 也 可 以 解 决 这 个 问 题, 但 基 于 检 测 能 力 方 面 的 原 因, 有 时 不 能 采 用 76

79 nm B TFA 图 48. TFA 对 基 线 的 影 响 峰 归 属 1. 非 那 西 汀 2. 托 美 汀 3. 酮 洛 芬 4. 非 诺 洛 芬 5. 异 丙 酚 6. 保 泰 松 7. 甲 灭 酸 8. 氟 灭 酸 分 析 条 件 色 谱 柱 : Eclipse XDB-C8 4.6 x 150 mm, 5 µm 溶 剂 A: 含 0.1% TFA 的 水 溶 液 溶 剂 B: 含 0.1% TFA 的 乙 腈 温 度 : 35 C 梯 度 : B 在 30 分 钟 内 由 5% 升 至 100% 流 速 : 2.0 ml/min 这 张 色 谱 图 ( 图 49) 显 示 的 是 我 们 期 望 的 状 态 良 好 平 稳 的 基 线 注 意, 这 是 与 图 48 中 实 例 不 同 的 分 析 峰 归 属 1. 亮 氨 酸 脑 啡 肽 2. 血 管 紧 张 素 3. 核 糖 核 酸 酶 A 4. 胰 岛 素 5. 细 胞 色 素 C 6. 溶 菌 酶 7. 肌 红 蛋 白 8. 碳 酸 酐 酶 图 49. 具 有 期 望 的 平 稳 基 线 的 梯 度 分 离 分 析 条 件 : 色 谱 柱 : ZORBAX 300SB-C3 4.6 x 150 mm, 5 µm 梯 度 : B 在 19 分 钟 内 由 15% 升 至 35% 流 动 相 : A:95:5 水 : 含 0.1% TFA 的 乙 腈 B:5:95 水 : 含 0.085% 的 乙 腈 TFA 这 里 显 示 的 是 对 不 同 分 子 量 的 多 肽 / 蛋 白 进 行 的 典 型 梯 度 洗 脱 我 们 在 流 动 相 A 中 加 入 了 0.1% TFA,B 中 加 入 了 0.085% 结 果 得 到 了 平 稳 的 基 线, 不 仅 结 果 更 好, 而 且 有 助 于 积 分 在 基 线 漂 移 可 以 忽 略 不 计 的 情 况 下, 如 果 色 谱 峰 大 小 合 适, 就 可 以 进 行 精 确 积 分 了 77

80 问 题 排 查 实 例 : 高 ph 造 成 的 峰 展 宽 和 峰 分 裂 在 图 50 中, 可 以 看 到 用 ZORBAX StableBond 柱 ( 不 是 为 在 高 ph 下 使 用 而 设 计 的 ) 得 到 的 两 个 截 然 不 同 的 结 果 色 谱 操 作 者 配 制 了 含 0.2% TEA 的 流 动 相, 但 却 忘 记 了 将 ph 调 低, 因 此 其 流 动 相 实 际 上 ph 高 达 11 他 开 始 过 夜 连 续 运 行 直 到 第 二 天, 进 样 30 次 后 得 到 右 侧 的 色 谱 图 ph 11 使 硅 胶 发 生 溶 解, 并 形 成 死 体 积, 从 而 造 成 灾 难 性 的 峰 展 宽 只 能 换 新 柱 了 分 析 条 件 流 动 相 : 50% 乙 腈 :50% H 2 O 含 0.2% TEA (~ph 11) 初 始 30 次 进 样 后 图 50. 在 高 ph 下 使 用 硅 胶 柱 的 后 果 因 此, 由 于 ph 对 保 留 和 柱 均 一 性 都 有 很 大 影 响, 应 该 将 其 作 为 方 法 开 发 的 重 要 参 数 我 们 建 议 使 用 缓 冲 液, 以 控 制 ph 值 并 使 其 保 持 稳 定 问 题 排 查 实 例 : 流 动 相 改 性 剂 和 选 择 性 选 择 流 动 相 改 性 剂 或 缓 冲 液 时, 要 确 保 其 处 于 缓 冲 范 围 内 应 查 看 缓 冲 液 的 有 效 范 围, 然 后 应 用 这 一 范 围 通 常, 比 缓 冲 液 的 pk 值 高 或 低 1 个 ph 单 位 典 型 缓 冲 范 围 见 参 考 资 料 后 的 图 表 让 我 们 来 看 一 些 低 ph 下 方 法 开 发 的 实 例 ( 图 51) 该 例 使 用 ZORBAX Eclipse Plus C18 柱, 在 低 ph 条 件 下 进 行 分 离 我 们 可 以 使 用 缓 冲 液 也 可 以 用 弱 酸 溶 液 作 为 流 动 相, 同 时 我 们 可 以 通 过 调 节 有 机 相 的 百 分 比 调 节 色 谱 峰 保 留 中 性 ph (~4-7) 具 有 更 好 的 选 择 性, 可 能 与 您 的 样 品 兼 容 性 更 强 中 性 ph 条 件 下 的 方 法 开 发 过 程 与 低 ph 相 同 Eclipse Plus 柱 在 中 性 ph 下 具 有 卓 越 性 能 如 果 需 要 改 善 选 择 性 的 话 也 可 以 使 用 其 他 键 合 相 Eclipse Plus 柱 是 方 法 开 发 的 理 想 选 择 它 拥 有 ph 2-9 这 一 极 宽 的 ph 范 围, 适 用 于 在 低 和 中 性 ph 范 围 内 进 行 方 法 开 发 可 提 供 良 好 的 峰 形 和 柱 效 78

81 峰 归 属 1. 扑 热 息 痛 2. 咖 啡 因 3. 乙 酰 水 杨 酸 4. 未 知 分 析 条 件 色 谱 柱 : Eclipse Plus C8 4.6 x 50 mm, 5 µm, PN 梯 度 : 在 3 分 钟 内 由 10% 升 至 60% ph 2.7 A:0.1% 甲 酸 B:0.1% FA 的 乙 腈 ph 7.0 A:20 mm 磷 酸 钠, 用 磷 酸 调 至 ph 7.0 B: 乙 腈 样 品 : 非 专 利 Excedrin 片 图 51. ph 2 和 ph 7 条 件 下 的 选 择 性 具 有 很 大 差 异 如 果 您 在 中 性 ph 范 围 内 仍 不 能 得 到 满 意 的 分 离 度, 还 可 以 考 虑 尝 试 更 高 ph 这 是 因 为 有 时 在 低 ph 和 中 性 ph 条 件 下 的 分 离 效 果 不 佳, 不 能 得 到 您 希 望 的 保 留 在 高 ph 条 件 下 对 碱 性 化 合 物 进 行 离 子 抑 制 形 态 下 的 分 析, 可 以 增 加 其 保 留 还 可 以 提 高 选 择 性 ZORBAX Extend-C18 是 一 款 双 配 位 色 谱 柱, 能 够 耐 受 严 苛 的 高 流 动 相 ph 条 件,Poroshell HPH-C18 和 HPH-C8 化 学 键 合 相 是 使 用 专 利 工 艺 对 Poroshell 120 填 料 颗 粒 进 行 化 学 改 性 而 制 得, 提 高 了 它 们 的 ph 稳 定 性 ZORBAX 和 Poroshell 色 谱 柱 均 可 用 于 ph 高 达 11 的 条 件,Poroshell HPH 还 具 有 出 色 的 使 用 寿 命 和 在 低 ph 下 进 行 方 法 开 发 一 样, 可 以 调 节 有 机 改 性 剂 浓 度 对 分 离 度 进 行 优 化 下 面 我 们 将 更 为 深 入 地 讨 论 我 们 提 出 的 反 相 色 谱 方 法 开 发 流 程 79

82 低 ph < 3 中 性 ph 7 高 ph > 9 A 区 B 区 C 区 方 法 开 发 从 低 ph 开 始, 此 时 反 相 HPLC 柱 上 的 硅 醇 基 发 生 质 子 化, 通 过 消 除 硅 醇 基 / 碱 的 相 互 作 用 最 大 限 度 地 减 少 了 峰 拖 尾 现 象 在 低 ph 条 件 下, 碱 性 化 合 物 带 正 电 荷, 其 保 留 可 能 减 弱 在 至 少 高 于 或 低 于 其 pk a 1 个 ph 单 位 的 条 件 下 进 行 方 法 开 发, 这 样 可 以 把 ph 略 有 变 化 时 对 保 留 的 影 响 降 至 最 低 在 ph 4 到 5 以 上 时, 部 分 硅 胶 表 面 SiOH 基 团 变 为 SiO ; 导 致 峰 拖 尾 的 相 互 作 用 可 能 存 在 碱 性 化 合 物 可 能 以 其 游 离 碱 的 形 态 存 在 可 能 增 加 碱 性 化 合 物 的 保 留 和 分 离 度 酸 性 化 合 物 发 生 质 子 化, 保 留 增 加 选 择 设 计 良 好 的 封 端 色 谱 柱, 用 TEA( 三 乙 胺 ) 等 添 加 剂 或 使 用 极 性 - 交 联 键 合 相, 可 最 大 限 度 地 减 少 相 互 作 用 在 这 一 区 域 保 留 基 本 不 变, 可 开 发 耐 用 的 方 法 ph 略 有 变 化 时 保 留 时 间 通 常 很 稳 定, 可 以 开 发 耐 用 的 方 法 挥 发 性 流 动 相 添 加 剂, 如 甲 酸 或 TFA, 常 用 于 ph 条 件 的 LC/MS 分 析 通 过 采 用 创 新 的 键 合 化 学 坚 实 封 端, 并 使 用 酸 性 更 低 的 高 纯 度 硅 胶, 降 低 了 金 属 含 量 (Rx-SIL), 避 免 了 硅 胶 的 断 裂 通 过 采 用 创 新 的 双 配 位 柱 化 学 坚 实 封 端 使 用 Rx-SIL, 并 优 化 流 动 相, 避 免 了 硅 胶 的 断 裂 氢 氧 化 铵 是 高 ph 下 良 好 的 挥 发 性 流 动 相 改 性 剂 表 9. 使 用 硅 胶 柱 在 不 同 ph 条 件 下 的 方 法 开 发 优 化 反 相 色 谱 条 件 在 确 定 了 色 谱 柱 规 格 合 适 的 固 定 相 柱 填 料 流 动 相 溶 剂 和 改 性 剂 后, 即 可 开 始 优 化 方 法 方 法 的 优 化 是 根 据 最 终 目 标 决 定 的 如 果 要 开 发 质 量 控 制 方 法, 您 可 能 会 需 要 像 等 度 分 离 这 种 可 变 因 素 较 少 的 方 法 如 果 目 标 是 得 到 最 高 分 离 度, 节 省 分 析 时 间 并 不 是 首 要 问 题, 可 以 选 择 长 柱 使 所 有 组 分 都 得 到 最 大 分 离 度 如 果 分 离 速 度 很 重 要, 则 应 使 用 短 柱 和 高 流 速 对 于 含 许 多 保 留 不 同 的 目 标 化 合 物 的 复 杂 样 品, 用 等 度 分 离 可 能 不 能 解 决 问 题, 应 开 发 并 优 化 梯 度 方 法 下 面 我 们 要 讨 论 两 种 方 法 的 条 件 优 化 : 1. 等 度 ( 流 动 相 组 成 不 变 ) 2. 梯 度 ( 流 动 相 强 度 随 时 间 变 化 ) 80

83 在 我 们 的 讨 论 中, 主 要 涉 及 二 元 溶 剂 系 统, 但 同 样 的 方 法 也 可 以 用 于 三 元 或 四 元 流 动 相 系 统 中 我 们 按 约 定 俗 成 将 水 相 溶 剂 和 反 相 色 谱 中 较 弱 的 溶 剂 称 为 流 动 相 A, B 溶 剂 是 有 相 组 成 较 高 和 较 强 的 溶 剂 在 反 相 色 谱 模 式 中, 当 增 加 B 的 百 分 比 时, 通 常 保 留 将 减 少 请 注 意, 在 还 没 有 开 发 出 样 品 的 实 际 分 析 方 法 前, 大 部 分 人 开 发 HPLC 方 法 都 是 采 用 反 复 实 验 的 方 法, 即, 尝 试 各 种 不 同 流 动 相 条 件, 以 找 出 最 佳 条 件 等 度 优 化 等 度 优 化 的 一 般 方 法 是 不 断 改 变 流 动 相 强 度 (% B), 直 到 获 得 适 当 的 保 留 范 围 这 种 方 法 有 时 也 称 为 溶 剂 筛 查 对 于 简 单 的 分 离,k 值 应 在 1 到 10 之 间 如 果 k 值 太 低 ( 比 如,< 1), 早 洗 脱 的 色 谱 峰 可 能 不 发 生 保 留 峰 或 融 入 基 质 组 分, 因 此 对 其 进 行 定 量 将 非 常 困 难 而 且 不 可 重 复 另 外, 低 k 值 峰 受 柱 外 效 应 影 响 很 大, 可 能 会 使 峰 展 宽 如 果 k 值 太 大 ( 比 如,> 10), 分 析 时 间 将 变 得 过 长, 检 测 限 会 因 峰 展 宽 而 提 高 对 于 反 相 色 谱 中 的 等 度 方 法 开 发 是 从 流 动 相 有 机 改 性 剂 最 高 比 例 开 始, 然 后 逐 渐 降 低 在 降 低 流 动 相 强 度 之 前, 先 要 确 定 所 有 组 分 都 已 从 柱 中 洗 出 如 果 组 分 保 留 在 色 谱 柱 中, 以 后 可 能 在 B 相 比 例 较 低 的 流 动 相 中 洗 脱, 成 为 无 法 解 释 的 鬼 峰 通 常, 流 动 相 以 +/-10%( 如,90% B 80% B 70% B 等 ) 或 +/-20% 的 幅 度 改 变 利 用 一 些 现 代 软 件 ( 如,ChromSword 的 ChromSword,ACD 的 AutoChrom), 显 示 保 留 变 化 曲 线, 系 统 进 行 自 动 调 节, 更 快 得 到 优 化 条 件 当 接 近 最 佳 等 度 条 件 时, 进 行 手 动 调 节, 幅 度 应 减 为 5% 或 3% 请 注 意, 如 果 流 动 相 A 中 含 高 浓 度 缓 冲 液 ( 比 如, 大 于 25 mm), 则 不 能 使 用 100% 的 B, 因 为 当 两 种 溶 剂 系 统 开 始 混 合, 随 着 B 相 百 分 比 的 减 少, 可 能 发 生 沉 淀 一 旦 建 立 优 化 条 件, 如 果 目 标 还 没 有 得 到 完 全 分 离, 则 需 继 续 提 高 选 择 性 (α) 如 需 分 离 两 个 相 邻 的 色 谱 峰 会 涉 及 到 许 多 实 验 参 数 的 调 节 温 度 可 以 作 为 一 个 变 量 大 多 数 现 代 仪 器 都 具 有 某 种 类 型 的 柱 温 控 制 器, 大 部 分 反 相 柱 可 以 承 受 高 达 60 C 的 温 度, 有 些 甚 至 更 高 一 般 来 说, 升 高 温 度 可 以 缩 短 所 有 峰 的 保 留 时 间, 但 对 有 些 峰 的 影 响 可 能 与 对 其 它 峰 不 同, 从 而 导 致 选 择 性 发 生 变 化 其 它 用 于 改 变 选 择 性 的 变 量 如 下 : 1. ph( 对 于 可 离 子 化 的 化 合 物 ) 2. 缓 冲 液 ( 离 子 ) 强 度 3. 缓 冲 液 类 型 ( 比 如, 磷 酸 盐 醋 酸 盐 或 甲 酸 盐, 取 决 于 需 要 的 ph 范 围 ) 4. 流 动 相 有 机 改 性 剂 ( 比 如, 从 乙 腈 变 为 甲 醇 或 两 者 的 混 合 液 ; 可 使 用 三 元 和 四 元 流 动 相 混 合 溶 剂 ) 5. 流 速 ( 一 般 而 言, 由 于 提 高 了 柱 效, 较 低 的 流 速 可 能 对 分 离 略 有 改 善, 但 也 有 例 外 见 下 面 的 提 示 ) 6. 离 子 对 试 剂 浓 度 ( 如 果 使 用 离 子 对 RPC) 81

84 如 果 调 节 这 些 参 数 还 不 能 改 善 分 离, 那 么 最 好 的 解 决 办 法 就 是 改 变 色 谱 柱 或 固 定 相 更 长 的 色 谱 柱 具 有 更 多 塔 板 数, 因 此 有 助 于 分 离, 但 切 记, 分 离 度 只 能 增 加 长 度 的 平 方 根 柱 长 加 倍 使 分 析 时 间 和 溶 剂 消 耗 加 倍, 而 灵 敏 度 降 低, 但 只 能 使 分 离 度 提 高 约 40% 改 用 较 小 粒 度 色 谱 柱 也 能 增 加 塔 板 数, 但 柱 压 上 升 1/d 2 p 使 用 新 的 固 定 相 ( 如 C18 换 成 苯 基 柱 ) 需 要 进 行 一 套 新 的 溶 剂 筛 选 实 验, 耗 费 更 多 时 间, 但 可 能 得 到 最 佳 的 分 离 结 果 但 需 要 额 外 购 买 具 有 不 同 固 定 相 的 反 相 柱 随 着 粒 径 变 小, 最 佳 流 速 升 高, 用 亚 2 µm 色 谱 柱 时, 流 速 可 以 比 用 常 规 柱 优 化 分 离 时 使 用 的 流 速 更 高 让 我 们 来 看 一 个 优 化 5 组 分 简 单 样 品 最 佳 等 度 分 离 条 件 的 筛 选 实 验 图 52 显 示 了 三 张 以 10% 幅 度 递 增 的 色 谱 图 分 别 为 40% 30% 和 20% 有 机 相 高 百 分 比 有 机 相 洗 脱 过 快 速, 在 死 体 积 内 洗 脱 ( 未 显 示 ), 而 有 机 相 低 于 20% 则 太 费 时 ( 未 显 示 ) 30% 有 机 相 时,5 个 组 分 分 离 良 好, 且 分 析 可 迅 速 完 成 如 果 需 要, 可 在 30% 左 右 进 行 1-2% 有 机 相 比 例 的 微 调, 以 进 一 步 优 化 分 离 这 些 步 骤 未 在 这 里 显 示 请 注 意 进 行 这 些 实 验 时, 所 有 其 它 条 件 不 变, 仅 改 变 有 机 相 百 分 比 进 行 该 等 度 方 法 优 化 即 可 使 用 Eclipse Plus C x 50 mm,1.8 µm 柱, 所 有 实 验 均 可 快 速 进 行, 方 法 开 发 筛 选 过 程 高 效 率 完 成 分 离 度 良 好 分 析 速 度 快 不 浪 费 时 间 峰 归 属 1. 吲 哚 洛 尔 2. Diisopyridamide 3. 心 得 安 4. 双 嘧 达 莫 5. 地 尔 硫 卓 分 析 条 件 色 谱 柱 : ZORBAX RRHT Eclipse Plus C18, 4.6 x 50 mm,1.8 µm 流 动 相 : A:25 mm NaH 2 PO 4,pH 3.0 B: 乙 腈 流 速 : 2.0 ml/min 温 度 : 30 C 检 测 : UV 240 nm 图 52. 通 过 调 节 有 机 改 性 剂 比 例 对 等 度 方 法 进 行 优 化 的 实 例 82

85 为 了 进 一 步 说 明 优 化 得 到 更 高 分 离 度 的 方 法, 图 53 显 示 了 使 用 不 同 固 定 相 的 对 比 每 一 根 色 谱 柱 上 都 使 用 相 同 的 最 佳 流 动 相, 只 是 键 合 相 不 同 这 个 例 子 中, 在 传 统 的 C18 柱 上 没 有 得 到 最 佳 分 离 度, 而 改 变 固 定 相 则 达 到 了 目 的 这 种 方 法 有 时 称 为 固 定 相 筛 选, 可 以 用 一 种 或 更 多 不 同 固 定 相 完 成 许 多 实 验 室 都 用 液 相 色 谱 仪 和 LC/MS 系 统 通 过 这 种 方 式 进 行 无 人 值 守 的 方 法 开 发, 流 动 相 不 变, 通 过 色 谱 柱 选 择 阀, 以 等 度 或 梯 度 洗 脱 开 发 或 优 化 不 同 固 定 相 的 分 离 峰 归 属 1. 雌 三 醇 2. 炔 雌 醇 3. 乙 炔 基 雌 二 醇 4. 己 烯 雌 酚 (DES) 5. 己 二 烯 雌 酚 分 析 条 件 流 动 相 : 流 速 : 监 测 器 : 雌 三 醇 乙 炔 基 雌 二 醇 60% MeOH,40% 水 1 ml/min, DAD = 220 nm 3.5 µm 30% 图 53. 等 梯 度 方 法 的 选 择 性 筛 选 83

86 梯 度 优 化 对 于 含 各 种 组 分 的 样 品 混 合 物 来 说, 选 择 单 一 流 动 相 组 分 可 能 得 不 到 满 意 的 解 决 方 案 ( 比 如, 一 般 洗 脱 问 题 ) 例 如, 某 些 样 品 组 分, 如 强 极 性 分 析 物, 可 能 很 快 从 反 相 柱 上 被 洗 脱 下 来, 而 疏 水 性 组 分 可 能 在 疏 水 性 的 C8 或 C18 上 吸 附 非 常 强, 洗 脱 不 下 来 对 这 一 问 题 的 解 决 方 案 是 随 时 间 改 变 流 动 相 组 成 ( 梯 度 洗 脱 ) 在 绝 大 多 数 例 子 中, 初 始 流 动 相 非 常 弱 ( 比 如, 含 水 量 高 ), 随 时 间 的 推 移, 有 机 溶 剂 的 百 分 比 通 常 是 以 线 性 形 式 增 加 ( 图 54) 增 加 溶 剂 强 度 = 增 加 流 动 相 中 有 机 相 百 分 比 线 性 溶 剂 强 度 梯 度 = 每 分 钟 的 变 化 百 分 比 是 恒 定 的 图 54. 梯 度 洗 脱 : 在 本 例 中, 乙 腈 每 十 分 钟 升 高 20% 两 种 情 况 下 要 使 用 梯 度 洗 脱 的 方 法 开 发 过 程 一 种 是 用 梯 度 预 测 反 相 分 离 的 最 佳 起 始 等 度 条 件 大 多 数 方 法 开 发 软 件 ( 如,DryLab ChromSword AutoChrom) 都 具 有 这 项 功 能, 最 少 进 行 两 次 梯 度 分 离, 然 后 预 测 出 最 佳 等 度 条 件 接 下 来 就 可 以 用 这 些 条 件 进 一 步 进 行 等 度 分 离 优 化 了 第 二 种 情 况 是 开 发 梯 度 方 法, 并 使 用 了 宽 范 围 的 快 速 梯 度 ( 比 如,10 分 钟 内 B 由 5% 变 到 95%), 确 定 目 标 化 合 物 的 最 佳 梯 度 范 围 实 际 上, 某 些 软 件 系 统 可 以 通 过 色 谱 数 据 系 统 / 控 制 器 之 间 的 相 互 作 用 来 设 置 最 佳 梯 度, 对 分 离 进 行 优 化 但 是, 手 动 操 作 也 可 以 完 成 同 样 的 工 作, 找 到 目 标 峰 洗 脱 的 流 动 相 比 例, 然 后 通 过 下 一 次 梯 度, 调 节 k*( 梯 度 等 于 k) 范 围, 让 梯 度 分 离 在 合 理 的 时 间 内 完 成 然 后, 与 等 度 优 化 一 样, 当 分 离 时 间 合 理 后 进 行 选 择 性 的 确 定 84

87 我们以一种相对复杂的含 10 种磺胺药物的混合物为例 简述优化过程 见图 首先 运行一个相对 快速的宽范围梯度 如图 55 所示 这里我们运行的梯度是 B 在 20 分钟内从 8% 变到 90% 使用 250 mm 色谱柱 从这张初始色谱图上 我们可以得到以下信息 首先 12.5 分钟后再无色谱峰 说明 90% B 太强 还可以看出 峰 5 和峰 6 峰 7 和峰 8 这两对色谱峰没有分开 峰归属 1. 磺胺哒嗪 2. 磺胺噻唑 3. 磺胺吡啶 12.5 分钟后无色谱峰洗脱 4. 磺胺甲基嘧啶 5. 磺胺间二甲嘧啶 6. 磺胺二甲恶唑 7. 磺胺甲氧哒嗪 8. 磺胺氯哒嗪 9. 磺胺甲恶唑 10. 磺胺多辛 图 55. 磺胺药物分析的初始梯度 分析条件 色谱柱 4.6 x 250 mm Eclipse Plus 流速 1 ml/min C18, 5 µm 监测器 254 nm 进样 5 µl 流动相 A 0.1% 甲酸的水溶液 B 0.1% 甲酸的甲醇溶液 下一个步骤是缩小有机相范围 延长梯度时间 以增加梯度保留 k* 得到的优化分离结果见图 56 我们 还采取了几个中间步骤 未显示 优化该梯度 剩下的事情就是调节梯度时间和 B 相百分比 直到获得最佳 分离 此时 10 种化合物都得到了基线分离 但分析时间是 30 分钟 考虑到柱规格和流速 我们可以对梯度方法 进一步优化 切记 调节柱规格和流速时 需要对梯度进行相应调节 我们已在第一章 即 10 页讨论过 两种最难分离的组分 峰归属 峰归属请参见图 55 分析条件 色谱柱 4.6 x 250 mm Eclipse Plus 流速 1 ml/min C18, 5 µm 监测器 254 nm 进样 5 µl 流动相 A 0.1% 甲酸的水溶液 B 0.1% 甲酸的甲醇溶液 图 56. 对 250 mm 柱的梯度优化 85

88 峰 归 属 峰 归 属 请 参 见 图 55 图 57. 从 250 mm 到 100 mm Poroshell 120 柱 所 进 行 的 进 样 体 积 和 梯 度 调 节 分 析 条 件 色 谱 柱 : 4.6 x 100 mm Poroshell 120 EC-C18, 2.7 µm 流 速 : 1 ml/min 监 测 器 : 254 nm 进 样 : 2 µl 流 动 相 : A:0.1% 甲 酸 的 水 溶 液 B:0.1% 甲 酸 的 甲 醇 溶 液 本 例 中, 我 们 使 用 的 是 Poroshell 120 柱, 柱 长 100 mm, 分 析 时 间 缩 短 到 十 几 分 钟, 仍 有 良 好 的 分 离 度 如 果 进 一 步 优 化 流 速, 分 析 时 间 还 可 以 再 缩 短 用 于 反 相 色 谱 的 聚 合 物 色 谱 柱 聚 合 物 柱 在 分 析 复 杂 样 品 时 具 有 明 显 优 势 其 化 学 稳 定 性 高 并 能 在 极 端 ph 保 持 稳 定 这 类 色 谱 柱 由 于 其 聚 合 物 特 性, 没 有 反 应 位 点, 在 极 端 ph 环 境 下 固 定 相 不 会 发 生 溶 解 用 聚 合 物 柱 进 行 反 相 梯 度 分 离 的 一 个 良 好 起 点 是 使 用 乙 腈 / 水 + 0.1% TFA 流 动 相 筛 选 梯 度, 比 如, 乙 腈 从 5% 升 至 95% 然 后 再 根 据 分 析 物 的 洗 脱 情 况 对 梯 度 进 行 调 节, 改 善 所 有 组 分 的 分 离 度 聚 合 物 填 料 可 以 使 用 酸 性 中 性 和 碱 性 洗 脱 液 例 如, 可 以 用 乙 腈 洗 脱 剂 在 四 种 不 同 ph 条 件 下 筛 选 合 成 多 肽 的 分 离 条 件, 包 括 0.1% TFA 20 mm 醋 酸 铵 (ph 5.5) 20 mm 醋 酸 铵 (ph 9.5) 和 20 mm 氢 氧 化 铵 (ph 10.5) 对 于 更 复 杂 的 样 品, 由 于 溶 解 度 不 够 或 共 洗 脱 等 问 题, 可 能 很 难 得 到 希 望 的 纯 度 或 回 收 率, 或 者 都 无 法 得 到 多 肽 上 的 净 电 荷 取 决 于 缓 冲 液 的 ph, 在 其 等 电 点 (pi) 时 净 电 荷 为 零 因 此, 在 反 相 HPLC 中, 改 变 ph 可 改 变 样 品 及 相 关 组 分 的 净 电 荷, 从 而 改 变 分 离 的 保 留 和 选 择 性 86

89 反 相 色 谱 的 等 度 方 法 开 发 上 手 步 骤 指 南 方 法 开 发 过 程 最 常 用 的 是 上 手 法 图 58 列 出 了 用 这 一 方 法 进 行 方 法 开 发 的 流 程 在 本 方 案 中, 可 遵 循 首 选 的 方 法 开 发 流 程, 选 择 合 适 的 色 谱 柱 或 键 合 相 通 过 调 节 ph 或 尝 试 不 同 的 有 机 改 性 剂 对 流 动 相 进 行 改 变 也 可 以 使 用 方 法 开 发 软 件, 进 行 一 些 实 验 性 操 作, 对 最 佳 方 法 进 行 预 测 可 以 选 择 用 手 动 或 自 动 方 式 对 多 种 色 谱 柱 或 流 动 相 进 行 评 价 在 本 方 案 中, 可 以 将 几 根 不 同 色 谱 柱 与 不 同 流 动 相 结 合 在 一 起, 尝 试 不 同 组 合 提 示 :ZORBAX Eclipse Plus 柱 具 有 良 好 的 耐 用 性 和 灵 活 性, 可 在 宽 ph 范 围 内 使 用 步 骤 1 步 骤 2 步 骤 3 步 骤 4 从 低 ph 开 始 选 择 Eclipse Plus C18 低 ph 调 节 乙 腈 百 分 比, 达 到 0.5 < k < 20 如 果 保 留 不 够, 然 后... 改 变 有 机 相 百 分 比 如 果 保 留 不 够, 然 后... 改 变 流 动 相 改 性 剂 调 节 有 机 相 百 分 比, 达 到 0.5 < k < 20 如 果 保 留 不 够, 然 后... 改 变 键 合 相 Eclipse Plus C8, SB-C18, -CN, -Phenyl, 其 它 反 相 键 合 相 首 先 选 择 高 质 量 的 C18 或 C8 键 合 相, 以 使 一 般 酸 性 碱 性 和 中 性 样 品 得 到 良 好 峰 形 保 留 和 分 离 度 请 注 意 短 柱 能 最 大 限 度 地 缩 短 开 发 时 间,Poroshell 120 EC-C18 等 新 技 术 可 以 通 过 降 低 操 作 压 力 和 改 善 峰 形 提 高 柱 效, 改 善 结 果 从 可 用 于 多 种 样 品 的 可 靠 流 动 相 改 性 剂 开 始, 如 在 水 相 部 分 选 择 磷 酸 盐 缓 冲 液 (ph 3) TFA 或 甲 酸, 有 机 改 性 剂 选 择 乙 腈 或 甲 醇 要 使 所 有 峰 都 有 足 够 的 保 留,Rs > 2.0 第 一 个 峰 的 保 留 至 少 应 满 足 k = 2( 更 多 信 息 请 参 见 第 7-8 页 ) 优 化 流 动 相 的 有 机 组 分, 以 改 变 选 择 性 如 果 需 要, 可 选 择 另 一 种 固 定 相, 对 方 法 进 行 全 面 优 化 ph 1-2 条 件 下 可 选 择 ZORBAX StableBond SB-C18 87

90 步 骤 5 步 骤 6 从 低 ph 到 中 性 ph ZORBAX Eclipse Plus C18 ph 7 (6-9) mm 缓 冲 液 调 节 乙 腈 百 分 比, 以 达 到 0.5 < k < 20 如 果 保 留 不 够, 然 后... 改 变 有 机 相 百 分 比 中 性 ph 可 提 供 更 好 的 选 择 性 : 可 能 与 样 品 更 加 兼 容 在 中 性 ph 条 件 下 方 法 开 发 的 过 程 与 低 ph 相 同 ZORBAX Eclipse Plus 和 Poroshell 120 柱 在 中 性 ph 下 具 有 卓 越 性 能 如 果 需 要 改 善 选 择 性, 也 应 考 虑 改 变 键 合 相, 同 时 选 择 适 当 的 缓 冲 液 ( 在 中 性 ph 下 使 用 醋 酸 铵 或 甲 酸 铵, 而 在 低 ph 下 使 用 的 是 磷 酸 盐 缓 冲 液 磷 酸 甲 酸 或 TFA) 如 果 保 留 不 够, 然 后... 步 骤 7 改 变 有 机 改 性 剂 (MeOH) 调 节 有 机 相 百 分 比, 以 达 到 0.5 < k < 20 重 复 进 行 第 6 步 如 果 保 留 不 够, 然 后... 步 骤 8 尝 试 Eclipse Plus Phenyl-Hexyl, Eclipse XDB-CN, XDB-Phenyl 或 Bonus-RP 重 复 进 行 第 5 步 步 骤 9 从 中 性 ph 到 高 ph ZORBAX Extend-C18 ph 10.5 (9-12) 5 mm 氨 或 TEA, 或 mm 有 机 或 硼 酸 盐 缓 冲 液 T = 25 C ( 室 温 40 C) 调 节 MeOH 百 分 比, 以 达 到 0.5 < k < 20 选 择 高 ph 的 理 由 : 分 析 不 带 电 荷 的 碱 性 化 合 物, 以 增 加 其 保 留 提 高 选 择 性 如 果 保 留 不 够, 然 后... 步 骤 10 改 变 有 机 改 性 剂 ( 乙 腈 或 THF) 调 节, 使 达 到 0.5 < k < 20 尝 试 不 同 的 HPLC 模 式 图 58. 方 法 开 发 流 程 图 在 高 ph 下 使 用 缓 冲 液 时 应 注 意 : 缓 冲 液 可 能 吸 收 CO 2, 因 碳 酸 盐 的 加 入 使 ph 发 生 变 化 ( 取 决 于 缓 冲 容 量 ) 防 止 这 一 现 象 出 现 的 唯 一 办 法 是 给 流 动 相 瓶 加 盖, 使 其 隔 绝 空 气, 或 使 用 烧 碱 石 棉 捕 集 器 88

91 从 常 规 柱 向 高 效 柱 进 行 方 法 转 移 的 技 巧 使 用 UHPLC/ 快 速 LC 和 高 效 柱 将 帮 助 您 提 高 分 析 速 度 和 分 离 度 根 据 您 使 用 的 仪 器 配 置, 要 使 这 类 色 谱 柱 最 大 限 度 地 发 挥 作 用, 还 需 要 对 您 所 用 的 仪 器 进 行 一 些 调 节 Poroshell 120 柱 填 料 外 径 为 2.7 µm, 是 一 种 具 有 实 心 核 和 多 孔 外 壳 的 表 面 多 孔 型 填 料 由 于 分 析 物 在 多 孔 外 壳 内 外 扩 散 速 度 更 快, 并 具 有 非 常 均 匀 的 填 充 柱 床, 所 以 这 种 色 谱 柱 能 在 2.7 µm 填 料 的 柱 压 下 提 供 与 亚 2 µm 填 料 相 媲 美 的 柱 效 最 高 耐 压 可 达 600 bar, 因 此,Poroshell 120 柱 可 用 于 优 化 UHPLC 性 能 而 亚 2 µm 柱 则 可 以 在 高 达 1300 bar 的 压 力 下 使 用 由 于 具 有 高 柱 效, 洗 脱 速 度 相 当 快, 峰 形 也 很 窄 现 代 HPLC 仪 器 和 数 据 系 统 可 以 应 用 这 类 填 料 的 优 势, 但 要 注 意, 仪 器 配 置 对 获 得 最 佳 结 果 非 常 重 要 这 类 色 谱 柱 的 选 择 性 与 其 它 相 似 固 定 相 极 为 类 似, 所 以 可 以 很 方 便 地 进 行 方 法 转 移, 以 获 得 优 异 的 结 果 您 仅 需 注 意 的 是 如 何 对 常 规 液 相 色 谱 仪 进 行 优 化 方 法 转 移 步 骤 : 查 阅 仪 器 附 带 的 说 明 书 和 仪 器 性 能 指 标 确 定 仪 器 已 针 对 高 效 色 谱 柱 进 行 了 配 置 如 果 尚 未 进 行 配 置, 继 续 下 一 步 优 化 数 据 采 集 速 率 ( 采 用 快 速 响 应 时 间 的 检 测 器 采 集 频 率 至 少 40 Hz) 使 用 Poroshell 120 柱 和 更 高 流 速, 得 到 类 似 于 亚 2 µm 柱 所 得 的 窄 峰 将 检 测 器 设 为 最 快 采 集 速 率, 然 后 设 为 第 二 快 采 集 速 率, 比 较 二 者 的 分 离 度 是 否 不 同 更 多 信 息 参 见 第 47 页 使 用 半 微 量 或 微 量 流 通 池 安 捷 伦 1200 的 标 准 流 通 池 体 积 为 10 mm/13 µl( 注 意, 并 非 所 有 检 测 器 都 用 相 同 的 流 通 池 ) 这 可 能 会 降 低 使 用 Poroshell 120 柱 所 获 得 的 性 能 建 议 使 用 更 小 体 积 的 流 通 池, 如 半 微 量 (6 mm/5 µl) 或 微 量 (3 mm/2 µl) 流 通 池, 以 获 得 最 佳 性 能 通 常, 流 通 池 越 小, 光 程 越 短, 可 能 降 低 UV 方 法 的 灵 敏 度 注 意, 某 些 低 体 积 流 通 池 就 是 通 过 缩 短 光 程 实 现 的, 这 将 降 低 绝 对 峰 高 最 大 限 度 减 少 仪 器 管 线 体 积 用 红 色 (0.12 mm 内 径 ) 管 线 代 替 绿 色 管 线 (0.17 mm 内 径 ), 因 为 可 以 使 样 品 流 经 体 积 减 少 一 半 这 样 就 能 降 低 柱 外 体 积 和 峰 带 变 宽 确 保 连 接 尽 可 能 短 ( 更 多 信 息 请 参 见 第 40 页 ) 以 下 是 3 到 4 处 可 能 需 要 您 更 换 管 线 的 地 方, 请 注 意 所 需 要 的 连 接 管 线 长 度 : 自 动 进 样 器 针 座 自 动 进 样 器 到 柱 温 箱 或 TCC TCC 到 色 谱 柱 色 谱 柱 到 流 通 池, 包 括 一 体 式 流 通 池 入 口 毛 细 管 的 内 径 89

92 如 果 您 的 方 法 不 用 升 高 柱 温, 可 以 采 用 快 捷 连 接, 自 动 进 样 器 直 接 连 接 色 谱 柱, 然 后 从 色 谱 柱 连 接 流 通 池, 减 少 了 柱 外 体 积 根 据 分 析 化 合 物 的 具 体 情 况, 如 果 不 控 制 温 度, 这 种 操 作 可 能 出 现 问 题 所 有 特 殊 毛 细 管 都 可 以 按 需 要 的 长 度 单 独 从 安 捷 伦 订 购 注 意 接 头 连 接 安 捷 伦 建 议 使 用 带 前 后 垫 圈 的 Swagelok 接 头, 该 接 头 可 使 整 个 LC 系 统 的 密 封 性 能 最 佳 ( 在 仪 器 连 接 处 使 用, 比 如, 阀 和 加 热 器 等 ) 在 最 高 操 作 压 力 600 bar 时, 我 们 强 烈 推 荐 使 用 A-line 接 头 与 Poroshell 120 柱 连 接 时 使 用 这 种 接 头 ( 部 件 号 ) 更 多 接 头 的 相 关 信 息 请 参 见 第 27 页 优 化 流 速 使 用 Poroshell 120 柱 时, 如 果 您 使 用 的 柱 内 径 为 2.1 mm, 建 议 初 始 流 速 为 0.42 ml/min, 对 于 3.0 mm 内 径 的 Poroshell 120 柱, 我 们 建 议 初 始 流 速 为 0.85 ml/min, 对 于 4.6 mm 内 径 色 谱 柱, 我 们 建 议 初 始 流 速 为 2 ml/min 图 59. van Deemter 曲 线 重 叠 图 :Poroshell 120 的 最 佳 流 速 比 5 或 3.5 µm 柱 更 快 90

93 按 比 例 调 整 梯 度 曲 线 和 进 样 体 积 如 果 用 梯 度 洗 脱 优 化 色 谱 结 果, 您 应 确 保 针 对 新 的 较 小 色 谱 柱 按 比 例 正 确 调 整 梯 度 曲 线 和 进 样 体 积, 以 便 进 行 快 速 方 法 转 移 并 避 免 过 载 安 捷 伦 网 站 可 提 供 免 费 的 方 法 转 移 软 件, 帮 助 您 选 择 正 确 条 件 ( 参 见 140 页 上 的 其 它 安 捷 伦 资 源 ) 对 于 等 度 和 梯 度 洗 脱, 应 确 保 按 比 例 调 整 后 的 进 样 体 积 与 整 个 色 谱 柱 体 积 相 匹 配 最 大 限 度 地 减 少 样 品 进 样 的 柱 扩 散 应 使 用 与 流 动 相 溶 剂 强 度 相 当 或 更 弱 的 进 样 溶 剂, 特 别 是 在 使 用 等 度 方 法 时 这 对 任 何 色 谱 柱 都 是 良 好 的 通 行 做 法, 对 高 效 柱 尤 为 重 要 相 关 的 步 骤 视 频, 请 访 问 自 动 化 方 法 开 发 工 具 许 多 实 验 室 仍 在 使 用 手 动 或 上 手 方 法 开 发 方 法 但 自 动 化 方 法 有 很 多 优 势, 有 助 于 让 LC 方 法 开 发 更 加 轻 松 新 的 方 法 开 发 软 件, 如 安 捷 伦 1200 Infinity 系 列 多 方 法 解 决 方 案, 为 自 动 方 法 开 发 过 程 的 许 多 步 骤 提 供 了 特 殊 硬 件 和 专 用 的 软 件 解 决 方 案 Agilent 1200 Infinity 系 列 多 方 法 解 决 方 案 The 1290 Infinity II LC 的 流 量 和 压 力 范 围 较 宽 再 加 上 较 小 的 梯 度 延 迟 体 积, 有 利 于 开 发 其 它 HPLC 或 UHPLC 系 统 的 方 法 根 据 分 离 的 复 杂 性, 可 在 软 件 输 入 不 同 需 要 以 支 持 不 同 的 实 验 设 置 新 软 件, 如 安 捷 伦 化 学 工 作 站 方 法 筛 选 向 导, 可 提 供 工 具 用 于 设 定 序 列 和 全 部 方 法, 以 便 色 谱 柱 溶 剂 梯 度 和 温 度 多 维 筛 选 实 验 的 完 成 Agilent 1290 Infinity II 最 多 可 使 用 三 个 TCC 模 块, 而 无 需 考 虑 系 统 使 用 的 是 1260 Infinity 还 是 1290 Infinity 模 块 快 速 更 换 阀 可 让 用 户 方 便 地 操 作 毛 细 管 接 头, 有 助 于 直 接 安 装 和 维 护 91

94 系 统 概 况 检 测 器 TCC TCC 进 样 器 泵 溶 剂 1. 可 选 择 多 达 12 种 外 加 溶 剂 的 外 接 溶 剂 选 择 阀 2. 用 于 色 谱 柱 选 择 的 8 位 /9 通 出 口 阀 3. 用 于 色 谱 柱 选 择 的 8 位 /9 通 入 口 阀 所 有 阀 均 适 用 于 不 同 压 力 范 围 图 60. 灵 活 的 自 动 化 方 法 开 发 用 一 个 或 两 个 外 接 12 通 道 选 择 阀 可 以 扩 展 溶 剂 数 量 用 户 可 以 从 计 算 机 屏 幕 上 的 列 表 中 选 择 其 溶 剂, 实 现 自 动 化 用 阀 安 装 辅 助 程 序 和 管 线 工 具 包 可 实 现 有 条 不 紊 的 优 化 设 置 使 用 系 统 中 的 二 元 泵, 可 实 现 多 达 169 种 二 元 溶 剂 组 合 四 元 泵 可 多 达 193 种 组 合 安 装 8 根 色 谱 柱 时, 可 全 自 动 筛 选 1000 多 种 独 特 的 分 离 条 件 在 安 捷 伦 系 统 上 可 以 使 用 各 种 规 格 的 分 析 柱 提 示 : 如 需 了 解 自 动 化 方 法 开 发 解 决 方 案 的 更 多 信 息, 请 在 安 捷 伦 网 站 上 搜 寻 出 版 物 EN 92

95 其 它 HPLC 模 式 的 方 法 开 发 HILIC 亲 水 相 互 作 用 液 相 色 谱 (HILIC) 有 时 也 被 称 为 水 相 正 相 (ANP) 是 一 项 已 发 展 了 数 十 年 的 技 术 由 于 这 项 技 术 能 够 对 反 相 柱 上 不 保 留 或 保 留 较 差 的 极 性 化 合 物 进 行 分 析, 近 年 来 又 重 新 受 到 了 重 视 而 且, 这 项 技 术 很 容 易 与 MS 和 MS/MS 检 测 技 术 兼 容 当 HILIC 分 离 使 用 高 有 机 相 流 动 相 时, 与 水 相 缓 冲 系 统 相 比 由 于 具 有 较 低 的 离 子 抑 制, 从 而 提 高 了 MS 灵 敏 度 HILIC 使 用 极 性 固 定 相, 如 硅 胶 氨 基 混 合 模 式 两 性 离 子 等, 以 及 水 溶 性 的 非 极 性 流 动 相, 由 少 量 水 ( 至 少 2.5% 体 积 比 ) 和 高 比 例 有 机 相 组 成 在 HILIC 方 法 中, 亲 水 极 性 和 带 电 荷 化 合 物 比 疏 水 中 性 化 合 物 更 容 易 保 留 与 反 相 液 相 色 谱 完 全 相 反 在 流 动 相 中 加 水 会 降 低 保 留 HILIC 与 正 相 色 谱 相 比, 能 得 到 强 极 性 溶 质 的 良 好 峰 形 是 反 相 色 谱 的 补 充 方 法, 由 于 保 留 了 亲 水 性 化 合 物, 因 此 常 使 洗 脱 顺 序 倒 置 开 发 HILIC 方 法 时, 需 要 优 化 下 列 参 数 : 固 定 相 有 机 溶 剂 浓 度 缓 冲 液 类 型 缓 冲 液 ( 盐 ) 浓 度 ph 温 度 HILIC 方 法 中 常 用 的 色 谱 柱 : 硅 胶 柱 氨 基 柱 混 合 型 柱 ( 烷 基 - 二 醇 烷 基 - 羧 基 C18- 酰 胺 芳 香 - 氰 基 烷 基 - 羟 基 C18- SCX 和 聚 羟 乙 基 天 冬 酰 胺 ) 氢 化 物 衍 生 氢 化 物 柱 两 性 柱 ( 如, 四 烷 基 铵 - 磺 酸 ) 专 利 固 定 相 柱 93

96 在 图 中 显 示 了 两 种 药 物 的 分 离 雷 尼 替 丁 和 帕 罗 西 汀 使 用 反 相 色 谱, 然 后 用 HILIC 方 法, 以 及 MS 数 据 结 果 显 示 了 HILIC 模 式 的 主 要 优 势 在 HILIC 中 雷 尼 替 丁 保 留 更 强,MS 灵 敏 度 更 高 吸 光 值 分 析 条 件 仪 器 Agilent 系 列 1100 液 相 色 谱 仪 色 谱 柱 ZORBAX Eclipse Rx-SIL mm, 5 µm 流 动 相 : A:8 mm HCOONH 4 的 水 溶 液 B:8 mm HCOONH 4 的 95% 乙 腈 (ACN) /5% 水 梯 度 : B 在 10 分 钟 内 由 5% 升 至 90% 柱 温 : 40 C 样 品 体 积 : 5 µl 流 速 : 0.3 ml/min 图 61. 在 ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱 上 对 帕 罗 西 汀 和 雷 尼 替 丁 进 行 的 LC/MS/MS 分 离 ( 反 相 HPLC 模 式 ) 分 析 条 件 色 谱 柱 : 梯 度 : ZORBAX Rx-SIL, 2.1 x 150 mm, 5 µm B 在 10 分 钟 内 由 100% 降 至 50% 吸 光 值 图 62. 在 ZORBAX Rx-Sil 柱 上 对 帕 罗 西 汀 和 雷 尼 替 丁 进 行 的 LC/MS/MS 分 离 (HILIC 模 式 ) 100 ppb 水 平 94

97 帕 罗 西 汀 MS 条 件 仪 器 : 1100 系 列 LC/MSD 离 子 阱 电 离 : 正 离 子 ESI 扫 描 范 围 : m/z SIM 离 子 : m/z = 315, 330 干 燥 气 体 : 350 C 下 10 L/min 雾 化 气 体 : 45 psi 裂 解 电 压 : 0.25 V 雷 尼 替 丁 二 次 裂 解 选 择 的 母 离 子 图 63. 药 物 标 准 品 的 MS/MS 图 谱 正 相 色 谱 正 相 或 吸 附 色 谱 的 出 现 早 于 反 相 色 谱 正 的 叫 法 源 自 其 原 本 概 念, 即, 固 定 相 为 极 性 流 动 相 为 非 极 性 极 性 化 合 物 保 留 更 强 在 正 相 色 谱 中, 使 用 硅 胶 或 另 一 种 极 性 固 定 相, 如 短 链 氨 基 或 二 醇 流 动 相 为 非 极 性 通 常 为 烃 类 二 氯 甲 烷 乙 酸 乙 酯, 或 另 一 种 水 溶 性 的 溶 剂 在 正 相 色 谱 中, 极 性 组 分 保 留 更 强 随 流 动 相 极 性 增 大 极 性 组 分 保 留 减 弱 使 用 的 流 动 相 极 性 越 强, 分 析 物 的 洗 脱 越 快 在 硅 胶 柱 上 进 行 正 相 梯 度 分 离 时, 可 以 从 己 烷 等 非 极 性 溶 剂 开 始, 然 后 逐 渐 加 入 极 性 溶 剂, 如 乙 酸 乙 酯, 比 如, 乙 酸 乙 酯 从 5% 到 95% 根 据 目 标 物 的 洗 脱 位 置, 可 以 调 节 梯 度 以 改 善 所 有 组 分 的 分 离 有 时 加 入 一 定 量 的 水 或 少 量 异 丙 醇, 可 以 调 节 硅 胶 填 料 的 表 面 活 性 键 合 相 色 谱 柱 可 能 不 需 要 水 的 存 在, 并 常 使 用 醇 类 作 为 改 性 剂 如 果 检 测 器 为 UV 或 荧 光 检 测 器, 可 参 考 溶 剂 UV 截 止 波 长 表 在 本 书 参 考 章 节, 第 137 页 上, 可 以 查 到 某 些 最 常 用 溶 剂 的 UV 截 止 波 长 95

98 我 们 使 用 正 相 色 谱 的 原 因 之 一 是 使 更 多 的 极 性 化 合 物 得 到 保 留 也 可 以 用 这 种 模 式 洗 脱 在 反 相 色 谱 中 高 度 保 留 的 疏 水 化 合 物 正 相 色 谱 有 许 多 用 途, 适 合 分 离 几 何 异 构 体 和 位 置 异 构 体, 可 得 到 比 反 相 色 谱 更 高 的 分 辨 率 当 我 们 没 有 水 溶 性 的 溶 剂 时, 可 以 使 用 正 相 色 谱 也 可 以 用 于 制 备 分 离, 流 动 相 不 含 水, 易 于 蒸 发 总 结 : 正 相 柱 填 料 为 极 性 : 硅 胶 ( 最 强 )> 氨 基 > 二 醇 > 氰 基 ( 最 弱 ) 流 动 相 为 非 极 性 : 己 烷 异 辛 烷 二 氯 甲 烷 乙 酸 乙 酯 等 极 性 化 合 物 保 留 更 强 随 流 动 相 极 性 增 大 保 留 减 弱 选 择 正 相 的 目 的 : 分 离 高 度 保 留 的 疏 水 样 品 分 离 异 构 体 样 品 进 样 溶 剂 为 非 极 性 和 / 或 非 水 溶 性 的 使 用 非 极 性 溶 剂 进 行 回 收 96

99 离 子 交 换 色 谱 离 子 交 换 色 谱 可 以 分 离 离 子 型 化 合 物 和 可 离 子 化 的 化 合 物 在 这 种 模 式 中, 我 们 使 用 带 有 离 子 型 官 能 团 的 填 料, 其 所 带 电 荷 与 分 析 物 相 反 在 强 阳 离 子 交 换 (SCX) 色 谱 中, 我 们 要 分 析 带 正 电 荷 的 分 子 或 阳 离 子, 因 此 使 用 的 是 阴 离 子 型 或 带 负 电 荷 的 固 定 相 如 果 我 们 要 分 析 带 负 电 荷 的 分 子 或 阴 离 子, 应 使 用 阳 离 子 型 或 带 正 电 荷 的 固 定 相 在 离 子 交 换 色 谱 中, 流 动 相 通 常 含 水 量 较 高, 并 含 有 缓 冲 液 或 盐 通 过 连 续 或 阶 梯 梯 度 增 加 离 子 强 度 ( 盐 浓 度 ) 进 行 洗 脱 常 用 于 对 生 物 大 分 子 的 分 离, 也 用 于 小 分 子 的 分 离, 如 氨 基 酸 无 机 阳 离 子 和 阴 离 子, 以 及 氨 类 或 羧 酸 等 可 离 子 化 的 化 合 物 在 图 64 的 实 例 中, 我 们 分 离 了 蛋 白 质, 由 于 其 具 有 两 种 离 子 官 能 团 ( 即 能 带 正 电 荷 又 能 带 负 电 荷 ), 肯 定 带 电 荷 根 据 其 所 带 的 净 电 荷, 蛋 白 质 和 多 肽 可 以 用 阳 离 子 交 换 柱 或 阴 离 子 交 换 柱 进 行 分 离 离 子 交 换 色 谱 小 结 : 柱 填 料 含 离 子 基 团 ( 如, 磺 酸 盐 四 烷 基 铵 ) 流 动 相 为 水 相 缓 冲 液 ( 如, 磷 酸 盐 甲 酸 盐 TRIS 等 ) 比 反 相 色 谱 用 得 少 与 离 子 对 色 谱 相 似 ( 更 多 信 息 请 参 见 词 汇 表 ) 峰 归 属 1. RNA 聚 合 酶 2. 胰 凝 乳 蛋 白 酶 原 3. 溶 菌 酶 图 64. 用 强 阳 离 子 交 换 柱 (-SO 3 ) 分 离 碱 性 蛋 白 97

100 凝 胶 渗 透 色 谱 / 体 积 排 阻 色 谱 在 GPC/SEC 中, 样 品 分 子 与 填 料 之 间 不 存 在 相 互 作 用, 并 通 过 扩 散 进 入 多 孔 聚 合 物 基 质 或 硅 胶 基 质 的 孔 隙 中 根 据 分 子 的 体 积 大 小 和 相 应 填 料 孔 隙 大 小 进 行 分 离 体 积 比 填 料 孔 隙 大 的 分 子 不 能 扩 散 进 入 填 料, 而 体 积 比 填 料 孔 隙 小 的 分 子 则 可 以 进 入 填 料, 因 此 样 品 得 到 分 离 与 反 相 色 谱 不 同 的 是, 大 分 子 先 洗 脱 出 来, 小 分 子 后 洗 脱 出 来 通 常, 较 大 分 子 被 排 阻 在 孔 隙 之 外, 从 而 快 速 从 色 谱 柱 中 洗 脱 出 来, 为 完 全 排 阻 体 积 最 小 的 分 子 可 以 渗 透 入 色 谱 柱 的 所 有 孔 隙, 最 后 洗 脱 出 来, 为 完 全 渗 透 体 积 其 它 所 有 分 子 在 这 两 者 之 间 按 分 子 大 小 洗 脱 出 来 如 果 要 测 定 单 个 组 分 的 分 子 量 (MW) 或 整 体 分 布, 需 要 先 用 已 知 分 子 量 的 标 样 以 洗 脱 体 积 对 log MW 建 立 校 正 曲 线 然 后, 在 与 标 样 相 同 的 条 件 下 分 析 聚 合 物 样 品, 即 可 测 定 该 聚 合 物 的 分 子 量 和 分 子 量 分 布 主 要 选 用 流 动 相 溶 解 分 析 物 主 要 化 合 物 小 的 低 聚 物 和 单 体 分 析 条 件 : 色 谱 柱 : 流 动 相 : PLgel MIXED-D 四 氢 呋 喃 (THF) 单 体 在 聚 合 物 之 后 洗 脱 出 来 示 差 折 光 图 65. 用 非 水 相 GPC/SEC 柱 分 离 聚 丁 二 烯 的 凝 胶 渗 透 色 谱 图 GPC/SEC 小 结 : 两 种 模 式 : 非 水 相 GPC 和 水 相 SEC( 也 称 凝 胶 过 滤 色 谱, 或 GFC) 在 体 积 排 阻 色 谱 中, 样 品 分 子 与 填 料 之 间 无 相 互 作 用, 并 通 过 扩 散 进 入 多 孔 聚 合 物 基 质 的 孔 隙 中 根 据 分 子 的 体 积 大 小 和 相 应 填 料 孔 隙 大 小 进 行 分 离 在 不 同 溶 剂 或 流 动 相 中 可 能 得 到 不 同 的 流 体 动 力 学 半 径 主 要 选 用 流 动 相 溶 解 分 析 物 GPC box 色 谱 柱 主 要 用 于 聚 合 物 表 征 聚 合 物 分 子 量 测 定 和 蛋 白 质 分 离 98

101 液 质 联 用 仪 基 本 原 理 哪 种 仪 器 的 化 合 物 分 析 能 力 能 够 超 越 液 相 色 谱? 接 下 来 我 们 就 将 为 您 介 绍 什 么 是 LC/MS? 将 液 相 色 谱 (LC) 与 质 谱 (MS) 的 分 离 能 力 相 结 合, 用 于 分 析 复 杂 样 品 中 的 单 一 化 合 物 或 多 种 组 分 的 仪 器 被 称 为 液 质 联 用 仪 (LC/MS) 符 号 LC/MS 代 表 两 种 不 同 分 离 技 术 的 结 合, 先 通 过 液 相 色 谱 进 行 分 离, 然 后 再 按 化 合 物 的 质 量 ( 或 更 精 确 地, 按 质 荷 比 (m/z)) 对 其 进 行 分 离 为 了 使 该 技 术 具 有 分 析 实 用 性, 在 液 相 中 分 离 出 的 组 分 必 须 通 过 电 离 过 程 转 换 为 带 电 的 离 子 形 态 该 过 程 在 质 谱 仪 的 离 子 源 中 进 行, 它 是 连 接 液 相 色 谱 仪 和 质 谱 仪 的 接 口 一 般 来 说,LC/MS 的 灵 敏 度 比 UV 检 测 更 高, 其 选 择 性 和 特 异 性 也 更 加 出 色 在 过 去 几 十 年 中,LC/MS 的 应 用 大 幅 增 长 技 术 的 进 步 使 得 LC/MS 越 来 越 简 单 易 用, 可 轻 松 添 加 到 任 何 实 验 室 电 离 技 术 的 改 进 拓 宽 了 LC/MS 可 分 析 的 化 合 物 范 围 如 今,LC/MS 已 成 为 了 诸 多 领 域 ( 例 如 药 代 动 力 学 法 医 学 毒 理 学 和 蛋 白 质 组 学 等 ) 的 标 准 分 析 工 具 液 质 联 用 仪 现 在 几 乎 已 经 应 用 到 了 每 一 个 需 要 进 行 化 学 分 析 的 行 业 中 ; 制 药 食 品 安 全 环 境 化 学 和 能 源 领 域 的 实 验 室 都 部 署 了 LC/MS 以 应 对 分 析 挑 战 基 本 样 品 电 离 之 后 被 转 移 到 检 测 器 中 99

102 LC/MS 可 提 供 哪 些 信 息? LC/MS 分 析 所 产 生 的 数 据 为 多 维 数 据 根 据 组 分 在 各 种 溶 剂 和 色 谱 柱 条 件 下 的 液 相 色 谱 保 留 特 性 及 其 在 气 相 中 的 质 荷 比 进 行 分 离 和 检 测 最 高 级 别 的 结 果 是 总 离 子 流 色 谱 图 (TIC) TIC 展 示 的 是 色 谱 运 行 过 程 中 检 测 到 的 离 子 的 总 强 度 TIC 中 的 每 个 采 样 点 都 可 进 行 进 一 步 分 析, 因 为 每 个 点 都 与 特 定 的 质 谱 图 相 关 联 质 谱 图 可 显 示 某 个 色 谱 保 留 时 间 处 出 现 了 哪 些 质 量 数 的 离 子, 以 及 它 们 相 应 的 强 度 图 66. 聚 丁 二 烯 聚 合 物 在 非 水 性 GPC/SEC 色 谱 柱 上 分 离 得 到 的 凝 胶 渗 透 色 谱 图 质 谱 峰 的 分 辨 率 和 准 确 度 是 质 谱 仪 的 重 要 性 能 标 准 对 于 能 够 以 大 约 ± 0.1 Da 的 准 确 度 识 别 质 量 的 仪 器, 我 们 称 其 具 有 标 称 质 量 准 确 度 或 单 位 质 量 准 确 度 此 类 仪 器 通 常 是 基 于 四 极 杆 的 仪 器, 例 如 单 四 极 杆 或 三 重 四 极 杆 质 谱 仪 具 有 标 称 质 量 准 确 度 的 质 谱 仪 与 液 相 色 谱 仪 联 用 通 常 已 经 足 够 用 于 多 种 应 用 高 分 辨 率 精 确 质 量 质 谱 仪 能 够 更 精 确 地 测 量 离 子 的 质 荷 比, 准 确 度 可 达 ± 0.1 mda 质 量 准 确 度 的 提 升 大 大 提 高 了 化 合 物 鉴 定 的 可 信 度 另 外, 更 高 的 质 量 分 辨 能 力 还 能 以 足 够 的 精 度 测 量 化 合 物 的 同 位 素, 有 助 于 对 化 合 物 分 子 量 和 结 构 表 征 结 果 进 行 额 外 的 验 证 此 类 仪 器 基 于 飞 行 时 间 (TOF) 技 术 或 离 子 阱 液 质 联 用 仪 记 录 不 断 增 加 的 化 合 物 丰 度 的 能 力 被 称 为 线 性 动 态 范 围 线 性 范 围 对 于 实 现 准 确 测 量 而 言 非 常 重 要, 在 对 样 品 中 的 化 合 物 进 行 定 量 分 析 时 尤 其 如 此 100

103 液 质 联 用 仪 的 类 型 液 质 联 用 仪 有 多 种 类 型, 它 们 分 别 采 用 不 同 的 技 术, 具 有 不 同 的 分 析 能 力 和 性 能 水 平 单 四 极 杆 仪 器 单 四 极 杆 液 质 联 用 仪 可 提 供 具 有 标 称 质 量 准 确 度 的 数 据, 并 且 通 常 是 实 验 室 初 次 引 入 液 质 联 用 仪 作 为 与 液 相 色 谱 仪 联 用 的 检 测 器 时 的 首 选 单 四 极 杆 仪 器 利 用 四 极 杆 质 量 过 滤 器 测 定 样 品 所 产 生 的 离 子 的 m/z, 还 能 扫 描 一 定 范 围 内 的 质 量 进 行 筛 选 分 析, 或 者 选 择 具 有 特 定 m/z 值 的 特 定 离 子 进 行 目 标 分 析 此 类 液 质 联 用 仪 采 用 先 进 的 仪 器 设 计 并 且 易 于 操 作, 因 此 非 常 适 用 于 常 规 的 质 量 分 析 三 重 四 极 杆 仪 器 三 重 四 极 杆 液 质 联 用 仪 是 应 用 最 广 泛 的 类 型, 有 时 也 被 称 为 串 联 质 谱 仪, 因 为 同 一 台 仪 器 配 备 有 两 个 质 量 过 滤 器 这 种 设 计 可 通 过 分 离 母 离 子 碎 裂 母 离 子 然 后 分 析 所 得 的 碎 片 离 子 来 生 成 MS/MS 数 据 多 反 应 监 测 (MRM) 是 实 验 设 置 中 最 常 用 的 三 重 四 极 杆 仪 器 类 型, 因 为 它 能 够 提 供 极 高 的 灵 敏 度, 重 现 性 高, 并 具 有 出 色 的 选 择 性 飞 行 时 间 和 四 极 杆 飞 行 时 间 仪 器 飞 行 时 间 和 三 重 四 极 杆 飞 行 时 间 液 质 联 用 仪 的 原 理 是 : 对 于 动 能 一 定 的 离 子, 其 飞 行 时 间 会 根 据 其 质 量 和 电 荷 数 的 不 同 而 有 所 差 异 精 确 测 量 而 得 的 飞 行 时 间 可 用 于 准 确 测 定 样 品 中 存 在 的 离 子 的 质 荷 比 此 类 仪 器 可 提 供 高 质 谱 分 辨 率, 且 测 量 的 质 量 准 确 度 在 5 ppm 以 内 在 碎 片 离 子 进 入 飞 行 管 进 行 分 析 之 前, 四 极 杆 飞 行 时 间 仪 器 还 能 通 过 分 离 和 碎 裂 母 离 子 提 供 MS/MS 数 据 Agilent 6000 系 列 液 质 联 用 解 决 方 案 安 捷 伦 提 供 可 改 善 定 量 和 定 性 分 析 可 信 度 的 全 套 液 质 联 用 解 决 方 案, 涵 盖 这 几 页 所 述 的 所 有 类 型 的 系 统 右 侧 展 示 了 外 观 不 同 的 三 重 四 极 杆 系 统 以 及 Q-TOF 系 统 Agilent 6100 系 列 单 四 极 杆 液 质 联 用 系 统 Agilent 6470 三 重 四 极 杆 液 质 联 用 系 统 Agilent 6550 ifunnel Q-TOF 液 质 联 用 系 统 101

104 匀 场 离 子 淌 度 系 统 匀 场 离 子 淌 度 系 统 兼 具 离 子 淌 度 和 质 谱 的 分 离 能 力 该 技 术 可 直 接 准 确 测 量 碰 撞 截 面, 从 而 提 供 额 外 的 分 离 维 度 它 还 能 保 留 分 子 构 象 的 结 构 特 征, 扩 展 了 对 复 杂 样 品 的 覆 盖 率 安 捷 伦 离 子 淌 度 质 谱 Agilent 6560 IMS-Q-TOF 液 质 联 用 仪 能 够 在 没 有 同 类 型 校 准 标 准 品 的 情 况 下, 实 现 高 性 能 的 离 子 淌 度 分 析 和 精 密 准 确 的 碰 撞 截 面 (CCS) 测 量 前 端 漏 斗 捕 集 门 捕 集 漏 斗 漂 移 管 后 端 漏 斗 MS/MS 碎 裂 化 合 物, 获 得 额 外 的 特 异 性 某 些 液 质 联 用 仪 会 有 意 碎 裂 母 分 子, 然 后 根 据 碎 片 离 子 的 质 量 获 取 关 于 化 合 物 结 构 组 成 的 信 息 施 加 相 同 的 碰 撞 能 量 时, 化 合 物 将 可 重 现 地 碎 裂 因 此, 通 过 研 究 完 整 质 量 数 和 生 成 的 不 同 碎 片 离 子 的 质 量 数, 我 们 可 以 查 找 特 定 的 化 合 物 该 技 术 提 升 了 化 合 物 鉴 定 的 特 异 性, 通 常 被 称 为 LC/MS-MS, 表 示 分 析 时 要 进 行 多 个 阶 段 的 质 量 分 析 图 67. 聚 丁 二 烯 聚 合 物 在 非 水 性 GPC/SEC 色 谱 柱 上 分 离 得 到 的 凝 胶 渗 透 色 谱 图 三 重 四 极 杆 仪 器 使 用 一 个 四 极 杆 来 分 离 初 始 离 子 或 母 离 子, 然 后 在 另 一 个 区 域 中 碎 裂 该 离 子, 接 下 来 再 分 析 第 三 个 四 极 杆 中 生 成 的 碎 片 离 子 使 用 这 些 仪 器 时, 我 们 通 过 被 称 为 多 反 应 监 测 (MRM) 的 实 验 来 采 集 数 据 MRM 实 验 主 要 监 测 第 一 个 四 极 杆 中 的 母 离 子, 以 及 第 三 个 四 极 杆 中 的 一 种 或 多 种 碎 片 离 子 ( 或 子 离 子 ) 碎 裂 过 程 可 快 速 完 成, 因 此 可 同 时 监 测 多 个 MRM 该 方 法 常 用 于 农 药 食 品 和 毒 理 学 分 析, 这 些 分 析 可 能 涉 及 多 个 不 同 的 目 标 化 合 物 MRM 实 验 的 重 现 性 很 高, 并 且 可 达 到 极 高 的 灵 敏 度 动 态 MRM (dmrm) 是 一 种 更 先 进 的 MRM, 它 能 确 保 在 单 次 LC/MS 分 析 中 对 多 种 分 析 物 (200 多 种 化 合 物 ) 进 行 高 灵 敏 度 的 定 量 分 析 某 些 精 确 质 量 液 质 联 用 系 统 也 能 执 行 MS/MS 级 别 的 实 验 此 类 仪 器 包 括 四 极 杆 飞 行 时 间 仪 器 和 某 些 离 子 阱 仪 器 它 们 可 提 供 给 定 化 合 物 的 精 确 质 量 同 位 素 信 息 和 碎 片 离 子 信 息, 具 有 LC/MS 所 能 达 到 的 最 高 特 异 性 102

105 化合物的电离 为了进行分析 所有质谱仪都要求化合物处于气相状态并且带有电荷 因此 必须通过某种方法将液态的 中性分子转换为气态的离子 可采用多种不同的技术进行电离 电喷雾电离 电喷雾电离 (ESI) 是如今应用最广泛的 LC/MS 电离技术 它是一种软电离技术 有助于保留被电离分子的结 构 它能够分析范围极宽的化合物 包括完整蛋白质和寡核苷酸等大分子以及热不稳定化合物 不粘液滴的毛细管 层流超声 液相色谱洗脱液雾化器 进入质谱仪的离子 雾滴 高密度离子形成区域 用于容纳液滴与脱溶剂的 加热 N2 鞘气 图 68. 安捷伦喷射流 ESI 离子源 大气压化学电离 大气压化学电离 (APCI) 技术使用高度带电荷的探头电离中性化合物 进而生成离子 它适用于偏非极性的 化合物 如类固醇 芳香结构和某些脂类 大气压光电离 大气压光电离 (APPI) 技术利用高强度灯产生的光子使样品电离 生成离子 高度非极性的化合物适合采用 APPI 进行电离 安捷伦离子源 采用以上三种关键技术的还有多种其他类型的电离技术 安捷伦喷射流离子源是一种高度增强版的电喷雾离子源 它利用额外的加热气源来改善蒸发并协助 LC/MS 入口前方的离子聚焦 安捷伦组合离子源可同时使用 ESI 和 APCI 进行电离 拓宽了单个样品中所能电离的化合物范围 纳流电喷雾离子源和 Chip Cube 离子源可用于纳流 HPLC 应 用 使用极少的溶剂即可提高信号强度 103

106 利 用 LC/MS 开 发 方 法 的 技 巧 ESI-MS 的 溶 剂 选 择 LC/UV 流 动 相 通 常 采 用 能 够 在 MS 离 子 源 中 积 聚 的 非 挥 发 性 缓 冲 液 配 制 换 用 具 有 相 同 ph 的 挥 发 性 缓 冲 液 通 常 是 一 种 简 单 的 方 法 理 想 的 ESI-MS 缓 冲 液 浓 度 应 低 于 25 mm, 最 理 想 的 情 况 下 应 低 于 10 mm 流 速 通 常 也 应 保 持 较 低 水 平, 一 般 而 言 应 低 于 0.5 ml/min 但 如 果 采 用 安 捷 伦 喷 射 流 热 梯 度 聚 焦 技 术, 可 采 用 5 µl/min 至 最 高 2 ml/min 范 围 内 的 流 速 通 常 应 避 免 使 用 金 属 离 子 缓 冲 液, 因 为 它 们 会 干 扰 电 离 过 程 例 如, 用 甲 酸 盐 缓 冲 液 替 代 磷 酸 盐 缓 冲 液 同 样 能 将 流 动 相 的 ph 调 节 为 3, 而 且 与 质 谱 仪 配 合 良 好 由 于 质 谱 检 测 需 要 形 成 离 子, 因 此 应 当 利 用 流 动 相 使 分 析 物 带 上 电 荷 这 意 味 着 流 动 相 ph 和 样 品 的 pka 信 息 至 关 重 要, 为 了 获 得 稳 定 的 方 法,pH 应 当 与 分 析 物 的 pka 相 差 1 至 2 个 单 位 选 择 可 生 成 带 正 电 荷 或 带 负 电 荷 的 分 析 物 的 流 动 相 将 有 利 于 提 高 灵 敏 度 较 低 的 ph 通 常 用 于 碱 性 化 合 物 的 离 子 化 对 于 酸 性 化 合 物, 我 们 需 要 更 仔 细 地 选 择 流 动 相 ph, 因 为 它 们 的 pka 值 很 有 可 能 在 ph 2 至 5 的 范 围 内 酸 性 流 动 相 通 常 更 适 用 于 正 离 子 模 式 电 离, 并 且 应 含 有 0.1% 至 1% 的 甲 酸 0.1% 至 1% 的 乙 酸 和 0.05% 至 0.2% 的 三 氟 乙 酸 (TFA) TFA 会 引 起 离 子 抑 制, 但 如 果 样 品 浓 度 足 够 高, 也 可 以 使 用 TFA 碱 性 流 动 相 通 常 更 适 用 于 负 离 子 模 式 电 离 氢 氧 化 铵 三 乙 胺 二 乙 胺 哌 啶 和 碳 酸 氢 铵 常 被 用 于 负 ESI 模 式 当 中 性 化 合 物 与 缓 冲 液 中 的 乙 酸 根 或 铵 根 离 子 络 合 时, 也 可 对 其 进 行 分 析 向 电 喷 雾 探 头 施 加 电 压 可 形 成 离 子, 而 选 择 合 适 的 流 动 相 形 成 预 离 子 化 的 分 子 能 够 显 著 促 进 离 子 形 成, 从 而 改 善 灵 敏 度 对 于 有 机 流 动 相 组 分, 通 常 优 选 乙 腈 而 不 是 甲 醇 尽 管 甲 醇 也 可 用 于 LC/MS, 但 是 乙 腈 - 水 混 合 物 的 粘 度 和 表 面 张 力 比 甲 醇 - 水 混 合 物 更 低 较 低 的 粘 度 有 利 于 在 离 子 源 中 形 成 更 小 的 液 滴, 使 其 更 易 于 蒸 发 这 些 可 兼 容 质 谱 的 流 动 相 适 用 于 反 相 HILIC 和 正 相 色 谱 图 69 所 示 的 例 子 在 使 用 EIS 分 析 茶 叶 的 方 法 中 应 用 了 若 干 种 可 兼 容 LC/MS 的 流 动 相, 旨 在 对 它 们 进 行 筛 选 无 论 使 用 哪 种 流 动 相, 选 择 性 和 峰 形 均 保 持 一 致 因 此, 我 们 根 据 分 析 物 的 信 号 强 度 来 选 择 最 佳 流 动 相 使 用 乙 酸 铵 缓 冲 液 和 三 氟 乙 酸 流 动 相 时, 出 现 了 明 显 的 离 子 抑 制 效 应 两 个 最 有 力 的 竞 争 者 是 甲 酸 和 乙 酸, 其 中 甲 酸 产 生 的 信 号 略 强 一 点 将 灵 敏 度 最 高 的 乙 酸 流 动 相 与 灵 敏 度 最 低 的 乙 酸 铵 流 动 相 相 比, 使 用 乙 酸 时 的 灵 敏 度 比 使 用 乙 酸 铵 时 的 灵 敏 度 高 五 倍 104

107 % HCOOH S/N = % CH 3 COOH S/N = 响应 % CF3 COOH S/N = mm CH3 COONH4 ph 3.6 使用 10 mm CH3COOH 调节 ph S/N = 采集时间 (min) 图 69. 筛选可兼容 LC/MS 的流动相用于采用 ESI 和 Agilent Poroshell 120 SB-C18 色谱柱的茶叶分析法 APCI-MS 和 APPI-MS 的溶剂选择 APCI 和 APPI 通常用于 ESI-MS 无法充分电离的弱极性分子 某些液相色谱流动相 如乙腈 可能不适用于 此类离子源 甲醇是分析时可以尝试的首选溶剂 与 ESI 类似 APCI 和 APPI 不兼容非挥发性缓冲液 然而 与 ESI 不同的是 APCI 和 APPI 可采用更宽范围的缓冲液浓度 最高可达 100 mm 以及更高的流速 最高 可达 1.5 ml/min 当采用 0.75 ml/min 以上的流速时 APCI 和 APPI 的灵敏度比 ESI 更高 而且噪音更低 出 于安全考虑 应避免使用高度易燃的溶剂 离子对色谱与质谱联用系统的溶剂选择 使用离子对色谱和液质联用系统时 流动相中必须包含非挥发性离子对试剂 如烷基磺酸盐或四烷基铵盐 常用的流动相包括七氟丁酸 (HFBA) 和三丁胺 (TBA) 离子对试剂可能会干扰电离过程 如果这种干扰会影 响分析结果 那么可以转而使用 HILIC 进行色谱分析 105

108 样 品 前 处 理 如 前 文 所 述, 适 当 选 择 流 动 相 缓 冲 液 和 ph 对 于 获 得 稳 定 灵 敏 的 质 谱 性 能 至 关 重 要 样 品 前 处 理 对 于 成 功 实 施 HPLC-UV-MS 分 析 也 非 常 重 要, 样 品 前 处 理 不 当 可 能 导 致 离 子 信 号 抑 制 或 干 扰 在 进 行 ESI-MS 分 析 之 前 需 要 考 虑 的 主 要 因 素 是 基 质 组 分 和 浓 度 问 题 基 质 组 分 盐 类 会 抑 制 电 离 过 程, 表 面 活 性 剂 会 干 扰 蒸 发 过 程, 而 高 分 析 物 浓 度 会 导 致 检 测 器 饱 和 一 些 可 清 除 基 质 效 应 盐 类 和 表 面 活 性 剂 效 应 的 典 型 技 术 包 括 超 滤 溶 剂 萃 取 或 脱 盐 液 液 萃 取 固 相 萃 取 (SPE) 免 疫 亲 和 柱 上 浓 缩 和 色 谱 柱 切 换 (LC/LC) 如 果 无 法 避 免 盐 类 和 表 面 剂, 可 使 用 色 谱 法 ( 使 用 短 色 谱 柱 即 可 ) 或 截 止 过 滤 器 将 其 去 除 浓 度 问 题 为 了 解 决 浓 度 问 题, 应 使 用 液 相 色 谱 方 法 中 一 开 始 就 存 在 的 溶 剂 组 分 对 样 品 进 行 稀 释 关 于 离 子 抑 制 的 注 意 事 项 离 子 抑 制 是 目 标 化 合 物 离 子 化 效 率 下 降 对 LC/MS 检 测 器 造 成 的 不 良 结 果 产 生 信 号 抑 制 的 原 因 可 能 是 流 动 相 或 样 品 基 质 中 的 组 分 与 分 析 物 产 生 了 竞 争, 或 是 抑 制 了 分 析 物 的 离 子 化 尽 管 引 起 离 子 抑 制 效 应 的 确 切 化 学 和 物 理 原 因 尚 不 明 确, 但 我 们 仍 然 应 该 尽 可 能 地 避 免 目 标 分 析 物 与 其 他 潜 在 的 抑 制 物 质 发 生 共 洗 脱 在 LC/MS 分 析 之 前 对 复 杂 样 品 进 行 色 谱 分 离 是 避 免 离 子 抑 制 效 应 的 一 种 有 效 方 法 另 外, 稀 释 样 品 和 降 低 流 速 也 可 减 少 电 离 过 程 中 会 产 生 抑 制 效 应 的 物 质 的 数 量 106

109 使 用 配 备 高 效 色 谱 柱 的 LC/MS 时 的 注 意 事 项 灵 敏 度 的 提 升 LC/MS 是 一 种 灵 敏 的 技 术, 非 常 适 合 分 析 低 浓 度 化 合 物 将 LC/MS 与 高 效 UHPLC 色 谱 柱 联 用 能 够 进 一 步 提 升 灵 敏 度 图 70 显 示 了 吗 啡 代 谢 物 (M3G, M6G) 的 分 析 结 果, 与 传 统 5 µm 色 谱 柱 相 比, 高 效 亚 2 µm UHPLC 色 谱 柱 生 成 了 更 高 更 尖 锐 的 峰 这 些 分 析 采 用 的 方 法 参 数 ( 包 括 固 定 相 化 学 性 质 ) 均 相 同, 唯 一 的 变 量 是 粒 径 M3G 和 M6G 为 同 量 异 位 物 质, 因 此 在 同 一 质 量 数 (m/z 462) 处 被 检 出 将 这 些 EIC 调 整 为 相 同 的 刻 度 之 后, 我 们 不 仅 能 够 更 明 显 地 看 出 小 粒 径 色 谱 柱 带 来 的 峰 宽 改 善, 还 能 看 到 峰 高 的 差 异 比 较 灵 敏 度 最 低 的 M6G 峰 的 信 噪 比 之 后 我 们 发 现, 与 传 统 5 µm 色 谱 柱 相 比, 高 效 亚 2 µm UHPLC 色 谱 柱 能 够 将 质 谱 灵 敏 度 提 高 五 倍 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, mm,5 µm 压 力 :90 bar 响 应 (%) 响 应 (%) 响 应 (%) Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, mm,3.5 µm 压 力 :160 bar Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18, mm,1.8 µm 压 力 :480 bar 采 集 时 间 (min) 图 70. 吗 啡 代 谢 物 的 分 析 结 果, 表 明 使 用 填 充 亚 2 µm 颗 粒 的 高 效 UHPLC 色 谱 柱 能 够 提 高 灵 敏 度 107

110 质 谱 扫 描 速 率 为 了 充 分 利 用 液 质 联 用 系 统, 我 们 必 须 仔 细 优 化 各 个 方 法 参 数 使 用 高 效 色 谱 柱 时, 通 过 适 当 设 置 较 快 的 数 据 采 集 速 率 以 采 集 足 可 覆 盖 整 个 窄 峰 的 数 据 点 对 于 生 成 可 靠 的 结 果 至 关 重 要 图 71 显 示 了 快 速 分 离 茶 叶 中 的 10 种 常 见 儿 茶 酚 的 结 果 图 中 显 示 了 各 种 数 据 采 集 速 率 对 色 谱 分 析 ( 包 括 UV MS 扫 描 MS SIM 和 MS/MS 检 测 模 式 ) 质 量 的 影 响 在 所 有 模 式 下 都 可 以 看 到 相 同 的 特 征 质 谱 仪 的 数 据 采 集 速 率 超 出 了 该 快 速 分 析 所 需 的 采 集 速 率, 以 致 于 过 快 的 数 据 采 集 速 率 采 集 了 过 多 的 数 据 点, 给 分 析 带 来 了 负 面 影 响 最 快 的 数 据 采 集 速 率 生 成 了 最 窄 的 峰, 然 而, 最 快 的 数 据 采 集 速 率 产 生 的 基 线 噪 音 也 最 多, 导 致 信 噪 比 下 降 如 果 对 分 析 而 言 灵 敏 度 是 最 重 要 因 素, 则 应 当 使 用 稍 低 的 数 据 采 集 速 率, 尽 管 这 样 意 味 着 峰 宽 会 略 有 增 加 UV 数 据 采 集 速 率 质 谱 扫 描 速 率 MS SIM 驻 留 时 间 MS/MS dmrm 分 析 周 期 图 71. 使 用 Agilent ZORBAX RRHD SB-C18 色 谱 柱 分 析 茶 叶 中 常 见 的 10 种 儿 茶 酚 系 统 扩 散 为 了 实 现 理 想 的 LC/MS 分 析, 除 了 优 化 方 法 参 数 之 外, 还 应 考 虑 仪 器 硬 件 系 统 柱 外 体 积 会 显 著 影 响 小 体 积 高 效 色 谱 柱 ( 如 内 径 2.1 mm 的 亚 2 µm 色 谱 柱 ) 的 分 离 效 果 图 72 显 示 了 吗 啡 及 其 代 谢 物 的 LC/MS/MS 分 析 结 果, 分 析 时 分 别 使 用 的 是 配 备 0.12 mm 内 径 毛 细 管 的 标 准 液 相 色 谱 仪 以 及 配 备 mm 内 径 短 毛 细 管 的 低 扩 散 优 化 仪 器 低 扩 散 液 质 联 用 系 统 所 得 的 色 谱 峰 明 显 更 高 更 窄 由 于 低 扩 散 系 统 的 样 品 流 路 体 积 更 小, 因 此 其 保 留 时 间 略 有 缩 短 提 取 MRM 色 谱 图 突 出 显 示 了 通 过 最 大 程 度 减 小 LC/MS 分 析 的 系 统 扩 散 来 优 化 UHPLC 色 谱 柱 性 能 的 重 要 性 尽 管 质 谱 一 般 都 能 分 离 共 洗 脱 峰, 但 在 本 例 中,M6G 和 M3G 为 同 量 异 位 物 质, 而 且 具 有 相 同 的 定 量 和 定 性 离 子 对, 因 此 我 们 需 要 使 其 实 现 色 谱 基 线 分 离 将 柱 外 体 积 减 小 60% 能 够 将 这 两 个 峰 的 分 离 度 提 高 37%, 并 且 将 灵 敏 度 提 高 30% 108

111 默 认 的 Agilent 1290 Infinity 液 相 色 谱 系 统 与 Agilent 6410A 三 重 四 极 杆 质 谱 仪 压 力 最 大 = 230 bar 响 应 优 化 的 Agilent 1290 Infinity 液 相 色 谱 系 统 与 Agilent 6410A 三 重 四 极 杆 质 谱 仪 压 力 最 大 = 240 bar 采 集 时 间 (min) 响 应 采 集 时 间 (min) 图 72. 使 用 标 准 及 优 化 的 Agilent 1290 Infinity 液 相 色 谱 对 吗 啡 及 其 代 谢 物 进 行 LC/MS/MS 分 析 的 结 果 比 较 标 准 1290 Infinity 液 相 色 谱 配 置 0.12 mm 内 径 的 毛 细 管, 而 经 过 优 化 的 超 低 扩 散 1290 Infinity 液 相 色 谱 配 置 mm 内 径 的 短 毛 细 管, 将 柱 外 体 积 减 小 了 60% 分 流 阀 用 法 和 价 值 所 有 安 捷 伦 液 质 联 用 仪 均 配 备 分 流 阀 液 相 色 谱 流 动 相 在 到 达 离 子 源 之 前 将 通 过 分 流 阀 不 应 使 流 动 相 绕 过 分 流 阀 直 接 到 达 雾 化 器, 因 为 该 阀 具 有 非 常 重 要 的 作 用 当 运 行 的 LC/MS 方 法 洗 脱 大 量 的 非 目 标 化 合 物 时, 您 可 以 将 这 些 化 合 物 引 入 废 液 瓶 分 析 人 员 不 希 望 这 些 化 合 物 进 入 离 子 源, 将 它 们 引 至 废 液 瓶 可 降 低 离 子 源 需 要 清 洁 的 频 率 此 外, 分 析 人 员 可 能 不 需 要 采 集 这 些 化 合 物 的 质 谱 数 据, 此 时 可 关 闭 保 存 谱 图 功 能 以 节 省 磁 盘 空 间 这 些 功 能 位 于 软 件 的 时 间 段 选 项 卡 中 LC/MS 软 件 扫 描 类 型 比 较 TIC EIC 和 SIM 总 离 子 流 色 谱 图 (TIC) 将 扫 描 仪 器 范 围 内 用 户 所 选 的 整 个 分 子 量 范 围 如 果 化 合 物 的 分 子 量 已 知, 可 使 用 提 取 离 子 色 谱 图 (EIC) 从 复 杂 的 TIC 色 谱 图 中 分 离 出 特 定 的 分 析 物, 得 到 仅 含 特 定 分 子 量 的 离 子 的 简 化 色 谱 图 图 73 显 示 了 在 0.4 分 钟 内 快 速 分 离 15 种 镇 痛 化 合 物 的 结 果 分 析 设 置 了 足 够 快 的 质 谱 扫 描 速 率, 目 的 是 采 集 足 以 覆 盖 这 些 窄 峰 的 数 据 点 ( 即 使 是 存 在 共 洗 脱 峰 的 情 况 下 ), 以 确 保 得 到 可 靠 的 数 据 上 方 的 TIC 中 有 多 个 部 分 共 洗 脱 峰 ( 特 别 是 托 美 汀 周 围 ), 以 红 色 箭 头 标 出 由 于 各 化 合 物 是 通 过 其 独 有 的 质 量 数 进 行 鉴 定 的, 因 此 分 析 人 员 可 通 过 EIC 单 独 查 看 各 种 组 分, 如 下 方 色 谱 图 中 仅 针 对 托 美 汀 的 EIC (m/z 257) 所 示 通 过 单 独 查 看 EIC, 分 析 人 员 能 够 轻 松 地 对 任 何 化 合 物 进 行 积 分 和 定 量 分 析 109

112 响 应 TIC 扫 描 P = 1072 bar 最 大 采 集 时 间 (min) 所 有 15 种 化 合 物 的 EIC 叠 加 图 响 应 采 集 时 间 (min) 图 73. 使 用 填 充 1.8 µm 颗 粒 的 Agilent ZORBAXRRHD Eclipse Plus C18 色 谱 柱 在 0.4 分 钟 内 快 速 分 离 15 种 镇 痛 化 合 物 的 结 果 m/z 257( 托 美 汀 ) 的 单 独 EIC TIC 模 式 在 分 析 复 杂 样 品 时 ( 尤 其 是 可 能 存 在 未 知 物 时 ) 很 有 用 当 方 法 以 某 种 已 知 的 分 析 物 为 目 标 时, 我 响 应 们 可 以 将 LC/MS 设 置 为 选 择 离 子 监 测 (SIM) 模 式, 该 模 式 仅 采 集 目 标 分 析 物 的 数 据, 可 得 到 类 似 于 EIC 的 色 谱 图 SIM 模 式 可 同 时 监 测 多 种 离 子, 并 且 数 据 可 显 示 为 复 合 色 谱 图 或 单 独 EIC 在 SIM 模 式 下 使 用 LC/MS 采 集 时 间 (min) 的 优 势 与 通 过 TIC 模 式 提 取 EIC 相 反,SIM 模 式 能 够 为 用 户 提 供 针 对 目 标 分 析 物 的 更 高 的 灵 敏 度 个 人 化 合 物 数 据 库 与 谱 库 在 执 行 非 目 标 筛 查 时, 化 合 物 鉴 定 给 我 们 带 来 了 一 定 的 挑 战 我 们 可 通 过 购 买 标 样 建 立 谱 图 来 协 助 化 合 物 的 鉴 定 然 而, 许 多 实 验 室 缺 少 购 买 和 测 试 新 标 样 的 资 源 或 时 间 个 人 化 合 物 数 据 库 与 谱 库 (PCDL) 能 够 利 用 精 确 质 量 MS/MS 谱 库 更 可 靠 地 鉴 定 目 标 化 合 物, 以 及 更 灵 活 地 创 建 可 定 制 的 PCD 和 PCDL 第 三 方 PCDL 的 实 例 包 括 METLIN 代 谢 组 学 数 据 库 以 及 由 Broecker Herre 和 Pragst 发 布 的 法 医 和 毒 理 学 PCD/PCDL 安 捷 伦 还 与 研 究 人 员 合 作 开 发 有 用 的 PCDL 用 于 热 点 污 染 物 ( 如 真 菌 毒 素 和 化 学 合 成 毒 品 ) 的 检 测 110

113 图 74. MassHunter 定 性 分 析 软 件, 常 用 的 MassHunter 工 作 站 软 件 套 装 中 的 组 件, 其 使 用 精 确 质 量 保 留 时 间 同 位 素 模 式 和 MS/MS 数 据 实 现 高 可 信 度 的 代 谢 物 鉴 定 111

114 色 谱 结 果 的 保 护 重 现 性 是 色 谱 最 重 要 的 性 质 之 一 要 获 得 良 好 的 重 现 性 首 先 要 有 高 质 量 的 色 谱 柱 和 耐 用 的 HPLC 方 法 有 一 些 能 帮 助 您 提 高 重 现 性, 并 延 长 柱 寿 命 的 方 法 在 本 章 中, 我 们 将 按 工 作 流 程 的 顺 序 对 这 些 方 法 进 行 讨 论 : 可 扩 展 性 使 用 高 纯 度 溶 剂 UHPLC 溶 剂 的 特 殊 注 意 事 项 在 线 滤 头 入 口 筛 板 保 护 柱 溶 剂 饱 和 柱 然 后, 我 们 将 讨 论 如 何 保 护 色 谱 柱 : 最 大 限 度 地 延 长 柱 寿 命 如 需 获 取 安 捷 伦 样 品 前 处 理 手 册 ( CHCN) 的 副 本, 请 访 问 疏 通 色 谱 柱 色 谱 柱 受 损 的 警 告 信 号 我 们 将 用 几 个 字 来 概 括 当 在 实 验 室 间 进 行 转 移 时 如 何 进 行 保 护 : 如 需 了 解 安 捷 伦 样 品 前 处 理 产 品 系 列 的 更 多 信 息, 请 访 问 确 保 方 法 在 世 界 范 围 的 重 现 性 批 间 保 留 或 选 择 性 的 变 化 112

115 可 扩 展 性 过 去 5 到 7 年 以 来, 随 着 越 来 越 多 的 用 户 开 始 在 分 析 方 法 中 应 用 表 面 多 孔 色 谱 柱 (SPP), 这 类 色 谱 柱 发 展 非 常 迅 猛 许 多 用 户 都 体 会 到 了 此 类 色 谱 柱 与 传 统 全 多 孔 色 谱 柱 相 比 的 优 势 在 开 发 新 方 法 时, 人 们 更 倾 向 于 采 用 SPP 色 谱 柱, 因 为 它 们 的 普 适 性 已 经 超 越 了 亚 2 µm 色 谱 柱 SPP 色 谱 柱 的 这 种 优 势 得 益 于 其 高 稳 定 性 高 效 低 背 压 的 特 点 然 而, 也 有 许 多 用 户 选 择 使 用 现 代 2.7 µm SPP 色 谱 柱, 原 因 是 考 虑 到 此 类 色 谱 柱 相 比 传 统 5 µm 填 料 色 谱 柱 的 柱 压 更 高 安 捷 伦 最 近 推 出 了 Poroshell µm 色 谱 柱 系 列 该 系 列 产 品 丰 富 了 Poroshell 120 平 台, 为 色 谱 工 作 者 和 方 法 开 发 人 员 提 供 了 可 扩 展 的 解 决 方 案 这 一 平 台 扩 展 最 初 包 括 EC-C18 EC-C8 Phenyl-Hexyl PFP 和 HILIC 化 学 键 合 相, 让 用 户 能 够 非 常 轻 松 地 开 始 应 用 Poroshell 120 系 列 产 品 4 µm Poroshell 120 色 谱 柱 的 柱 压 仅 为 2.7 µm Poroshell 120 色 谱 柱 的 50%, 效 率 却 几 乎 是 传 统 全 多 孔 色 谱 柱 的 两 倍, 对 于 想 要 适 当 提 升 分 析 性 能 的 用 户 而 言, 在 方 法 中 应 用 4 µm Poroshell 120 色 谱 柱 是 一 个 简 单 有 效 的 解 决 方 案 将 方 法 转 换 至 Poroshell 120 系 列 相 比 而 言 更 加 直 观 简 便 的 关 键 在 于 转 换 过 程 非 常 简 单, 可 扩 展 性 和 方 法 转 换 的 简 便 性 是 关 键 所 在 Poroshell 120 的 固 定 相 化 学 组 成 可 扩 展 为 其 他 ZORBAX 固 定 相 化 学 组 成, 因 此 从 原 来 的 全 多 孔 5 µm 色 谱 柱 进 行 方 法 转 换 的 过 程 尤 为 直 观 图 75 展 示 了 Eclipse Plus C18 与 Poroshell 120 EC- C18 相 比 的 可 扩 展 性 条 件 1. 抗 坏 血 酸 2. 安 赛 蜜 3. 糖 精 4. 对 羟 基 苯 甲 酸 5. 咖 啡 因 6. 苯 甲 酸 图 75. 从 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18,5 µm 色 谱 柱 ( 上 图 ) 到 Poroshell 120,4 µm( 下 图 ) 的 可 扩 展 性 (0.2% 甲 酸, 甲 醇 35%, 两 种 色 谱 柱 均 为 4.6 x 100 mm, 流 速 :Eclipse Plus 1.45 ml/min,poroshell ml/min) 这 表 明 方 法 转 换 的 简 便 性 得 到 了 极 大 提 升, 我 们 可 将 现 有 的 方 法 从 原 来 的 Eclipse Plus 系 列 色 谱 柱 轻 松 转 换 至 更 加 现 代 化 性 能 更 出 色 的 Poroshell 120 系 列 进 行 方 法 转 换 时, 从 一 种 固 定 相 到 另 一 种 固 定 相 的 可 扩 展 性 固 然 重 要, 粒 径 之 间 的 可 扩 展 性 也 不 容 小 觑 分 析 方 法 在 机 构 中 乃 至 全 球 各 地 进 行 转 换 时, 可 能 需 要 在 各 种 不 同 的 仪 器 上 运 行 因 此, 色 谱 工 作 者 通 常 都 需 要 确 保 某 种 色 谱 柱 固 定 相 有 多 种 粒 径 可 选 Poroshell 120 化 学 键 合 相 提 供 2.7 µm 和 4 µm 规 格 供 用 户 选 择, 不 同 粒 径 之 间 可 轻 松 实 现 扩 展, 从 而 增 强 了 Poroshell 120 系 列 的 灵 活 性 实 例 见 图

116 条件 流动相 50:49:1 MeCH:H20: 乙酸 流速 1.2 ml/min 采用传统方法分析萘普生 N = Rs = 13.7 mau Eclipse Plus C18 5 µm 4.6 x 150 mm USP 规定使用的色谱柱 bar mau N = Rs = 压力仅增加约 50% N = Rs = 14.2 mau min 1. 萘普生 2. 丁酰苯 bar 9 min Poroshell µm 4.6 x 100 mm 效率更高 30 8 Poroshell µm 4.6 x 150 mm 效率提升 2 倍 0 7 相同的背压 98 bar min 图 76. Agilent Poroshell µm 可随时替换传统的 5 µm 色谱柱 采用本方法对萘普生进行 USP 分析时 过去通常使用 5 µm 全多孔色谱柱 但在本例中 我们使用 4.6 x 150 mm 5 µm 的 C18 代表传统方法 使用 5 µm Eclipse Plus C18 色谱柱进行分析时 您可以看到所有的方法 要求均轻松满足 将方法转换到 4 µm Poroshell 120 EC-C18 色谱柱时 不仅维持了原来的选择性 还将效率 提升了近 2 倍 因此 我们使用稍短的色谱柱即可实现更快的分析 4 µm Poroshell 120 色谱柱的分析速度 虽然不如 2.7 µm Poroshell 120 色谱柱 但它仅采用 2.6 或 2.7 µm 表面多孔色谱柱约 50% 的背压 可实现比 5 µm 色谱柱更高的分离度和效率 图 77 展示了使用 2.7 µm 和 4 µm Poroshell 120 色谱柱代替 5 µm 色谱柱进行分析的另一个例子 这个例子 分析了牛奶中的喹诺酮类物质 114

117 初 始 压 力 : 309 bar R3, PW: min Poroshell 120 EC-C x 100 mm, 2.7 µm min 初 始 压 力 : 173 bar R3, PW: min Poroshell 120 EC-C x 100 mm, 4 µm min 图 77. 使 用 Agilent Poroshell 120 EC-C18,4 µm 和 2.7 µm 色 谱 柱 分 析 牛 奶 中 的 喹 诺 酮 类 物 质 采 用 这 种 梯 度 和 方 法,2.7 µm 和 4 µm Poroshell 120 色 谱 柱 之 间 的 可 扩 展 性 是 可 预 见 的 此 外, 对 于 这 一 特 定 的 分 析, 我 们 可 以 看 到 2.7 µm Poroshell 120 色 谱 柱 增 大 了 峰 宽 和 分 离 度, 但 4 µm 色 谱 柱 的 背 压 更 低 可 扩 展 性 对 于 提 升 方 法 开 发 的 灵 活 性 而 言 非 常 重 要 色 谱 柱 产 品 系 列 稳 定 可 预 见 的 可 扩 展 性 有 助 于 我 们 在 不 同 粒 径 的 色 谱 柱 之 间 无 缝 地 进 行 方 法 转 换, 同 时 在 适 用 的 系 统 中 维 持 最 佳 的 性 能 对 于 未 经 优 化 的 旧 系 统,Poroshell µm 是 提 高 分 离 性 能 的 理 想 解 决 方 案, 而 且 方 法 可 在 未 来 轻 松 转 换 至 Poroshell µm 色 谱 柱, 性 能 和 选 择 性 均 可 预 测, 能 够 将 方 法 优 化 和 方 法 转 换 的 难 度 降 至 最 低 115

118 使 用 高 纯 度 级 别 溶 剂 的 重 要 性 一 般 来 讲,HPLC 应 用 中 只 应 使 用 色 谱 级 及 以 上 级 别 的 溶 剂 过 滤 所 有 缓 冲 液, 最 好 使 用 0.22 µm 滤 膜, 特 别 是 对 于 UHPLC 应 用, 标 准 HPLC 应 用 可 使 用 0.45 µm 滤 膜 色 谱 级 及 以 上 的 有 机 溶 剂 一 般 不 需 要 过 滤, 如 果 过 滤 使 用 的 滤 膜 和 玻 璃 容 器 不 是 色 谱 级 的, 过 滤 反 而 可 能 带 来 污 染 物 记 住, 要 适 当 冲 洗 色 谱 柱 一 天 分 析 结 束 时, 将 缓 冲 液 从 系 统 中 冲 洗 出 去, 使 其 处 于 水 / 有 机 流 动 相 环 境 使 用 与 样 品 溶 剂 相 溶 的 流 动 相 ( 参 见 本 指 南 封 底 的 参 考 流 程 ) 如 果 流 动 相 A 只 用 水 或 最 多 含 5% 的 乙 醇, 将 其 留 在 系 统 中 较 长 一 段 时 间 后, 将 会 长 菌 这 将 带 来 压 力 问 题, 并 很 难 去 除, 因 此, 一 定 要 确 保 每 天 或 至 少 每 两 天 新 配 缓 冲 液 UHPLC 的 特 殊 考 虑 由 于 高 效 柱 中 填 料 粒 径 太 小, 色 谱 柱 两 端 需 要 用 更 小 的 筛 板 阻 挡 它 们 同 时 筛 板 也 能 起 到 阻 止 颗 粒 物 进 入 系 统 的 作 用, 避 免 引 起 压 力 升 高 所 以, 对 于 更 高 压 力 的 UHPLC 应 用 而 言, 防 止 污 染 物 进 入 系 统 变 得 更 为 重 要 安 捷 伦 建 议 在 UHPLC 应 用 中 只 使 用 认 证 的 色 谱 / 质 谱 级 溶 剂 一 定 要 检 查 溶 剂 供 应 商 是 否 提 供 以 下 证 书 : 低 溶 剂 和 金 属 杂 质, 以 减 少 对 痕 量 或 未 知 样 品 的 干 扰 痕 量 金 属 指 标 极 低 不 超 过 5 ppb 正 离 子 模 式 和 负 离 子 模 式 性 能 指 标 LC-MS 测 试 和 其 它 QC 测 试 (QC 测 试 项 目 越 多, 溶 剂 越 好!) 溶 剂 和 缓 冲 液 使 用 提 示 : 过 滤 水 性 流 动 相 ( 包 括 缓 冲 液 ) 0.45 µm 用 于 标 准 HPLC,0.2 µm 用 于 UHPLC 使 用 缓 冲 液 会 增 加 色 谱 柱 堵 塞 的 风 险 务 必 确 保 缓 冲 液 浓 度 不 会 导 致 溶 剂 中 的 缓 冲 盐 析 出 制 备 流 动 相 时, 一 定 要 始 终 严 格 遵 循 操 作 程 序, 比 如 溶 剂 的 加 入 顺 序 水 性 流 动 相 会 生 长 藻 类 和 细 菌, 尤 其 当 ph 在 4-8 范 围 时 定 期 更 换 缓 冲 液 ( 建 议 每 2 天 更 换 一 次 ), 始 终 使 用 干 净 的 器 皿 使 用 棕 色 瓶 盛 装 水 性 流 动 相 116

119 在 线 过 滤 器 在 自 动 进 样 器 和 色 谱 柱 之 间 安 装 在 线 过 滤 器 可 以 捕 集 颗 粒 物, 防 止 其 流 入 柱 头, 阻 塞 筛 板 如 果 您 使 用 的 是 3.5 µm 柱, 应 配 置 2 µm 筛 板 1.8 µm 柱 使 用 0.5 µm 筛 板 安 装 在 1290 Infinity 液 相 色 谱 上 的 1290 在 线 过 滤 器 低 体 积 在 线 过 滤 器 过 滤 器 可 用 于 所 有 色 谱 柱, 以 保 护 色 谱 柱 不 被 颗 粒 物 堵 塞 在 线 过 滤 器 通 过 防 止 颗 粒 物 ( 来 自 未 过 滤 的 样 品 和 洗 脱 液, 或 两 者 ) 堵 塞 柱 筛 板 而 延 长 分 析 柱 寿 命 使 用 保 护 柱 可 能 影 响 柱 体 积 极 低 和 粒 径 极 小 色 谱 柱 的 柱 效 对 于 这 些 色 谱 柱, 强 烈 建 议 使 用 低 体 积 在 线 过 滤 器 Agilent 1290 Infinity LC (PN ) 的 在 线 过 滤 器 含 为 低 交 叉 污 染 而 设 计 的 0.3 µm 滤 膜 可 以 在 高 达 1300 bar 压 力 下 使 用, 死 体 积 1.3 µl 该 过 滤 器 也 可 用 于 Agilent 1260 和 1220 Infinity LC, 以 及 1200 RRLC 117

120 保 护 柱 脏 样 品 多 次 进 样 到 不 带 保 护 柱 的 分 析 柱 上 时, 会 缩 短 分 析 柱 的 寿 命 根 据 进 样 次 数 和 样 品 类 型, 色 谱 工 作 者 可 选 择 经 济 的 保 护 柱 在 分 析 柱 之 前 的 溶 剂 流 路 中 配 置 一 根 保 护 柱 保 护 柱 避 免 了 由 颗 粒 物 和 强 吸 附 物 质 造 成 的 损 坏 为 保 持 对 样 品 杂 质 有 足 够 的 容 量, 应 选 择 内 径 与 色 谱 柱 内 径 相 似 的 保 护 柱 理 想 情 况 下, 保 护 柱 的 填 料 应 与 分 析 柱 相 同, 从 而 使 分 析 柱 的 色 谱 性 能 不 发 生 改 变 保 护 柱 参 与 分 离, 因 此 在 方 法 开 发 时 就 应 在 线 安 装 保 护 柱 判 断 何 时 更 换 保 护 柱 可 能 比 较 困 难, 最 好 根 据 经 验 如 果 说 作 为 粗 略 判 断 标 准 的 话, 那 么 塔 板 数 压 力 或 分 离 度 的 改 变 超 过 10%, 就 需 要 更 换 保 护 柱 了 您 需 要 根 据 应 用 类 型 对 更 换 保 护 柱 的 频 率 做 出 判 断 尽 早 更 换 保 护 柱 总 比 晚 更 换 好 UHPLC 的 快 速 保 护 柱 保 护 分 析 柱 溶 剂 饱 和 柱 如 果 您 使 用 的 是 极 端 流 动 相 条 件, 如 在 ph 7, 温 度 在 40 C 以 上, 以 及 缓 冲 盐 浓 度 超 过 50 mm 时, 可 以 使 用 溶 剂 或 硅 胶 饱 和 柱 对 分 析 柱 进 行 保 护 溶 剂 饱 和 柱 安 装 于 泵 和 进 样 器 之 间, 流 动 相 流 过 时 释 放 硅 胶, 在 这 一 过 程 中 使 流 动 相 饱 和 这 样 可 以 防 止 分 析 柱 中 的 硅 胶 溶 解, 延 长 柱 寿 命 溶 剂 饱 和 柱 会 增 加 驻 留 体 积, 对 梯 度 有 延 迟 作 用, 使 用 梯 度 时 这 是 个 缺 点 在 方 法 转 换 过 程 中 应 将 这 一 增 加 的 驻 留 体 积 考 虑 在 内, 以 确 保 重 现 性 色 谱 柱 入 口 筛 板 如 果 没 有 保 护 柱 或 在 线 柱 前 过 滤 器, 在 使 用 HPLC 柱 时, 分 析 柱 可 能 发 生 堵 塞 由 于 现 在 使 用 的 是 高 效 装 柱 工 艺, 不 建 议 更 换 色 谱 柱 入 口 筛 板, 在 许 多 色 谱 柱 上 也 不 可 能 更 换 如 果 更 换 筛 板, 可 能 影 响 柱 效 色 谱 柱 保 护 和 保 存 最 大 限 度 地 延 长 柱 寿 命 现 代 色 谱 柱 都 很 耐 用, 采 用 的 设 计 在 常 用 色 谱 条 件 下 都 可 长 期 使 用 在 其 性 能 指 标 范 围 内 操 作 可 最 大 限 度 地 延 长 柱 寿 命 在 确 定 最 终 方 法 时 一 定 要 再 查 验 一 下 这 些 性 能 指 标 118

121 提 示 使 用 保 护 柱 和 / 或 0.5 µm 在 线 过 滤 器 附 加 信 息 参 见 第 117 页 保 护 柱 章 节 经 常 用 强 溶 剂 冲 洗 色 谱 柱 使 用 100% B 溶 剂, 如 果 怀 疑 压 力 升 高, 使 用 更 强 溶 剂 参 见 第 58 页 的 色 谱 柱 清 洗 指 南 对 脏 样 品 进 行 预 处 理, 最 大 限 度 减 少 强 保 留 组 分 和 颗 粒 按 照 色 谱 柱 生 产 商 的 温 度 上 限 指 标 进 行 操 作 使 用 固 相 萃 取 液 - 液 萃 取 用 0.45 µm 滤 膜 (UHPLC 用 0.22 µm 滤 膜 ) 过 滤 样 品, 或 高 速 离 心 许 多 新 方 法 都 要 求 较 高 温 度, 某 些 色 谱 柱 可 以 承 受 高 温, 理 想 情 况 下, 应 在 温 度 上 限 指 标 之 下 操 作 色 谱 柱 在 压 力 上 限 之 下 使 用 色 谱 柱 选 择 使 压 力 低 于 压 力 上 限 的 流 速, 最 好 低 10% 按 标 注 方 向 操 作 色 谱 柱, 查 阅 色 谱 柱 说 明 书 或 咨 询 厂 商, 以 确 定 色 谱 柱 是 否 可 以 反 冲 使 用 ph 2-7 的 流 动 相, 可 最 大 限 度 地 延 长 柱 寿 命 使 用 新 鲜 溶 剂, 以 防 止 细 菌 生 长 贮 存 色 谱 柱 时, 应 先 冲 出 盐 和 缓 冲 液 柱 内 只 保 留 纯 乙 腈, 或 纯 水 与 乙 腈 50/50 混 合 溶 剂 使 用 高 温 时 一 定 要 逐 渐 升 高 柱 温, 而 且 仅 在 用 流 动 相 洗 脱 时 进 行 色 谱 柱 接 入 仪 器 时, 两 端 接 头 不 要 拧 得 过 紧 使 用 短 柄 扳 手, 以 防 两 端 接 头 过 紧 如 果 您 有 问 题, 一 定 要 询 问 厂 商 如 果 您 需 要 在 超 过 此 ph 范 围 的 条 件 下 工 作, 可 使 用 StableBond 柱 ( 用 于 低 ph 条 件 ) 或 为 高 ph 而 设 计 的 色 谱 柱 ( 如,Eclipse Extend-C18) 或 聚 合 物 色 谱 柱 为 防 止 细 菌 生 长, 可 配 制 流 动 相 贮 备 液, 并 将 其 保 存 在 冰 箱 中, 需 要 时 每 天 使 用 用 叠 氮 钠 也 可 以 防 止 细 菌 生 长, 但 其 具 有 致 癌 性, 须 小 心 使 用 这 样 可 以 防 止 缓 冲 盐 在 柱 内 沉 淀 乙 腈 是 色 谱 柱 保 存 的 良 好 溶 剂, 因 为 水 和 醇 类 流 动 相 可 能 提 高 固 定 相 水 解 速 率 分 析 完 成 后, 让 流 动 相 继 续 洗 脱, 直 到 回 到 室 温 由 于 色 谱 柱 的 柱 端 螺 母 为 3/8 英 寸, 应 使 用 3/8 英 寸 短 扳 手 将 色 谱 柱 接 入 仪 器, 不 要 将 柱 端 接 头 拧 得 过 紧 表 10. 延 长 柱 寿 命 的 提 示 119

122 保 存 注 意 事 项 为 防 止 金 属 腐 蚀, 应 避 免 将 色 谱 柱 长 期 保 存 在 含 卤 素 溶 剂 中 ( 如, 丁 酰 氯 二 氯 甲 烷 等 ) 如 果 使 用 了 含 缓 冲 液 的 流 动 相, 应 使 用 20 到 30 倍 柱 体 积 的 乙 腈 和 水 冲 洗 色 谱 柱, 然 后 用 同 样 体 积 的 纯 有 机 溶 剂 冲 洗 缓 冲 液 残 留 在 色 谱 柱 内, 将 促 使 细 菌 生 长, 使 色 谱 柱 或 筛 板 堵 塞, 或 导 致 鬼 峰 的 出 现 可 以 用 大 多 数 其 他 溶 剂 保 存 未 键 合 的 硅 胶 柱 但 不 能 保 存 在 容 易 发 生 降 解 的 溶 剂 中, 如,THF TEA 或 TFA 如 需 过 夜 保 存, 不 要 将 色 谱 柱 停 止 运 行, 您 可 以 使 流 动 相 流 经 色 谱 柱, 保 持 流 速 在 0.1 到 0.2 ml/min 这 样 还 可 以 缩 短 第 二 天 的 平 衡 时 间 如 需 长 期 保 存, 应 使 用 厂 商 推 荐 的 溶 剂, 通 常 是 新 柱 装 运 时 所 用 的 溶 剂 疏 通 色 谱 柱 如 果 反 压 升 高, 您 怀 疑 发 生 了 色 谱 柱 堵 塞 时, 可 以 进 行 反 冲 断 开 色 谱 柱 与 检 测 器 之 间 的 连 接, 将 流 动 相 从 反 方 向 泵 入 色 谱 柱 ( 如 果 厂 商 说 明 这 样 操 作 没 有 问 题 的 话 ) 如 需 了 解 清 洗 色 谱 柱 的 更 多 信 息, 请 参 见 第 60 页 色 谱 柱 变 坏 时 的 快 速 检 查 除 了 保 存 色 谱 柱 刚 刚 使 用 时 的 柱 性 能 测 试 色 谱 图 ( 见 第 122 页 ) 外, 您 还 可 以 根 据 色 谱 的 基 本 概 念, 以 评 估 色 谱 柱 是 否 需 要 更 换 : 参 数 理 论 塔 板 数,N( 柱 效 ) 保 留 因 子,k 选 择 性 因 子,α 拖 尾 因 子,Tf 柱 反 压,P 警 告 信 号 长 时 间 使 用 造 成 的 色 谱 柱 空 洞 和 污 染 将 降 低 柱 效 峰 展 宽 是 柱 效 降 低 的 信 号 通 过 监 测 N, 可 以 检 测 出 这 些 问 题 更 多 信 息 请 参 见 第 6 页 保 留 因 子 与 流 速 和 柱 尺 寸 无 关 k 值 改 变 说 明 可 能 由 于 未 洗 脱 化 合 物 出 现 了 键 合 相 流 失 或 柱 污 染 等 问 题 该 值 也 可 能 与 流 动 相 的 变 化 相 关, 造 成 色 谱 柱 出 问 题 的 假 象 详 见 第 7 页 选 择 性 因 子 的 偏 移 与 k 一 起, 是 键 合 相 流 失 柱 污 染 或 流 动 相 条 件 改 变 的 另 一 个 标 志, 详 见 第 7 页 拖 尾 因 子 是 用 来 说 明 峰 对 称 性 的 拖 尾 因 子 增 大 说 明 色 谱 柱 出 现 了 空 洞 问 题, 但 也 可 能 是 键 合 相 流 失 造 成 极 性 溶 质 和 硅 醇 基 位 点 相 互 作 用 的 结 果 柱 压 升 高 通 常 是 颗 粒 堵 塞 色 谱 柱 入 口 筛 板 造 成 的 但 柱 填 料 塌 陷 所 引 起 的 色 谱 柱 空 洞 也 可 以 引 起 压 力 的 较 大 波 动, 详 见 第 9 页 表 11. 有 助 于 监 测 柱 性 能 的 参 数 120

123 确 保 方 法 在 全 球 范 围 内 都 重 现 如 果 色 谱 柱 的 使 用 背 景 不 同 那 么 它 们 的 保 留 就 很 可 能 不 一 样, 如 果 在 方 法 开 发 时 使 用 的 色 谱 柱 被 另 一 根 色 谱 柱 代 替, 那 么 将 会 产 生 不 同 的 结 果 这 是 由 于 第 二 根 色 谱 柱 可 能 没 有 经 历 过 与 第 一 根 柱 相 似 的 使 用 背 景 在 开 发 方 法 的 过 程 中, 可 能 存 在 平 衡 不 足 或 不 一 致 的 情 况, 又 没 有 给 重 复 实 验 的 其 他 工 作 人 员 明 确 的 提 示 每 个 工 作 人 员 平 衡 其 色 谱 柱 的 时 间 可 能 不 同, 很 可 能 使 结 果 产 生 波 动 当 采 用 与 方 法 开 发 人 员 相 同 的 方 式 平 衡 色 谱 柱 后, 将 得 到 相 同 的 结 果 引 起 保 留 改 变 的 其 它 因 素 包 括, 由 于 方 法 可 能 不 耐 用, 导 致 色 谱 柱 / 流 动 相 组 合 不 好 ; 流 动 相 流 速 以 及 其 它 仪 器 参 数 发 生 改 变 ; 以 及 色 谱 柱 之 间 柱 床 体 积 略 有 不 同 等 提 高 方 法 的 耐 用 性 不 同 批 次 的 色 谱 柱 可 能 对 特 定 化 合 物 的 分 析 结 果 产 生 波 动 不 同 批 次 的 试 剂 也 可 能 存 在 影 响 色 谱 结 果 的 变 化 开 发 方 法 时, 良 好 的 习 惯 做 法 是 对 多 个 批 次 * 进 行 分 析, 并 评 估 分 析 条 件 是 否 可 以 承 受 不 同 批 次 的 微 小 变 化 生 产 厂 商 都 试 图 确 保 不 同 批 次 之 间 的 重 复 性, 但 差 异 的 存 在 不 可 避 免 谨 慎 的 方 法 开 发 将 有 助 于 避 免 将 来 出 现 的 相 关 问 题 评 估 批 次 之 间 的 变 化 时, 首 先 要 确 定 您 已 经 解 决 了 柱 与 柱 之 间 的 问 题 然 后 再 考 核 方 法 的 耐 用 性 如 果 您 分 析 的 是 可 离 子 化 的 化 合 物, 要 确 定 您 使 用 了 缓 冲 液, 其 ph 不 能 接 近 分 析 物 的 pk a 另 外, 要 检 查 样 品 和 色 谱 柱 对 ph 的 敏 感 性, 以 及 次 级 相 互 作 用 如 果 您 已 确 定 存 在 ph 敏 感 性 的 问 题, 可 能 需 要 对 方 法 进 行 重 新 评 价 在 本 例 中 ( 图 78), 批 次 之 间 的 变 化 与 ph 有 关 方 法 用 批 次 1 在 ph 4.5 条 件 下 开 发 回 想 一 下 前 面 讲 过 的 内 容, 硅 醇 基 对 ph 4.5 左 右 的 碱 性 化 合 物 具 有 活 性 ( 详 见 第 70 页 上 的 ph 与 方 法 ) 您 可 以 看 到 两 个 碱 性 化 合 物 都 具 有 良 好 峰 形 使 用 批 次 2 时, 碱 性 化 合 物 2 发 生 明 显 偏 移, 峰 形 不 再 尖 锐 可 以 通 过 加 入 TEA 或 降 低 ph 解 决 这 个 问 题 在 本 例 中, 采 用 降 低 ph 的 方 法 在 ph 3 条 件 下, 批 次 1 的 选 择 性 发 生 了 改 变, 但 仍 可 以 得 到 良 好 的 基 线 分 离 另 外, 在 ph 3 条 件 下, 批 次 1 和 批 次 2 的 重 复 性 很 好 在 这 个 特 例 中, 峰 4 降 低, 但 这 是 由 于 样 品 降 解 造 成 的 * 安 捷 伦 拥 有 200 多 种 便 捷 的 一 体 式 工 具 包, 三 批 独 立 方 法 验 证 色 谱 柱 让 您 唾 手 可 得 121

124 图 78. ph 水 平 所 引 起 的 批 次 之 间 的 保 留 变 化 批 次 之 间 保 留 变 化 小 结 : 消 除 引 起 柱 间 选 择 性 改 变 的 全 部 因 素 重 新 评 估 方 法 耐 用 性, 并 修 改 方 法 测 定 ph 敏 感 性, 并 再 次 修 改 方 法 将 不 同 的 选 择 性 变 化 分 类, 并 联 系 生 产 厂 商 有 关 驻 留 体 积 的 提 示 驻 留 体 积 与 实 验 室 之 间 的 方 法 转 移 密 切 相 关 ( 如 需 了 解 驻 留 体 积 的 更 多 信 息 可 参 见 第 48 页 ) 如 果 一 个 实 验 室 中 使 用 的 HPLC 仪 器 与 另 一 个 实 验 室 仪 器 的 驻 留 体 积 不 同, 即 使 两 个 实 验 室 使 用 相 同 的 方 法, 运 行 结 果 也 很 有 可 能 不 完 全 相 同 这 种 不 匹 配 的 原 因 就 在 于 在 两 种 ( 或 更 多 ) 流 动 相 混 合 形 成 梯 度 后, 经 仪 器 管 路 到 达 柱 头 的 时 间 不 同 因 此, 分 析 物 进 样 后, 将 通 过 不 同 的 流 动 相 组 成 ( 时 间 的 函 数 ) 进 行 分 离, 其 保 留 和 分 离 度 都 可 能 受 到 影 响 所 以, 应 对 驻 留 体 积 较 小 的 仪 器 增 加 体 积 来 调 整 驻 留 体 积 或 者, 减 少 驻 留 体 积 大 的 仪 器 的 管 线 内 径 和 长 度, 使 其 与 驻 留 体 积 小 的 仪 器 相 匹 配 另 一 个 办 法 是 在 方 法 中 设 置 一 段 梯 度 延 迟, 对 流 路 系 统 中 不 同 的 驻 留 时 间 进 行 补 偿 但 是, 某 些 认 证 方 法 可 能 不 允 许 分 析 中 使 用 这 种 改 变 122

125 快 速 故 障 排 查 指 南 我 们 知 道 这 是 怎 么 回 事 您 需 要 一 次 读 完 整 本 书, 但 谁 有 这 么 多 时 间? 您 可 能 在 遇 到 问 题 时, 才 来 读 这 本 书 我 们 有 一 张 快 速 指 南 表, 其 中 包 含 了 我 们 的 技 术 支 持 团 队 从 行 业 中 色 谱 工 作 人 员 那 里 了 解 到 的 最 常 见 问 题, 帮 助 您 快 速 确 定 可 能 的 原 因, 并 提 供 省 时 的 技 巧 用 以 找 到 问 题 所 在 更 多 有 关 特 定 问 题 的 细 节 信 息, 可 参 考 本 指 南 的 其 它 部 分 有 效 排 查 故 障 的 要 点 要 记 住 一 条 原 则, 您 事 先 需 要 知 道 正 常 情 况 是 什 么 样, 那 么 您 才 能 判 断 是 否 出 了 问 题 实 验 室 中 应 该 做 到 以 下 两 点, 对 故 障 排 查 会 很 有 帮 助 : 每 根 新 柱 都 要 保 留 一 张 测 试 样 品 的 色 谱 图 从 查 看 随 色 谱 柱 一 起 提 供 的 测 试 色 谱 图 开 始 多 数 情 况 下, 测 试 样 品 都 是 很 容 易 找 到 的 化 学 药 品, 或 在 实 验 室 中 常 用, 或 可 以 从 化 学 试 剂 供 应 商 处 买 到 配 制 测 试 样 品 ( 各 组 分 的 起 始 浓 度 0.1 mg/ml 是 一 个 良 好 的 选 择 ), 在 您 的 仪 器 上 用 新 柱 对 其 分 析, 然 后 进 行 比 较 最 初 的 测 试 样 品 进 样 将 有 助 于 确 定, 是 否 存 在 妨 碍 您 获 得 最 佳 结 果 的 系 统 问 题 有 些 人 更 愿 意 用 他 们 自 己 的 样 品 或 标 准 品, 因 为 测 试 混 标 可 能 与 他 们 的 应 用 无 关 最 好 使 用 等 度 条 件, 因 为 有 时 梯 度 会 压 缩 峰 而 掩 盖 不 良 柱 效, 使 这 些 峰 人 为 地 显 得 尖 锐 一 段 时 间 后, 将 您 自 己 的 测 试 色 谱 图 与 这 张 最 初 的 色 谱 图 进 行 比 较, 可 以 帮 助 您 判 断 柱 效 是 否 降 低, 或 是 否 有 影 响 柱 效 的 其 它 变 化 用 第 5 到 11 页 中 讨 论 的 公 式 对 柱 效 选 择 性 分 离 度 和 压 力 等 参 数 进 行 定 量 分 析 也 是 个 好 办 法 通 过 色 谱 柱 的 性 能 对 比, 可 以 开 始 分 辨 问 题 的 来 源 制 造 厂 商 的 仪 器 针 对 测 试 色 谱 柱 进 行 了 优 化 以 获 得 最 佳 的 色 谱 柱 性 能 因 此 实 际 塔 板 数 会 比 制 造 厂 商 提 供 的 测 试 色 谱 图 的 数 字 要 低 保 留 优 化 仪 器 的 系 统 图 安 装 仪 器 并 优 化 方 法 时, 详 细 记 录 您 的 仪 器 是 如 何 叠 放 的, 所 有 附 件 的 部 件 号 和 所 有 连 接 管 线 的 长 度, 以 及 所 有 电 子 连 接 如 果 有 问 题 时 这 张 图 可 作 为 便 捷 的 参 考, 用 以 确 保 配 置 没 有 改 变, 从 而 改 变 的 是 结 果 或 仪 器 性 能 123

126 问 题 可 能 的 原 因 解 决 办 法 压 力 高 反 压 ( 如 需 更 多 信 息 请 参 见 第 9 页 上 的 压 力 方 程 ) 色 谱 柱 入 口 筛 板 堵 塞 反 冲 色 谱 柱 ( 见 58 页 ) 色 谱 柱 堵 塞 ( 化 学 污 染 ) 用 溶 剂 清 洗 色 谱 柱, 如 果 不 能 改 善 则 更 换 色 谱 柱 色 谱 柱 粒 径 太 小 参 考 色 谱 柱 的 选 择 ( 见 12 页 ) 在 线 过 滤 器 或 保 护 柱 堵 塞 管 线 堵 塞 聚 合 物 色 谱 柱 : 溶 剂 改 变 导 致 溶 胀 流 动 相 粘 度 过 高 盐 / 缓 冲 液 沉 淀 检 查 在 线 过 滤 器 的 滤 头, 必 要 时 更 换 拆 卸 管 线 以 便 确 证, 必 要 时 更 换 咨 询 厂 商, 了 解 溶 剂 兼 容 性 信 息 使 用 粘 度 较 低 的 溶 剂, 或 升 高 温 度 确 保 流 动 相 与 缓 冲 液 的 兼 容 性 压 力 波 动 泵 中 有 气 泡 溶 剂 脱 气 ( 见 70 页 ); 溶 剂 中 充 氦 气 或 使 用 在 线 脱 气 机 压 力 下 降 或 低 压 峰 形 单 向 阀 或 密 封 垫 渗 漏 泵 流 量 不 够 泵 单 向 阀 或 密 封 垫 渗 漏 泵 内 有 气 泡 更 换 或 清 洗 单 向 阀 ; 更 换 泵 密 封 垫 放 空 流 动 相 容 器, 更 换 容 器 中 的 进 样 口 在 线 过 滤 头 ; 检 查 管 线 是 否 被 挤 压 ; 检 查 流 量 设 置 ; 全 系 统 检 漏 更 换 或 清 洗 单 向 阀 ; 更 换 泵 密 封 垫 ; 检 查 是 否 有 盐 析 出 残 留 溶 剂 脱 气 ; 检 查 溶 剂 瓶 到 泵 的 管 路 是 否 阻 塞 ; 更 换 进 样 口 在 线 滤 头 无 峰 仪 器 问 题 确 定 所 有 HPLC 组 件 都 已 开 启 并 运 行 ; 检 查 检 测 器 出 口 管 路 流 动 相 或 固 定 相 组 合 错 误 是 否 有 液 体 流 出 ; 进 样 不 保 留 化 合 物 以 确 保 系 统 适 用 性 ; 提 高 溶 剂 强 度 或 使 用 梯 度 洗 脱 意 外 峰 或 鬼 峰 在 之 前 分 析 中 未 洗 脱 的 分 析 物 流 动 相 污 染 样 品 制 备 / 样 品 制 备 污 染 使 用 快 速 梯 度, 如 在 10 到 15 分 钟 的 时 间 内 乙 腈 由 10% 升 至 90%, 弄 清 样 品 中 的 组 分 数 量 及 其 相 对 保 留 从 强 流 动 相 开 始, 如 75% 甲 醇 和 / 或 更 高 流 速, 让 组 分 更 快 流 出 色 谱 柱 只 使 用 高 纯 度 色 谱 级 及 以 上 的 (LC/MS 或 梯 度 级 ) 溶 剂 使 用 内 部 纯 水 系 统 的 高 纯 度 水 水 相 流 动 相 中 使 用 TFA, 有 机 流 动 相 溶 剂 中 使 用 较 低 浓 度 的 TFA( 即, 水 中 含 0.1% TFA/ 乙 腈 中 含 0.086% TFA); 使 用 更 长 的 检 测 波 长, 这 样 TFA 的 吸 收 较 弱 ( 见 75 页 ) 使 用 降 低 污 染 的 常 用 样 品 制 备 方 法 过 滤 SPE 液 液 萃 取 离 心 等 表 12. 快 速 故 障 排 查 技 巧 转 下 页 124

127 问 题 可 能 的 原 因 解 决 办 法 峰 形, 续 意 外 峰, 或 鬼 峰, 续 系 统 污 染 色 谱 柱 污 染 ( 注 : 较 少 引 起 鬼 峰 ) 进 样 样 品 溶 剂, 确 保 样 品 溶 剂 没 有 问 题 ; 在 多 次 运 行 过 程 中 进 行 空 白 进 样, 证 明 没 有 交 叉 污 染 引 起 的 鬼 峰 从 流 路 中 拆 除 自 动 进 样 器, 运 行 空 白 程 序, 检 查 鬼 峰 是 否 消 失 如 果 消 失, 清 洗 自 动 进 样 器 如 果 没 有, 再 检 查 流 路 中 的 其 它 系 统 组 件, 以 查 找 来 源 反 冲 色 谱 柱 ( 如 果 可 以 反 冲 的 话, 查 看 厂 商 的 信 息 ); 清 洗 色 谱 柱 ( 见 58 页 ) 前 伸 峰 色 谱 柱 沟 流 更 换 色 谱 柱, 使 用 保 护 柱 拖 尾 峰 色 谱 柱 过 载 硅 醇 基 相 互 作 用 ( 硅 胶 类 色 谱 柱 ) 柱 外 效 应 色 谱 柱 在 高 温 下 降 解 ( 硅 胶 基 色 谱 柱 ) 色 谱 柱 在 高 ph 下 降 解 ( 硅 胶 类 色 谱 柱 ) 色 谱 柱 空 洞 干 扰 共 洗 脱 峰 使 用 更 高 容 量 的 色 谱 柱 ( 增 加 柱 长 或 内 径 ); 减 少 样 品 量 使 用 封 端 或 专 用 柱 ; 增 大 缓 冲 液 浓 度 ; 降 低 流 动 相 ph 以 抑 制 硅 醇 基 相 互 作 用 ; 使 用 竞 争 碱 ; 采 用 改 变 极 性 相 互 作 用 的 衍 生 化 解 决 方 案 ; 如 果 没 有 效 果, 尝 试 反 向 运 行 色 谱 柱 ; 如 果 结 果 改 善, 则 说 明 很 可 能 是 柱 污 染 所 致 ; 清 洗 或 更 换 色 谱 柱 检 查 系 统, 各 部 件 的 连 接 管 线 是 否 过 长, 并 更 换 为 较 短 管 线 ; 如 果 使 用 的 是 高 效 柱, 将 内 径 0.18 mm 的 绿 色 管 线 换 成 内 径 0.12 mm 的 红 色 管 线 将 温 度 降 低 到 40 C 以 下, 特 别 是 使 用 高 ph 流 动 相 时 ; 使 用 高 温 兼 容 色 谱 柱, 如 立 体 保 护 的 硅 胶 柱 混 合 型 柱 聚 合 物 柱 氧 化 锆 柱 等 使 用 特 别 适 合 在 较 高 ph 下 操 作 的 高 覆 盖 率 或 双 交 联 固 定 相 ( 比 如,ZORBAX Extend-C18), 或 使 用 聚 合 物 混 合 型 或 氧 化 锆 反 相 柱 反 方 向 运 行 ; 如 果 所 有 峰 的 峰 形 都 差 或 出 现 双 峰, 说 明 可 能 存 在 色 谱 柱 空 洞 ; 弃 用 色 谱 柱 调 节 流 动 相 以 改 善 选 择 性 ( 见 69 页 ) 或 选 择 新 的 固 定 相, 改 善 样 品 净 化 峰 裂 分 / 双 峰 干 扰 组 分 通 过 样 品 制 备 净 化 样 品 ; 改 变 流 动 相 或 固 定 相 以 调 节 选 择 性 如 果 怀 疑 该 组 分 来 自 以 前 的 进 样, 分 析 后 用 强 溶 剂 冲 洗 色 谱 柱 ; 在 梯 度 中 增 加 强 溶 剂 浓 度 ; 延 长 洗 脱 时 间 转 下 页 125

128 问 题 可 能 的 原 因 解 决 办 法 峰 形, 续 峰 分 裂 / 双 峰, 续 色 谱 柱 筛 板 部 分 堵 塞 反 冲 色 谱 柱 ( 如 果 可 以 反 冲 的 话 )( 见 58 页 ); 在 进 样 器 和 色 谱 柱 之 间 使 用 0.2 µm 或 0.5 µm (UHPLC) 在 线 过 滤 器 ; 过 滤 样 品 使 用 保 护 柱 ( 见 117 页 ) 色 谱 柱 空 洞 更 换 色 谱 柱 ; 以 后 使 用 保 护 柱 以 保 护 分 析 柱 ( 见 117 页 ); 使 用 较 少 凝 聚 的 流 动 相 条 件 进 样 溶 剂 效 应 使 用 流 动 相 或 较 弱 的 进 样 溶 剂 ( 见 页 ) 样 品 体 积 过 载 使 用 较 小 的 样 品 进 样 体 积 ( 见 46 页 ) 样 品 溶 剂 与 流 动 相 不 兼 容 进 样 器 转 子 损 坏 使 用 流 动 相 或 与 进 样 溶 剂 相 溶 的 较 弱 溶 剂 更 换 进 样 器 转 子 峰 展 宽 / 宽 峰 接 头 / 连 接 不 合 适 确 保 您 的 接 头 正 确 安 装 ( 见 45 页 ) 系 统 中 的 管 线 外 体 积 确 保 管 线 细 并 尽 量 短, 避 免 柱 外 体 积 ( 见 41 页 ) 进 样 体 积 过 大 降 低 进 样 体 积 ( 见 46 页 ) 系 统 设 置 ( 比 如, 数 据 采 集 速 率 过 低 ) 检 查 数 据 采 集 速 率 调 节 检 测 器 设 置 和 / 或 时 间 常 数, 在 不 降 低 信 噪 比 的 情 况 下 用 最 快 的 采 集 速 率 ( 见 47 页 ) 样 品 稀 释 度 过 高 降 低 稀 释 强 度 ( 见 47 页 ) 对 于 梯 度 洗 脱 : 驻 留 体 积 降 低 初 始 梯 度 浓 度, 以 进 行 峰 浓 缩, 或 者 在 样 品 进 样 前 使 用 进 样 器 程 序 开 始 梯 度 ( 见 49 页 ) 注 意 峰 是 在 梯 度 阶 段 被 洗 脱 出 来 而 不 是 等 度 洗 脱 的 保 留 保 留 时 间 漂 移 色 谱 柱 逐 渐 陈 旧 与 测 试 色 谱 图 ( 见 122 页 ) 进 行 比 较, 发 现 色 谱 柱 的 变 化 ; 使 用 保 护 柱 以 延 长 柱 寿 命 色 谱 柱 规 格 和 流 速 变 化 确 保 您 的 方 法 参 数 根 据 流 速 和 柱 规 格 的 变 化 ( 见 页 ) 而 调 节 这 对 于 梯 度 洗 脱 尤 为 重 要 对 您 的 分 析 物 而 言 色 谱 柱 / 流 动 相 的 搭 配 不 对 ( 对 于 键 合 相 保 留 太 低,pH 过 于 接 近 pk a, 色 谱 柱 的 ph 范 围 与 流 动 相 的 不 兼 容 等 ) 对 于 流 动 相 : 色 谱 柱 的 再 平 衡 时 间 不 够 您 的 流 动 相 很 可 能 不 能 保 持 一 致 确 保 您 每 次 使 用 的 流 动 相 都 是 一 样 的 缓 冲 液 和 溶 剂 应 该 分 别 用 干 净 的 玻 璃 器 皿 测 量, 然 后 混 合 ; 流 动 相 脱 气 ; 更 换 老 化 流 动 相 ( 见 页 ) 对 您 柱 的 死 体 积 和 系 统 的 驻 留 体 积 进 行 测 量, 以 便 优 化 平 衡 时 间 和 方 法 ( 见 56 和 83 页 ) 转 下 页 126

129 问 题 可 能 的 原 因 解 决 办 法 保 留, 续 保 留 时 间 缩 短 色 谱 柱 填 料 的 活 性 位 点 使 用 流 动 相 改 性 剂, 竞 争 碱 ( 碱 性 化 合 物, 如 三 乙 胺 ) 或 增 加 缓 冲 液 强 度, 使 用 高 覆 盖 率 的 柱 填 料 样 品 过 载 键 合 相 或 硅 胶 基 流 失 色 谱 柱 老 化 减 少 样 品 量 或 使 用 较 大 内 径 或 更 长 的 色 谱 柱 使 用 ph 2 到 8 之 间 的 流 动 相 ; 使 用 高 ph 或 低 ph 专 用 硅 胶 柱, 聚 合 物 柱 或 其 它 高 / 低 ph 柱 使 用 保 护 柱, 或 高 稳 定 性 键 合 相 聚 合 物 混 合 型 或 高 稳 定 性 柱 ( 如, 氧 化 锆 钛 石 墨 碳 ) 保 留 时 间 延 长 流 速 降 低 检 查 并 重 新 设 置 流 速 ; 检 查 泵 是 否 有 气 泡 ; 检 查 泵 密 封 垫 是 否 渗 漏, 以 及 单 向 阀 和 其 它 系 统 渗 漏 流 动 相 组 成 改 变 键 合 相 流 失 补 足 溶 剂 瓶 ; 确 保 梯 度 系 统 比 例 正 确 ; 预 混 合 流 动 相 进 行 等 梯 度 洗 脱 ( 见 69 页 ) 对 于 常 用 硅 胶 型 色 谱 柱, 要 保 持 流 动 相 ph 在 2-8 之 间 ; 对 于 极 高 ph (> 10) 或 极 低 ph (< 2) 的 工 作, 使 用 高 稳 定 性 固 定 相, 聚 合 物 或 高 稳 定 性 固 定 相 柱 基 线 基 线 漂 移 对 于 梯 度 洗 脱 : 流 动 相 A 或 B 的 吸 收 不 同 波 动 室 温 变 化 正 向 LC/MS, 固 定 相 流 失 正 向 MS 污 染 色 谱 柱 污 染 ( 色 谱 柱 流 失 ) 对 于 持 续 性 问 题 : 检 查 检 测 器 光 源 或 流 通 池 对 于 负 漂 移 : 使 用 无 UV 吸 收 的 流 动 相 溶 剂 ; 使 用 色 谱 级 流 动 相 溶 剂 ; 把 流 动 相 A 中 的 UV 吸 收 添 加 剂 加 至 流 动 相 B 中, 用 于 平 衡 / 补 偿 漂 移 对 于 正 漂 移 : 使 用 分 析 物 仍 有 吸 收 的 更 高 UV 吸 收 检 测 器 波 长 ; 使 用 无 UV 吸 收 的 流 动 相 溶 剂 ; 减 少 流 动 相 B 中 UV 吸 收 化 合 物 的 量, 用 以 平 衡 / 补 偿 漂 移 ( 见 75 页 ) 隔 离 色 谱 柱 或 使 用 柱 温 箱 ; 遮 蔽 示 差 折 光 检 测 器 或 使 其 隔 绝 空 气 流 使 用 低 流 失 MS 兼 容 或 高 稳 定 性 固 定 相 色 谱 柱 清 洗 质 谱 接 口, 避 免 使 用 THF 和 含 卤 素 溶 剂, 使 用 PEEK 管 线 柱 用 强 溶 剂 冲 洗 色 谱 柱 ; 改 善 样 品 净 化 ; 使 用 / 更 换 保 护 柱 ; 更 换 分 析 柱 更 换 UV 灯 ; 清 洁 并 冲 洗 流 通 池 转 下 页 127

130 问 题 可 能 的 原 因 解 决 办 法 基 线, 续 基 线 漂 移, 续 梯 度 或 等 度 : 缺 乏 溶 剂 混 合 使 用 适 当 混 合 装 置 ; 通 过 将 一 种 含 UV 吸 收 的 化 合 物 加 入 溶 剂 并 监 测 UV 吸 收 检 测 器 的 输 出, 检 查 比 例 阀 精 密 度 梯 度 或 等 度 比 例 比 例 阀 故 障 清 洗 并 更 换 比 例 阀 ; 部 分 地 预 混 合 溶 剂 ( 如,A 中 含 5% B, 和 / 或 反 之 亦 然 ) 偶 然 尖 峰 外 部 电 信 号 干 扰 LC 系 统 使 用 稳 压 器 / 恒 电 压 电 源 ; 检 查 是 否 有 局 部 干 扰 源, 如, 循 环 炉, 使 用 独 立 电 流 周 期 性 泵 脉 冲 维 修 或 更 换 阻 尼 器 ; 排 除 泵 中 的 空 气 ; 清 洁 或 更 换 单 向 阀 ; 流 动 相 脱 气 随 机 积 聚 污 染 尖 刺 峰 检 测 器 中 的 气 泡 用 强 溶 剂 ( 见 58 页 ) 冲 洗 或 反 冲 色 谱 柱 ( 如 果 可 以 反 冲 的 话 ); 净 化 样 品 ; 使 用 色 谱 级 溶 剂 流 动 相 脱 气 ( 见 70 页 ); 检 测 器 出 口 处 使 用 反 压 限 流 器 ; 确 保 所 有 接 头 都 紧 密 无 渗 漏 ( 见 44 页 ) 128

131 有 用 的 参 考 资 料 这 里 还 有 一 个 您 随 身 携 带 这 本 书 的 理 由 我 们 列 出 了 一 些 对 方 法 开 发 有 用 的 表 格 : 美 国 药 典 指 定 填 料 溶 剂 性 质 表, 包 括 极 性 指 数 值 和 UV 截 止 波 长 溶 剂 相 溶 性 表 常 用 流 动 相 改 性 剂 的 UV 截 止 波 长 固 相 萃 取 (SPE) 填 料 概 况 SPE 吸 附 剂 使 用 条 件 美 国 药 典 指 定 填 料 美 国 药 典 (USP) 指 定 色 谱 柱 填 料, 而 不 是 生 产 厂 家 在 大 多 数 规 定 中, 都 列 出 了 几 种 不 同 类 型 的 色 谱 柱, 具 有 不 同 粒 径 不 同 填 料 颗 粒 形 状, 可 能 还 有 碳 载 量 或 比 表 面 积 在 这 些 例 子 中,USP 色 谱 柱 性 能 指 标 相 当 宽 泛, 几 种 柱 类 型 都 能 符 合 其 基 本 性 能 指 标 例 如,L1 性 能 指 标 要 求 十 八 烷 基 硅 烷 化 键 合 到 多 孔 硅 胶 陶 瓷 微 粒 ( 直 径 1.5 到 10 µm) 或 整 体 柱 上 许 多 商 品 化 的 色 谱 柱 都 符 合 这 些 基 本 性 能 指 标, 但 可 能 采 用 不 同 类 型 的 填 料, 包 括 全 多 孔 型 表 面 多 孔 型 和 整 体 型 但 是, 并 非 所 有 C18 柱 都 相 同, 实 际 上 只 有 有 限 的 几 种 C18 柱 能 够 进 行 要 求 的 分 离 为 了 提 高 柱 效 和 分 离 度, 我 们 推 荐 球 形 全 多 孔 或 表 面 多 孔 µm 直 径 填 料 USP 特 意 让 您 能 灵 活 决 定 能 满 足 需 要 的 最 好 色 谱 柱 ( 表 11) 129

132 美 国 药 典 指 定 填 料 (12/2010) USP 方 法 USP 填 料 色 谱 柱 粒 径 (µm) 孔 径 (Å) L1 十 八 烷 基 硅 烷 化 学 键 合 到 多 孔 硅 胶 陶 瓷 微 粒 ( 直 径 1.5 到 10 µm) 或 整 体 柱 上 Poroshell 120 EC-C Poroshell 120 SB-C Poroshell HPH-C ZORBAX Eclipse Plus C18 1.8, 3.5, 5 95 ZORBAX Eclipse XDB-C18 1.8, 3.5, 5, 7 80 ZORBAX SB-C18 1.8, 3.5, 5, 7 80, 300 ZORBAX Rx-C18 3.5, 5 80 ZORBAX Extend-C18 1.8, 3.5, 5, 7 80, 300 ZORBAX ODS 3.5, 5, 7 70 ZORBAX ODS Classic 5 70 ZORBAX 300SB-C18 ZORBAX 300 Extend C18 AdvanceBio 肽 谱 分 析 色 谱 柱 AdvanceBio 寡 核 苷 酸 色 谱 柱 Pursuit XRs C18 3, 5, Pursuit C18 3, 5, Polaris C18-A 3, 5, Polaris C18-Ether 3, SepTech ST60 C SepTech ST150 C L3 5 到 10 µm 直 径 多 孔 硅 胶 颗 粒, 或 整 体 硅 胶 柱 ZORBAX SIL 5 70 ZORBAX Rx-Sil 3.5, 5 80, 300 Pursuit XRs Si 3, 5, Polaris Si-A 5, 表 13. 美 国 药 典 指 定 的 填 料 和 安 捷 伦 色 谱 柱 转 下 页 130

133 美 国 药 典 指 定 填 料 (12/2010) USP 方 法 USP 填 料 色 谱 柱 粒 径 (µm) 孔 径 (Å) L7 L8 L9 L10 辛 基 硅 烷 化 学 键 合 到 1.5 到 10 µm 直 径 的 全 多 孔 硅 胶 颗 粒 或 整 体 硅 胶 柱 上 氨 丙 基 硅 烷 单 分 子 层 形 式 化 学 键 合 到 全 多 孔 硅 胶 载 体 上, 粒 径 为 3 到 10 µm 具 有 化 学 键 合 的 强 酸 性 阳 离 子 交 换 涂 层 的 3 到 10 µm 不 规 则 全 多 孔 硅 胶 腈 基 化 学 键 合 到 多 孔 硅 胶 颗 粒, 粒 径 为 3 到 10 µm Poroshell 120 EC-C Poroshell 120 SB-C Poroshell HPH-C ZORBAX Eclipse Plus C8 1.8, 3.5, 5 95 ZORBAX Eclipse XDB-C8 1.8, 3.5, 5, 7 80 ZORBAX SB-C8 1.8, 3.5, 5, 7 80, 300 ZORBAX Rx-C8 1.8, 3.5, 5, 7 80 ZORBAX C Pursuit XRs C8 3, 5, Pursuit C8 3, 5, Polaris C8-A 3, Polaris C8-Ether 3, ZORBAX 300SB-C8 AdvanceBio RP-mAb SB-C8 ZORBAX NH Polaris NH ZORBAX SCX 5 球 形 300 ZORBAX CN 5 70 ZORBAX SB-CN 3.5, 5, 7 80, 300 ZORBAX 300SB-CN ZORBAX Eclipse XDB-CN 3.5, 5 80 Poroshell 120 EC-CN L11 苯 基 化 学 键 合 到 多 孔 硅 胶 颗 粒, 粒 径 为 1.5 到 10 µm ZORBAX Eclipse XDB 苯 基 5 70 ZORBAX Eclipse Plus 苯 基 - 己 基 1.8, 3.5, 5 95 ZORBAX SB 苯 基 ZORBAX 300 二 苯 基 Poroshell 120 苯 基 - 己 基 Pursuit XRs 二 苯 基 3, 5, Pursuit 二 苯 基 3, 5, 转 下 页 131

134 美 国 药 典 指 定 填 料 (12/2010) USP 方 法 USP 填 料 色 谱 柱 粒 径 (µm) 孔 径 (Å) L13 L14 L17 三 甲 基 硅 烷 化 学 键 合 到 多 孔 硅 胶 颗 粒, 粒 径 3 到 10 µm 具 有 化 学 键 合 的 强 碱 性 季 铵 盐 阴 离 子 交 换 涂 层 的 硅 胶, 粒 径 为 5 到 10 µm 以 氢 形 式 存 在 的 磺 化 交 联 的 聚 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 共 聚 物 组 成 的 强 阳 离 子 交 换 树 脂, 粒 径 为 7 到 11 µm ZORBAX TMS 5 70 ZORBAX SAX 5 70 IonoSpher A Hi-Plex H 8 N/A Bio SCX NP10 L19 以 钙 形 式 存 在 的 磺 化 交 联 的 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 共 聚 物 组 成 的 强 阳 离 子 交 换 树 脂, 粒 径 为 9 µm Hi-Plex Ca 8 N/A Hi-Plex Ca (Duo) 8 N/A L20 L21 二 羟 基 丙 烷 化 学 键 合 到 多 孔 硅 胶 颗 粒 上, 粒 径 为 3 到 10 µm 刚 性 球 形 聚 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 共 聚 物, 粒 径 为 5 到 10 µm LiChrospher Diol 5 N/A PLRP-S 3, 5, 8, 10, , 15-20, 50 PLRP-S 3, 5, 8, 10, 10-15, 15-20, 50 PLRP-S 5, 8, 10, 30, 50 PLRP-S 5, 8, 10, 30, L22 由 具 有 磺 酸 基 的 多 孔 聚 苯 乙 烯 凝 胶 制 成 的 阳 离 子 交 换 树 脂, 粒 径 约 为 10 µm PLgel 3, 5, 10, 20 50, 100, 500, 103, 104, 105, 106, MIXED Hi-Plex H 8 N/A 转 下 页 132

135 美 国 药 典 指 定 填 料 (12/2010) USP 方 法 USP 填 料 色 谱 柱 粒 径 (µm) 孔 径 (Å) L25 填 料 具 有 分 离 分 子 量 范 围 1000 到 5000 道 尔 顿 化 合 物 的 能 力 ( 按 照 使 用 环 氧 乙 烷 所 测 定 ), 适 用 于 中 性 含 阴 离 子 和 阳 离 子 型 水 溶 性 聚 合 物 填 料 以 聚 甲 基 丙 烯 酸 酯 树 脂 为 载 体, 交 联 聚 羟 基 醚 ( 表 面 含 一 些 羧 基 官 能 团 ) PL aquagel-oh 5, 8 30 L26 L33 AdvanceBio RP-mAb C4 具 有 分 离 4000 到 da 分 子 量 范 围 蛋 白 质 的 能 力 为 球 形 硅 胶 基, 经 处 理 后 可 提 供 ph 稳 定 性 ZORBAX GF Bio SEC , 150, 300 Bio SEC , 150, 300, 500, 1000, 2000 ProSEC L34 以 铅 形 式 存 在 的 磺 化 交 联 的 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 共 聚 物 组 成 的 强 阳 离 子 交 换 树 脂, 粒 径 为 9 µm Hi-Plex Pb 8 N/A L35 L43 L45 L50 氧 化 锆 稳 定 化 的 球 形 硅 胶 材 料, 具 有 亲 水 性 ( 二 醇 类 ) 分 子 单 层 键 合 固 定 相, 孔 径 150Å 五 氟 苯 酚 基 化 学 键 合 到 硅 胶 填 料 颗 粒 上, 粒 径 为 5 到 10 µm β- 环 糊 精 键 合 到 多 孔 硅 胶 颗 粒 上, 粒 径 5 到 10 µm 具 有 反 相 保 留 和 强 阴 离 子 交 换 功 能 的 多 功 能 树 脂 该 树 脂 由 乙 烯 基 乙 苯 与 55% 的 二 乙 烯 基 苯 交 联 而 成 的 共 聚 物, 粒 径 3 到 15 µm, 比 表 面 积 不 小 于 350 m 2 /g 基 质 是 具 有 季 胺 官 能 团 涂 层 的 乳 胶 填 料 颗 粒 乳 胶 颗 粒 由 含 聚 苯 乙 烯 交 联 二 乙 烯 基 苯 交 联 而 成 ZORBAX GF ZORBAX GF Pursuit PFP 3, Poroshell 120 PFP ChiraDex Chiral ZORBAX 300SCX 转 下 页 133

136 美 国 药 典 指 定 填 料 (12/2010) USP 方 法 USP 填 料 色 谱 柱 粒 径 (µm) 孔 径 (Å) L52 L53 L56 L57 由 具 有 磺 丙 基 的 多 孔 硅 胶 制 成 的 弱 阳 离 子 交 换 树 脂, 粒 径 为 5 到 10 µm 由 使 用 二 乙 烯 基 苯 55% 交 联 的 乙 基 乙 烯 基 苯 共 聚 物 组 成 的 弱 阳 离 子 交 换 树 脂, 粒 径 3 到 15 µm 基 质 表 面 接 羧 酸 和 / 或 磷 酸 功 能 基 化 单 体 容 量 不 低 于 400 µeq/ 柱 丙 基 硅 烷 化 学 键 合 到 全 多 孔 硅 胶 颗 粒 上, 粒 径 3 到 10 µm 手 性 识 别 蛋 白 ( 卵 类 粘 蛋 白 ), 化 学 键 合 到 硅 胶 颗 粒, 粒 径 5 µm, 孔 径 120Å IonSpher C Bio SAX 3, 5, ZORBAX SB-C3 1.8, 3.5, 7 80, 300 ZORBAX 300 SB-C3 Ultron ES-OVM L58 以 钠 形 式 存 在 的 磺 化 交 联 的 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 共 聚 物 组 成 的 强 阳 离 子 交 换 树 脂, 粒 径 6 到 30 µm Hi-Plex Na 10 N/A Hi-Plex Na (Octo) 8 N/A L60 球 形 多 孔 硅 胶,10 µm, 表 面 用 烷 基 酰 胺 进 行 了 共 价 修 饰 和 封 端 Bonus-RP 1.8, 3.5, 4.6, 5 80 Poroshell 120 Bonus-RP Polaris Amide-C18 3, L68 糖 谱 分 析 色 谱 柱 AdvanceBio 糖 谱 分 析 色 谱 柱 2.7, 1.8 N/A 134

137 溶 剂 相 溶 性 对 于 液 相 色 谱 分 析, 了 解 各 种 溶 剂 的 相 溶 性 非 常 重 要, 因 为, 如 果 系 统 中 使 用 不 兼 容 的 溶 剂, 可 能 会 得 到 不 可 靠 的 色 谱 结 果 相 溶 性 是 指 一 种 溶 液 与 另 一 种 溶 液 按 任 意 比 例 混 合 成 为 新 的 均 匀 溶 液 的 能 力 对 于 有 机 化 合 物, 溶 剂 的 极 性 决 定 了 什 么 类 型 的 化 合 物 可 以 溶 解 在 其 中, 并 可 以 与 何 种 其 它 溶 剂 或 液 体 化 合 物 相 溶 通 常, 极 性 溶 剂 最 好 溶 解 极 性 化 合 物, 非 极 性 溶 剂 最 好 溶 解 非 极 性 化 合 物 : 相 似 者 相 溶 因 此, 水 ( 强 极 性 ) 和 己 烷 ( 强 非 极 性 ) 不 能 彼 此 混 溶, 充 分 振 摇 以 后 也 会 迅 速 分 成 两 层 对 于 无 机 化 合 物, 碳 链 长 度 常 常 决 定 其 相 对 于 同 系 物 的 相 溶 性 例 如, 在 醇 类 中, 乙 醇 有 两 个 碳 原 子, 可 以 与 水 混 溶, 而 丁 醇 有 四 个 碳 原 子, 则 不 能 与 水 混 溶 常 用 HPLC 溶 剂 的 性 质 溶 剂 粘 度 (20 C 下 cp) 沸 点 ( C) UV 截 止 波 长 (nm) 极 性 指 数 (P') 相 溶 数 (M) 丙 酮 乙 腈 0.38* , 17 乙 酸 正 丁 酯 正 丁 醇 正 氯 丁 烷 氯 苯 氯 仿 环 己 烷 环 戊 烷 邻 - 二 氯 苯 1.32** 二 氯 甲 烷 二 甲 基 乙 酰 胺 N,N- 二 甲 基 甲 酰 胺 二 甲 基 亚 砜 ,4- 二 烷 乙 酸 乙 酯 乙 醇 乙 醚 二 氯 乙 烯 庚 烷 表 14. 溶 剂 特 性 转 下 页 135

138 常 用 HPLC 溶 剂 的 性 质 溶 剂 粘 度 (20 C 下 cp) 沸 点 ( C) UV 截 止 波 长 (nm) 极 性 指 数 己 烷 异 辛 烷 异 丁 醇 异 丙 醇 十 四 酸 异 丙 酯 甲 醇 甲 基 叔 丁 基 醚 甲 乙 酮 甲 基 异 丁 基 酮 N- 甲 基 吡 咯 烷 酮 1.67** 戊 烷 石 油 醚 0.1 正 丙 醇 丙 烯 碳 酸 酯 吡 啶 四 氢 呋 喃 甲 苯 ,2,4- 三 氯 苯 三 乙 胺 0.36** 三 氟 乙 酸 水 邻 - 二 甲 苯 * 15 C 下 cp ** 25 C 下 cp 缺 失 值 表 示 没 有 检 测 数 据 (P') 相 溶 数 (M) 相 溶 (M) 数 : 1. M 数 相 差 15 个 单 位 或 以 下 的 所 有 溶 剂 对, 在 15 C 下 能 够 以 任 意 比 例 混 溶 2. M 数 相 差 16 的 每 对 溶 剂 在 25 到 75 C 之 间, 通 常 为 50 C, 形 成 临 界 溶 液 3. 相 差 17 或 更 多 的 溶 剂 不 混 溶, 或 在 75 C 以 上 形 成 临 界 溶 液 本 图 表 由 Honeywell Burdick & Jackson 提 供, 136

139 溶 剂 相 溶 性 表 丙 酮 乙 腈 (ACN) 正 丁 醇 氯 仿 环 己 烷 二 氯 甲 烷 (DCM) N,N- 二 甲 基 甲 酰 胺 二 甲 基 亚 砜 (DMSO) 1,4 二 噁 烷 乙 酸 乙 酯 乙 醇 乙 醚 二 氯 乙 烯 庚 烷 己 烷 异 辛 烷 异 丙 醇 (IPA) 甲 醇 甲 基 叔 丁 基 醚 甲 乙 酮 戊 烷 四 氢 呋 喃 (THF) 甲 苯 水 邻 二 甲 苯 丙 酮 乙 腈 (ACN) 正 丁 醇 氯 仿 环 己 烷 二 氯 甲 烷 (DCM) N,N- 二 甲 基 甲 酰 胺 二 甲 基 亚 砜 (DMSO) 1,4 二 烷 乙 酸 乙 酯 乙 醇 乙 醚 二 氯 乙 烯 庚 烷 正 己 烷 异 辛 烷 异 丙 醇 (IPA) 甲 醇 甲 基 叔 丁 基 醚 甲 乙 酮 戊 烷 四 氢 呋 喃 (THF) 甲 苯 水 邻 - 二 甲 苯 不 相 溶 相 溶 表 15. 溶 剂 相 溶 性 本 表 中 将 两 种 溶 剂 能 以 任 意 比 例 混 合 在 一 起 不 分 层, 归 为 相 溶 表 中 信 息 由 Honeywell Burdick & Jackson 提 供, 如 有 问 题 请 联 系 B&J 137

140 流 动 相 改 性 剂 的 UV 截 止 波 长 流 动 相 改 性 剂 的 选 择 需 要 达 到 各 种 需 求 之 间 的 平 衡 分 析 溶 液 的 稳 定 ph 是 否 在 色 谱 柱 的 安 全 范 围 内, 并 且 还 能 适 当 控 制 离 子 化 ( 通 过 离 子 抑 制 离 子 对 或 两 者 结 合 )? 是 否 对 检 测 器 性 能 没 有 明 显 干 扰, 包 括 不 同 的 挥 发 性 MS 离 子 抑 制 和 UV 透 光 性? 现 在 的 问 题 是 符 合 要 求 的 改 性 剂 很 少, 要 提 高 特 定 分 析 物 的 选 择 性, 经 常 需 要 分 析 人 员 尝 试 各 种 固 定 相 ( 除 了 常 用 的 烷 基 键 合 固 定 相, 如 C8 和 C18 之 外, 还 有 内 嵌 极 性 基 团 烷 基 苯 基 氟 取 代 RP 等 ) 下 表 提 供 了 常 用 HPLC 流 动 相 改 性 剂 的 UV 截 止 波 长 v/v 25 C 下 pk a 最 大 ph 范 围 UV 截 止 波 长 (nm) 三 氟 醋 酸 (TFA) 0.1% % % 磷 酸 盐, pk < 200 磷 酸 盐, pk < 200 磷 酸 盐, pk < 200 柠 檬 酸 盐, pk 柠 檬 酸 盐, pk 柠 檬 酸 盐, pk 碳 酸 盐, pk < 200 碳 酸 盐, pk < 200 甲 酸 盐 (10 mm) 醋 酸 (HAC) 1.0% 醋 酸 盐 (10 mm) 氨 水 (10 mm) 硼 酸 盐 n/a 三 乙 胺 (TEA) < 200 TRIS-HCl (120 mm) 阴 影 部 分 表 示 LC/MS 应 用 中 常 用 的 缓 冲 液 表 16. 常 用 流 动 相 改 性 剂 的 UV 截 止 波 长 138

141 固 相 萃 取 吸 附 剂 分 离 机 理 典 型 固 定 相 结 构 无 机 ( 吸 附 ) 氧 化 铝 AlOH Florisil Mg 2SiO 3 正 相 ( 极 性 键 合 相 硅 胶 基 ) 硅 胶 Si-OH 氰 基 -CN 氨 基 -NH 2 二 醇 -CH(OH)-CH(OH)- 反 相 ( 非 极 性 键 合 相 强 疏 水 性 硅 胶 基 ) 十 八 烷 基 硅 氧 烷 (C18) (-CH 2-) 17 CH 3, 反 相 ( 非 极 性 键 合 相 中 等 疏 水 性 硅 胶 基 ) 辛 基 硅 氧 烷 (C8) (-CH2-) 7CH 3 环 己 基 苯 基 反 相 ( 非 极 性 键 合 相 弱 疏 水 性 硅 胶 基 ) 乙 基 (C2) -C2H 5 甲 基 (C1) -CH 3 聚 合 物 型 反 相 ( 经 亲 水 修 饰 ) PS-DVB PS-DVB DVB DVB WAX( 弱 阴 离 子 交 换 ) 氨 基 (-CH 2-) 3NH 2 1, 2 - 氨 基 (-CH 2-) 3 NHCH 2CH 2NH 2 SAX( 强 阴 离 子 交 换 ) 季 铵 (-CH 2-) 3N+(CH 3) 3 WCX( 弱 阳 离 子 交 换 ) 羧 酸 (-CH2-) 3COOH SCX( 强 阳 离 子 交 换 ) 烷 基 磺 酸 (-CH2-) 3SO 3H 芳 香 族 磺 酸 SO 3H 表 17. 固 相 萃 取 (SPE) 固 定 相 概 况 139

142 SPE 吸 附 剂 条 件 分 离 机 理 用 于 以 下 分 析 物 : 载 样 溶 剂 洗 脱 溶 剂 无 机 ( 吸 附 ) 弱 极 性 到 中 等 极 性 弱 极 性 (P ), 例 如 正 己 烷 CHCl 3 正 相 ( 极 性 键 合 相 硅 胶 基 ) 中 等 极 性 到 强 极 性 弱 极 性, 例 如 正 己 烷 强 极 性 (P ), 例 如 甲 醇 乙 醇 强 极 性, 例 如 甲 醇 乙 醇 反 相 ( 非 极 性 键 合 相 强 疏 水 性 硅 胶 基 ) CHCl 3 疏 水 性 ( 完 全 非 极 性 ) 强 极 性, 例 如 H 2O CH 3OH/H 2O CH 3CN/H 2O 弱 极 性, 例 如 正 己 烷 CHCl 3 反 相 ( 非 极 性 键 合 相 中 等 非 极 性 强 极 性, 例 如 H2O 中 等 极 性, 例 如 二 氯 甲 烷 中 等 疏 水 性 硅 胶 基 ) CH 3OH/H 2O CH 3CN/H 2O 乙 酸 乙 酯 反 相 ( 非 极 性 键 合 相 弱 极 性 到 中 等 非 极 性 强 极 性 ( 例 如 H2O) 到 中 强 极 性, 例 如 乙 腈 甲 醇 弱 疏 水 性 硅 胶 基 ) 等 极 性 ( 例 如 乙 酸 乙 酯 ) 聚 合 物 型 反 相 ( 经 亲 水 修 饰 ) 酸 性 碱 性 中 性 水 或 缓 冲 液 强 极 性, 例 如 乙 腈 甲 醇 WAX( 弱 阴 离 子 交 换 ) 离 子 型 ( 可 离 子 化 ) 酸 性 SAX( 强 阴 离 子 交 换 ) 离 子 型 ( 可 离 子 化 ) 酸 性 WCX( 弱 阳 离 子 交 换 ) 离 子 型 ( 可 离 子 化 ) 碱 性 SCX( 强 阳 离 子 交 换 ) 离 子 型 ( 可 离 子 化 ) 碱 性 水 或 缓 冲 液 (ph 约 为 1-2) 水 或 缓 冲 液 (ph = pk a + 2) 水 或 缓 冲 液 (ph 约 为 6-7) 水 或 缓 冲 液 (ph = pk a 2) A. 碱 性 有 机 溶 剂 B. 吸 附 剂 为 中 性 时 的 ph 值 C. 高 离 子 强 度 缓 冲 液 A. 采 用 有 机 溶 剂 配 制 的 缓 冲 液 (ph = pk a - 2) B. 分 析 物 为 中 性 时 的 ph 值 C. 高 离 子 强 度 缓 冲 液 A. 酸 性 有 机 溶 剂 B. 吸 附 剂 或 分 析 物 为 中 性 时 的 ph C. 高 离 子 强 度 缓 冲 液 A. 采 用 有 机 溶 剂 配 制 的 缓 冲 液 (ph = pk a + 2) B. 分 析 物 为 中 性 时 的 ph 值 C. 高 离 子 强 度 缓 冲 液 表 18. SPE 吸 附 剂 条 件 指 南 140

143 其 它 推 荐 的 读 物 色 谱 样 品 前 处 理 的 基 本 知 识, 安 捷 伦 科 技 公 司 2013 年, 出 版 号 CHCN Snyder, Lloyd R, Kirkland, Joseph J. and Dolan, John W., Introduction to Modern Liquid Chromatography( 现 代 液 相 色 谱 导 论 ),John Wiley & Sons Inc., 第 三 版 An Introduction to Gel Permeation Chromatography and Size Exclusion Chromatography( 凝 胶 过 滤 色 谱 与 体 积 排 阻 色 谱 导 论 ), 安 捷 伦 科 技 公 司,2011, 出 版 号 EN Meyer, Veronika R., Practical High-Performance Liquid Chromatography( 实 用 高 效 液 相 色 谱 法 ) 第 四 版, John Wiley & Sons, Inc., 1999 Snyder, Lloyd R. and Dolan, John W., High-Performance Gradient Elution( 高 效 梯 度 洗 脱 ),John Wiley & Sons, Inc., 2007 Snyder, Lloyd R. Kirkland, Joseph J. and Glajch, Joseph L., Practical HPLC Method Development( 实 用 HPLC 方 法 开 发 ),John Wiley & Sons, Second Edition, 1997 Cunico, Robert L.; Gooding, Karen M. and Wehr, Tim, Basic HPLC and CE of Biomolecules( 生 物 分 子 的 HPLC 和 CE 分 析 基 础 导 论 ),Bay Bio 分 析 柱 Laboratory, Inc., 1998 Neue, Uwe D., HPLC Columns: Theory, Technology and Practice(HPLC 色 谱 柱 : 理 论 技 术 与 实 践 ), John Wiley & Sons, Inc., 1997 其 它 安 捷 伦 资 源 以 下 介 绍 一 些 获 取 更 多 信 息 的 好 去 处 : 资 源 详 细 介 绍 液 相 色 谱 柱 和 样 品 前 处 理 导 航 器 LC 方 法 转 换 器 LC 流 速 计 算 器 应 用 程 序 一 款 互 动 的 在 线 工 具, 可 为 您 的 应 用 提 供 最 佳 的 液 相 色 谱 柱 和 样 品 制 备 产 品 建 议 这 款 在 线 工 具 帮 助 您 在 柱 长 柱 内 径 系 统 流 速 等 因 素 改 变 时, 快 速 计 算 方 法 中 相 应 因 子 的 调 整 对 准 确 调 节 梯 度 方 法 尤 为 有 用 请 访 问 并 搜 索 LC Method Translator(LC 方 法 转 换 器 ) 如 果 您 有 一 部 智 能 手 机, 将 可 以 在 其 中 安 装 免 费 的 应 用 程 序, 让 您 根 据 方 法 的 其 他 变 化 调 整 流 速 登 录 查 找 该 应 用 程 序 Agilent CrossLab 选 择 工 具 仅 需 要 回 答 在 线 工 具 上 的 几 个 问 题, 我 们 便 可 以 针 对 您 的 非 安 捷 伦 仪 器, 推 荐 最 佳 的 消 耗 品 样 品 瓶 选 择 向 导 产 品 选 择 如 此 之 多, 要 想 为 您 的 应 用 选 择 匹 配 的 样 品 瓶 瓶 盖 隔 垫 将 费 时 又 费 力 使 用 该 互 动 工 具 可 使 这 一 过 程 简 单 无 比 注 射 式 过 滤 器 选 择 指 南 使 用 该 工 具, 可 快 速 简 便 地 选 择 适 合 您 应 用 的 注 射 式 过 滤 器 我 们 根 据 本 指 南 制 作 了 一 系 列 视 频 说 明 其 中 某 些 要 点, 过 一 段 时 间, 我 们 还 将 lctroubleshooting 添 加 新 的 其 它 视 频 表 19. 其 它 安 捷 伦 资 源 141

144 词 汇 表 A a: 见 分 离 因 子 A solvent( 溶 剂 A): 通 常 指 二 元 洗 脱 或 梯 度 洗 脱 分 离 中 较 弱 的 溶 剂 在 反 相 液 相 色 谱 (LC) 中, 溶 剂 A 一 般 为 水 或 含 水 量 较 大 的 混 合 物 A term(a 项 ): van Deemter 方 程 中 的 第 一 项 参 见 涡 流 扩 散 项 和 van Deemter 方 程 Accurate mass( 精 确 质 量 ): 在 适 当 的 准 确 度 和 精 度 水 平 下, 经 实 验 测 定 而 得 的 离 子 质 量 数, 可 用 于 确 定 或 限 定 离 子 对 应 的 分 子 式 Adapter( 适 配 接 头 ): 每 端 螺 纹 不 同 的 两 通 接 头 ; 通 常 用 于 将 两 种 不 同 类 型 的 管 线 连 在 一 起 Absorption( 吸 附 ): 保 留 的 过 程, 其 中 溶 质 分 配 到 液 体 状 态 的 表 层 中 Activity( 活 性 ): 吸 附 色 谱 填 料 表 面 的 相 对 强 度 对 硅 胶 来 说, 硅 醇 基 越 多, 表 面 活 性 越 强 可 以 通 过 加 水 或 其 它 极 性 改 性 剂 与 活 性 位 点 发 生 氢 键 结 合, 对 活 性 进 行 控 制, 使 表 面 活 性 降 低 Additive( 添 加 剂 ): 添 加 到 流 动 相 中 改 善 分 离 或 检 测 特 征 的 物 质 ; 例 如, 掩 蔽 硅 醇 基 作 用 的 竞 争 性 碱 封 闭 金 属 位 点 的 螯 合 剂, 或 用 于 间 接 光 度 检 测 的 UV 吸 收 化 合 物 等 Adjusted retention time (t R')( 调 整 保 留 时 间 t R'): 扣 除 滞 留 时 间 后 的 保 留 时 间 :t R' = t R t M, 其 中 t R 为 保 留 时 间, t M 为 滞 留 时 间 ( 不 保 留 的 小 分 子 化 合 物 完 全 通 过 各 孔 隙 从 色 谱 柱 中 被 洗 脱 出 来 所 用 的 时 间 ) Adjusted retention volume (V R')( 调 整 保 留 体 积 V R'): 扣 除 滞 留 体 积 后 的 保 留 体 积 ;V R' = V R V M, 其 中 V R 为 目 标 峰 的 保 留 体 积,V M 为 滞 留 体 积 ( 相 对 于 色 谱 柱 中 流 动 相 总 体 积 的 体 积 ) 参 见 死 体 积 和 滞 留 体 积 Adsorbent( 吸 附 剂 ): 吸 附 色 谱 所 用 的 填 料 硅 胶 和 氧 化 铝 是 高 效 液 相 色 谱 (HPLC) 中 最 常 用 的 吸 附 剂 Adsorption( 吸 附 ): 溶 质 与 吸 附 剂 表 面 发 生 相 互 作 用 的 保 留 过 程 其 作 用 力 可 以 是 强 作 用 力 ( 氢 键 ) 或 弱 作 用 力 ( 范 德 华 力 ) 对 于 硅 胶, 硅 醇 基 是 吸 附 的 驱 动 力, 任 何 溶 质 官 能 团 都 可 以 与 该 基 团 发 生 相 互 作 用, 而 保 留 在 硅 胶 上 吸 附 主 要 发 生 在 表 面, 而 不 是 渗 透 或 嵌 入 到 固 定 相 涂 层 内 部, 或 键 合 到 表 面 Adsorption chromatography( 吸 附 色 谱 ): 一 种 吸 附 发 生 在 活 性 固 体 表 面 而 影 响 分 离 的 基 本 LC 模 式 硅 胶 和 氧 化 铝 是 最 常 用 的 正 相 吸 附 剂, 分 子 通 过 其 极 性 官 能 团 与 填 料 表 面 官 能 团 的 相 互 作 用 而 被 保 留, 例 如, 硅 醇 基 碳 在 反 相 模 式 中 也 被 用 作 吸 附 剂 Adsorption isotherm( 吸 附 等 温 线 ): 吸 附 色 谱 中, 单 位 体 积 流 动 相 中 的 样 品 浓 度 与 单 位 重 量 固 定 相 中 的 浓 度 之 比 吸 附 等 温 线 的 形 状 可 以 决 定 溶 质 的 色 谱 行 为 ; 例 如, 拖 尾 峰 前 伸 峰 和 色 谱 柱 过 载 Aerogel( 气 凝 胶 ): 在 制 备 过 程 中, 从 凝 胶 系 统 中 去 除 分 散 溶 剂 后 不 会 使 硅 胶 结 构 塌 陷 的 一 种 填 料 体 积 排 阻 色 谱 (SEC) 中 使 用 的 硅 胶 和 玻 璃 珠 即 为 气 凝 胶 的 实 例, 即 使 在 HPLC 的 高 压 下 仍 能 保 持 其 结 构 可 参 见 干 凝 胶 Affinity chromatography( 亲 和 色 谱 ): 将 特 异 性 配 体 比 如 酶 抗 体 或 激 素 与 固 体 基 体 或 载 体 偶 联, 从 而 能 够 提 供 特 异 生 物 吸 附 的 技 术 这 种 固 定 配 体 只 和 能 与 之 选 择 性 结 合 的 分 子 发 生 作 用 未 结 合 的 分 子 将 被 不 保 留 洗 脱 出 去 然 后 保 留 的 化 合 物 将 以 纯 化 状 态 被 洗 脱 亲 和 色 谱 一 般 为 一 种 开 关 式 分 离 技 术 Agarose( 琼 脂 糖 ): 一 种 在 生 物 色 谱 中 作 为 分 离 介 质 的 高 分 子 量 多 糖 在 凝 胶 过 滤 色 谱 中 常 以 珠 状 形 式 存 在, 使 用 水 相 流 动 相 Alkoxysilane( 硅 氧 烷 ): 化 学 键 合 相 制 备 中 使 用 的 一 种 反 应 物 可 与 硅 胶 进 行 下 列 反 应 :R 3SiOR + SiOH & Si- OSiR 3 + ROH, 其 中 R 为 烷 基 Alumina( 氧 化 铝 ): 吸 附 色 谱 中 使 用 的 一 种 正 相 吸 附 剂 氧 化 铝 为 多 孔 吸 附 剂, 具 有 弱 碱 性 表 面 ; 也 可 以 进 行 中 性 和 酸 性 改 性 碱 性 氧 化 铝 比 硅 胶 更 有 优 势, 后 者 具 有 酸 性 表 面 142

145 图 79. 拖 尾 峰 实 例 ( 经 参 考 文 献 3 允 许 进 行 修 改 ) Amino phase( 氨 基 固 定 相 ): 正 相 键 合 相 色 谱 中 使 用 的 丙 胺 基 固 定 相 可 与 某 些 溶 质 分 子 ( 如, 醛 类 ) 或 可 与 胺 发 生 反 应 的 流 动 相 添 加 剂 产 生 相 互 作 用 氨 基 固 定 相 有 几 种 用 途 : 作 为 弱 阴 离 子 交 换 剂, 也 可 以 用 水 - 乙 腈 为 流 动 相 分 离 碳 水 化 合 物 等 这 是 一 种 相 对 不 稳 定 的 固 定 相 Amphoteric ion exchange resin( 两 性 离 子 交 换 树 脂 ): 既 带 阳 离 子 基 团 又 带 阴 离 子 基 团 的 离 子 交 换 树 脂 这 类 树 脂 主 要 用 于 离 子 阻 滞, 所 有 离 子 型 物 质 都 可 以 从 溶 液 中 去 除, 因 为 该 树 脂 上 同 时 存 在 阴 离 子 和 阳 离 子 的 功 能 基 Analyte( 分 析 物 ): 经 由 HPLC 色 谱 柱 进 样 并 被 洗 脱 的 目 标 待 测 化 合 物 分 析 柱 Column( 分 析 柱 ): 用 于 定 性 和 定 量 分 析 的 HPLC 色 谱 柱 ; 一 般 分 析 柱 为 4.6 mm 内 径 cm( 柱 长 ), 但 也 有 更 窄 内 径 ( 低 至 0.05 mm 内 径 ) 的 分 析 柱 ; 可 用 不 锈 钢 玻 璃 玻 璃 内 衬 不 锈 钢 PEEK 和 其 它 金 属 和 非 金 属 材 料 制 成 Anion exchange( 阴 离 子 交 换 ): 分 离 阴 离 子 的 离 子 交 换 过 程 合 成 树 脂 键 合 相 硅 胶 和 其 它 金 属 氧 化 物 都 可 以 用 于 这 种 模 式 的 分 析 典 型 的 阴 离 子 交 换 功 能 基 是 四 烷 基 季 铵 盐, 为 强 阴 离 子 交 换 剂 而 键 合 固 定 相 上 的 氨 基 是 弱 阴 离 子 交 换 的 一 个 例 子 Asymmetry( 不 对 称 性 ): 描 述 色 谱 峰 形 的 因 子 色 谱 理 论 认 为 高 斯 分 布 的 峰 为 对 称 峰 定 量 测 定 峰 不 对 称 因 子, 在 峰 高 10% 处, 色 谱 峰 顶 点 到 色 谱 峰 后 沿 的 距 离 与 峰 顶 点 到 色 谱 峰 前 沿 的 距 离 之 比 不 对 称 性 还 有 其 它 常 用 测 量 方 法, 特 别 是 美 国 药 典 (USP) 方 法 见 图 80, 还 可 参 见 Foley-Dorsey 方 程 Asymmetry factor( 不 对 称 因 子 ): 表 示 峰 形 的 因 子 不 对 称 因 子 的 计 算 方 法 是, 从 色 谱 峰 顶 点 作 垂 线, 与 峰 高 10% 处 的 水 平 线 相 交 ; 交 点 处 沿 水 平 线 到 峰 尾 的 距 离 ( 距 离 B), 除 以 交 点 沿 水 平 线 到 峰 前 沿 的 距 离 ( 距 离 A), 得 到 的 比 值 称 为 峰 不 对 称 因 子 ( 见 图 79) 该 比 值 为 1 代 表 对 称 峰, 小 于 1 为 伸 舌 峰, 大 于 1 为 拖 尾 峰 该 值 越 大, 峰 的 对 称 性 越 差, 大 于 2 以 上 为 不 合 格 Atmosphere (atm)( 大 气 压 (atm)): 通 过 HPLC 柱 的 压 力 降 数 值 ;1 atm = 14.7 lb/ 英 寸 2 (psi) 可 参 见 bar 和 pascals Atmospheric pressure chemical ionization (APCI)( 大 气 压 化 学 电 离 (APCI)): Atmospheric pressure photo ionization (APPI)( 大 气 压 光 电 离 (APPI)): Atomic mass( 原 子 质 量 ): 原 子 的 质 量, 以 amu( 原 子 质 量 单 位 ) 测 量, 该 单 位 定 义 为 基 态 碳 -12 原 子 的 质 量 的 十 二 分 之 一 B β: 参 见 相 比 B o: 参 见 渗 透 性 B solvent(b 溶 剂 ): 通 常 指 二 元 洗 脱 或 梯 度 分 离 中 较 强 的 溶 剂 ; 一 般 为 反 相 LC 中 的 有 机 改 性 剂 或 富 含 改 性 剂 的 二 元 混 合 物 ( 与 水 混 合 ) B term(b 项 ): van Deemter 方 程 中 的 第 二 项 也 可 参 见 纵 向 扩 散 和 分 子 扩 散 项 Backflushing( 反 冲 ): 一 种 柱 切 换 技 术, 在 进 样 器 和 色 谱 柱 之 间 有 一 个 四 通 阀, 流 动 相 可 以 向 两 个 方 向 流 动 使 用 反 冲 洗 脱 柱 头 上 的 强 驻 留 化 合 物 可 以 对 这 些 化 合 物 进 行 分 析, 也 可 以 只 是 将 其 从 色 谱 柱 中 除 去 Backpressure( 反 压 ): 同 柱 头 压 柱 压 Backpressure regulator( 反 压 调 节 器 ): 置 于 检 测 器 之 后 的 在 线 设 备, 其 作 用 是 使 流 通 池 保 持 正 压, 最 大 限 度 地 减 少 检 测 器 中 溶 剂 气 泡 溢 出 的 问 题 Band( 谱 带 ): 指 流 经 并 最 终 洗 脱 出 色 谱 柱 的 色 谱 峰 143

146 Bidentate silane( 双 配 位 基 硅 烷 ): 一 种 特 殊 键 合 相, 硅 烷 通 过 两 个 硅 氧 烷 基 键 合 在 填 料 表 面 上, 硅 烷 上 的 两 个 硅 原 子 以 短 烃 桥 连 接 Binary mobile phase( 二 元 流 动 相 ): 含 两 种 溶 剂 或 缓 冲 液 的 流 动 相 图 80. 不 同 高 度 的 高 斯 峰 宽 是 该 峰 标 准 偏 差 σ 的 函 数 ( 经 参 考 文 献 2 允 许 进 行 修 改 ) Band broadening( 谱 带 变 宽 ): 色 谱 谱 带 流 经 色 谱 柱 的 过 程 中, 峰 宽 增 加 并 伴 随 稀 释 的 现 象 理 论 上, 色 谱 峰 以 窄 条 形 式 进 样, 如 果 没 有 谱 带 变 宽 的 过 程, 每 个 分 离 的 组 分 也 将 以 纯 化 合 物 的 窄 条 形 式 被 洗 脱 谱 带 变 宽 的 测 量 是 带 宽 (t w), 或, 更 准 确 地 说, 是 色 谱 柱 的 理 论 塔 板 数 (N) 有 时 称 为 谱 带 扩 散 或 谱 带 延 伸 参 见 图 80 Bandwidth (t w )( 谱 带 宽 度 t w ): 从 色 谱 柱 中 洗 脱 出 的 色 谱 谱 带 宽 度 一 般 测 量 方 法 是, 在 高 斯 峰 曲 线 两 侧 的 拐 点 处 作 切 线, 测 量 基 线 上 两 交 点 间 的 距 离 窄 带 宽 通 常 代 表 有 效 分 离, 也 称 峰 宽 见 图 80 Bar:HPLC 中 的 压 力 单 位, 相 当 于 1 atm,~ 15 lb/in. 2, 或 0.1 MPa Baseline( 基 线 ): 基 线 是 记 录 设 备 划 出 的 一 条 线, 表 示 仅 有 流 动 相 通 过 时 检 测 器 产 生 的 信 号 也 是 计 算 色 谱 峰 的 峰 面 积 或 峰 高 的 初 始 边 界 线 Baseline noise( 基 线 噪 音 ): 电 流 噪 音 温 度 波 动 流 通 池 中 气 体 溢 出 或 流 动 相 溶 剂 混 合 不 好 等 原 因 造 成 的 色 谱 基 线 的 不 规 则 变 化 ( 短 期 ) BET method(bet 方 法 ): 由 Bruner Emmett 和 Teller (BET) 三 人 开 发 的 方 法, 通 过 液 氮 温 度 下 孔 隙 内 氮 吸 附 - 凝 结 测 量 表 面 积 用 BET 方 法 还 可 以 计 算 孔 隙 体 积 和 孔 径 分 布 Biocompatible( 生 物 兼 容 性 ): 指 不 会 发 生 不 可 逆 吸 附 或 强 吸 附 使 生 物 分 子 ( 如, 蛋 白 质 ) 失 活 的 色 谱 柱 或 仪 器 部 件 通 常 指 无 金 属 或 陶 瓷 的 表 面 和 部 件 Bonded-phase chromatography( 键 合 相 色 谱 ): 液 相 色 谱 中 最 常 用 的 模 式, 用 化 学 键 合 在 支 持 剂 上 的 固 定 相 进 行 分 离 键 合 相 色 谱 最 常 用 的 支 持 剂 是 硅 胶 微 粒, 最 常 见 的 键 合 相 类 型 是 有 机 硅 烷, 如, 反 相 色 谱 中 使 用 的 十 八 烷 基 硅 烷 约 70% 的 HPLC 应 用 都 是 用 化 学 键 合 相 完 成 的 Bonded-phase concentration( 键 合 相 浓 度 ): 参 见 覆 盖 率 Boxcar chromatography(boxcar 色 谱 ): 参 见 柱 切 换 Breakthrough volume( 穿 透 体 积 ): 某 种 溶 质 持 续 通 过 色 谱 柱 到 开 始 被 洗 脱 前 的 体 积 与 色 谱 柱 体 积 和 该 溶 质 的 保 留 因 子 有 关 在 测 定 特 定 溶 质 的 色 谱 柱 总 样 品 容 量 时 非 常 有 用 Buffer( 缓 冲 液 ): 保 持 ph 不 变 的 溶 液, 阻 止 因 稀 释 或 加 入 少 量 酸 碱 而 带 来 的 ph 改 变 Buffer capacity( 缓 冲 容 量 ): 缓 冲 液 缓 冲 能 力 的 定 量 测 定 值 ( 定 义 为 改 变 1 升 缓 冲 液 ph 1 个 单 位 所 需 的 强 酸 或 碱 的 量 ), 或 指 承 受 进 样 缓 冲 的 样 品 溶 液 而 不 改 变 流 动 相 ph 的 缓 冲 能 力 ; 缓 冲 容 量 由 ph 缓 冲 液 pk a 缓 冲 液 浓 度 决 定 Buffer strength( 缓 冲 强 度 ): 参 见 离 子 强 度 C C term(c 项 ): van Deemter 方 程 的 传 质 阻 抗 项 参 见 传 质 和 van Deemter 方 程 C8: 参 见 辛 基 硅 烷 C18: 参 见 十 八 烷 基 硅 烷 144

147 C4, C8, C18, etc(c4, C8, C18 等 ): 指 反 相 键 合 相 的 烷 烃 链 长 度 C S : 参 见 Langmuir 等 温 线 Capacity( 容 量 ): 参 见 样 品 容 量 Capacity factor (k')( 容 量 因 子 k'): 色 谱 参 数 的 旧 术 语 是 说 明 保 留 的 参 数 现 在 由 国 际 提 纯 和 应 用 化 学 联 盟 (IUPAC) 定 义 为 保 留 因 子 (k) 参 见 保 留 因 子 的 计 算 方 法 Capillary column( 毛 细 管 柱 ): 指 内 径 小 于 0.5 mm 的 色 谱 柱 Capillary electrochromatography (CEC)( 毛 细 管 电 色 谱 CEC): 在 毛 细 管 柱 内 填 充 色 谱 吸 附 剂, 由 电 渗 流 而 不 是 压 力 驱 动 流 动 相 流 过 色 谱 柱 的 一 种 混 合 技 术 ; 该 技 术 兼 具 有 HPLC 填 料 表 面 的 选 择 性 和 毛 细 管 电 泳 (CE) 的 高 柱 效 Capillary LC( 毛 细 管 液 相 色 谱 ): 一 般 指 在 石 英 管 或 其 它 类 型 毛 细 管 中 进 行 的 HPLC, 内 径 一 般 小 于 0.5 mm, 也 称 微 量 LC Capillary micellar electrochromatography( 毛 细 管 胶 束 电 色 谱 ): 毛 细 管 胶 束 电 色 谱 (MEKC) 的 CEC 版 Capillary tubing( 毛 细 管 管 线 ): 连 接 色 谱 仪 各 部 件 并 引 导 流 动 相 流 入 适 当 部 件 的 管 线 HPLC 中 使 用 的 大 多 数 毛 细 管 管 线 内 径 小 于 英 寸 最 窄 的 有 用 内 径 约 为 英 寸 Capping( 端 基 保 护 ): 同 封 端 Carbon load( 碳 载 量 ): 对 于 硅 胶 键 合 相 来 说, 该 术 语 一 般 用 来 描 述 表 面 覆 盖 率 或 填 料 表 面 硅 醇 基 已 发 生 反 应 并 被 键 合 相 取 代 的 程 度 ; 碳 载 量 越 高, 残 留 硅 醇 基 数 越 少 碳 载 量 通 常 用 % 碳 表 示 ( 比 如,12% 碳 ) 在 反 相 LC 中, 碳 载 量 越 高, 分 析 物 保 留 越 大 Carrier( 载 体 ): 常 在 亲 和 色 谱 中 使 用 的 术 语 ; 指 结 合 活 性 配 基 ( 通 常 通 过 共 价 键 ) 的 支 持 剂 ; 也 指 其 它 色 谱 模 式 ( 比 如, 液 液 色 谱 ) 中 的 支 持 剂 Carrier gas( 载 气 ): 气 象 色 谱 (GC) 中 的 流 动 相 Cartridge column( 卡 套 柱 ): 一 种 置 于 卡 套 中 没 有 柱 端 接 头 的 色 谱 柱 该 柱 由 一 根 柱 管 和 填 料 组 成, 柱 管 两 端 有 筛 板 卡 套 柱 易 于 更 换, 比 带 柱 端 接 头 的 常 规 色 谱 柱 更 经 济 更 方 便 Cation exchange chromatography( 阳 离 子 交 换 色 谱 ): 离 子 交 换 色 谱 的 一 种, 使 用 带 有 分 离 阳 离 子 官 能 团 的 树 脂 或 填 料 强 阳 离 子 官 能 团 可 以 是 磺 酸, 弱 阳 离 子 交 换 官 能 团 可 以 是 羧 酸 CE: 毛 细 管 电 泳 CEC: 参 见 毛 细 管 电 色 谱 CGE: 参 见 毛 细 管 凝 胶 电 泳 CZE: 参 见 毛 细 管 区 带 电 泳 Chain length( 碳 链 长 度 ): 反 相 填 料 烷 烃 部 分 中 的 碳 链 长 度 用 碳 原 子 数 表 示 (C8 C18 等 ) 不 包 括 短 链 一 般 为 也 能 连 接 硅 烷 的 甲 基 异 丙 基 和 仲 丁 基 Channeling( 沟 流 ): 发 生 于 填 料 产 生 的 空 隙 中, 使 流 动 相 及 溶 质 的 流 速 比 平 均 流 速 移 动 更 快, 从 而 导 致 谱 带 变 宽 空 隙 产 生 的 原 因 是 填 充 不 当, 或 填 充 柱 床 损 坏 Check valve( 单 向 阀 ): 插 入 到 流 动 液 体 中 的 装 置, 可 以 使 液 流 只 向 一 个 方 向 流 动, 常 用 于 HPLC 泵 的 入 口 和 出 口 部 分 Chemisorption( 化 学 吸 附 ): 与 填 料 发 生 化 学 反 应 引 起 的 吸 附 这 种 相 互 作 用 大 多 数 都 是 不 可 逆 的, 通 常 发 生 在 带 反 应 性 官 能 团 的 填 料 上 ( 如, 硅 醇 基 或 键 合 氨 基 固 定 相 ) 化 学 吸 附 常 见 于 有 强 Lewis 酸 位 点 的 金 属 氧 化 物 固 定 相 Chiral recognition( 手 性 识 别 ): 手 性 固 定 相 与 两 个 对 映 体 发 生 不 同 相 互 作 用, 使 其 发 生 HPLC 分 离 的 能 力 Chiral stationary phases( 手 性 固 定 相 ): 为 分 离 对 映 体 混 合 物 而 设 计 的 固 定 相 固 体 支 持 剂 可 以 键 合 或 涂 覆 这 种 固 定 相, 在 固 体 支 持 剂 表 面 产 生 原 位, 或 存 在 于 表 面 孔 隙 内, 均 能 与 一 种 对 映 体 结 构 发 生 特 异 性 相 互 作 用 Chlorosilane( 氯 硅 烷 ): 用 于 制 备 硅 氧 烷 键 合 相 的 化 学 试 剂, 反 应 能 力 依 次 为 单 氯 硅 烷 < 二 氯 硅 烷 < 三 氯 硅 烷 烷 烃 部 分 ( 十 八 烷 基 辛 烷 基 等 ) 决 定 了 所 得 键 合 相 的 疏 水 性, 也 可 以 用 烷 氧 基 硅 烷, 但 反 应 活 性 较 低 Chromatogram( 色 谱 图 ): 在 色 谱 分 离 过 程 中, 时 间 对 检 测 器 输 出 信 号 或 洗 脱 体 积 对 样 品 浓 度 作 图 的 曲 线 145

148 Chromatograph( 色 谱 仪 ): 名 词 : 用 于 进 行 色 谱 分 离 的 仪 器 动 词 (IUPAC): 通 过 色 谱 柱 床 进 行 洗 脱 分 离 的 行 为 Chromatographic conditions( 色 谱 条 件 ): 描 述 如 何 进 行 分 析 的 色 谱 方 法 参 数 必 须 提 供 足 够 的 信 息, 从 而 使 分 析 可 以 重 复, 达 到 验 证 的 目 的 Classification( 分 级 ): 筛 分 不 同 粒 径 填 料 的 过 程 ; 一 般 而 言, 在 HPLC 中 窄 粒 径 分 布 由 于 没 有 细 微 颗 粒, 能 提 供 更 好 的 柱 效 和 更 高 的 渗 透 性 可 采 用 沉 降 水 析 和 离 心 等 技 术 完 成 不 同 粒 径 填 料 的 分 级 Column backpressure( 色 谱 柱 反 压 ): 见 柱 头 压 Column chromatography( 柱 色 谱 ): 采 用 色 谱 柱 或 柱 管 填 充 固 定 相 的 色 谱 形 式 开 管 柱 色 谱 HPLC 和 开 管 毛 细 管 柱 色 谱, 都 是 柱 色 谱 的 形 式 多 数 情 况 下 是 指 用 于 制 备 级 别 的 开 管 柱 色 谱 Column dead time( 色 谱 柱 死 时 间 ): 死 时 间 与 死 体 积 相 关 ; 用 死 体 积 除 以 流 速 测 定 ; 在 反 相 液 相 色 谱 中, 常 用 尿 嘧 啶 测 量 死 体 积 和 死 时 间 Column length (L)( 柱 长,L): HPLC 或 CE 中 用 于 进 行 液 相 分 离 的 色 谱 柱 或 毛 细 管 的 长 度 Column packing( 柱 填 料 ): 固 体 材 料, 通 常 为 多 孔 固 体 可 具 备 或 不 具 备 化 学 活 性 表 面 的, 填 充 于 色 谱 柱 内, 用 于 有 差 异 地 保 留 分 析 物, 特 指 固 定 相 常 用 填 料 为 未 键 合 和 键 合 硅 胶 树 脂 无 机 - 有 机 混 合 物 和 石 墨 化 炭 黑 Column performance (N)( 色 谱 柱 性 能,N): 特 指 色 谱 柱 柱 效 ; 给 定 化 合 物 的 理 论 塔 板 数 Column plate number (N)( 色 谱 柱 塔 板 数,N): 代 表 柱 效, 塔 板 数 越 高, 该 色 谱 柱 的 理 论 塔 板 数 就 越 高 一 般 来 讲, 用 5-/m d p 多 孔 填 料 填 充 良 好 的 150 x 4.6 mm 色 谱 柱 的 塔 板 数 应 在 之 间 Column switching( 柱 切 换 ): 将 多 根 色 谱 柱 通 过 切 换 阀 连 接 在 一 起, 用 于 更 好 的 色 谱 分 离 或 样 品 净 化 第 一 根 色 谱 柱 中 流 出 的 组 分 可 以 切 换 到 两 个 或 更 多 二 级 色 谱 柱 上, 再 依 次 被 送 入 其 它 色 谱 柱 或 检 测 器 有 时 称 为 多 维 色 谱 Competing base( 竞 争 性 碱 ): 在 反 相 色 谱 流 动 相 中 添 加 少 量 碱 性 化 合 物, 如 三 乙 胺 或 二 甲 基 辛 胺 (10-50 mm), 抑 制 碱 性 分 析 物 与 残 留 硅 醇 基 的 相 互 作 用, 遵 循 质 量 作 用 定 律, 因 为 竞 争 性 碱 的 浓 度 远 远 大 于 分 析 物 浓 度 也 可 参 见 添 加 剂 Comprehensive two-dimensional chromatography ( 全 二 维 色 谱 ): 用 于 各 种 组 分 分 离 的 二 维 色 谱 也 可 参 见 二 维 色 谱 Controlled surface porosity support( 控 制 表 面 孔 隙 率 支 持 剂 ): 同 多 孔 层 珠 和 薄 壳 型 填 料 Counterion( 平 衡 离 子 ): 在 离 子 交 换 过 程 中 用 于 从 离 子 位 点 上 取 代 目 标 离 子 的 溶 液 中 离 子 在 离 子 对 形 成 过 程 中, 加 入 流 动 相 中 的 用 于 形 成 溶 液 中 中 性 离 子 对 的 反 电 荷 离 子 Coupled columns( 结 合 柱 ): 柱 切 换 的 一 种 形 式, 一 根 初 级 柱 通 过 选 择 阀 连 接 两 根 二 级 柱 从 第 一 根 色 谱 柱 中 流 出 的 组 分, 选 择 性 地 导 入 第 二 和 第 三 根 色 谱 柱 进 一 步 分 离 该 术 语 还 用 于 表 示 将 两 根 或 更 多 色 谱 柱 串 联 在 一 起, 增 加 塔 板 数 Coverage( 覆 盖 率 ): 指 在 键 合 相 色 谱 中, 硅 胶 支 持 剂 上 键 合 相 的 量 覆 盖 率 通 常 用 每 平 方 米 微 摩 尔 或 碳 百 分 含 量 (w/w) 表 示 Critical micelle concentration( 临 界 胶 束 浓 度 ): 离 子 型 表 面 活 性 剂 聚 集 形 成 胶 束 的 浓 度 ; 胶 束 加 入 流 动 相 中 通 过 分 配 机 制 改 善 非 离 子 型 物 质 在 HPLC 和 CE (MEKC) 中 的 分 离 Cross-linking( 交 联 ): 在 树 脂 形 成 三 维 基 质 的 共 聚 过 程 中, 加 入 一 种 双 功 能 基 单 体 在 相 邻 聚 合 物 链 之 间 形 成 交 联 键 交 联 的 程 度 由 反 应 中 单 体 的 加 入 量 决 定 例 如, 二 乙 烯 基 苯 是 生 产 聚 苯 乙 烯 离 子 交 换 树 脂 常 用 的 交 联 剂 树 脂 的 溶 胀 和 扩 散 性 质 由 其 交 联 度 决 定 Cyano phase( 氰 基 固 定 相 ): 一 种 末 端 带 -CN 基 团 的 化 学 键 合 相, 可 以 作 为 一 种 中 等 极 性 的 吸 附 剂 用 于 正 相 分 离, 也 可 以 作 为 一 种 短 链 键 合 相 用 于 反 相 分 离 Column volume (V c)( 柱 体 积,V c ): 未 填 充 柱 的 体 积 ; V c = A cl, 其 中 A c 和 L 分 别 为 柱 管 截 面 积 和 柱 管 长 度 146

149 Cyclodextrins( 环 糊 精 ): 由 几 个 D-(+)- 吡 喃 葡 萄 糖 单 元 组 成 的 环 状 低 聚 物, 用 于 手 性 HPLC 和 CE 分 离 常 用 的 有 a,b 和 g- 环 糊 精 ; 具 有 短 锥 形 结 构 相 对 疏 水 的 空 腔, 在 其 两 端 有 一 级 和 二 级 羟 基 ; 基 于 对 对 映 体 不 同 的 包 含 作 用 对 其 进 行 分 离 ; 带 衍 生 羟 基 的 改 性 环 糊 精 也 可 用 于 改 变 选 择 性 D Data acquisition rate( 数 据 采 集 速 率 ): 指 检 测 器 输 出 的 样 品 采 集 速 率 如 需 表 征 一 个 色 谱 峰 必 须 至 少 采 集 个 数 据 点 数 据 采 集 速 率 通 常 用 赫 兹 表 示, 定 义 为 当 色 谱 峰 通 过 检 测 器 时, 每 秒 钟 收 集 多 少 个 数 据 点 对 于 快 速 色 谱 分 析 而 言, 数 据 采 集 速 率 必 须 足 够 快, 以 表 征 一 个 窄 峰 现 代 检 测 器 的 数 据 采 集 速 率 可 高 达 80 Hz; 也 称 为 数 据 速 率 和 采 样 速 率 Dead volume (V M)( 死 体 积 V M ): 色 谱 柱 死 体 积 指 小 分 子 ( 可 渗 透 入 填 料 的 所 有 孔 隙 ) 可 通 过 的 所 有 空 间 包 括 空 隙 体 积 和 空 孔 隙 体 积 用 V M 表 示 系 统 死 体 积 包 括 连 接 进 样 器 和 检 测 器 到 色 谱 柱 的 管 线 体 积 系 统 死 体 积 一 般 通 过 进 样 基 本 不 保 留 的 小 分 子 来 测 定 尿 嘧 啶 丙 酮 和 硫 脲 是 反 相 色 谱 中 最 常 用 的 测 试 物 质 也 可 参 见 调 整 保 留 体 积 滞 留 体 积 和 空 隙 体 积 DEAE: 参 见 二 乙 氨 基 乙 基 Degassing( 脱 气 ): 在 使 用 前 或 使 用 中, 去 除 流 动 相 中 溶 解 气 体 的 过 程 溶 解 的 气 体 可 能 在 检 测 器 流 通 池 内 从 溶 液 中 逸 出, 引 起 基 线 尖 峰 和 噪 音 溶 解 的 空 气 可 以 影 响 的 检 测 器 包 括 电 化 学 ( 参 与 反 应 ) 或 荧 光 ( 造 成 淬 灭 ) 检 测 器 溶 解 的 气 体 还 可 能 使 泵 损 失 性 能 脱 气 的 方 式 包 括 加 热 溶 剂 氦 气 鼓 泡 或 使 用 真 空 ( 用 真 空 瓶 ) 或 用 一 种 由 可 透 过 气 体 的 物 质 ( 聚 四 氟 乙 烯 PTFE) 制 成 的 管 线 在 线 抽 真 空 Denaturing HPLC( 变 性 HPLC): 用 反 相 HPLC 研 究 DNA 碱 基 对 以 分 析 基 因 突 变 Desalting( 脱 盐 ): 将 低 分 子 量 盐 和 其 它 化 合 物 从 非 离 子 化 和 高 分 子 量 化 合 物 中 去 除 的 技 术 一 个 实 例 是 反 相 填 料 通 过 疏 水 作 用 保 留 样 品 化 合 物, 使 盐 不 保 留 洗 脱 另 一 个 例 子 是 使 用 SEC 柱 排 除 大 分 子, 保 留 较 小 分 子 量 的 盐 Dextran( 葡 聚 糖 ): 主 要 用 于 低 压 生 物 色 谱 的 葡 聚 糖 基 质 填 料 ; 例 如,Sephadex (GE Healthcare, Piscataway, NewJersey) Diethylaminoethyl (DEAE)( 二 乙 氨 基 乙 基,DEAE): 一 种 常 用 的 弱 阴 离 子 交 换 功 能 基 ( 通 常 连 接 在 纤 维 素 或 Sepharose [GE Healthcare] 上 ), 用 于 分 离 生 物 大 分 子 Diffusion coefficient (D M or D S)( 扩 散 系 数,D M 或 D S ): 分 子 在 气 体 溶 液 (D M) 或 固 定 相 (D S) 中 的 基 本 参 数 用 每 秒 平 方 厘 米 表 示 D M 取 决 于 溶 质 的 分 子 量 温 度 溶 剂 粘 度 和 溶 质 的 摩 尔 体 积 100-Da 的 分 子 在 室 温 下 反 相 色 谱 中 扩 散 系 数 一 般 为 10-5 cm 2 /s Diol phase( 二 醇 固 定 相 ): 一 种 正 相 和 反 相 使 用 的 亲 水 固 定 相 为 二 醇 结 构 ( 在 脂 肪 烃 链 相 邻 碳 原 子 上 有 两 个 羟 基 ) 在 正 相 色 谱 中, 其 极 性 比 硅 胶 弱 在 反 相 色 谱 中 用 于 分 离 蛋 白 质 和 多 肽 Displacement chromatography( 置 换 色 谱 ): 一 种 色 谱 技 术, 样 品 置 于 色 谱 柱 头, 然 后 用 一 种 比 原 混 合 物 中 化 合 物 与 固 定 相 吸 附 更 强 的 化 合 物 进 行 置 换 然 后 样 品 分 子 被 彼 此 置 换, 被 强 吸 附 化 合 物 推 动 其 结 果 是 洗 脱 的 样 品 溶 质 区 带 可 能 很 尖 锐 ; 置 换 技 术 主 要 用 于 制 备 级 HPLC 应 用 Distribution constant (coefficient) (K c)( 分 布 常 数 ( 系 数 )(K c): 在 分 配 色 谱 中, 用 固 定 相 单 位 体 积 表 述 固 定 相 中 的 样 品 浓 度, 使 用 分 配 系 数 K c, 即 V R = V M + K cv S 在 固 体 固 定 相 中, 则 用 干 燥 固 定 相 的 单 位 质 量 ( 重 量 ) 表 述 固 定 相 中 的 样 品 浓 度, 即 分 配 系 数 KV g 在 吸 附 色 谱 中, 吸 附 剂 的 比 表 面 积 需 是 良 好 表 征 的 已 知 值, 固 体 相 中 浓 度 用 单 位 表 面 积 表 述 Divert valve( 分 流 阀 ): 用 于 将 色 谱 柱 液 流 导 入 废 液 瓶 ( 而 非 质 谱 仪 ) 的 阀 D M : 见 扩 散 系 数 d p : 见 粒 径 D S : 见 扩 散 系 数 Dwell time( 驻 留 时 间 ): 与 驻 留 体 积 相 当 的 时 间 ; 由 流 速 和 驻 留 体 积 决 定 147

150 Dwell volume( 驻 留 体 积 ): 溶 剂 混 合 点 ( 通 常 在 液 相 色 谱 仪 的 混 合 腔 内 或 比 例 阀 中 ) 与 LC 柱 头 之 间 的 体 积 在 梯 度 洗 脱 或 等 度 洗 脱 的 溶 剂 组 成 改 变 时, 驻 留 体 积 对 于 使 色 谱 柱 在 尽 可 能 短 的 时 间 内 完 成 流 动 相 组 成 的 变 化 非 常 重 要 低 压 混 合 物 系 统 的 驻 留 体 积 一 般 比 高 压 混 合 系 统 大 Dynamic coating( 动 态 涂 层 ): 在 流 动 相 中 添 加 一 种 物 质, 可 以 吸 附 在 填 料 上 ( 或 吸 附 进 填 料 中 ), 或 管 壁 表 面, 在 HPLC 中 填 料 上 或 CE 中 毛 细 管 壁 上 形 成 原 位 涂 层 动 态 涂 层 的 目 的 是 生 成 新 的 固 定 相 或 去 除 填 料 或 毛 细 管 壁 的 活 性, 避 免 发 生 不 需 要 的 相 互 作 用 一 个 简 单 的 例 子 是 将 流 动 相 或 分 析 缓 冲 液 的 ph 调 到 3 以 下, 使 硅 醇 基 质 子 化 并 抑 制 其 影 响 另 一 个 例 子 是 用 亲 水 聚 合 物 材 料 对 固 定 相 进 行 涂 层, 防 止 蛋 白 质 的 吸 收 Dynamic range( 动 态 范 围 ): 测 定 量 的 最 大 值 与 最 小 值 之 比 E E: 参 见 分 离 阻 抗 e: 参 见 颗 粒 间 孔 隙 率 Eddy dispersion (diffusion) term (l)( 涡 流 扩 散 项,l): van Deemter 方 程 中 的 A 项 由 于 填 料 粒 径 和 形 状 及 管 壁 作 用 造 成 了 轴 向 流 向 不 稳 定, 决 定 因 此 影 响 了 塔 板 高 度 ; A = 2 ld p, 其 中,l 为 色 谱 柱 经 验 常 数 填 充 良 好 的 色 谱 柱 其 典 型 的 l 值 为 某 些 色 谱 理 论 认 为, 与 流 速 相 关 的 塔 板 高 度 相 当 于 这 一 过 程 的 理 论 塔 板 高 度 (HETP) 也 称 为 涡 流 扩 散, 流 向 不 稳 定 导 致 峰 变 宽, 及 多 通 道 项 也 可 参 见 van Deemter 方 程 e e : 见 间 隙 孔 隙 率 Effective plate height (H eff)( 有 效 塔 板 高 度,H eff ): 柱 长 除 以 有 效 塔 板 数 Effective theoretical plates (N eff)( 有 效 理 论 塔 板 数 N eff ): 同 时 也 被 IUPAC 称 为 有 效 塔 板 数 色 谱 柱 中 的 真 实 塔 板 数, 因 为 它 用 死 体 积 校 正 了 理 论 塔 板 数 N eff = 16[(t R'/ w b) 2 ], 其 t R' 为 调 整 R b 保 留 时 间,w b 为 该 色 谱 峰 的 带 宽 ( 见 144 页 图 80) 对 于 形 状 和 相 比 差 别 很 大 的 色 谱 柱 而 言, 这 一 指 标 比 单 纯 的 塔 板 数 更 有 可 比 性 Efficiency (N or H )( 柱 效,N 或 H): 一 般 为 用 方 程 N = 16(V R/w b) 2 = 16 (t R/w b) 2 计 算 产 生 的 理 论 塔 板 数 (N), 其 中 w b 为 色 谱 峰 的 基 线 宽 度 ( 见 144 页 图 80) 如 果 在 半 峰 高 处 测 量 峰 宽, 则 使 用 下 式 计 算 :N = (V R/w h) 2 塔 板 高 度 (H) 或 HETP 由 H = L/N 测 定 不 对 称 峰 的 柱 效 最 好 用 峰 的 距 心 和 峰 形 方 差 进 行 计 算 也 可 参 见 Foley- Dorsey 方 程 Effluent( 流 出 物 ): 从 色 谱 柱 流 出 的 流 动 相 ; 同 洗 脱 物 e i : 见 颗 粒 内 孔 隙 率 EIC: 提 取 离 子 色 谱 图 Electrospray Ionization (ESI)( 电 喷 雾 电 离 (ESI)): 电 喷 雾 电 离 (ESI) 是 一 种 用 于 生 成 气 相 离 子 的 软 电 离 技 术 Eluate( 洗 脱 物 ): 从 色 谱 柱 流 出 的 流 动 相 与 溶 质 ; 也 称 流 出 物 Eluent( 洗 脱 液 ): 用 于 进 行 分 离 的 流 动 相 Eluite( 被 洗 脱 物 ): 被 洗 脱 的 物 质, 分 析 物, 或 样 品 Eluotropic series( 洗 脱 序 ): 在 液 固 色 谱 或 吸 附 色 谱 中, 按 照 溶 剂 强 度 增 强 的 顺 序 排 列 的 一 系 列 常 用 溶 剂 ( 洗 脱 液 ) 在 正 相 色 谱 中, 非 极 性 溶 剂, 如 戊 烷 应 在 序 列 的 最 低 端, 中 等 极 性 溶 剂, 如 二 氯 甲 烷, 应 在 序 列 的 中 间, 强 极 性 溶 剂, 如 甲 醇, 应 接 近 序 列 的 最 高 端 在 反 相 色 谱 中, 强 度 顺 序 相 反, 水 最 弱, 而 乙 腈 最 强 因 此, 开 发 方 法 或 运 行 梯 度 时, 洗 脱 序 对 溶 剂 的 选 择 非 常 有 用 也 可 参 见 Snyder e o Elute( 洗 脱 ): 通 过 洗 脱 进 行 色 谱 分 离 洗 脱 一 词 在 旧 术 语 表 中 多 指 过 展 开 Elution( 洗 脱 过 程 ): 流 动 相 流 经 色 谱 柱, 将 溶 质 洗 出 色 谱 柱 的 过 程 Elution chromatography( 洗 脱 色 谱 ): 最 常 用 的 色 谱 方 法, 将 样 品 以 一 条 窄 区 带 置 于 柱 头, 各 分 析 物 被 分 离 并 从 柱 末 端 洗 脱 可 与 置 换 色 谱 和 迎 头 分 析 进 行 对 比 Elution volume (V R)( 洗 脱 体 积 V R ): 指 将 溶 质 从 色 谱 柱 中 洗 脱 需 要 的 流 动 相 体 积 为 一 个 对 称 峰 从 进 样 时 算 起 到 最 大 浓 度 ( 顶 点 ) 时 的 体 积 ;V R = Ft R, 其 中 F 为 流 速,t R 是 目 标 峰 的 保 留 时 间 148

151 Elutriation( 水 析 ): 按 斯 托 克 沉 淀 速 度 不 同 使 粒 径 大 小 不 同 的 填 料 颗 粒 分 开 的 技 术 常 用 于 分 离 需 要 窄 粒 径 范 围 的 离 子 交 换 树 脂, 如 氨 基 酸 树 脂 该 技 术 是 让 水 从 下 向 上 进 入 大 圆 管 中, 把 未 筛 分 的 颗 粒 加 入 水 流 中, 颗 粒 按 密 度 和 粒 径 不 同 沉 淀 在 自 己 的 层 面 上 然 后 取 出 特 定 层 面 高 纯 度 球 形 硅 胶 有 时 也 用 水 析 筛 分 Enantiomeric compound( 对 映 体 化 合 物 ): 具 有 手 性 活 性 的 化 合 物 ; 这 些 化 合 物 需 要 能 拆 分 R- 和 S- 对 映 体 的 分 离 机 制, 特 殊 色 谱 柱 才 能 进 行 这 种 分 离 Endcapping( 封 端 ): 用 于 去 除 在 硅 胶 与 大 分 子 硅 烷 化 试 剂 ( 如, 十 八 烷 基 三 氯 硅 烷 ) 反 应 后 残 留 的 硅 醇 基 的 技 术 在 小 分 子 硅 烷 化 试 剂 ( 如, 三 甲 基 氯 硅 烷, 或 二 氯 二 甲 基 硅 烷 ) 键 合 硅 胶 填 料 表 面 残 留 的 硅 醇 基 之 后, 可 以 认 为 该 色 谱 柱 已 封 端 最 常 用 于 反 相 填 料, 以 最 大 限 度 地 减 少 对 碱 性 可 离 子 化 离 子 型 化 合 物 的 不 必 要 吸 附 封 端 反 应 也 用 于 去 除 聚 合 物 固 定 相 的 末 端 硅 醇 基 Endfitting( 柱 端 接 头 ): 色 谱 柱 柱 端 的 接 头, 可 连 接 进 样 器 或 检 测 器 大 多 数 HPLC 柱 端 接 头 都 有 截 留 填 料 的 筛 板, 死 体 积 小, 能 最 大 限 度 地 减 小 谱 带 变 宽 通 常 用 不 锈 钢 制 成, 但 也 可 使 用 聚 醚 醚 酮 (PEEK) 和 其 它 聚 合 物 材 料 e T : 见 总 孔 隙 率 Exact mass( 精 确 质 量 数 ): 使 用 单 同 位 素 质 量 数, 通 过 分 子 式 计 算 而 得 的 质 量 数 通 过 比 较 精 确 质 量 与 精 确 质 量 数 来 确 定 元 素 组 成 Exchange capacity( 交 换 容 量 ): 见 离 子 交 换 容 量 Excluded volume( 排 阻 体 积 ): 见 间 隙 体 积 Exclusion chromatography( 排 阻 色 谱 ): 见 离 子 排 阻 色 谱 和 空 间 排 阻 色 谱 Exclusion limit( 排 阻 限 ): 超 出 分 子 量 ( 或 体 积 ) 上 限 的 分 子 将 以 相 同 保 留 体 积 被 洗 脱, 这 一 体 积 称 为 排 阻 体 积 许 多 SEC 填 料 的 排 阻 限 已 知 例 如, 多 孔 硅 胶 105 柱 将 排 阻 分 子 量 大 于 的 分 子 ( 基 于 聚 苯 乙 烯 校 正 标 样 ) Exclusion volume (V 0,V ei)( 排 阻 体 积,V 0,V ei ): 一 个 分 子 在 SEC 填 料 上 的 最 小 保 留 体 积, 在 此 填 料 中 所 有 比 最 大 孔 隙 大 的 分 子 都 被 完 全 排 阻 这 些 分 子 不 能 进 入 到 孔 隙 内, 直 接 通 过 色 谱 柱 的 间 隙 ( 颗 粒 间 ) 被 洗 脱 出 来 Exponentially modified Gaussian peak( 指 数 修 正 的 高 斯 峰 ): 高 斯 峰 由 于 过 慢 通 过 检 测 器 或 体 积 过 大 将 导 致 非 对 称 峰 经 常 作 为 柱 每 秒 所 产 生 拖 尾 峰 的 模 型 Foley- Dorsey 方 程 的 基 础 也 可 参 见 Foley-Dorsey 方 程 Extracolumn effects( 柱 外 效 应 ): 除 色 谱 柱 本 身 以 外 所 有 色 谱 系 统 部 件 的 总 谱 带 展 宽 效 应 为 保 持 柱 效 必 须 将 柱 外 效 应 降 至 最 低 谱 带 展 宽 的 原 因 包 括 进 样 器 设 计 进 样 体 积 连 接 管 线 柱 端 接 头 筛 板 检 测 器 池 体 积 以 及 检 测 器 内 部 管 线 所 有 这 些 因 素 的 不 同 都 会 导 致 谱 带 展 宽 的 不 同 Extracolumn volume( 柱 外 体 积 ): 有 效 进 样 点 到 有 效 检 测 点 之 间 排 除 色 谱 柱 中 包 含 固 定 相 部 分 的 体 积 包 括 进 样 器 连 接 管 线 和 筛 板, 以 及 检 测 器 的 体 积 它 决 定 了 柱 外 效 应 F F: 参 见 流 速 F: 参 见 流 量 阻 抗 参 数 Fast LC( 快 速 LC): 使 用 填 充 了 小 粒 径 填 料 (3 或 5 µm d p ) 的 常 规 内 径 (2-6 mm) HPLC 短 柱 进 行 分 析 分 离 常 在 几 分 钟 内, 甚 至 几 秒 内 完 成 Fast protein LC (FPLC)( 快 速 蛋 白 质 LC): 特 指 蛋 白 质 分 离 的 专 用 HPLC 术 语 FPLC 中 通 常 使 用 玻 璃 柱 中 等 耐 压 和 球 形 填 料 微 粒 Flow rate (F)( 流 速,F): 流 动 相 流 经 LC 柱 的 流 量 速 率 常 规 4.6 mm 内 径 HPLC 柱 的 一 般 流 速 为 1-2 ml/min Flow resistance parameter (F)( 流 阻 参 数 F):F = d 2 p /B o, 其 中 B o 为 渗 透 率 也 可 参 见 渗 透 率 Fluoro phase( 含 氟 固 定 相 ): 脂 肪 族 和 芳 香 族 反 相 填 料 的 一 种, 其 中 键 合 相 的 重 要 成 分 是 氟 取 代 的 有 时 也 称 为 含 氟 固 定 相 或 全 氟 固 定 相 一 般 这 种 固 定 相 具 有 与 烃 类 固 定 相 不 同 的 选 择 性 Foley-Dorsey equation(foley-dorsey 方 程 ): 对 由 于 柱 外 体 积 造 成 的 峰 展 宽 所 致 拖 尾 峰 的 塔 板 数 和 保 留 时 间 的 修 正 见 参 考 3 FPLC: 见 快 速 蛋 白 质 LC 149

152 Fractionation range( 分 离 范 围 ): 指 SEC 中 凝 胶 或 填 料 的 操 作 范 围 在 该 范 围 内, 填 料 可 以 按 分 子 大 小 对 其 进 行 分 离 此 范 围 的 上 限, 是 不 能 扩 散 到 孔 隙 内 而 发 生 排 阻 的 过 大 分 子 此 范 围 下 限, 是 可 以 扩 散 进 入 到 所 有 孔 隙 内, 在 填 料 中 完 全 扩 散 的 小 分 子, 需 要 渗 透 体 积 才 能 被 洗 脱 ( 未 分 离 ) Frit( 筛 板 ): 在 色 谱 柱 两 端 截 留 柱 填 料 的 多 孔 配 件 每 根 柱 管 的 末 端 都 要 配 置, 更 常 见 的 是 置 于 柱 端 接 头 中 筛 板 可 以 是 不 锈 钢 或 其 它 惰 性 金 属 或 塑 料 的, 如, 多 孔 PTFE 或 聚 丙 烯 筛 板 的 孔 隙 必 须 小 于 HPLC 柱 中 的 最 小 填 料 颗 粒 ; 否 则 颗 粒 将 通 过 筛 板, 造 成 填 料 流 失 Frontal analysis( 迎 头 分 析 ): 一 种 将 样 品 连 续 加 到 色 谱 柱 上, 吸 附 最 弱 的 化 合 物 流 动 速 度 最 快, 从 而 得 到 其 最 纯 状 态 的 色 谱 技 术 在 第 一 种 洗 脱 的 化 合 物 之 后 被 洗 脱 的 是 次 弱 吸 附 的 化 合 物, 第 一 种 和 第 二 种 化 合 物 之 后 是 第 三 弱 吸 附 的 化 合 物, 依 次 类 推, 直 到 最 初 的 样 品 从 色 谱 柱 出 口 洗 脱 迎 头 分 析 很 少 使 用, 主 要 是 一 种 制 备 技 术 Frontal chromatography( 迎 头 色 谱 ): 同 迎 头 分 析 Fronting( 前 伸 峰 ): 在 色 谱 图 中 峰 前 半 部 分 ( 顶 点 之 前 ) 锥 度 超 过 后 半 部 分 的 峰 形 ; 即, 前 半 部 分 的 坡 度 小 于 后 半 部 分 该 峰 前 沿 呈 不 对 称 分 布 前 伸 峰 的 不 对 称 因 子 值 小 于 1 拖 尾 峰 则 与 之 相 反 前 伸 峰 可 能 是 由 于 等 温 线 中 的 正 曲 度 及 使 用 了 填 充 柱 较 差 造 成 的 上 样 量 过 大 引 起 的 G g: 障 碍 或 曲 度 因 子, 分 子 扩 散 项 也 可 参 见 曲 度 Gaussian curve( 高 斯 曲 线 ): 一 种 基 于 数 学 方 程 的 标 准 误 差 曲 线, 为 对 称 的 铃 铛 形 谱 带 或 峰 大 多 数 色 谱 理 论 都 认 为 色 谱 峰 是 高 斯 峰 用 峰 的 最 高 位 置 测 定 保 留 时 间, 前 述 柱 效 方 程 也 假 设 色 谱 峰 为 高 斯 峰 形 见 144 页 图 80 Gaussian peak( 高 斯 峰 ): 峰 形 遵 循 下 列 方 程 的 色 谱 峰 : C = C max exp[-(t - t R) 2 /2σ 2 ] Gel( 凝 胶 ): 凝 胶 色 谱 或 凝 胶 渗 透 色 谱 (GPC) 中 使 用 的 固 体 填 料 凝 胶 包 含 两 部 分 : 被 分 散 介 质 ( 固 体 部 分 ) 和 分 散 介 质 ( 溶 剂 ) 也 定 义 为 胶 状 分 散 的 固 体 和 液 体, 其 中 固 体 为 连 续 相 Gel filtration chromatography (GFC)( 凝 胶 过 滤 色 谱, GFC): 又 称 为 水 相 体 积 排 阻 色 谱 用 水 相 流 动 相 进 行 一 般 指 在 软 胶 ( 葡 聚 糖 ) 上 进 行 的 依 据 分 子 体 积 进 行 的 分 离, 但 也 可 以 使 用 高 度 交 联 的 聚 合 物 硅 胶 和 其 它 多 孔 介 质 大 多 数 凝 胶 过 滤 分 离 都 应 用 于 生 物 聚 合 物 和 水 溶 性 聚 合 物 如 聚 丙 烯 酸 的 分 离 Gel permeation chromatography (GPC)( 凝 胶 渗 透 色 谱, GPC): SEC 是 用 有 机 相 作 为 流 动 相, 用 于 聚 合 物 的 分 离 和 表 征 使 用 水 相 流 动 相 的 SEC 称 为 水 相 GPC GFC 或 水 相 SEC GFC: 参 见 凝 胶 过 滤 色 谱 Gigapores: 见 灌 注 色 谱 GPC: 见 凝 胶 渗 透 色 谱 Gradient( 梯 度 ): 溶 剂 强 度 随 时 间 变 化 ( 一 般 是 溶 剂 强 度 增 强 ), 逐 渐 洗 脱 保 留 较 强 的 分 析 物 的 过 程 通 常, 梯 度 可 以 是 二 元 三 元 和 四 元 混 合 溶 剂, 其 中 各 种 溶 剂 混 合 以 达 到 适 当 强 度 Gradient delay volume( 梯 度 延 迟 体 积 ): 见 驻 留 体 积 Gradient elution( 梯 度 洗 脱 ): 通 过 在 色 谱 分 离 过 程 中 逐 渐 增 加 流 动 相 强 度 而 缩 短 分 离 时 间 的 技 术 也 称 为 溶 剂 编 程 梯 度 可 以 是 连 续 的, 也 可 以 阶 梯 式 的 HPLC 常 用 二 元 三 元 和 四 元 溶 剂 梯 度 Graphitized carbon( 石 墨 化 炭 黑 ): 石 墨 化 炭 黑 是 由 非 石 墨 碳 经 石 墨 化 加 热 处 理 后 制 备 的 多 维 或 至 少 三 维 六 角 晶 型 序 列 石 墨 化 碳 ; 这 种 填 料 对 水 相 样 品 和 水 溶 性 的 有 机 提 取 物 中 的 极 性 化 合 物 具 有 强 亲 和 作 用 常 用 于 食 品 样 品 中 的 农 药 分 析 Graphitized carbon packing( 石 墨 化 炭 黑 填 料 ): 一 种 由 纯 石 墨 化 炭 黑 组 成 的 反 相 填 料 具 有 目 标 吸 附 特 性, 如, 对 邻 间 和 对 位 芳 香 化 合 物 和 顺 反 异 构 体 等 几 何 异 构 体 的 分 离 Guard column( 保 护 柱 ): 安 装 于 进 样 器 和 分 析 柱 之 间 的 小 柱 可 保 护 分 析 物 不 被 样 品 颗 粒 和 强 保 留 物 质 污 染 保 护 柱 一 般 填 充 和 分 析 柱 相 同 的 填 料, 通 常 具 有 相 同 的 内 径 但 它 更 短 更 便 宜, 一 般 在 发 生 污 染 后 丢 弃 即 可 一 体 化 的 保 护 - 分 析 柱 系 统 与 保 护 柱 和 分 析 柱 分 开 的 系 统 相 比, 连 接 管 线 所 带 来 的 柱 外 效 应 更 小 150

153 H h: 折 合 板 高 定 义 为 HETP/d p, 其 中 HETP 相 当 于 理 论 塔 板 数 的 塔 板 高 度,d p 是 填 料 颗 粒 直 径 也 可 参 见 折 合 板 高 H: 同 HETP 也 可 参 见 柱 效 h: 参 见 粘 度 Head pressure (Dp)( 柱 前 压,Dp): 色 谱 柱 入 口 和 出 口 的 压 力 之 差, 用 每 平 方 英 寸 磅 表 示 填 充 一 般 孔 隙 率 (0.5) 的 球 形 填 料 色 谱 柱, 其 柱 前 压 可 由 下 列 方 程 估 算 :Dp = 3000Lh/t Md 2 p, 其 中 L 是 色 谱 柱 的 柱 长 ( 以 厘 米 为 单 位 ), h 为 流 动 相 的 粘 度 ( 以 厘 泊 为 单 位 ),t M 是 色 谱 柱 的 滞 留 时 间 ( 以 分 钟 为 单 位 ),d p 为 填 料 直 径 ( 以 微 米 为 单 位 ) 压 力 可 以 用 每 平 方 英 寸 磅 巴 大 气 压 或 帕 斯 卡 表 示 Heart cutting( 中 心 切 割 ): 指 在 制 备 LC 中, 对 色 谱 峰 中 心 纯 度 最 高 的 部 分 进 行 馏 分 收 集 该 术 语 也 用 于 柱 切 换 H eff : 见 有 效 塔 板 高 度 Helium sparging( 氦 气 鼓 泡 ): 见 脱 气 氦 在 大 多 数 常 用 液 体 中 的 溶 解 度 都 非 常 低 HETP: 理 论 塔 板 数 对 应 的 高 度 来 自 于 蒸 馏 理 论 ; 柱 效 的 一 种 表 达 方 式 ;HETP = L/N, 其 中,L 为 柱 长,N 是 理 论 塔 板 数 对 于 5 µm 粒 径 填 充 良 好 的 HPLC 柱,HETP 应 为 2-3 d p,hetp( 或 H) 值 一 般 在 mm 范 围 内 也 可 参 见 柱 效 和 h High performance CE( 高 效 毛 细 管 电 泳 ): 一 种 在 小 直 径 毛 细 管 内 缓 冲 的 电 导 液 中 高 电 压 下 ( 可 高 达 V) 使 用 的, 基 于 不 同 电 泳 淌 度 对 离 子 型 分 子 进 行 分 离 的 技 术 非 离 子 型 ( 中 性 ) 分 子 可 以 用 MEKC 分 离 High performance liquid chromatography (HPLC)( 高 效 液 相 色 谱 HPLC): 液 相 色 谱 技 术 的 现 代 全 仪 器 化 形 式, 采 用 小 粒 径 填 料 和 高 压 有 时 称 为 高 压 LC High pressure mixing( 高 压 混 合 ): 一 种 HPLC 系 统 的 配 置, 溶 剂 用 多 个 泵 ( 一 般 为 2 个 ) 高 压 混 合 ; 这 种 系 统 与 在 单 泵 前 用 比 例 阀 进 行 混 合 的 低 压 混 合 系 统 相 比, 梯 度 延 迟 体 积 更 低 Holdup volume (V M)( 滞 留 体 积,V M ): 柱 内 流 动 相 总 体 积, 无 论 其 在 哪 里 ;V M = V e + V i, 其 中 V e 为 间 隙 体 积, V i 为 颗 粒 内 体 积 也 称 为 色 谱 柱 空 隙 体 积 IUPAC 提 出 应 将 死 体 积 这 一 术 语 从 这 个 概 念 中 删 除 死 体 积 的 使 用 限 于 流 动 相 系 统 没 有 流 经 的 区 域 进 样 可 通 过 所 有 孔 径 的 不 保 留 物 质 对 滞 留 体 积 进 行 测 量 也 可 参 见 间 隙 孔 隙 率 和 颗 粒 内 孔 隙 率 HPLC: 见 高 效 液 相 色 谱 Hybrid silica( 杂 化 硅 胶 ): 包 含 有 机 和 无 机 两 部 分 的 硅 胶, 兼 具 聚 合 物 填 料 和 硅 胶 填 料 的 性 质 用 含 有 机 官 能 团 的 硅 烷 合 成 与 未 加 修 饰 或 未 涂 层 硅 胶 相 比, 具 有 不 同 的 选 择 性 和 更 高 的 ph 稳 定 性 Hydrodynamic volume( 流 体 力 学 体 积 ): 由 分 子 在 自 由 溶 液 中 的 有 效 半 径 决 定 的 分 子 体 积, 其 流 体 动 力 学 半 径 由 分 子 在 溶 液 中 以 其 中 心 轴 旋 转 的 半 径 决 定 SEC 中 使 用 该 术 语 定 义 分 子 形 状, 解 释 为 什 么 同 样 分 子 量 的 分 子 常 具 有 不 同 的 洗 脱 体 积 用 斯 托 克 半 径 测 定 Hydrophilic( 亲 水 的 ): 希 腊 语 亲 水 一 般 指 完 全 与 水 兼 容 的 固 定 相 和 水 溶 性 分 子 用 于 分 离 蛋 白 质 的 许 多 色 谱 柱 如 离 子 交 换 SEC 和 亲 和 柱 等 都 具 有 亲 水 性, 不 会 发 生 水 相 环 境 的 蛋 白 质 不 可 逆 吸 附 或 变 性 Hydrophilic interaction chromatography( 亲 水 相 互 作 用 色 谱 ): 反 相 HPLC (RPC) 的 一 种 替 代 技 术, 用 于 分 离 在 RPC 中 可 能 只 有 微 弱 保 留 的 强 极 性 分 析 物,HILIC 需 要 高 比 例 非 极 性 流 动 相 和 极 性 固 定 相, 与 正 相 色 谱 (NPC) 的 需 求 相 似 但 不 同 的 是,NPC 使 用 非 极 性 溶 剂 ( 如, 正 己 烷 和 二 氯 甲 烷 ), 其 流 动 相 不 含 水, 而 HILIC 的 流 动 相 中 需 要 含 一 定 量 水, 以 维 持 固 定 相 表 面 对 分 析 物 可 能 有 选 择 性 分 配 的 富 水 层 另 外, 使 用 与 水 相 溶 的 有 机 溶 剂 而 不 是 NPC 中 与 水 不 相 溶 的 溶 剂 在 HILIC 中, 使 用 的 吸 附 剂 包 括 未 修 饰 硅 胶 键 合 二 醇 和 聚 羟 乙 基 天 冬 酰 胺 极 性 分 析 物 具 有 良 好 保 留, 按 亲 水 性 逐 渐 增 大 的 顺 序 洗 脱, 与 RPLC 正 好 相 反 Hydrophobic( 疏 水 的 ): 希 腊 语 恐 水 指 与 水 不 兼 容 的 固 定 相 或 一 般 不 与 水 亲 和 的 分 子 疏 水 分 子 基 本 上 没 有 极 性 官 能 团 大 多 数 具 有 高 含 烃 量 ( 脂 肪 族 和 芳 香 族 ) 官 能 团 151

154 Hydrophobic interaction chromatography( 疏 水 相 互 作 用 色 谱 ): 使 用 弱 极 性 ( 非 烃 类 ) 填 料 通 过 其 疏 水 部 分 的 相 互 作 用 和 填 料 表 面 的 疏 水 位 点 对 分 子 进 行 分 离 的 技 术 流 动 相 使 用 高 浓 度 盐 溶 液, 通 过 改 变 盐 浓 度 进 行 分 离 该 技 术 类 似 于 从 溶 液 中 盐 析 分 子 梯 度 洗 脱 为 逐 渐 降 低 盐 浓 度 常 用 该 技 术 分 离 在 常 规 反 相 色 谱 的 有 机 溶 剂 中 极 易 变 性 的 蛋 白 质 疏 水 相 互 作 用 色 谱 中 一 般 很 少 使 用 或 不 使 用 有 机 溶 剂 Hydroxyapatite( 羟 磷 灰 石 ): 一 种 化 学 上 类 似 于 骨 骼 和 牙 齿 的 多 孔 羟 基 磷 酸 钙 类 固 体 是 分 离 核 酸 成 分 单 克 隆 抗 体 和 蛋 白 质 等 的 生 物 色 谱 的 填 料 Hyphenated techniques( 联 用 技 术 ): 指 以 其 首 字 母 缩 写 而 闻 名 的 一 系 列 技 术, 包 括 LC- 质 谱 (MS) LC- 傅 里 叶 变 换 IR 光 谱 (FTIR) 和 LC-MS-MS 也 可 参 见 多 维 色 谱 I IC: 参 见 离 子 色 谱 Immobilized metal-affinity chromatography( 固 定 金 属 亲 和 色 谱 ): 参 见 金 属 亲 和 色 谱 Immunoaffinity chromatography( 免 疫 亲 和 色 谱 ): 一 种 将 抗 体 键 合 或 固 定 在 HPLC 支 持 材 料 表 面 的 特 殊 分 离 形 式 根 据 分 子 识 别 机 制, 被 抗 体 作 为 特 异 性 靶 标 的 分 析 物, 通 过 抗 原 - 抗 体 相 互 作 用 被 选 择 性 地 保 留, 而 从 复 杂 混 合 物 中 分 离 出 来 洗 脱 干 扰 物 之 后, 改 变 流 动 相 条 件, 将 强 结 合 的 分 析 物 释 放 出 来 Imprinted phases( 印 迹 固 定 相 ): 依 据 模 板 或 印 迹 分 子 产 生 的 聚 合 物 和 硅 胶 固 定 相 这 种 固 定 相 能 够 提 高 对 模 板 分 子 的 选 择 性 Included volume( 渗 入 体 积 ): 也 称 为 全 渗 入 体 积 小 分 子 完 全 进 入 到 色 谱 柱 的 全 部 孔 隙 空 间 的 洗 脱 体 积 也 可 参 见 体 积 排 阻 色 谱 Indirect detection( 间 接 检 测 ): 用 于 检 测 没 有 紫 外 吸 收 或 无 荧 光 的 分 析 物 将 具 有 UV 吸 收 的 化 合 物 或 荧 光 化 合 物 加 入 流 动 相 中, 保 持 高 背 景 信 号 ; 当 无 吸 收 或 无 荧 光 的 分 析 物 洗 脱 时, 背 景 被 稀 释, 这 样 就 检 测 到 了 分 析 物 的 负 峰 当 分 析 物 表 现 为 增 加 指 示 物 浓 度 时, 将 产 生 一 个 正 峰 检 测 到 负 信 号 时, 检 测 器 信 号 反 向 传 送 到 输 出 设 备 Infinite diameter column effect( 无 限 直 径 柱 效 应 ): 一 定 柱 长 下, 进 样 到 填 充 柱 床 中 心 的 样 品, 按 半 径 方 向 扩 散 展 开, 但 不 能 触 及 柱 管 壁, 管 壁 效 应 可 能 导 致 谱 带 变 宽 John Knox 观 察 到 一 个 现 象, 从 色 谱 柱 中 心 收 集 的 样 品 峰 比 靠 近 管 壁 处 收 到 的 样 品 峰, 柱 效 更 高 无 限 直 径 效 应 取 决 于 柱 长 内 径 粒 径 和 流 动 相 性 质 在 HPLC 中 很 少 应 用 Injection solvent( 进 样 溶 剂 ): 将 样 品 进 样 到 色 谱 柱 所 用 的 溶 剂 ; 溶 剂 应 与 流 动 相 强 度 相 当 或 略 低, 可 防 止 使 用 较 强 溶 剂 时 发 生 的 延 色 谱 柱 过 早 的 运 动 Inlet( 入 口 ): 溶 剂 和 样 品 进 入 色 谱 柱 的 起 始 部 位 入 口 筛 板 通 常 可 以 截 留 填 料, 某 种 情 况 下, 对 填 充 柱 床 起 到 保 护 作 用 Inlet/outlet check valves( 入 口 / 出 口 单 向 阀 ):LC 泵 上 的 单 向 阀 使 流 动 相 沿 一 个 方 向 而 不 是 相 反 方 向 流 动 入 口 单 向 阀 使 流 动 相 从 溶 剂 瓶 流 入 泵, 出 口 单 向 阀 使 流 动 相 从 泵 流 入 色 谱 柱 Inlet filter( 入 口 过 滤 器 ): 连 接 到 泵 的 入 口 管 路 上 的 过 滤 装 置, 在 溶 剂 达 到 泵 之 前 去 除 流 动 相 中 的 颗 粒 物 ; 溶 剂 瓶 过 滤 头 是 置 于 溶 剂 瓶 中 的 一 种 入 口 过 滤 器 Inline filter( 在 线 过 滤 器 ): 一 种 防 止 颗 粒 物 损 坏 色 谱 柱 的 装 置 现 代 低 体 积 在 线 过 滤 器 可 以 置 于 进 样 器 和 色 谱 柱 之 间, 对 谱 带 变 宽 没 有 大 的 影 响 在 这 个 位 置 上 的 过 滤 器 可 以 防 止 样 品 颗 粒 进 入 柱 床 或 柱 入 口 筛 板 Interparticle porosity (e e)( 颗 粒 间 孔 隙 率,e e ): 每 单 位 柱 体 积 的 填 充 柱 颗 粒 间 体 积 ;e e = V e/v c, 其 中 V e 为 间 隙 体 积,V c 为 总 体 积 也 可 参 见 间 隙 孔 隙 率 Interparticle volume (V o)( 颗 粒 间 体 积,V o ): 在 填 料 颗 粒 之 外 的 流 动 相 体 积 Interstitial porosity (e e)( 间 隙 孔 隙 率,e e ): 柱 填 料 颗 粒 间 ( 间 隙 ) 的 体 积 比 率 ;e e = V e/v c Interstitial velocity (u e)( 间 隙 流 速,u e ): 洗 脱 液 流 经 色 谱 柱 从 填 料 颗 粒 周 围 流 过 的 实 际 速 度 ;u e = F/A c e e 间 隙 流 速 是 计 算 折 合 流 速 的 基 础 152

155 Interstitial volume (V e)( 间 隙 体 积 ): 填 料 颗 粒 之 间 的 体 积 不 包 括 颗 粒 孔 隙 内 的 体 积 也 称 为 排 阻 体 积 ( 见 SEC) 和 颗 粒 间 体 积 通 过 进 样 不 进 入 任 何 孔 隙 不 与 填 料 表 面 发 生 相 互 所 用 的 分 子 测 得 在 SEC 中, 该 体 积 用 V o 表 示 Intraparticle porosity (e i)( 颗 粒 内 孔 隙 率,e i ): 填 料 颗 粒 孔 内 的 体 积 比 率 :e i = V pore/v particle Intraparticle volume (V i)( 颗 粒 内 体 积,V i ): 填 料 颗 粒 孔 内 体 积 也 称 内 体 积 和 渗 入 体 积 可 以 用 BET 法 或 汞 压 入 孔 隙 率 法 测 定 Ion chromatography (IC)( 离 子 色 谱,IC): 一 种 离 子 交 换 技 术, 用 低 离 子 交 换 容 量 的 离 子 交 换 剂 和 稀 缓 冲 液, 测 定 低 浓 度 有 机 和 无 机 阴 阳 离 子 常 用 电 导 检 测 器 IC 有 两 种 操 作 形 式 : 抑 制 型 IC, 用 第 二 根 色 谱 柱 或 膜 分 离 器 去 除 分 析 物 中 的 缓 冲 液 反 离 子, 同 时 用 氢 离 子 或 氢 氧 根 离 子 置 换, 将 缓 冲 液 转 换 成 不 带 电 荷 的 物 质, 起 到 抑 制 背 景 提 高 灵 敏 度 的 作 用 在 非 抑 制 型 IC 中, 选 择 低 浓 度 弱 电 导 的 缓 冲 液, 所 有 洗 脱 物 都 流 经 检 测 器, 离 子 在 背 景 信 号 之 上 被 检 测 Ion exchange capacity( 离 子 交 换 容 量 ): 填 料 上 能 够 参 与 离 子 交 换 过 程 的 离 子 型 位 点 数 离 子 交 换 容 量 用 每 克 毫 当 量 (mequiv) 表 示 典 型 的 聚 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 强 阴 离 子 交 换 树 脂 的 容 量 为 3-5 mequiv/g IC 所 用 的 交 换 剂 容 量 非 常 低 弱 阴 离 子 和 弱 阳 离 子 交 换 剂 的 容 量 随 ph 改 变 而 发 生 显 著 变 化 Ion exchange chromatography( 离 子 交 换 色 谱 ): 在 填 料 的 阳 离 子 或 阴 离 子 位 点 上 分 离 离 子 型 物 质 的 一 种 色 谱 模 式 样 品 离 子, 通 常 带 反 离 子, 与 填 料 上 已 存 在 的 离 子 基 团 发 生 交 换 保 留 大 小 基 于 不 同 离 子 对 该 位 点 的 亲 和 性, 以 及 其 它 溶 液 参 数, 如,pH 离 子 强 度 和 反 离 子 类 型 等 离 子 色 谱 基 本 上 是 一 种 离 子 交 换 技 术 Ion exclusion( 离 子 排 斥 ): 用 离 子 交 换 树 脂 使 离 子 化 溶 质 与 非 离 子 化 或 部 分 离 子 化 溶 质 分 离 的 过 程 唐 南 电 位 使 分 离 得 以 进 行, 即, 离 子 型 溶 质 在 溶 液 中 的 浓 度 比 在 固 定 相 中 的 更 高, 而 非 离 子 型 溶 质 则 均 匀 分 布 在 流 动 相 和 树 脂 之 间 因 此 离 子 型 溶 质 比 非 离 子 型 溶 质 的 通 过 色 谱 柱 的 速 度 更 快 当 用 反 相 色 谱 在 使 硅 醇 基 离 子 化 的 ph 条 件 下 分 离 阴 离 子 时, 也 存 在 离 子 排 斥 现 象 Ionic strength( 离 子 强 度 ): 离 子 强 度 是 电 解 质 溶 液 的 特 性 通 常 表 示 为 电 解 质 离 子 之 间 的 平 均 静 电 相 互 作 用 其 与 电 解 质 浓 度 有 关, 但 离 子 强 度 与 电 解 质 浓 度 的 主 要 区 别 在 于, 如 果 某 些 离 子 带 更 高 的 电 荷, 前 者 将 更 高 流 动 相 的 离 子 强 度 越 高, 其 对 于 离 子 分 析 物 或 吸 附 位 点 的 竞 争 力 就 越 强 Ion-moderated partitioning chromatography( 离 子 调 节 分 配 色 谱 ): 一 种 用 强 阳 离 子 交 换 填 料 ( 特 殊 的 阳 离 子 形 态, 如, 钙 氢 银 ) 分 离 碳 水 化 合 物 的 技 术, 其 分 离 机 制 是 络 合 而 不 是 离 子 交 换 Ion-pair chromatography( 离 子 对 色 谱 ): 一 种 色 谱 形 式, 溶 液 中 的 离 子 可 以 成 对 或 被 中 性 化, 以 离 子 对 的 形 式 在 反 相 柱 上 得 到 分 离 离 子 对 试 剂 一 般 为 含 烷 烃 链 的 离 子 型 化 合 物, 具 有 一 定 疏 水 型, 因 而 形 成 的 离 子 对 可 以 在 反 相 柱 上 保 留 保 留 与 烷 烃 链 的 长 度 和 离 子 对 添 加 剂 的 浓 度 成 正 比 正 相 色 谱 中 也 有 离 子 对, 离 子 对 的 一 部 分 是 动 态 添 加 的 吸 附 剂, 不 过 这 项 技 术 的 应 用 不 如 反 相 色 谱 中 普 遍 也 称 为 离 子 相 互 作 用 色 谱 或 动 态 离 子 交 换 色 谱, 要 强 调 的 是, 用 户 有 时 也 不 清 楚 添 加 剂 是 如 何 控 制 保 留 的 确 切 机 制 细 节 Ion retardation( 离 子 阻 滞 ): 指 使 用 两 性 离 子 交 换 树 脂, 阻 滞 离 子 型 分 子, 并 让 非 离 子 型 分 子 或 非 电 解 质 先 洗 脱 Ion suppression( 离 子 抑 制 ): 水 相 流 动 相 可 以 在 特 定 ph 下 发 生 缓 冲 作 用, 抑 制 溶 质 的 离 子 化 例 如, 弱 羧 酸 的 离 子 抑 制 是 将 ph 调 节 到 其 pk a 值 以 下 在 反 相 色 谱 中 用 于 改 善 弱 酸 和 弱 碱 的 峰 形 Irregular packing( 不 规 则 填 料 ): 指 填 料 的 形 状 不 规 则 填 料 有 各 种 粒 径 将 碾 碎 的 固 体 填 料 用 分 离 机 械 按 粒 径 筛 分 成 窄 范 围 填 料 颗 粒 在 分 析 型 HPLC 中 球 形 填 料 比 不 规 则 填 料 更 常 用, 但 在 制 备 型 LC 中 价 格 便 宜 的 不 规 则 填 料 仍 有 广 泛 用 途 Irreversible adsorption( 不 可 逆 吸 附 ): 将 把 与 吸 附 剂 有 极 强 亲 和 力 的 化 合 物 进 样 到 色 谱 柱 上 时, 将 产 生 强 烈 吸 附, 不 能 从 柱 上 洗 脱 样 品 与 吸 附 剂 表 面 之 间 发 生 化 学 反 应, 就 是 不 可 逆 吸 附 的 一 个 例 子 也 可 参 见 化 学 吸 附 Isocratic( 等 梯 度 ): 在 LC 中 洗 脱 剂 组 成 不 随 时 间 而 变 153

156 Isotherm( 等 温 线 ): 见 吸 附 等 温 线 Isothermal chromatography( 等 温 色 谱 ): 采 用 恒 温 条 件 绝 大 多 数 LC 都 是 在 等 温 条 件 下 进 行 的 K k: 见 保 留 因 子 k': 旧 术 语 已 被 IUPAC 批 准 的 术 语 保 留 因 子 (k) 取 代 K: 见 分 配 系 数 k A/B : 见 选 择 性 系 数 Kc: 见 分 布 常 数 ( 系 数 ) Kieselguhr( 硅 藻 土 ): 柱 色 谱 中 使 用 的 硅 藻 类 土, 也 可 作 为 样 品 净 化 介 质 只 有 弱 吸 附 性, 可 以 用 作 液 - 液 色 谱 的 支 持 剂 HPLC 中 很 少 使 用 Kinetic Plot( 动 力 学 曲 线 ): 动 力 学 曲 线 是 表 征 柱 效 实 际 极 限 的 方 法, 根 据 压 力 降 限 制 的 塔 板 数 (N ) 对 理 论 塔 板 (H) 和 分 离 阻 抗 (E ) 作 图 动 力 学 曲 线 保 留 了 van Deemter 曲 线 显 示 的 信 息, 但 还 包 含 了 柱 床 渗 透 性 的 信 息 参 见 Poppe 曲 线 Knox equation(knox 方 程 ):John Knox 对 van Deemter 方 程 的 改 良, 其 中 A 项 为 涡 流 扩 散 乘 以 u1/3, 其 中 u 为 间 隙 洗 脱 液 流 速 一 般 用 无 因 次 或 折 合 塔 板 高 度 (h ) 及 折 合 流 速 (v ) 等 表 示,h = Av 1/3 + B/v + Cv 也 可 参 见 van Deemter 方 程 L L: 见 柱 长 Laminar flow( 层 流 ): 液 体 在 粘 滞 力 比 惯 性 更 强 的 条 件 下 移 动 时, 产 生 的 不 随 时 间 变 化 的 平 坦 液 流 层 流 用 低 雷 诺 数 ( 见 雷 诺 数 ) 表 征 在 一 个 圆 筒 状 管 路 中, 中 心 的 液 流 比 管 壁 的 液 流 流 动 更 快, 呈 现 以 中 心 流 速 为 顶 点 的 抛 物 线 形 分 布 在 柱 床 中 的 这 种 间 隙 轴 向 流 速 不 均 衡 性, 也 是 导 致 填 充 柱 内 峰 变 宽 的 原 因 Langmuir isotherm(langmuir 等 温 式 ): 等 温 式 的 一 种 特 殊 形 式 :C S = N0C M/(K d + C M), 其 中 C S 和 C M 是 溶 质 在 固 定 相 和 流 动 相 的 平 衡 浓 度,N 0 是 可 用 的 表 面 吸 附 位 点 数,K d 是 吸 附 结 合 常 数 LC: 见 液 相 色 谱 Ligand( 配 位 体 ): 在 配 位 交 换 色 谱 中, 指 固 定 相 进 行 配 位 交 换 的 分 析 物 在 亲 和 色 谱 中, 指 与 支 持 剂 偶 联 构 成 亲 和 柱 的 生 物 特 异 性 物 质 酶 抗 原, 或 激 素 等 在 键 合 相 色 谱 中, 指 与 表 面 共 价 结 合 的 部 分 Ligand exchange chromatography( 配 位 交 换 色 谱 ): 螯 合 配 位 体 添 加 到 流 动 相 中, 被 填 料 吸 附 的 一 种 技 术 这 些 被 吸 附 的 分 子 充 当 了 特 定 溶 质 的 螯 合 剂 例 如, 可 以 将 铜 盐 加 入 流 动 相 中, 与 氨 基 酸 螯 合 并 使 其 分 离 螯 合 树 脂 具 有 类 似 的 功 能 : 螯 合 基 团 与 聚 苯 乙 烯 骨 架 化 学 键 合 Limit of detection (LOD)( 检 测 限 (LOD)): 在 本 底 噪 音 水 平 以 上 能 够 检 测 到 的 化 合 物 的 最 少 量 Linear elution adsorption chromatography( 线 性 洗 脱 吸 附 色 谱 ): 指 在 吸 附 等 温 线 的 线 性 部 分 所 进 行 的 吸 附 色 谱 由 Lloyd Snyder 创 造 的 术 语 Linear velocity (u)( 线 性 流 速,u): 流 动 相 流 经 色 谱 柱 时 的 流 速 用 厘 米 / 秒 表 示 与 色 谱 柱 横 截 面 积 的 流 速 有 关 用 柱 长 除 以 不 保 留 化 合 物 的 保 留 时 间 测 得 也 可 参 见 空 隙 时 间 Linearity( 线 性 ): 线 性 动 态 范 围 : 离 子 信 号 与 分 析 物 浓 度 呈 线 性 关 系 的 浓 度 范 围 Liquid chromatography (LC)( 液 相 色 谱,LC): 一 种 流 动 相 为 液 体 的 分 离 技 术 多 数 在 色 谱 柱 内 进 行 Liquid-liquid chromatography( 液 - 液 色 谱 ): 一 种 最 早 的 HPLC 分 离 模 式, 在 二 十 世 纪 七 十 年 代 初 期 化 学 键 合 相 出 现 后 即 已 不 再 使 用 同 分 配 色 谱 Liquid-solid chromatography( 液 - 固 色 谱 ): 同 吸 附 色 谱 Loadability( 负 载 能 力 ): 可 以 加 载 到 色 谱 柱 上 的 分 析 物 最 大 量, 如 果 超 过 这 个 量 就 不 能 够 达 到 分 离 所 需 纯 度 和 回 收 率 的 要 求 ; 在 制 备 色 谱 中 非 常 重 要 154

157 Loading (phase loading versus sample loading)( 荷 载 量, 固 定 相 荷 载 量 与 样 品 荷 载 量 ): 涂 层 或 键 合 在 固 体 支 持 剂 上 的 固 定 相 量 在 液 - 液 色 谱 中, 液 体 固 定 相 的 量 以 毫 克 / 克 填 料 计 在 键 合 相 色 谱 中, 荷 载 量 可 以 用 毫 摩 尔 / 平 方 米, 或 碳 百 分 含 量 (w/w) 表 示 也 称 为 覆 盖 率 或 表 面 覆 盖 率 还 有 另 一 种 不 相 关 的 概 念, 即, 进 样 到 分 析 柱 或 制 备 柱 上 的 样 品 质 量 制 备 柱 经 常 在 过 载 条 件 下 操 作, 以 得 到 更 高 通 量 log k w :log k 对 反 相 LC 中 有 机 改 性 剂 体 积 作 图 的 外 推 截 距 也 可 参 见 S Longitudinal diffusion( 纵 向 扩 散 ): 同 分 子 扩 散 项 van Deemter 方 程 中 的 B 项 也 可 参 见 van Deemter 方 程 Low pressure mixing( 低 压 混 合 ): 参 见 高 压 混 合 M µ: 见 电 泳 淌 度 Macroporous resin (macroreticular)( 大 孔 树 脂 ( 大 网 络 树 脂 )): 具 有 分 子 级 微 孔 或 几 百 埃 大 孔 的 交 联 离 子 交 换 树 脂 这 种 大 孔 树 脂 内 表 面 积 较 大 可 让 大 分 子 进 入 Mass accuracy( 质 量 准 确 度 ): 衡 量 分 析 物 的 测 定 质 量 与 其 精 确 质 量 数 的 接 近 程 度 的 指 标, 通 常 用 ppm 表 示 Mass defect( 质 量 亏 损 ): 标 称 质 量 与 精 确 质 量 数 之 差 Mass error( 质 量 误 差 ): 计 算 式 :( 精 确 质 量 数 ) ( 精 确 质 量 ) Mass resolution( 质 量 分 辨 率 ): 确 保 样 品 范 围 内 的 质 量 准 确 度 以 ( 离 子 质 量 )/( 质 谱 峰 宽 ) 衡 量,R = (m/z)/w 1/2 还 可 表 示 为 质 量 分 辨 率 = ( 离 子 质 量 )/( 质 谱 峰 分 离 度 ),R = (m/z)/dm 解 决 特 定 分 析 问 题 所 需 的 分 辨 率 取 决 于 样 品 和 基 质 Mass spectrum( 质 谱 ): 质 谱 仪 采 集 的 数 据, 代 表 离 子 的 分 布 情 况, 以 离 子 信 号 对 质 荷 比 (m/z) 作 图 而 得 Mass transfer (interphase)( 传 质 ( 相 间 )): 溶 质 在 流 动 相 和 固 定 相 之 间 运 动 的 过 程 van Deemter 方 程 的 C 项, 称 为 相 间 传 质 项 传 质 过 程 越 快, 柱 效 越 高 在 HPLC 中, 传 质 速 率 慢 是 影 响 柱 效 的 最 重 要 因 素 可 以 通 过 使 用 小 粒 径 填 料 薄 固 定 相 层 低 粘 度 流 动 相 和 高 温, 提 高 传 质 速 率 Mean pore diameter( 平 均 孔 径 ): 多 孔 填 料 的 平 均 孔 径 最 常 用 BET 法 测 定, 假 设 为 均 匀 的 圆 柱 状 孔, 可 用 4 倍 孔 隙 面 积 除 以 表 面 积 (4V/A) 计 算 得 到 孔 径 的 重 要 之 处 在 于, 溶 质 分 子 必 须 能 在 孔 内 外 自 由 扩 散, 才 能 与 固 定 相 表 面 发 生 相 互 作 用 另 外, 孔 之 间 必 须 贯 通 良 好, 具 有 最 少 的 闭 塞 点, 从 而 允 许 分 子 可 以 通 过 通 道 进 入 到 孔 内 的 任 何 部 分 在 SEC 中, 填 料 有 不 同 的 孔 径, 因 此 可 以 分 离 不 同 体 积 的 分 子 典 型 的 物 质, 如 硅 胶, 最 常 见 的 孔 径 是 60- 和 100Å 孔 径 大 于 300Å 可 用 于 生 物 分 子 的 分 离 孔 隙 一 般 分 为 微 孔 (< 20Å) 中 等 孔 (20-500Å) 和 大 孔 (> 500 Å) 三 个 级 别 MECC: 参 见 胶 束 电 动 毛 细 管 色 谱 Megapores: 参 见 灌 注 色 谱 MEKC: 参 见 胶 束 电 动 毛 细 管 色 谱 Metal-affinity chromatography( 金 属 亲 和 色 谱 ): 一 种 特 殊 的 配 位 交 换 色 谱, 用 特 定 金 属 离 子 ( 一 般 为 铜 (II) 锌 (II) 和 铁 (II)) 的 特 殊 亲 和 性 分 离 生 物 聚 合 物 Metalophile ( 嗜 金 属 ): 一 种 对 硅 胶 表 面 活 性 酸 性 硅 醇 基 有 高 亲 和 性 的 化 合 物 通 常 为 强 碱 性 胺 或 多 功 能 基 羧 酸 酯 或 酚 Method development( 方 法 开 发 ): 对 包 括 样 品 预 处 理 在 内 的 分 离 过 程 进 行 优 化, 以 得 到 可 重 现 的 耐 用 的 分 离 方 法 一 般 来 说, 重 点 是 筛 选 固 定 相 洗 脱 液 和 色 谱 柱 温 的 组 合, 提 供 足 够 的 ( 如 果 不 是 最 优 化 的 ) 分 离 Method validation( 方 法 认 证 ): 对 方 法 进 行 测 试, 检 查 其 保 留 时 间 分 离 度 以 及 对 目 标 组 分 的 定 量 是 否 能 符 合 需 求 的 准 确 度 和 精 密 度 的 过 程 Micellar chromatography( 胶 束 色 谱 ): 向 流 动 相 中 加 入 胶 束 进 行 分 离 胶 束 可 以 作 为 置 换 剂 或 分 配 剂, 为 改 变 选 择 性 提 供 另 一 个 参 数 胶 束 色 谱 和 MEKC 中 使 用 的 表 面 活 性 剂 浓 度 大 于 其 临 界 胶 束 浓 度 Micro-LC( 微 量 LC): 泛 指 分 离 所 用 色 谱 柱 内 径 比 常 规 柱 窄 的 技 术 在 色 谱 柱 内 径 小 于 0.5 mm 的 HPLC 中 常 用 微 量 LC 这 一 术 语 ; 在 样 品 量 有 限 的 高 灵 敏 度 分 析 中, 以 及 当 使 用 某 种 LC-MS 电 离 技 术, 需 要 进 入 离 子 源 的 溶 剂 体 积 必 须 尽 可 能 小 的 时 候, 也 使 用 微 量 LC 155

158 Microbore( 微 径 ): 指 在 HPLC 中 使 用 的, 比 常 用 内 径 更 小 的 色 谱 柱 一 般 认 为 2 mm 及 以 下 的 色 谱 柱 为 微 径 柱 0.5 mm 及 更 小 的 内 径 称 为 微 量 LC 柱 Microchip devices( 微 芯 片 装 置 ): 基 于 硅 玻 璃 和 其 它 类 型 的 微 加 工 芯 片, 通 过 这 一 装 置 可 以 将 实 验 微 缩 到 单 通 道 或 多 通 道 微 液 流 环 路 中 进 行 这 种 装 置 可 用 于 CE 和 CEC 成 本 较 低 并 且 是 一 次 性 的 目 前 进 行 分 离 的 微 型 装 置 还 处 于 初 级 阶 段, 今 后 其 应 用 还 将 进 一 步 扩 展 Microparticulate( 微 粒 ):HPLC 中 使 用 的 小 颗 粒 填 料 一 般 来 说, 粒 度 小 于 10 mm 的 全 多 孔 填 料 即 为 微 粒 Microporous resin( 微 孔 树 脂 ): 同 微 网 状 树 脂 Microreticular resin( 微 网 状 树 脂 ): 具 有 与 分 子 大 小 相 符 合 的, 交 联 合 成 的 开 口 孔 隙, 离 子 交 换 树 脂 在 窄 孔 内 的 扩 散 可 能 受 影 响, 存 在 离 子 交 换 率 低 和 柱 效 差 的 问 题, 尤 其 对 于 大 分 子 而 言 Migration rate( 迁 移 速 率 ): 见 电 泳 淌 度 Migration time (tm)( 迁 移 时 间,t m ): 在 毛 细 管 电 泳 中, 带 电 荷 分 子 从 进 样 点 移 动 到 检 测 点 所 用 的 时 间 与 滞 留 时 间 不 同 (t M ) Minimum plate height( 最 小 塔 板 高 度 ):van Deemter 曲 线 以 H 对 v 作 图 得 到 的 最 低 值 该 值 代 表 从 特 定 色 谱 柱 和 流 动 相 系 统 得 到 的 最 大 理 论 塔 板 数 一 般 出 现 在 极 低 流 速 下 也 称 为 最 佳 塔 板 高 度 通 常 为 良 好 填 充 色 谱 柱 粒 径 的 2-3 倍 Mixed-bed column( 混 合 床 色 谱 柱 ): 同 一 根 柱 子 上 填 充 了 两 种 或 更 多 固 定 相, 常 用 于 IEC( 阴 离 子 和 阳 离 子 混 合 树 脂 ) 和 SEC( 不 同 孔 径 填 料 的 混 合 物 ) 中 在 IEC 中 其 优 势 是 既 去 除 了 阳 离 子 化 合 物, 也 去 除 了 阴 离 子 化 合 物 在 SEC 使 用 是 因 为 可 以 在 同 一 根 色 谱 柱 上 得 到 更 宽 的 分 子 量 范 围 Mixed-mode separation( 混 合 模 式 分 离 ): 在 一 根 色 谱 柱 上 得 到 的, 由 双 重 保 留 机 制 进 行 的 具 有 不 同 保 留 和 选 择 性 的 分 离 例 如, 在 中 到 高 ph 下, 带 硅 醇 基 的 反 相 柱, 可 以 利 用 离 子 化 硅 醇 基 的 疏 水 相 互 作 用 和 离 子 相 互 作 用 进 行 分 离 有 时, 混 合 模 式 分 离 对 提 高 选 择 性 ( 谱 带 间 隔 ) 很 有 帮 助, 但 可 能 会 造 成 不 对 称 峰, 如 果 需 要 在 后 续 批 次 的 填 料 中 精 确 控 制 这 些 相 互 作 用 的 平 衡 将 会 比 较 困 难 Mobile phase( 流 动 相 ): 推 动 溶 质 流 经 色 谱 柱 的 溶 剂 在 LC 中, 流 动 相 与 溶 质 和 固 定 相 同 时 发 生 相 互 作 用, 因 而 对 分 离 有 重 大 影 响 Mobile phase strength( 流 动 相 强 度 ): 参 见 溶 剂 强 度 Mobile phase velocity (u M)( 流 动 相 流 速,u M ): 流 动 相 流 经 填 料 柱 床 的 速 度 ;u M = L/t M, 其 中 L 为 柱 长,t M 是 滞 留 时 间, 也 可 参 见 调 整 保 留 体 积 滞 留 体 积 和 死 体 积 Mobility( 淌 度 ): 参 见 电 泳 淌 度 Modifier( 改 性 剂 ): 改 变 流 动 相 性 质 的 添 加 剂 例 如, 甲 醇 是 反 相 中 的 强 溶 剂, 有 时 称 为 改 性 剂 ( 水 是 弱 溶 剂 ); 有 时 其 它 添 加 剂 竞 争 性 碱, 如, 三 乙 胺, 或 离 子 对 试 剂 也 称 为 改 性 剂, 但 称 其 为 添 加 剂 才 更 贴 切 也 可 参 见 添 加 剂 Molecular diffusion term (B term)( 分 子 扩 散 项,B 项 ): 指 van Deemter 方 程 中 的 B 项 ( 第 二 项 ) 也 称 纵 向 扩 散 项 或 轴 向 扩 散 项 它 只 在 流 速 非 常 低 ( 在 最 小 塔 板 高 度 以 下 ) 时 起 主 要 作 用, 此 时 各 溶 质 可 能 在 色 谱 柱 上 存 在 纵 向 ( 纵 深 ) 扩 散 对 B 项 的 影 响 来 自 流 动 相 中 的 扩 散, 为 2gD M, 其 中 g 为 障 碍 因 子 ( 一 般 为 ),D M 是 扩 散 系 数 也 可 参 见 van Deemter 方 程 Molecular weight distribution( 分 子 量 分 布 ): 聚 合 物 样 品 分 子 的 分 子 量 分 布 分 布 可 以 定 义 为 重 量 平 均 值 和 数 量 平 均 值 分 子 印 迹 相 : 参 见 印 迹 固 定 相 Monodisperse particles( 单 分 散 填 料 颗 粒 ): 粒 径 分 布 窄 的 填 料 颗 粒 也 可 参 见 多 分 散 颗 粒 Monomeric phase( 单 体 固 定 相 ): 指 单 个 分 子 键 合 到 支 持 剂 上 的 键 合 相 对 于 硅 胶 来 说, 单 体 固 定 相 是 由 一 氯 烷 烃 芳 烃 或 烷 氧 基 硅 烷 制 备 而 成 的 聚 合 物 固 定 相 通 常 用 二 或 三 氯 硅 烷 或 烷 氧 基 硅 烷 反 应 物, 在 水 存 在 下 制 备 而 成 的 Moving zone( 移 动 区 带 ): 与 流 动 相 不 同, 移 动 区 带 指 色 谱 柱 中 间 隙 部 分 的 流 动 相 部 分 也 可 参 见 固 定 相 156

159 Multidimensional chromatography( 多 维 色 谱 ): 使 用 两 根 或 更 多 色 谱 柱 或 使 用 不 同 的 色 谱 技 术, 以 获 得 更 好 的 分 离 用 于 样 品 净 化 提 高 分 离 度 提 高 通 量 和 增 加 峰 容 量 也 可 以 在 馏 分 收 集, 重 新 进 样 到 第 二 根 色 谱 柱 上 离 线 使 用, 或 者 通 过 切 换 阀 在 线 使 用 也 称 为 双 柱 色 谱 柱 切 换 多 柱 色 谱 和 boxcar 色 谱 N n: 见 峰 容 量 N: 理 论 塔 板 数 ;N = 16(t R/w b) 2, 其 中 t R 为 保 留 时 间, w b 是 峰 底 宽 是 说 明 色 谱 柱 柱 效 的 参 数 有 时 按 下 式 计 算,N = 5.54(t R/w h) 2, 其 中 w h ( 或 w 1 2) 为 半 峰 高 处 的 峰 宽 也 可 参 见 柱 效 和 理 论 塔 板 n: 见 折 合 流 速 NanoLC( 纳 升 LC): 采 用 内 径 小 于 100 µm 的 色 谱 柱 进 行 的 液 相 色 谱 分 离 ; 一 般 需 要 特 殊 仪 器 ; 常 用 于 样 品 有 限, 需 要 高 灵 敏 度 的 蛋 白 质 组 学 研 究 Narrow-bore column( 窄 径 柱 ):HPLC 中 使 用 的 内 径 小 于 2 mm 的 色 谱 柱 也 称 微 径 N eff : 参 见 有 效 理 论 塔 板 Noise( 噪 声 ): 参 见 基 线 噪 声 Non-aqueous reversed phase chromatography( 非 水 相 反 相 色 谱 ): 指 在 反 相 填 料 上 进 行 的 不 用 水 作 为 洗 脱 液 成 分 的 反 相 色 谱 在 化 合 物 非 极 性 很 强, 用 100% 的 甲 醇 或 乙 腈 不 能 或 很 难 将 其 洗 脱 下 来 时 使 用 该 方 法 在 这 种 情 况 下, 溶 剂 A 应 为 乙 腈, 溶 剂 B 为 更 强 的 溶 剂, 如, 四 氢 呋 喃 反 相 规 律 适 用 于 非 水 相 反 相 色 谱, 即, 分 析 物 非 极 性 越 强, 其 保 留 就 越 强 Non-Polar( 非 极 性 ): 非 极 性 分 子 是 电 子 分 布 更 为 对 称, 相 反 方 向 没 有 大 量 电 荷 的 分 子 所 有 电 荷 都 互 相 抵 消 非 极 性 化 合 物 溶 剂 或 固 定 相 易 溶 于 有 机 溶 剂, 如 正 己 烷, 而 不 易 溶 于 水 Nonporous packing( 非 多 孔 填 料 ): 填 料 颗 粒 类 似 于 多 孔 层 实 心, 但 粒 径 处 于 亚 5 µm 范 围 ; 粒 径 经 常 在 亚 2 µm d p 范 围 用 于 短 柱 的 高 速 分 离 常 用 的 色 谱 柱 缩 写 :NPS, 指 非 多 孔 硅 胶 ;NPR, 指 非 多 孔 树 脂 ;NPZ, 指 非 多 孔 氧 化 锆 Nonporous particle( 非 多 孔 颗 粒 ): 指 作 为 多 孔 涂 层 或 键 合 相 支 持 剂 的 固 体 颗 粒 ; 薄 壳 型 填 料 颗 粒 是 大 粒 径 非 多 孔 填 料 颗 粒 (~40 µm) 粒 径 小 于 3 µm 的 非 多 孔 硅 胶 和 树 脂 一 般 是 指 带 薄 多 孔 涂 层 的 硅 胶 键 合 硅 胶 或 聚 合 物 固 定 相 微 球 Normal phase chromatography( 正 相 色 谱 ): 一 种 固 定 相 极 性 大 于 流 动 相 的 色 谱 模 式 典 型 的 正 相 系 统 是 在 硅 胶 或 氧 化 铝 上 进 行 的 吸 附 色 谱, 用 弱 极 性 的 洗 脱 液, 如 己 烷 - 二 乙 基 乙 醚 作 为 流 动 相 也 指 极 性 键 合 相, 如 氰 基 和 氧 化 铝 O Octadecylsilane( 十 八 烷 基 硅 烷 ):HPLC 中 使 用 最 多 的 反 相 固 定 相 十 八 烷 基 硅 烷 固 定 相 键 合 到 硅 胶 或 聚 合 物 填 料 上 可 以 用 单 体 键 合, 也 可 以 聚 合 键 合 柱 名 称 缩 写 为 C18 和 ODS Octylsilane( 辛 基 硅 烷 ): 反 相 色 谱 中 的 常 用 固 定 相 与 更 加 常 用 的 C18 相 比, 保 留 稍 弱 可 以 用 单 体 键 合, 也 可 以 聚 合 键 合 柱 名 称 缩 写 为 C8 ODS: 见 十 八 烷 基 硅 烷 On-column detection( 柱 上 检 测 ): 色 谱 柱 本 身 作 为 HPLC 或 CE-CEC 的 流 通 池 通 常, 该 术 语 在 石 英 毛 细 管 应 用 中 使 用 剥 离 聚 酰 亚 胺 外 层, 光 束 直 接 透 过 毛 细 管, 测 量 设 备, 如 光 电 倍 增 管 置 于 该 毛 细 管 的 另 一 侧 Online preconcentration( 在 线 预 浓 缩 ): 将 预 柱 置 于 分 离 柱 之 前, 在 分 离 前 浓 缩 分 析 物 可 用 不 同 机 制 疏 水 相 互 作 用 吸 附 或 酶 反 应 保 留 分 析 物 然 后 浓 缩 的 分 析 物 通 过 置 换 ( 如, 溶 剂 洗 脱 或 ph 变 化 ) 转 移 到 分 离 柱 上 Open tubular columns( 开 管 柱 ): 这 是 一 种 目 前 正 在 研 究 的 用 于 HPLC 超 临 界 流 体 色 谱 (SFC) 和 CE 的 窄 内 径 色 谱 柱 ( 小 于 100 µm) 固 定 相 可 以 键 合 到 小 柱 的 内 壁 上 最 常 用 的 柱 材 料 是 石 英 管 在 常 规 HPLC 或 SFC 中 很 少 使 用, 但 在 CE 中 常 用 Optically active resin( 光 学 活 性 树 脂 ): 离 子 交 换 树 脂 中 结 合 光 学 活 性 基 团, 用 于 分 离 光 学 异 构 体 很 少 有 用 于 HPLC 应 用 的 该 种 商 业 树 脂 出 售 157

160 Organic modifier( 有 机 改 性 剂 ): 在 反 相 HPLC 中, 加 入 到 水 相 流 动 相 中 以 获 得 分 离 的 与 水 混 溶 有 机 溶 剂 常 用 的 有 机 改 性 剂 有 乙 腈 甲 醇 异 丙 醇 和 四 氢 呋 喃 Orthogonality( 正 交 性 ): 在 二 维 分 离 中, 可 以 对 二 维 中 的 洗 脱 时 间 分 别 进 行 统 计 学 处 理 理 想 情 况 下, 二 维 应 具 有 完 全 不 同 的 保 留 机 理 ( 如, 反 相 和 正 相, 离 子 交 换 和 反 相 ) Outlet Check Valve( 出 口 单 向 阀 ): 见 单 向 阀 Overload( 过 载 ): 在 制 备 色 谱 中, 过 载 定 义 为 进 样 到 色 谱 上 的 最 大 样 品 量, 如 果 再 继 续 增 加 上 样 量, 将 开 始 影 响 其 柱 效 和 分 离 度 也 可 参 见 样 品 容 量 P Dp: 见 柱 前 压 Pa: 见 帕 斯 卡 Packing( 填 料 ):HPLC 柱 中 使 用 的 吸 附 剂 凝 胶 或 固 体 支 持 剂 最 新 的 分 析 型 HPLC 填 料 平 均 直 径 小 于 10 µm, 一 般 常 用 5 µm Paired-ion chromatography( 配 对 离 子 色 谱 ): 同 离 子 对 色 谱 Particle size (d p)( 粒 径,d p ): LC 柱 中 填 料 的 平 均 粒 径 填 料 都 不 是 单 分 散 的, 因 此 一 根 5 µm d p 柱 应 填 充 具 有 一 定 粒 径 分 布 的 填 料 颗 粒 也 可 参 见 单 分 散 颗 粒 粒 径 分 布 和 多 分 散 颗 粒 Particle size distribution( 粒 径 分 布 ): 用 于 说 明 填 充 LC 柱 颗 粒 的 分 布 的 参 数 在 HPLC 中, 窄 粒 径 分 布 较 为 理 想 如 果 平 均 d p 为 10 µm, 粒 径 度 分 布 为 d p ± 10%, 说 明 90% 的 颗 粒 都 分 布 在 9 到 11 µm 的 范 围 内 Particulates( 微 粒 ): 通 常 指 流 动 相 中 的 小 颗 粒, 可 能 因 为 堵 塞 筛 板 引 起 反 压 问 题 ; 也 可 以 指 HPLC 柱 中 填 充 的 小 粒 径 填 料 Partition chromatography( 分 配 色 谱 ): 一 种 液 相 附 着 在 固 体 支 持 剂 上 ( 固 定 相 ), 而 另 一 种 液 相 自 由 流 过 该 色 谱 柱 ( 流 动 相 ) 的 分 离 过 程 溶 质 基 于 在 两 相 中 的 分 配 系 数 在 两 相 间 自 由 分 配 液 - 液 色 谱 就 是 一 个 例 子 ; 现 代 键 合 相 色 谱 也 可 以 看 作 是 分 配 色 谱 的 一 种 形 式, 其 中 液 相 真 正 键 合 在 固 体 支 持 剂 上 而 分 配 色 谱 意 味 着 溶 质 至 少 部 分 地 嵌 入 固 定 相 内, 或 浸 渍 涂 层 或 键 合 到 该 物 质 上 与 之 相 反 的 是 吸 附 过 程, 在 此 过 程 中 溶 质 不 渗 入 保 留 表 面 或 两 相 界 面 Partition coefficient (K)( 分 配 系 数,K): 溶 质 在 固 定 相 的 平 衡 浓 度 与 流 动 相 中 的 平 衡 浓 度 之 比 也 称 为 分 布 系 数,K D, 和 分 布 常 数 (K c) Pascal (Pa)( 帕 斯 卡,Pa): 压 力 单 位,1 MPa 约 等 于 10 bar (atm) 或 150 psi PCDL: 个 人 化 合 物 数 据 库 与 谱 库 Peak( 峰 ): 分 析 化 合 物 从 色 谱 柱 洗 脱 后 经 过 检 测 器 绘 制 的 曲 线 ; 通 常 用 记 录 仪 或 打 印 机 按 检 测 器 的 电 子 响 应 绘 出 可 见 输 出 信 号 Peak area( 峰 面 积 ): 色 谱 峰 下 的 测 量 面 积 ; 一 般 用 积 分 仪 或 数 据 系 统 测 量 ; 峰 面 积 与 色 谱 峰 中 洗 脱 物 质 的 量 有 关 Peak capacity (n)( 峰 容 量,n): 一 张 色 谱 图 从 滞 留 时 间 到 保 留 上 限 之 间 可 以 容 纳 分 离 良 好 的 色 谱 峰 的 数 量 (n ) 当 R = 1 时,n 大 约 为 [(N)1/2 ln(1 + k n)], 其 中 R 是 分 离 度,N 是 理 论 塔 板 数,k n 为 峰 n 的 保 留 因 子 Peak dispersion( 峰 分 散 度 ): 见 谱 带 展 宽 Peak doublet( 双 峰 ): 通 常 是 由 色 谱 柱 空 腔 造 成 的 分 裂 峰 也 可 为 距 离 很 近 的 相 邻 洗 脱 化 合 物 Peak height( 峰 高 ): 色 谱 峰 从 基 线 到 峰 顶 点 的 测 量 高 度 ; 峰 高 与 色 谱 峰 内 洗 脱 物 的 量 有 关 Peak shape( 峰 形 ): 对 色 谱 峰 形 状 的 描 述 理 论 上 认 为 是 高 斯 峰 形 ( 完 全 对 称 ) 峰 不 对 称 因 子 用 比 率 说 明 峰 形 见 143 和 144 页 图 79 和 80 也 可 参 见 不 对 称 性 Peak tracking( 峰 追 踪 ): 一 种 比 对 方 法 开 发 过 程 中 用 不 同 实 验 获 得 的 含 相 同 化 合 物 色 谱 峰 的 方 法 基 于 每 个 纯 分 析 物 的 检 测 参 数 二 极 管 阵 列 检 测 器 和 质 谱 具 有 特 异 性, 因 而 是 峰 追 踪 所 用 的 最 好 检 测 器 158

161 Peak variance (s 2 )( 峰 畸 变 性,s 2 ): 保 留 时 间 的 第 二 中 心 力 矩 对 于 高 斯 峰, 畸 变 性 是 控 制 峰 宽 的 基 本 参 数 见 144 页 图 80 也 可 参 见 高 斯 峰 Peak volume( 峰 体 积 ): 当 色 谱 峰 通 过 检 测 器 时 的 总 体 积 ;V R = F x W b 见 144 页 图 80 Peak width (W b)( 峰 宽,W b ): 同 带 宽 见 144 页 图 80 Pellicular packing( 薄 壳 型 填 料 ): 见 多 孔 层 微 球 Percent B solvent (% B solvent)( 溶 剂 B 的 百 分 比,%B 溶 剂 ): 指 二 元 溶 剂 混 合 物 中 的 较 强 溶 剂 % A 为 较 弱 溶 剂 Perfusion chromatography( 灌 流 色 谱 ): 指 用 很 大 孔 径 ( Å) 颗 粒, 称 为 通 孔 ( 巨 孔 ), 进 行 的 色 谱 分 离 洗 脱 液 在 大 孔 之 间 流 动, 经 过 颗 粒 的 Å 相 贯 通 孔 ( 称 为 扩 散 孔 ) 最 适 合 大 分 子 的 制 备 分 离 Permeability (B o)( 渗 透 性,B o ): 也 称 柱 渗 透 性 和 特 异 性 渗 透 性 是 表 示 填 充 柱 对 流 动 相 液 流 阻 抗 的 参 数 对 填 充 柱 来 说,B o d 2 p e 3 /[180(1-e) 2 ] 5 d 2 p /1000 渗 透 性 高 的 色 谱 柱 产 生 低 压 降 Permeation( 渗 透 ): 指 SEC 的 分 离 过 程 溶 质 随 流 动 相 进 入 填 料 孔 径 的 过 程 Phase ratio (b)( 相 比,b): 色 谱 柱 中 固 定 相 与 流 动 相 的 相 对 量 在 分 配 色 谱 中,b = V S/V M, 其 中 V S 和 V M 分 别 为 色 谱 柱 中 固 定 相 和 流 动 相 的 体 积 保 留 因 子 是 相 比 和 分 配 系 数 的 产 物 Phenyl phase( 苯 基 键 合 相 ): 通 过 二 甲 苯 基 氯 或 烷 氧 基 硅 烷 与 硅 胶 反 应 制 备 的 常 用 非 极 性 键 合 相 对 含 芳 香 基 团 的 化 合 物 具 有 亲 和 性, 提 供 与 烷 基 键 合 相 不 同 的 选 择 性 Pirkle column(pirkle 柱 ): 基 于 3,5- 二 硝 基 苯 甲 酰 苯 基 甘 氨 酸 硅 胶 的 手 性 刷 型 固 定 相, 用 于 分 离 各 种 对 映 异 构 体 用 其 开 发 者, 伊 利 诺 斯 大 学 的 William Pirkle 的 名 字 命 名 Planar chromatography( 平 板 色 谱 ): 一 种 固 定 相 以 平 面 存 在 或 涂 布 在 平 面 上 的 分 离 技 术 (IUPAC) 典 型 形 式 有 纸 层 析 色 谱 和 薄 层 层 析 色 谱 Plate height (H)( 塔 板 高 度,H): 见 HETP Plate or plate number( 塔 板 或 塔 板 数 ): 指 填 充 柱 中 的 理 论 塔 板 数 (IUPAC) 也 可 参 见 理 论 塔 板 数 Polar( 极 性 ): 化 学 极 性 是 指 一 个 分 子 的 正 电 荷 端 与 另 一 个 分 子 或 同 一 分 子 的 负 电 荷 端 之 间 的 偶 极 - 偶 极 相 互 作 用 分 子 的 极 性 取 决 于 化 合 物 中 原 子 间 负 电 性 的 差 异, 以 及 该 化 合 物 结 构 的 不 对 称 性 例 如, 水 是 极 性 的, 因 为 其 电 子 分 布 不 均 匀 但 一 般 认 为 甲 烷 是 非 极 性 的, 因 为 其 碳 原 子 均 衡 分 担 了 氢 原 子 Polyacrylamide gel( 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 ): 水 相 SEC 中 使 用 的 中 性 亲 水 聚 合 物 型 填 料 通 过 丙 烯 酰 胺 与 N,N'- 亚 甲 基 双 丙 烯 酰 胺 共 聚 制 得 Polydisperse particles( 多 分 散 颗 粒 ): 具 有 各 种 内 径 的 填 料 颗 粒 (> 10%) Polyethyleneimine( 聚 乙 烯 亚 胺 ): 一 种 用 于 涂 覆 或 键 合 到 硅 胶 或 聚 合 物 填 料 上 的 阴 离 子 型 固 定 相 常 用 于 分 离 蛋 白 质 和 多 肽 Polymeric packings( 聚 合 物 型 填 料 ): 以 聚 合 物 为 基 质 的 填 料, 通 常 为 球 形 微 粒 LC 中 常 用 的 聚 合 物 为 聚 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 (PS-DVB) 聚 二 乙 烯 基 苯 聚 丙 烯 酰 胺 聚 丙 烯 酸 甲 酯 聚 环 氧 乙 烯 葡 聚 糖 和 多 糖 Polymeric phase( 聚 合 物 固 定 相 ): 指 将 聚 合 物 材 料 键 合 到 硅 胶 颗 粒 上 的 化 学 键 合 相 Polystyrene-divinylbenzene resin (PS-DVB)( 聚 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 树 脂,PS-DVB): 离 子 交 换 色 谱 中 最 常 用 的 基 础 聚 合 物 离 子 型 基 团 可 参 与 各 种 化 学 反 应 中 性 PS-DVB 微 粒 用 于 反 相 色 谱 通 过 改 变 与 DVB 的 交 联 程 度 可 改 变 孔 隙 率 和 机 械 稳 定 性 Poppe Plot(Poppe 曲 线 ): 以 荷 兰 阿 姆 斯 特 丹 大 学 Hans Poppe [J. Chromatogr. A 778, 3 (1997)] 教 授 的 名 字 命 名 的 一 种 动 力 学 曲 线, 其 中, 以 理 论 塔 板 数 (N) 为 变 量 描 述 塔 板 时 间 [log(t0/n)], 以 评 估 柱 效 作 为 以 粒 度 柱 压 降 等 为 参 数 的 函 数 时 的 极 限 Pore diameter( 孔 径 ): 同 平 均 孔 径 Pore size( 孔 隙 大 小 ): 多 孔 填 料 上 一 个 孔 隙 的 平 均 尺 寸 其 数 值 用 埃 或 纳 米 表 示 孔 隙 大 小 决 定 了 分 子 是 否 能 够 在 填 料 内 外 扩 散 也 可 参 见 平 均 孔 径 Plate number( 塔 板 数 ): 见 色 谱 柱 塔 板 数 159

162 Pore volume( 孔 隙 体 积 ): 多 孔 填 料 中 孔 隙 体 积 的 总 和, 一 般 用 毫 升 / 克 表 示 更 恰 当 的 叫 法 应 该 是 特 异 性 孔 隙 体 积 用 氮 吸 附 BET 法 或 汞 压 入 孔 隙 法 ( 在 高 压 下 将 汞 泵 入 孔 隙 内 ) 测 定 Porosity( 孔 隙 率 ): 多 孔 物 质 颗 粒 孔 隙 的 体 积 占 该 颗 粒 总 体 积 的 比 率 孔 隙 体 积 ( 以 毫 升 / 克 表 示 ) 是 说 明 孔 隙 率 的 一 个 方 面 Porous-layer bead( 多 孔 层 微 球 ): 用 固 定 相 薄 层 涂 渍 的 小 玻 璃 微 球 薄 层 可 以 是 吸 附 剂 树 脂 或 化 学 键 合 在 吸 附 剂 上 的 固 定 相 该 填 料 是 首 先 应 用 在 HPLC 中 的 一 种 其 粒 度 为 µm, 比 现 在 用 的 填 料 微 粒 大, 但 容 易 填 充, 并 能 提 供 满 意 的 柱 效 也 称 为 控 制 表 面 孔 隙 率 的 支 持 剂 和 薄 壳 材 料 Porous particle( 多 孔 颗 粒 ): 指 具 有 一 定 直 径 和 体 积, 互 连 孔 隙 的 柱 填 料 颗 粒 在 HPLC 应 用 中, 分 析 人 员 一 般 使 用 直 径 小 于 10 mm 的 多 孔 颗 粒 较 大 颗 粒 成 本 较 低, 并 具 有 较 高 的 柱 渗 透 性, 因 而 用 于 制 备 级 色 谱 分 离 Porous polymer( 多 孔 聚 合 物 ): 一 种 以 有 机 聚 合 物 或 共 聚 物 为 基 质 的 填 料, 一 般 为 球 形 最 常 见 的 例 子 包 括 PS-DVB 聚 丙 烯 酸 酯 葡 聚 糖 聚 丙 烯 酰 胺 和 聚 丁 二 烯 Precolumn( 预 柱 ): 置 于 泵 和 进 样 器 之 间 的 小 柱 其 作 用 是 去 除 流 动 相 中 可 能 存 在 的 颗 粒, 用 固 定 相 或 溶 解 性 物 质 使 流 动 相 预 饱 和, 以 防 止 分 析 柱 中 的 固 定 相 损 失 或 溶 解, 导 致 目 标 物 的 化 学 吸 附, 从 而 干 扰 分 离 其 体 积 基 本 不 影 响 等 度 洗 脱, 但 对 梯 度 洗 脱 的 梯 度 有 延 迟 作 用 Precolumn Filter( 预 柱 过 滤 器 ): 在 进 样 器 和 色 谱 柱 ( 或 保 护 柱 ) 之 间 使 用 的 过 滤 器, 以 防 止 不 想 要 的 样 品 组 分 进 入 色 谱 柱 ; 有 时 也 称 为 在 线 过 滤 器, 偶 尔 称 为 进 样 口 过 滤 器 Preconcentration( 预 浓 缩 ): 参 见 痕 量 富 集 Preparative chromatography( 制 备 色 谱 ): 指 使 用 LC 进 行 分 离, 得 到 足 以 进 行 其 它 实 验 或 满 足 其 他 功 能 需 求 的 量 的 过 程 在 制 药 或 生 物 技 术 纯 化 中, 使 用 内 径 几 英 尺 的 大 柱 进 行 几 克 级 物 质 的 分 离 要 分 离 几 毫 克 宝 贵 的 天 然 产 物 时, 可 以 使 用 4.6 mm 内 径 的 分 析 柱 根 据 色 谱 工 作 者 的 目 的 不 同, 两 种 规 格 的 色 谱 柱 都 可 以 作 为 制 备 色 谱 的 选 择 Pressure (pressure drop) (Dp)( 压 力 ( 压 降 ),Dp): 见 柱 前 压 Pressure injection( 压 力 进 样 ):CE 中 的 压 力 驱 动 进 样 使 用 压 力 或 真 空 将 纳 升 级 体 积 的 样 品 注 入 毛 细 管 柱 最 适 用 于 内 径 小 于 10 µm 的 窄 径 毛 细 管 流 体 静 力 学 进 样 的 一 种 形 式 Process-scale chromatography( 生 产 规 模 色 谱 ): 指 在 实 验 室 外 使 用 的 工 业 规 模 的 LC 与 实 验 室 规 模 的 HPLC 相 比, 一 般 需 要 特 别 设 计 的 色 谱 柱 ( 内 径 通 常 > 5 cm), 可 回 收 的 溶 剂 低 成 本 填 料 ( 较 大 的 不 规 则 形 状 填 料 颗 粒 ) 和 过 载 操 作 条 件 Programmed-temperature chromatography( 程 序 温 控 色 谱 ): 在 色 谱 运 行 中 改 变 温 度 在 LC 中 很 少 使 用 PS-DVB: 参 见 聚 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 树 脂 Pulsating flow( 脉 动 流 ): 往 复 泵 产 生 的 液 流 通 常 情 况 下, 用 脉 冲 阻 尼 器 电 子 压 力 反 馈 环 路 或 主 动 阻 尼 器 泵 头 抑 制 脉 冲 电 化 学 示 差 折 光 等 检 测 器 受 流 量 脉 动 的 影 响 很 大 Q Quaternary methyl amine( 四 甲 基 铵 ): 树 脂 填 料 中 常 用 的 强 阴 离 子 交 换 官 能 团 通 常 使 用 氯 化 物 形 式 Quaternary mobile phase( 四 元 流 动 相 ): 包 含 四 种 溶 剂 或 缓 冲 液 的 流 动 相 Quaternary-solvent mobile phase( 四 元 溶 剂 流 动 相 ): 流 动 相 包 括 四 种 分 开 的 溶 剂, 可 以 对 流 动 相 组 成 进 行 微 调 ; 这 种 流 动 相 最 常 用 低 压 四 元 泵 输 送 Q-TOF: 由 四 极 杆 和 飞 行 时 间 质 量 分 析 器 组 成 的 混 合 型 质 谱 仪 QTOF 质 谱 仪 是 一 种 高 质 量 准 确 度 高 分 辨 率 的 仪 器 R r: 参 见 相 对 保 留 Radial compression( 径 向 压 缩 ): 对 弹 性 壁 色 谱 柱 实 施 径 向 压 缩, 以 降 低 柱 壁 效 应 160

163 Radial diffusion-dispersion( 径 向 扩 散 - 分 散 ):LC 柱 径 向 的 扩 散 - 分 散 如 果 样 品 恰 好 进 样 到 色 谱 柱 的 中 心, 它 将 不 仅 沿 纵 向 移 动 通 过 色 谱 柱, 也 将 沿 径 向 展 开, 使 溶 质 达 到 柱 壁 区 域, 洗 脱 液 的 流 速 与 柱 中 心 处 不 同 Re: 参 见 雷 诺 数 Recovery( 回 收 率 ): 从 色 谱 柱 洗 脱 出 的 溶 质 或 样 品 量 与 进 样 量 的 比 值 高 回 收 率 对 良 好 定 量 制 备 分 离 ( 尤 其 是 生 物 大 分 子 ), 以 及 良 好 峰 形 和 分 离 度 都 非 常 重 要 回 收 率 不 高 的 原 因 可 能 是 溶 质 与 填 料 柱 筛 板 和 柱 管 上 的 活 性 位 点 发 生 了 相 互 作 用 化 合 物 在 分 离 过 程 中 发 生 分 解 也 可 能 影 响 回 收 率 Recycling chromatography( 循 环 色 谱 ): 色 谱 柱 洗 脱 液 再 循 环 到 柱 头 以 延 长 柱 长 可 以 让 洗 脱 液 通 过 泵 头 在 同 一 根 色 谱 柱 上 进 行 循 环 也 可 以 使 用 两 根 色 谱 柱, 用 切 换 阀 连 接, 一 根 柱 子 的 洗 脱 液 直 接 进 入 另 一 根 柱 子 的 柱 头 HPLC 中 很 少 使 用, 只 在 排 阻 色 谱 中 应 用 Reduced plate height (h)( 折 合 塔 板 高 度,h): 用 于 比 较 不 同 色 谱 柱 的 柱 效 ;h = H/d p, 其 中 H 为 理 论 塔 板 数 的 塔 板 高 度,d p 是 粒 径 最 佳 流 速 下 h 为 2 或 更 小, 表 明 HPLC 柱 填 充 良 好 Reduced velocity (v)( 折 合 流 速,v): 与 折 合 塔 板 高 度 一 起 用 于 比 较 不 同 的 填 充 色 谱 柱 与 溶 质 在 流 动 相 中 的 扩 散 系 数 (D M) 和 柱 填 料 的 粒 径 (d p) 有 关,v = ud p/d M, 其 中 u 为 平 均 间 隙 流 动 相 线 速 度 也 可 参 见 Knox 方 程 Refractive index peak( 折 射 峰 ): 常 在 死 体 积 附 近 出 现 的 假 峰, 由 吸 收 对 折 射 率 的 敏 感 性 和 其 它 检 测 器 引 起 也 可 参 见 空 白 峰 Regeneration( 再 生 ): 在 梯 度 洗 脱 后, 使 色 谱 柱 中 的 填 料 恢 复 到 初 始 状 态 流 动 相 以 阶 梯 或 连 续 梯 度 流 经 色 谱 柱 恢 复 固 定 相 或 充 分 溶 剂 化 使 其 回 到 初 始 状 态 在 离 子 交 换 中, 再 生 包 含 用 占 据 交 换 位 点 的 原 始 离 子 置 换 在 交 换 过 程 中 被 取 代 的 离 子 再 生 也 可 以 指 使 色 谱 柱 恢 复 到 初 始 状 态 ; 例 如 用 强 溶 剂 去 除 杂 质 Relative retention (r)( 相 对 保 留,r): 相 对 于 标 样 的 保 留 ;r = t R '/t R(st)' = k/k st, 其 中 t R' 是 目 标 组 分 的 调 整 保 留 时 间,t R(st)' 是 标 样 的 调 整 保 留 时 间,k 和 k st 是 相 应 的 保 留 因 子 对 于 两 个 相 邻 的 色 谱 峰, 相 对 保 留 也 称 分 离 因 子 ( 以 前 叫 做 选 择 性 或 选 择 性 因 子 ); 计 算 公 式 为 a = t R2'/t R1' = k 2/k 1, 其 中 t R2' 和 t R1' 分 别 为 峰 2 和 峰 1 的 调 整 保 留 时 间, k 2 和 k 1 是 相 应 的 保 留 因 子 Residual silanols( 残 留 硅 醇 基 ): 在 填 料 表 面 进 行 化 学 键 合 后 填 料 表 面 残 留 的 硅 醇 基 (-Si-OH) 这 些 硅 醇 基 一 般 存 在 于 小 孔 隙 内, 不 能 参 与 与 大 分 子 有 机 硅 烷 ( 如, 十 八 烷 基 二 甲 基 氯 硅 烷 ) 的 反 应, 但 小 分 子 极 性 化 合 物 可 以 进 入 去 除 它 们 的 方 法 通 常 为 用 小 分 子 有 机 硅 烷 ( 如 三 甲 基 氯 硅 烷 ) 进 行 封 端 也 可 参 见 封 端 Resin( 树 脂 ): 离 子 交 换 分 离 使 用 的 固 体 聚 合 物 填 料 最 常 用 的 树 脂 是 粒 径 小 于 10 µm 的 PS-DVB 共 聚 物 离 子 型 官 能 团 结 合 在 树 脂 上 Resolution (R s)( 分 离 度,R s ): 色 谱 柱 分 离 色 谱 峰 的 能 力 R s = (t R2 - t R1 )/[(w b1 + w b2 )/2], 其 中 t R2 和 t R1 是 两 个 色 谱 峰 的 保 留 时 间,w b 是 两 峰 峰 底 宽 分 离 度 通 常 表 示 两 峰 分 离 程 度 分 离 度 为 1 时, 认 为 是 最 小 的 可 测 量 分 离, 可 以 进 行 良 好 定 量 分 离 度 为 0.6 时, 可 以 分 辨 两 个 等 高 的 色 谱 峰 分 离 度 为 1.5 时, 认 为 两 个 等 高 峰 已 达 到 足 够 的 基 线 分 离 分 离 度 为 1.7 或 以 上, 一 般 为 耐 用 方 法 的 理 想 值 参 见 144 页 图 80 Resolution equation( 分 离 度 方 程 ): 也 称 一 般 分 离 度 方 程 和 Purnell 方 程 ;R = 4N 1/2 [(α-1)/α][k/(1+k)], 其 中 N 是 柱 效,a 是 分 离 因 子,k 是 保 留 因 子 Retention factor (k)( 保 留 因 子,k): 样 品 组 分 滞 留 在 固 定 相 中 的 时 间 与 其 在 流 动 相 中 的 时 间 之 比 用 调 整 保 留 时 间 除 以 滞 留 时 间 计 算 ;k = (t R- t M)/t M, 其 中 t R 是 样 品 峰 的 保 留 时 间,t M 是 不 保 留 峰 的 保 留 时 间 ( 以 前 使 用 的 是 k', 称 为 容 量 因 子 或 容 量 比 ) Retention time (t R)( 保 留 时 间,t R ): 也 称 总 保 留 时 间 从 进 样 开 始 到 出 现 某 组 分 色 谱 峰 的 最 高 点 所 经 历 的 时 间 总 保 留 体 积 (V R) 用 保 留 时 间 乘 以 流 速 测 得 调 整 保 留 时 间 (t R' ) 则 需 减 去 色 谱 柱 空 隙 体 积 ;t R' = t R t M 一 般 测 定 从 进 样 点 到 峰 顶 点 的 距 离, 但 应 测 定 对 称 峰 的 重 心 161

164 Retention volume (V R)( 保 留 体 积,V R ): 从 色 谱 柱 中 洗 脱 一 种 物 质 需 要 的 流 动 相 体 积 ;V R = Ft R 或 V R = V M + K DV S, 其 中 V M 是 空 隙 体 积,K D 是 分 布 系 数,V S 是 固 定 相 体 积 也 可 参 见 保 留 时 间 Reversed phase chromatography( 反 相 色 谱 ): 最 常 用 的 HPLC 模 式 使 用 低 极 性 填 料, 如 十 八 烷 基 或 辛 基 硅 烷 固 定 相 键 合 到 硅 胶 或 中 性 聚 合 物 微 球 上 流 动 相 一 般 为 水 或 与 水 混 溶 的 有 机 溶 剂, 如 甲 醇 或 乙 腈 按 照 溶 质 的 疏 水 性 或 亲 油 性 进 行 洗 脱 疏 水 性 越 强, 保 留 就 越 强 分 析 物 的 水 溶 性 越 大, 保 留 就 越 弱 该 技 术 有 许 多 可 变 因 素, 各 种 流 动 相 添 加 剂 可 造 成 不 同 的 选 择 性 例 如, 分 析 阴 离 子 时 加 入 缓 冲 液 和 四 烷 基 铵 盐, 形 成 离 子 对 进 行 分 离, 与 离 子 交 换 色 谱 类 似 90% 以 上 的 HPLC 分 析 人 员 使 用 反 相 色 谱 Reynolds number (Re)( 雷 诺 数,Re): 流 体 粘 滞 力 与 惯 性 力 的 比 值 在 平 滑 的 无 填 充 管 内 测 量 流 量 ;Re = ud/(h/r), 其 中 u 是 平 均 流 速 ( 用 厘 米 / 秒 表 示 ),d 是 管 径,h 是 粘 度 ( 用 厘 米 秒 / 克 表 示 ),r 是 密 度 ( 用 克 / 立 方 厘 米 表 示 ) 低 Re 时, 粘 滞 摩 擦 主 要 控 制 着 流 体 的 运 动, 使 其 缓 慢 而 平 稳 在 空 管 中,Re 超 过 4200 时, 流 体 完 全 呈 湍 流 状 态 在 填 充 柱 床 上,u 用 平 均 间 隙 流 速 取 代,d 为 平 均 粒 度 在 填 充 柱 床 内 Re 值 大 于 10 时 流 体 为 湍 流, 但 不 是 全 湍 流 状 态, 直 到 Re 超 过 R s : 参 见 分 离 度 S S: 反 相 色 谱 中 的 溶 剂 强 度 参 数 以 log 10 k 对 有 机 改 性 剂 体 积 作 图, 曲 线 的 斜 率 与 溶 质 相 关 S 随 改 性 剂 类 型 固 定 相 和 温 度 而 变 化 SAX: 见 强 阴 离 子 交 换 剂 SCX: 见 强 阳 离 子 交 换 剂 s 2 : 见 峰 畸 变 性 Salting-out effect( 盐 析 作 用 ): 在 流 动 相 中 使 用 高 浓 度 盐 缓 冲 液 时, 导 致 低 极 性 分 析 物 在 水 中 溶 解 性 降 低, 从 而 在 溶 液 中 沉 淀 或 析 出 最 常 用 于 蛋 白 质 的 疏 水 相 互 作 用 色 谱, 蛋 白 质 首 先 在 高 盐 浓 度 下 沉 淀, 然 后 用 反 相 梯 度 洗 脱 通 过 逐 渐 稀 释 使 其 洗 脱 Sample capacity( 样 品 容 量 ): 指 进 样 不 过 载 的 最 大 样 品 量 一 般 用 每 克 填 料 的 样 品 克 数 表 示 过 载 的 定 义 是, 使 柱 效 比 正 常 值 降 低 10% 的 进 样 样 品 质 量 ; 有 时 称 为 样 品 负 荷 量 Sampling Rate( 采 样 速 率 ): 参 见 数 据 采 集 速 率 Saturator column( 饱 和 柱 ): 参 见 预 柱 Scalability( 放 大 ): 在 从 分 析 色 谱 过 渡 到 制 备 色 谱 的 过 程 中, 使 用 相 同 粒 度 和 键 合 相, 在 不 同 内 径 色 谱 柱 上 得 到 可 重 现 的 结 果 ; 通 常 是 使 用 较 大 内 径 的 色 谱 柱 以 增 加 容 量 ; 线 性 放 大 过 程 最 大 限 度 地 缩 短 了 优 化 制 备 分 离 的 时 间 SEC: 见 尺 寸 排 阻 色 谱 和 立 体 排 阻 色 谱 Sedimentation( 沉 降 ): 用 于 筛 分 离 子 交 换 色 谱 所 用 树 脂 的 技 术 在 一 个 固 定 于 固 定 平 面 的 容 器 中 加 入 溶 剂, 通 常 为 水, 后 将 宽 分 布 的 微 球 加 入 溶 剂 中 基 于 颗 粒 大 小 和 密 度, 微 球 将 以 不 同 速 度 下 沉, 形 成 颗 粒 大 小 梯 度, 即 可 取 出 感 兴 趣 的 馏 分 通 过 沉 降 可 以 得 到 非 常 窄 的 颗 粒 粒 径 范 围 Selectivity or selectivity factor (a )( 选 择 性 或 选 择 性 因 子,a): 已 被 分 离 因 子 取 代 的 旧 术 语 有 时 称 为 相 对 保 留 Selectivity coefficient (k A/B)( 选 择 性 系 数,k A/B ): 在 离 子 交 换 色 谱 中, 按 离 子 交 换 剂 的 质 量 作 用 定 律 得 到 其 平 衡 系 数, 并 用 电 渗 流 选 择 同 一 溶 液 中 存 在 的 两 个 离 子 表 征 离 子 交 换 剂 的 性 能 例 如, 用 Na + 交 换 H + k Na/H = ([Na] S [H] M)/([Na] M[H] S) Semi-preparative chromatography( 半 制 备 色 谱 ): 在 分 析 柱 (4-5 mm 内 径 ) 或 略 大 的 色 谱 柱 (6-10 mm 内 径 ) 上 进 行 的 制 备 型 LC 进 样 量 一 般 为 毫 克 到 低 克 级 Sensitivity( 灵 敏 度 ): 对 特 定 量 的 分 析 物 的 信 号 响 应, 被 归 一 化 为 产 生 该 响 应 的 分 析 物 的 量, 通 常 由 校 准 曲 线 的 斜 率 来 确 定 Separation factor (a)( 分 离 因 子,a): 测 量 两 个 组 分 相 对 保 留 的 热 动 力 学 因 子 过 去 称 为 选 择 性 或 选 择 性 因 子 相 对 保 留 ;a = t R2'/t R1' = k 2/k 1, 其 中 t R2' 和 t R1' 分 别 为 峰 2 和 峰 的 调 整 保 留 时 间,k 2 和 k 1 是 相 应 的 保 留 因 子 162

165 Separation impedance (E)( 分 离 阻 抗,E): 由 John Knox 建 立 的 一 种 性 能 指 数, 用 以 比 较 两 个 色 谱 系 统 的 柱 效, 对 分 析 时 间 和 压 力 降 进 行 归 一 化 处 理 ;E = t R D p/ N 2 v(1 + k), 其 中 t R 为 保 留 时 间,D p 是 压 力 降,N 为 柱 效, v 是 折 合 流 速,k 是 保 留 因 子 E 值 越 低, 系 统 越 好 SFC: 参 见 超 临 界 流 体 色 谱 Silanol( 硅 凝 胶 ): 硅 胶 表 面 上 的 Si-OH 基 团 硅 醇 基 在 强 度 方 面 的 变 化, 与 其 位 置 彼 此 间 的 联 系 以 及 硅 胶 的 金 属 含 量 有 关 最 强 的 硅 醇 基 为 酸 性, 在 色 谱 过 程 中 常 与 碱 性 化 合 物 发 生 不 良 相 互 作 用 Silanophile( 亲 硅 醇 基 化 合 物 ): 对 硅 胶 表 面 的 活 性 或 酸 性 硅 醇 基 具 有 强 亲 和 性 的 化 合 物 通 常 为 强 碱 性 胺 Silica gel( 硅 胶 ): 应 用 最 广 泛 的 HPLC 填 料 具 有 多 孔 无 定 形 结 构, 由 硅 氧 烷 和 硅 醇 基 组 成 可 用 于 所 有 LC 模 式, 在 吸 附 色 谱 作 为 填 料 在 液 - 液 色 谱 或 化 学 键 合 相 中 作 为 支 持 剂, 同 时 以 其 不 同 的 孔 径 也 可 作 为 SEC 的 填 料 HPLC 中 使 用 的 是 平 均 粒 径 3 5 和 10 µm 的 微 粒 硅 胶 与 不 规 则 硅 胶 相 比, 现 代 分 析 HPLC 柱 更 倾 向 于 使 用 球 形 硅 胶, 因 为 这 种 填 料 具 有 良 好 的 重 现 性 和 较 低 的 压 力 降 常 称 为 硅 胶 Siloxane( 硅 氧 烷 ):Si-O-Si 键 硅 胶 硅 烷 化 合 物 或 键 合 相 中 的 一 种 基 本 化 学 键 除 在 高 ph 下 的 条 件 下 均 较 稳 定 对 HPLC 分 离 几 乎 没 有 影 响 Silylation( 硅 烷 化 ): 有 机 氯 或 有 机 硅 氧 烷 与 含 反 应 基 团 的 化 合 物 发 生 反 应 的 过 程 在 LC 中, 指 在 色 谱 分 离 之 前 对 溶 质 进 行 的 衍 生 化 过 程, 使 其 可 检 测 或 防 止 与 固 定 相 发 生 有 害 相 互 所 用 也 可 以 指 在 固 体 支 持 剂 上 添 加 化 学 键 合 相 或 使 填 料 去 活 以 降 低 表 面 活 性 的 过 程 Simulated moving bed( 模 拟 移 动 床 ): 一 种 色 谱 系 统, 用 一 系 列 色 谱 柱 和 阀 设 置, 模 拟 流 动 相 和 固 定 相 的 逆 流 移 动, 能 够 连 续 取 出 产 品, 并 重 复 利 用 样 品 制 备 级 色 谱 中 应 用 的 一 种 复 杂 形 式 的 循 环 色 谱 Size exclusion chromatography (SEC)( 体 积 排 阻 色 谱, SEC): 同 立 体 排 阻 色 谱 Slurry packing( 匀 浆 填 充 ): 将 微 粒 填 充 入 HPLC 色 谱 柱 的 最 常 用 技 术 填 料 悬 浮 在 约 10% (w/v ) 的 匀 浆 中, 用 特 殊 的 高 压 泵 快 速 泵 入 空 柱 管 中 Snyder e o: 吸 附 色 谱 中 的 溶 剂 强 度 参 数 溶 剂 占 据 的 每 单 位 表 面 积 的 溶 剂 吸 附 能 量 Soap chromatography( 皂 色 谱 ): 离 子 对 色 谱 的 早 期 名 称 将 长 链 皂 或 表 面 活 性 剂 作 为 流 动 相 添 加 剂 Sol gel( 溶 胶 - 凝 胶 法 ): 硅 胶 由 硅 溶 胶 聚 集 形 成 得 到 的 B 型 硅 胶 与 较 早 的 A 型 硅 胶 相 比, 具 有 较 低 的 表 面 酸 性 较 低 痕 量 金 属 较 低 比 表 面 积 和 孔 隙 率, 以 及 更 高 的 ph 稳 定 性 Solid phase extraction (SPE)( 固 相 萃 取,SPE): 将 µm dp 固 相 填 料 装 填 在 小 塑 料 卡 套 柱 膜 盘 或 96 孔 板 的 孔 中, 以 此 进 行 样 品 制 备 的 技 术 使 用 的 固 定 相 与 HPLC 填 料 一 致 虽 然 与 色 谱 相 关, 但 SPE 的 原 理 却 不 相 同, 有 时 也 称 为 数 位 式 色 谱 最 常 用 的 过 程 需 要 4 步 : 活 化 吸 附 剂 加 入 样 品 洗 去 杂 质, 然 后 用 体 积 尽 可 能 小 的 强 溶 剂 洗 脱 样 品 Solid support( 固 体 吸 附 剂 ): 同 支 持 剂 Solute( 溶 质 ): 也 可 参 见 分 析 物 Solvent( 溶 剂 ): 用 于 溶 解 样 品 并 注 入 HPLC 柱 或 CE 毛 细 管 的 液 体 有 时 指 使 用 的 流 动 相 也 可 参 见 洗 脱 液 Solvent demixing( 溶 剂 分 层 ): 使 用 两 种 强 度 区 别 非 常 大 的 溶 剂 时 容 易 出 现 的 现 象 A 为 弱 溶 剂,B 是 强 溶 剂 两 者 作 为 洗 脱 液 用 于 未 修 饰 硅 胶 或 氧 化 铝 强 溶 剂 (B) 优 先 被 固 定 相 活 性 表 面 吸 附, 直 到 饱 和 ; 这 种 情 况 出 现 后, 弱 溶 剂 (A) 在 流 经 色 谱 柱 的 过 程 中 被 富 集 或 分 层 最 后, 整 根 柱 子 被 溶 剂 B 饱 和, 流 动 相 在 起 始 强 度 时 与 溶 剂 A 混 合 流 出, 样 品 组 成 则 随 着 溶 剂 强 度 的 突 然 改 变 被 洗 脱 Solvent selectivity( 溶 剂 选 择 性 ): 溶 剂 影 响 选 择 性 的 能 力 例 如, 溶 剂 B 从 5% 变 到 10%, 或 将 反 相 色 谱 中 的 有 机 改 性 剂 从 甲 醇 换 成 乙 腈, 将 影 响 谱 带 间 距 Solvent-selectivity triangle( 溶 剂 选 择 性 三 角 形 ): 在 不 同 溶 剂 中 进 行 选 择 以 改 变 谱 带 间 距 的 有 用 指 南 溶 剂 选 择 性 取 决 于 溶 剂 分 子 的 偶 极 距 酸 性 和 碱 性 Solvent strength( 溶 剂 强 度 ): 指 溶 剂 从 色 谱 柱 中 洗 脱 特 定 溶 质 或 化 合 物 的 能 力 Snyder 描 述 氧 化 铝 和 按 洗 脱 顺 序 对 溶 剂 定 量 分 级 的 线 性 洗 脱 吸 附 色 谱 ( 液 - 固 色 谱 ) 性 质 在 硅 胶 和 活 性 碳 吸 附 剂 上 应 用 不 广 泛 也 可 参 见 Snyder e o 163

166 Sorb( 吸 附 ): 当 保 留 机 制 吸 附 吸 收 或 分 配 不 明 时, 被 固 定 相 保 留 的 过 程 Sorbent( 吸 附 剂 ): 指 LC 使 用 的 填 料 常 用 吸 附 剂 为 聚 合 物 硅 胶 氧 化 铝 二 氧 化 钛 二 氧 化 锆 和 化 学 修 饰 材 料 SPE: 参 见 固 相 萃 取 Specific surface area( 特 定 表 面 积 ): 用 公 认 技 术 ( 如, 氮 吸 附 BET 法 ) 测 得 的 LC 填 料 表 面 积 Spherical packing( 球 形 填 料 ): 指 球 形 的 固 体 填 料 在 分 析 型 HPLC 中, 球 形 填 料 一 般 比 不 规 则 填 料 更 受 欢 迎, 但 不 规 则 填 料 因 其 价 格 低 廉 常 用 制 备 色 谱 中 Standards( 标 样 ): 含 有 已 知 量 目 标 化 合 物 的 样 品 通 过 相 同 条 件 下 对 比 标 准 品 和 样 品 的 保 留 时 间, 鉴 别 样 品 峰 在 定 量 分 析 中, 以 外 标 化 合 物 的 检 测 器 输 出 ( 峰 面 积 或 峰 高 ) 对 浓 度 作 图 绘 制 校 正 曲 线 ; 将 未 知 物 的 检 测 器 输 出 带 入 校 正 曲 线 进 行 计 算 浓 度 内 标 法 是 将 已 知 浓 度 但 保 留 时 间 不 同 的 化 合 物 加 入 到 样 品 中, 通 过 对 比 内 标 物 与 未 知 物 的 相 对 响 应 值 对 未 知 物 进 行 定 量 Stagnant mobile phase( 滞 留 流 动 相 ): 填 料 颗 粒 孔 隙 中 所 含 的 流 动 相 部 分 Stationary phase( 固 定 相 ): 参 与 色 谱 过 程 的 色 谱 保 留 性 固 定 相 LC 中 的 固 定 相 可 以 是 固 体 在 固 体 支 持 剂 上 键 合 的 固 定 的 或 涂 层 相, 或 涂 壁 相 固 定 相 常 代 表 LC 模 式 的 特 征 例 如, 硅 胶 用 于 吸 附 色 谱, 十 八 烷 基 硅 烷 键 合 相 用 于 反 相 色 谱 Stationary zone( 固 定 区 带 ): 与 固 定 相 不 同 固 定 区 带 包 括 滞 留 流 动 相 和 具 有 色 谱 活 性 的 固 定 相 Stepwise elution( 分 段 洗 脱 ): 在 色 谱 过 程 中 使 用 不 同 组 成 的 洗 脱 液 通 过 泵 或 选 择 器 阀 以 分 段 形 式 改 变 洗 脱 液 而 梯 度 洗 脱 是 连 续 改 变 流 动 相 的 组 成 Steric exclusion chromatography( 立 体 排 阻 色 谱 ): LC 的 一 种 主 要 模 式, 其 中 样 品 基 于 其 在 溶 液 中 的 大 小 得 到 分 离 也 称 体 积 排 阻 色 谱 凝 胶 渗 透 色 谱 凝 胶 过 滤 色 谱 和 凝 胶 色 谱 立 体 排 阻 色 谱 在 聚 合 物 分 离 和 表 征 中 最 为 常 用 Sterically protected bonded phase( 立 体 保 护 键 合 相 ): 对 大 官 能 团 进 行 立 体 保 护 的 键 合 相, 如, 异 丙 基 和 异 丁 基 环 绕 共 价 键 合 表 面 硅 氧 烷 防 止 硅 氧 键 发 生 催 化 水 解, 以 及 在 ph 3 以 下 条 件 下 的 键 合 相 流 失 Straight phase chromatography: 同 正 相 色 谱 Strong anion exchanger( 强 阴 离 子 交 换 剂 ): 带 强 碱 性 离 子 基 团 ( 如, 四 烷 基 胺 基 团 ) 的 阴 离 子 交 换 填 料 Strong cation exchanger( 强 阳 离 子 交 换 剂 ): 带 强 酸 性 离 子 基 团 ( 如, 磺 酸 基 ) 的 阳 离 子 交 换 填 料 Strong solvent( 强 溶 剂 ): 一 般 指 对 化 合 物 溶 解 性 良 好 的 溶 剂 ; 在 色 谱 中, 指 提 供 较 高 溶 剂 强 度 能 使 分 析 物 快 速 从 色 谱 柱 中 洗 脱 的 流 动 相 成 分 ; 在 反 相 色 谱 水 和 乙 腈 的 二 元 溶 剂 系 统 中, 乙 腈 是 强 溶 剂 Sub-2 µm( 亚 2 µm): 指 平 均 直 径 2 µm 以 下 的 多 孔 填 料 ; 目 前 的 产 品 直 径 在 1.5 到 2.0 µm 之 间 Sulfonyl cation exchanger( 磺 酰 基 阳 离 子 交 换 剂 ): 树 脂 类 填 料 上 的 强 阳 离 子 交 换 官 能 团, 一 般 为 丙 基 -SO 3H 可 能 以 阳 离 子 形 式 存 在, 如, 钠 铵 银 和 钙 Supercritical fluid chromatography (SFC)( 超 临 界 流 体 色 谱,SFC): 一 种 将 超 临 界 流 体 作 为 流 动 相 的 技 术 该 技 术 已 用 于 不 能 使 用 LC( 因 检 测 问 题 ), 或 GC( 因 挥 发 性 不 足 ) 分 析 的 物 质 的 分 离 应 用 实 例 包 括 甘 油 三 酯 碳 水 化 合 物 和 脂 肪 酸 目 前 SFC 已 可 以 同 时 应 用 HPLC 泵 和 GC 检 测 器 了 Superficial velocity (us)( 表 面 速 度,us): 当 相 同 色 谱 柱 在 未 填 充 但 流 速 相 同 的 条 件 下 操 作, 假 设 的 流 动 相 流 速 ;us = F/A c, 其 中 F 是 流 速,A c 是 柱 管 的 横 截 面 积 Superficially porous packing( 表 面 多 孔 填 料 ): 同 多 孔 层 微 球 Support( 支 持 剂 ): 指 固 体 颗 粒 在 HPLC 中, 支 持 剂 可 以 是 裸 露 的 覆 盖 涂 层 或 带 化 学 键 合 相 通 常, 固 体 支 持 剂 不 参 与 色 谱 分 离 过 程 Suppressor column( 抑 制 柱 ): 指 置 于 离 子 交 换 柱 后 的 色 谱 柱 其 目 的 是 去 除 或 抑 制 缓 冲 离 子 的 离 子 化, 从 而 使 样 品 离 子 在 电 导 检 测 器 的 弱 电 导 背 景 下 可 以 被 测 到 有 时 用 膜 抑 制 器 代 替 色 谱 柱 164

167 Surface area( 比 表 面 积 ): 指 吸 附 剂 固 体 表 面 的 总 面 积, 用 公 认 的 测 量 技 术 ( 如, 使 用 氮 气 吸 附 的 BET 法 ) 测 定 一 般 多 孔 吸 附 剂 ( 如, 硅 胶 ) 的 比 表 面 积 范 围 为 100 到 600 m 2 /g Surface coverage( 表 面 覆 盖 率 ): 一 般 指 键 合 在 LC 支 持 剂 上 的 单 位 面 积 固 定 相 的 质 量 常 用 毫 摩 尔 / 平 方 米 表 面 积 表 示 有 时 也 用 碳 百 分 比 表 示 Swelling-shrinking( 胀 缩 ): 树 脂 和 凝 胶 由 于 溶 剂 环 境 的 改 变 而 增 加 或 减 小 其 体 积 的 过 程 胀 缩 取 决 于 交 联 度 程 度, 低 交 联 度 的 树 脂 比 高 交 联 度 树 脂 更 容 易 胀 缩 如 果 在 填 充 柱 中 发 生 溶 胀, 将 使 柱 发 生 堵 塞, 反 压 升 高, 并 影 响 柱 效 T Tailing( 拖 尾 ): 正 常 高 斯 峰 不 对 称 因 子 大 于 1 的 现 象 该 色 谱 峰 后 缘 延 长 拖 尾 是 由 填 料 位 点 造 成 的, 溶 质 比 正 常 保 留 更 强, 并 且 具 有 解 吸 附 更 慢 拖 尾 现 象 的 一 个 典 型 离 子 是 在 中 等 ph 值 下, 低 覆 盖 率 反 相 填 料 残 留 硅 醇 基 对 氨 类 的 强 吸 附 造 成 拖 尾 的 其 它 原 因 还 包 括, 进 样 量 过 大 色 谱 柱 填 充 不 当 柱 外 体 积 过 大 不 良 接 头 检 测 器 体 积 过 大, 以 及 检 测 器 响 应 慢 等 见 143 页 图 79 Tailing factor( 拖 尾 因 子 ): 美 国 药 典 对 峰 不 对 称 性 的 描 述, 指 峰 高 5% 处 的 峰 宽 除 以 距 峰 顶 点 峰 宽 处 较 短 半 峰 宽 两 倍 的 值 大 于 1 的 为 拖 尾 峰 也 可 参 见 不 对 称 因 子 Temperature programming( 温 度 编 程 ); 在 分 离 过 程 中 柱 温 随 时 间 改 变 在 HPLC 中 很 少 使 用, 主 要 用 于 分 段 洗 脱 方 式 Ternary mobile phase( 三 元 流 动 相 ): 三 种 溶 剂 或 缓 冲 液 组 成 的 流 动 相 Theoretical plate (N)( 理 论 塔 板 数,N): 由 Martin 和 Synge 提 出 的 一 个 概 念 将 色 谱 分 离 与 蒸 馏 理 论 联 系 在 一 起 与 这 一 概 念 有 关 的 柱 长 称 为 高 度, 相 当 于 理 论 塔 板 也 可 参 见 HETP 塔 板 数 用 下 式 计 算 N = 16(V R/w b ) 2 = 16 (t R/w b ) 2, 其 中 V R 是 保 留 体 积,w b 是 色 谱 峰 峰 底 宽,t R 是 保 留 时 间, 也 可 参 见 N Thermally tuned tandem column chromatography( 热 调 谐 串 联 柱 色 谱 ): 一 种 LC 形 式, 两 根 选 择 性 完 全 不 同 的 色 谱 柱 串 联 在 一 起, 在 两 个 温 度 下 操 作, 优 化 分 离 度 或 分 析 速 度 两 根 色 谱 柱 使 用 一 种 洗 脱 液, 所 有 样 品 都 要 通 过 两 根 色 谱 柱, 然 后 用 同 一 检 测 器 检 测 这 不 是 二 维 技 术, 因 为 每 个 样 品 组 分 只 有 一 个 色 谱 峰 Titania( 二 氧 化 钛 ): 一 种 吸 附 色 谱 中 不 太 常 用 的 吸 附 剂 TIC: 总 离 子 流 色 谱 图 t m : 见 迁 移 时 间 t M : 滞 留 时 间 TOF: 一 种 质 量 分 析 器, 在 初 始 动 能 已 知 的 情 况 下, 根 据 离 子 通 过 设 定 距 离 所 需 的 时 间 来 测 量 离 子 的 质 荷 比 Tortuosity or tortuosity factor( 曲 折 度 或 曲 折 因 子 ): 填 充 柱 的 一 种 性 质, 当 溶 质 沿 色 谱 柱 轴 向 扩 散 时, 控 制 其 纵 向 扩 散 抑 制 程 度 van Deemter 方 程 中 B 项 与 曲 折 度 成 正 比 也 可 参 见 B 项 g 和 分 子 扩 散 项 Total mobile-phase volume (V t)( 流 动 相 总 体 积,V t ): SEC 柱 中 的 流 动 相 总 体 积 也 称 为 总 渗 入 体 积 同 V M Total permeation volume (V p)( 总 渗 透 体 积,V p ): SEC 填 料 的 保 留 体 积, 所 有 小 于 最 小 孔 径 的 分 子 将 被 洗 脱 换 言 之, 所 有 分 子 全 部 渗 透 到 全 部 孔 隙 中, 以 单 一 峰 被 洗 脱 同 V M Total porosity (e T)( 总 孔 隙 率,e T ): 色 谱 柱 中 流 动 相 总 体 积 与 色 谱 柱 总 体 积 的 比 值 ;e = V M/V c = e e + e i (1 - e e); 其 中 V M 是 流 动 相 体 积,V c 是 色 谱 柱 体 积 ;e e 是 颗 粒 间 隙 孔 隙 率,e i 是 颗 粒 内 孔 隙 率 Totally porous packing( 全 多 孔 填 料 ): 固 定 相 是 多 孔 基 质, 溶 质 渗 透 入 多 孔 基 质 与 固 定 相 发 生 相 互 作 用 t R : 见 保 留 时 间 t R': 见 调 整 保 留 时 间 和 保 留 时 间 165

168 Trace enrichment( 痕 量 富 集 ): 用 弱 流 动 相 或 溶 液 洗 脱 时, 将 痕 量 化 合 物 保 留 在 HPLC 或 预 柱 填 料 上, 然 后 再 加 入 较 强 流 动 相, 使 其 以 浓 缩 形 式 被 洗 脱 下 来, 这 种 技 术 称 为 痕 量 富 集 该 技 术 最 成 功 的 应 用 是 对 疏 水 化 合 物 的 痕 量 浓 缩, 如, 用 反 相 填 料 富 集 水 中 的 多 环 芳 烃 用 强 溶 剂 ( 如, 乙 腈 ) 洗 脱 富 集 的 化 合 物 Triethylamine( 三 乙 胺 ): 用 反 相 色 谱 分 离 碱 性 分 析 物 时, 一 种 极 为 常 用 的 屏 蔽 硅 醇 基 的 添 加 剂 Trifluoroacetic acid( 三 氟 乙 酸 ): 使 用 反 相 色 谱 分 离 多 肽 和 蛋 白 质 时 极 为 常 见 的 添 加 剂 Tryptic digestion( 胰 蛋 白 酶 裂 解 ): 一 种 有 选 择 并 可 重 复 地 切 断 蛋 白 质 肽 键 的 技 术, 得 到 可 以 用 反 相 LC 梯 度 洗 脱 分 析 的, 原 始 蛋 白 质 的 较 小 特 征 单 位 Turbulence( 湍 流 ): 流 体 流 速 在 某 点 上 下 随 机 波 动 的 状 态 也 可 参 见 雷 诺 数 和 湍 流 Turbulent flow( 湍 流 ): 一 种 流 体 运 动 形 式, 随 时 间 变 化, 液 流 不 再 平 稳, 而 是 变 得 无 序 而 波 动 其 特 征 是 压 力 降 明 显 高 于 层 流 区 获 得 同 样 体 积 流 速 产 生 的 压 力 降 Turbulent flow chromatography( 紊 流 色 谱 ): 在 使 用 高 雷 诺 数 的 条 件 下, 用 大 粒 径 填 料 以 极 高 线 性 流 速 进 行 的 色 谱 分 离 在 此 条 件 下, 在 H 对 v 的 曲 线 上,H 随 v 增 加 而 减 少 见 144 页 图 80 t w : 见 带 宽 Two-dimensional chromatography( 二 维 色 谱 ): 部 分 或 全 部 分 离 样 品 组 分 继 续 进 入 另 一 个 分 离 步 骤 的 过 程 可 以 将 从 第 一 根 色 谱 柱 洗 脱 的 特 定 组 分 导 入 第 二 根 色 谱 柱 或 具 有 不 同 分 离 特 征 的 系 统 中 包 括 二 维 TLC 等 技 术, 使 用 两 种 展 开 系 统, 将 薄 层 板 旋 转 90, 再 使 用 第 二 种 展 开 剂 也 包 括 LC 再 接 GC, 一 种 LC 模 式, 再 接 另 一 种 不 同 的 模 式, 如, 反 相 色 谱 后 面 接 SEC 也 可 参 见 多 维 色 谱 Type A silica(a 型 硅 胶 ): 由 胶 化 可 溶 性 硅 酸 盐 形 成 的 硅 胶 与 B 型 硅 胶 相 比, 通 常 具 有 较 高 的 酸 性 较 高 的 比 表 面 积 和 孔 隙 率 较 多 痕 量 金 属, 较 低 的 高 ph 稳 定 性 Type B silica(b 型 硅 胶 ): 见 溶 胶 - 凝 胶 t 0 : 见 空 隙 时 间 U u: 参 见 线 性 流 速 和 线 速 度 u e : 参 见 间 隙 流 速 u M : 参 见 流 动 相 流 速 u s : 参 见 表 面 流 速 u z : 参 见 区 域 流 速 UHPLC: 指 超 高 压 液 相 色 谱 泛 指 任 何 压 力 高 于 常 规 泵 (400 bar) 的 分 离, 原 指 在 psi 以 上 进 行 的 分 离 V Vacancy chromatography( 空 穴 色 谱 ): 流 动 相 添 加 剂 造 成 检 测 器 正 输 出 信 号 的 技 术 一 种 溶 质 从 色 谱 柱 中 洗 脱 时, 将 使 该 信 号 稀 释 并 产 生 负 峰 或 空 穴 这 项 技 术 起 初 用 于 单 柱 离 子 色 谱, 其 中 柠 檬 酸 盐 和 磷 酸 盐 缓 冲 液 等 流 动 相 在 UV 区 有 吸 收 当 没 有 吸 收 的 阴 离 子 被 洗 脱 时, 将 稀 释 UV 吸 收 背 景, 产 生 一 个 负 峰 ; 检 测 器 的 输 出 一 般 设 为 反 向, 从 而 使 色 谱 图 看 起 来 为 正 向 这 一 技 术 也 已 应 用 于 CE 检 测 中 van Deemter equation(van Deemter 方 程 ): 用 于 解 释 色 谱 中 峰 展 宽 的 方 程 该 方 程 提 出 了 理 论 塔 板 高 度 (HETP) 的 概 念 并 由 三 项 进 行 描 述 A 项 描 述 的 是 由 轴 向 流 速 不 均 匀 导 致 的 涡 流 分 散 或 扩 散 B 项 反 映 的 是 流 经 色 谱 柱 的 溶 质 分 子 扩 散 或 纵 向 扩 散 对 峰 展 宽 的 影 响 C 项 是 固 定 相 内 传 质 对 峰 展 宽 的 影 响, 将 溶 质 在 固 定 相 和 流 动 相 之 间 的 有 限 速 度 考 虑 在 内 其 最 简 单 的 表 达 是,h = A + B/v + Cv 也 可 参 见 折 合 塔 板 高 度 和 折 合 流 速 V c : 参 见 柱 体 积 V d : 参 见 死 体 积 V e : 参 见 间 隙 体 积 Velocity (u)( 线 速 度 ): 同 线 速 度 v eo : 参 见 电 渗 流 V i : 参 见 颗 粒 内 体 积 166

169 Viscosity (h)( 粘 度,h): 也 称 为 流 动 相 粘 度 流 动 相 粘 度 随 色 谱 柱 温 度 而 改 变 低 粘 度 流 动 相 通 常 比 粘 度 较 差 的 流 动 相 提 供 更 高 的 柱 效, 因 为 扩 散 因 子 与 溶 剂 粘 度 呈 负 相 关 例 如, 反 相 色 谱 中, 使 用 乙 腈 作 为 改 性 剂 比 用 异 丙 醇 柱 效 高, 因 为 后 者 粘 性 更 大 柱 反 压 直 接 与 溶 剂 粘 度 成 正 比 V M : 参 见 滞 留 体 积 也 可 参 见 流 动 相 体 积 Void( 空 隙 ): 通 常 是 在 柱 头 形 成 的 空 隙 或 间 隙, 由 柱 填 料 沉 降 或 溶 解 产 生 色 谱 柱 中 的 空 隙 导 致 了 柱 效 降 低 和 分 离 度 损 失 即 便 是 小 空 隙, 对 小 粒 径 色 谱 柱 也 将 是 灾 难 性 的 有 时 空 隙 可 以 用 玻 璃 微 球 或 色 谱 柱 中 使 用 的 相 同 多 孔 填 料 填 充 Void time (t 0)( 空 隙 时 间,t 0 ): 不 保 留 峰 的 洗 脱 时 间 ; 也 称 死 时 间 和 滞 留 时 间 (t M) 空 隙 体 积 由 空 隙 时 间 乘 以 流 速 测 得 Void volume (V M)( 空 隙 体 积,V M ): 色 谱 柱 中 流 动 相 的 总 体 积 ; 色 谱 柱 的 其 余 部 分 为 填 料 该 体 积 可 以 用 进 样 不 保 留 物 质 测 定 也 称 死 体 积 常 用 符 号 V 0 表 示 空 隙 体 积 这 只 能 用 于 填 充 非 多 孔 填 料 的 色 谱 柱 用 V 0 可 以 表 示 SEC 中 的 排 阻 体 积 (V e) V p : 参 见 总 渗 透 体 积 V R : 参 见 保 留 体 积 和 洗 脱 体 积 V R': 参 见 调 整 保 留 时 间 V t : 参 见 总 流 动 相 体 积 V o : 参 见 排 阻 体 积 W Wall effect( 管 壁 效 应 ): 刚 性 HPLC 柱 管 壁 附 近 填 料 密 度 松 散 造 成 引 起 的 后 果 由 于 局 部 渗 透 性 增 加, 流 动 相 靠 管 壁 附 近 的 流 速 有 稍 微 加 快 的 趋 势 了 管 壁 附 近 的 溶 质 分 子 比 溶 质 峰 的 平 均 移 动 速 度 快, 因 而 造 成 峰 变 宽, 以 及 柱 效 损 失 WCX: 见 弱 阳 离 子 交 换 剂 Weak anion exchanger( 弱 阴 离 子 交 换 剂 ): 带 弱 碱 性 离 子 基 团 的 阴 离 子 交 换 填 料, 如 氨 基 DEAE Weak cation exchanger( 弱 阳 离 子 交 换 剂 ): 带 弱 酸 性 离 子 基 团 ( 如, 羧 酸 基 ) 的 阳 离 子 交 换 填 料 Weak solvent( 弱 溶 剂 ): 通 常 指 对 化 合 物 溶 解 性 差 的 溶 剂 ; 在 色 谱 中, 指 提 供 低 溶 剂 强 度 使 分 析 物 从 色 谱 柱 中 洗 脱 较 慢 的 流 动 相 组 分, 在 反 相 LC 的 水 - 乙 腈 二 元 溶 剂 系 统 中, 水 被 认 为 是 弱 溶 剂 Wilke-Chang equation(wilke-chang 方 程 ): 用 于 估 算 扩 散 系 数 的 半 经 验 方 程, 溶 质 分 子 大 小 和 溶 液 粘 度 对 液 体 的 影 响 X Xerogels( 干 凝 胶 ):SEC 中 使 用 的 在 不 同 溶 剂 中 胀 缩 的 凝 胶 也 指 用 可 溶 性 硅 酸 盐 酸 化 制 备 的 硅 胶 基 填 料, 为 无 定 形 高 比 表 面 积 高 孔 隙 率 的 刚 性 颗 粒 Z Zero dead volume( 零 死 体 积 ): 接 头 或 组 件 没 有 洗 脱 液 未 及 的 体 积 Zirconia( 二 氧 化 锆 ): 多 孔 氧 化 锆 作 为 色 谱 吸 附 剂 使 用, 通 常 用 聚 合 有 机 固 定 相 覆 盖 或 键 合 Zone: 参 见 谱 带 Zone velocity (u z)( 区 带 速 度,u z ): 溶 质 区 带 移 动 的 速 度 ;u z = u M/(1 + k) = L/t R, 其 中 u M 为 流 动 相 速 度,k 为 保 留 因 子,L 为 柱 长,t R 为 保 留 时 间 Zwitterions( 两 性 离 子 ): 在 溶 液 中 既 带 正 电 荷 又 带 负 电 荷 的 化 合 物 WAX: 见 弱 阴 离 子 交 换 剂 w b : 见 峰 宽 167

170 词 汇 表 参 考 文 献 1:R.E. Majors and P.W. Carr, LCGC 19 (2) (2001). 2: 'Nomenclature for Chromatography', Pure and Appl. Chem. 65 (4), (1993). 3: J.P. Foley and J.G. Dorsey, Anal. Chem. 55, (1983) 4: L.R. Snyder, P.W., Carr, and S.C. Rutan, J. Chromatogr. A 656, 537 (1993). 词 汇 表 作 者 Peter W. Carr: Peter W. Carr 是 明 尼 苏 达 大 学 (207 Pleasant Street SE, Minneapolis, MN ) 化 学 系 的 化 学 教 授,LCGC 的 常 务 编 委 Ronald E. Majors: Ronald E. Majors 是 Column Watch 和 Sample Prep Perspectives 的 主 编 Ronald E. Majors 是 安 捷 伦 科 技 公 司 (Wilmington, Delaware) 生 命 科 学 与 化 学 分 析 部, 色 谱 柱 与 消 耗 品 部 门 的 资 深 化 学 家, 也 是 LCGC 的 常 务 编 委 致 谢 特 别 感 谢 参 与 本 书 编 撰 的 安 捷 伦 色 谱 工 作 人 员 : 样 品 前 处 理 产 品 经 理 Paul Boguszewski Aaron Boice,LC/Q-TOF 产 品 经 理 LC 柱 技 术 支 持 专 家 William Champion 应 用 化 学 家 John W. Henderson LC 柱 市 场 战 略 经 理 Maureen Joseph 博 士 小 分 子 LC 柱 产 品 经 理 Jason Link 博 士 大 分 子 LC 柱 产 品 经 理 Linda Lloyd 博 士 LC 资 深 应 用 科 学 家 William Long 博 士 Anne Mack, 小 分 子 液 相 色 谱 柱 应 用 科 学 家 资 深 科 学 家 Ron Majors 博 士 Maggie Ostrowski,GC/MS 和 LC/MS 单 四 极 杆 产 品 经 理 LC 柱 技 术 支 持 专 家 Rita Steed Lester Taylor, 小 分 子 制 药 市 场 经 理 Martin Vollmer 博 士, 分 析 型 和 制 备 型 HPLC 营 销 经 理 LC 和 LC/MS 应 用 专 家 Michael Woodman 168

171 索 引 性 能 影 响 因 素 索 引 保 留 螯 合 化 合 物...52 保 留 因 子...7 等 度 优 化... 79, 方 法 开 发 , 86 分 离 度...8 固 定 相 改 性... 53, 故 障 排 除... 68, 76-79, , 121, 聚 合 物 色 谱 柱...84 LC/MS...73 流 动 相 选 择...68 色 谱 柱 老 化...57 色 谱 柱 选 择...64 数 据 采 集 速 率...46 梯 度...54 梯 度 公 式 梯 度 优 化...82 UHPLC...29 USP 指 定 产 品 优 化 色 谱 柱 重 新 平 衡 正 相 滞 后 体 积...49 泵 13 等 度...15 二 元...14 溶 剂 混 合...14 四 元...15 压 力 范 围...13 延 迟 体 积...16 方 法 转 移 55, 87, 115 分 离 度 8-9 保 护 柱 保 留 因 子...7 等 度 优 化 , 85 方 法 开 发...60 固 定 相 改 性 固 定 相 选 择...66 故 障 排 除...68, 74-78, 87, 120 LC/MS...31 色 谱 柱 规 格...35 色 谱 柱 老 化...57 梯 度 优 化 填 料 粒 径...34 UHPLC... 13, 30, 113 USP 指 定 产 品 药 物 应 用...67 正 相...93, 94 滞 后 体 积... 16, 51, 52, 119 柱 外 体 积...16, 40 故 障 排 除 120 保 留 峰 形...97 固 定 相 改 性 剂... 74, 基 线 , 流 动 相 压 力 缓 冲 液 ( 另 请 参 见 流 动 相 ) 56, 58-59, 68, 70, 71, 73, 74, 86, , 113, 135 检 测 单 四 极 杆 质 谱...99 二 极 管 阵 列...23, 25 飞 行 时 间 质 谱...99 离 子 化 灵 敏 度...24,97 溶 剂 / 缓 冲 液 选 择... 71, 102, 110 软 件 三 重 四 极 杆 质 谱...99, 100 数 据 采 集 速 率...25,

172 稀 释 剂 强 度 线 性 范 围...24, 98 效 率...5-8, 10-11, 30 在 线 过 滤 器...89, 157 质 谱...22, 97 柱 外 体 积... 16, 40, 48, 88 紫 外 (UV) , 24, 25, 71, 73, 97, 124 接 头 与 连 接 A-Line Quick Connect 快 速 连 接 色 谱 柱 接 头...16 不 锈 钢... 高 压... 故 障 排 除 , 122, 124 接 头 类 型...44 聚 合 物...43 可 重 复 使 用...43 Parker...42 PEEK( 聚 酮 )...43 如 何 实 现 正 确 的 接 头 连 接...42 Swagelok...88 死 体 积...28 正 确 使 用 进 样 45 故 障 排 除... 68, 76, 交 叉 污 染...20 缩 放 谱 图 ( 梯 度 )...89 自 动 进 样 器 流 动 相 变 化 , 73 故 障 排 除 混 合 , 68, 69, 73, 119, 125 LC/MS... 71, 强 度...10, 78, 79 UHPLC...13, 113 选 择 改 性 剂 / 缓 冲 液... 53, 71, 135 选 择 溶 剂... 68, 正 相...93 毛 细 管 16, 22, 88, 105, 178, ph 53, 69-74, 76, 77, 84, 119 容 量 因 子 7, 8, 57 溶 剂 安 全 盖 185 溶 剂 效 应 46, 123 色 谱 柱 螯 合... 39, 表 面 多 孔...26, 30, 60 储 存 规 格... 27, 28, 35, 64, 78, 83, 123 老 化... 39, 57, 124 平 衡 / 重 新 平 衡 , 117, 118, 123 维 护 选 择... 28, 62-63, 121 延 长 寿 命 , 116 柱 温 箱...21 数 据 采 集 速 率 25, 39, 46-47, 87, 105, 123 梯 度 Agilent 1290 LC...89 安 捷 伦 方 法 转 换 软 件...46 操 作 多 肽 / 蛋 白 质 应 用...75 反 相...84 方 法 开 发...61 固 定 相 选 择 故 障 排 除... 74, 磺 胺 类 药 物 应 用...83 聚 合 物 色 谱 柱...84 离 子 交 换...95 溶 剂 饱 和 色 谱 柱 清 洗...57 缩 放 谱 图...89 梯 度 公 式 优 化... 78, 无 人 值 守 系 统...81 正 相...93 滞 后 体 积... 48, 49, 51, 52,

173 脱 气 13-15, 69 USP 指 定 产 品 选 择 性 保 留 因 子...7 等 度 优 化 , 85 方 法 重 现 性 方 法 转 移...87 分 离 度...8 分 离 因 子 固 定 相 改 性 , 135 故 障 排 除... 76, 117, 聚 合 物 色 谱 柱...84 LC/MS...72 流 动 相 选 择...68 色 谱 柱 老 化...57 色 谱 柱 特 性...33 色 谱 柱 选 择 梯 度 优 化...82 效 率...6 选 择 性 公 式 选 择 性 因 子 压 力 公 式 9, 30, 121 延 迟 ( 滞 后 ) 体 积 14-16, 18, 21, 49-50, 52, 89, 189 样 品 前 处 理 103, 109 van Deemter 曲 线 10, 88 产 品 索 引 C18 固 定 相 Polaris Amide-C Polaris C18-A Polaris C18-Ether Poroshell 120 EC-C Poroshell 120 SB-C Pursuit C Pursuit XRs C SepTech ST150 C SepTech ST60 C ZORBAX 300SB-C ZORBAX Eclipse Extend-C18 ZORBAX Eclipse Plus C , 86, 104, 110, 127 ZORBAX Eclipse XDB-C , 127 ZORBAX Extend-C , 86, 122, 127 ZORBAX RRHD SB-C ZORBAX Rx-C ZORBAX SB-C , 127 C3 固 定 相 ZORBAX 300SB-C ZORBAX SB-C C8 固 定 相 Polaris C8-A Polaris C8-Ether Poroshell 120 EC-C Pursuit C Pursuit XRs C ZORBAX C ZORBAX Eclipse Plus C ZORBAX Eclipse XDB-C ZORBAX Rx-C ZORBAX SB-C ZORBAX 快 速 分 离 Eclipse XDB-C HILIC 色 谱 柱 ZORBAX Eclipse XDB-C , 127 ZORBAX Rx-SIL...92, 127 HPLC 卡 套 柱 36 ChromSep...36 Dynamax 制 备 柱...37 Load & Lock 制 备 柱...37 PLRP-S...37 PL-SAX

174 PL-SCX ZORBAX RR...36 ZORBAX RRHT...36 ZORBAX 半 制 备 保 护 柱...37 ZORBAX 保 护 卡 套 柱...36 LC/MS Agilent 溶 剂 节 省 柱...31 PLRP-S... 33, 37, 67, 129 ZORBAX Eclipse XDB-C , 127 ZORBAX 快 速 分 离 高 通 量 卡 套 柱 ZORBAX Rx-SIL 9...2, 127 UHPLC Poroshell , 31 ZORBAX RRHD...30 ZORBAX RRHT...30 氨 基 固 定 相 Polaris Amide-C Polaris NH ZORBAX NH 保 护 柱 ZORBAX 半 制 备 保 护 柱 ZORBAX 保 护 卡 套 柱...36 苯 基 固 定 相 Pursuit Diphenyl Pursuit PFP Pursuit XRs Diphenyl ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl ZORBAX Phenyl ZORBAX SB-Phenyl...53, 128 灯 183 反 相 色 谱 柱 AdvanceBio 肽 谱 分 析 色 谱 柱 AdvanceBio 糖 谱 分 析 色 谱 柱 Bio SEC Bio SEC IonSpher C LiChrospher Diol PL aquagel-oh PLgel MIXED-D...96 PLgel PLRP-S... 33, 37, 67, 129 Polaris C18-A Polaris C18-Ether Polaris C8-A Polaris C8-Ether Polaris Si-A Poroshell 120 Bonus-RP Poroshell 120 EC-C Poroshell 120 EC-C Poroshell 120 PFP Poroshell 120 SB-C Poroshell , 31, 40, 66, 77, 84-88, 110 Poroshell Poroshell HPH-C Poroshell HPH-C ProSEC Pursuit C Pursuit C Pursuit Diphenyl Pursuit PFP Pursuit XRs C Pursuit XRs C Pursuit XRs Diphenyl Pursuit XRs Si SepTech ST150 C SepTech ST60 C Ultron ES-OVM ZORBAX 300SB-C , 127 ZORBAX 300SB-C ZORBAX C ZORBAX Eclipse Extend-C18 172

175 ZORBAX Eclipse Plus C , 86, 104, 110, 127 ZORBAX Eclipse Plus C ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl ZORBAX Eclipse Plus... 76, ZORBAX Eclipse XDB Phenyl ZORBAX Eclipse XDB...92 ZORBAX Eclipse XDB-C ZORBAX Eclipse XDB-C ZORBAX Extend-C , 86, 122, 127 ZORBAX GF ZORBAX GF ZORBAX ODS 经 典 ZORBAX ODS ZORBAX Phenyl ZORBAX RRHD ZORBAX RRHD SB-C ZORBAX RRHT...67 ZORBAX Rx-C ZORBAX Rx-C ZORBAX SB-C , 46, 127 ZORBAX SB-C ZORBAX SB-C8...55, 128 ZORBAX SB-Phenyl...53, 128 ZORBAX SIL ZORBAX StableBond...76 ZORBAX TMS ZORBAX 快 速 分 离 Eclipse XDB-C 硅 胶 柱 IonSpher C Polaris C18-A Polaris C18-Ether Polaris C8-A Polaris C8-Ether Polaris Si-A Poroshell 120 EC-C Poroshell 120 EC-C Poroshell 120 SB-C Poroshell , 31, 40, 66, 77, 84-88, 110 Poroshell Pursuit C Pursuit C Pursuit Diphenyl Pursuit PFP Pursuit XRs C Pursuit XRs C Pursuit XRs Diphenyl Pursuit XRs Si Ultron ES-OVM ZORBAX 300SB-C , 127 ZORBAX 300SB-C ZORBAX Bonus-RP ZORBAX C ZORBAX Eclipse Extend-C18 ZORBAX Eclipse Plus C , 86, 104, 110, 127 ZORBAX Eclipse Plus C ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl ZORBAX Eclipse Plus... 76, ZORBAX Eclipse XDB...92 ZORBAX Eclipse XDB-C , 127 ZORBAX Eclipse XDB-C ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl ZORBAX Extend-C , 86, 122, 127 ZORBAX GF ZORBAX GF ZORBAX ODS 经 典 ZORBAX ODS ZORBAX RRHD SB-C ZORBAX RRHT...67 ZORBAX Rx-C ZORBAX Rx-C ZORBAX SB-C , 46, 127 ZORBAX SB-C ZORBAX SB-C8...55, 128 ZORBAX SB-Phenyl...53, 128 ZORBAX SIL ZORBAX StableBond

176 ZORBAX TMS ZORBAX 快 速 分 离 Eclipse XDB-C 过 滤 器 1200 RRLC Infinity LC Infinity LC HPLC 卡 套 柱...36 检 测 器 1290 Infinity II 二 极 管 阵 列 系 列 LC/MS...99 聚 合 物 色 谱 柱 Bio SEC Bio SEC Hi-Plex Ca (Duo) Hi-Plex Ca Hi-Plex H Hi-Plex Na (Octo) Hi-Plex Na Hi-Plex Pb PL aquagel-oh PLgel MIXED-D...96 PLgel PLRP-S... 33, 37, 67, 129 PL-SAX...37 PL-SCX...37 ProSEC SepTech ST150 C SepTech ST60 C 卡 套 系 统 色 谱 柱 离 子 交 换 色 谱 柱 Bio SAX Hi-Plex Ca (Duo) Hi-Plex Ca Hi-Plex H Hi-Plex Na (Octo) Hi-Plex Na Hi-Plex Pb PL-SAX...37 PL-SCX...37 ZORBAX 300SCX ZORBAX SAX ZORBAX SCX 氰 基 固 定 相 ZORBAX CN ZORBAX Eclipse XDB-CN ZORBAX SB-CN 筛 板 Poroshell 手 性 柱 ChiraDex 手 性 柱 体 积 排 阻 色 谱 柱 Bio SEC Bio SEC PL aquagel-oh PLgel MIXED-D...96 PLgel ProSEC 液 相 色 谱 仪 1100 LC RRLC...50, SL Infinity LC Infinity II LC Infinity LC...106, 114 正 相 色 谱 柱 Polaris Amide-C Polaris NH ZORBAX CN ZORBAX Eclipse XDB-CN ZORBAX NH ZORBAX Rx-SIL...92, 127 ZORBAX SB-CN

177 产 品 与 订 购 信 息 在 下 面 几 页 中, 我 们 选 择 了 一 些 产 品 用 以 进 行 突 出 并 提 供 给 您 快 速 参 考 部 件 号 安 捷 伦 液 相 色 谱 柱 Poroshell 120 色 谱 柱 帮 助 您 在 任 何 高 效 液 相 色 谱 / 超 高 压 液 相 色 谱 上 获 得 更 高 效 率 和 分 析 速 度 参 见 页 获 得 更 多 信 息 Poroshell 粒 径 2.7 µm 尺 寸 (mm) Eclipse Plus EC-C18 (USP L1) Eclipse Plus EC-C8 (USP L7) Eclipse Plus EC-CN StableBond SB-C18 (USP L1) StableBond SB-C8 (USP L7) 分 析 柱 4.6 x 分 析 柱 4.6 x 分 析 柱 4.6 x 分 析 柱 4.6 x 分 析 柱 4.6 x 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 窄 径 柱 2.1 x 窄 径 柱 2.1 x 窄 径 柱 2.1 x 窄 径 柱 2.1 x 窄 径 柱 2.1 x Fast Guard 4.6 x Fast Guard 3.0 x Fast Guard 2.1 x 转 下 页 175

178 Poroshell 120 粒 径 2.7 µm 尺 寸 (mm) StableBond SB-Aq Phenyl-Hexyl (USP L11) Bonus-RP (USP L60) HILIC 分 析 柱 4.6 x 分 析 柱 4.6 x 分 析 柱 4.6 x 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 窄 径 柱 2.1 x 窄 径 柱 2.1 x 窄 径 柱 2.1 x 新 型 Poroshell 120 粒 径 2.7 µm 尺 寸 新 型 新 型 新 型 (mm) HPH-C18 HPH-C8 PFP 分 析 柱 4.6 x 分 析 柱 4.6 x 分 析 柱 4.6 x 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 窄 径 柱 2.1 x 窄 径 柱 2.1 x 窄 径 柱 2.1 x Poroshell 120 粒 径 4 µm 尺 寸 (mm) EC-C18 EC-C8 PFP Phenyl-Hexyl HILIC 分 析 柱 4.6 x 分 析 柱 4.6 x 分 析 柱 4.6 x 分 析 柱 4.6 x 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 转 下 页 176

179 Poroshell 120 粒 径 4 µm 尺 寸 EC-C18 EC-C8 PFP Phenyl-Hexyl HILIC (mm) 窄 径 柱 2.1 x 窄 径 柱 2.1 x 窄 径 柱 2.1 x 窄 径 柱 2.1 x Poroshell 120 保 护 柱 粒 径 4 µm 描 述 尺 寸 (mm) 部 件 号 Poroshell 120 UHPLC 保 护 柱,EC-C Poroshell 120 UHPLC 保 护 柱,EC-C Poroshell 120 UHPLC 保 护 柱,EC-C 我 们 将 继 续 开 发 更 多 Poroshell 120 固 定 相 如 需 完 整 列 表, 请 访 问 如 需 安 捷 伦 色 谱 柱 的 完 整 产 品 清 单, 请 访 问 索 取 最 新 的 安 捷 伦 色 谱 与 光 谱 产 品 目 录 AdvanceBio 肽 谱 分 析 色 谱 柱 粒 径 2.7 µm 尺 寸 (mm) AdvanceBio 色 谱 柱 分 析 柱 4.6 x 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 窄 径 柱 2.1 x 窄 径 柱 2.1 x 窄 径 柱 2.1 x 快 速 保 护 柱 * 快 速 保 护 柱 * 快 速 保 护 柱 * AdvanceBio 糖 谱 分 析 色 谱 柱 粒 径 2.7 µm 表 面 多 孔, 耐 压 达 600 bar 尺 寸 (mm) AdvanceBio 色 谱 柱 分 析 柱 4.6 x 分 析 柱 4.6 x 分 析 柱 4.6 x 窄 径 柱 2.1 x 窄 径 柱 2.1 x 窄 径 柱 2.1 x 快 速 保 护 柱 2.7, AdvanceBio 糖 谱 分 析 色 谱 柱 粒 径 1.8 µm 耐 压 达 1200 bar 尺 寸 (mm) AdvanceBio 色 谱 柱 窄 径 柱 2.1 x 窄 径 柱 2.1 x 快 速 保 护 柱 2.1, 有 关 Agilent Advanced Bio 的 更 多 信 息, 请 访 问 177

180 安 捷 伦 液 相 色 谱 色 谱 柱 ZORBAX 超 高 压 快 速 高 分 辨 (RRHD) 柱, 在 高 达 1200 Bar 下 稳 定 Eclipse Plus C18 (USP L1) Eclipse Plus C8 (USP L7) Eclipse XDB-C18 (USP L1) Extend-C18 (USP L1) RRHD 2.1 x 150 mm, 1.8 µm RRHD 2.1 x 100 mm, 1.8 µm RRHD 2.1 x 50 mm, 1.8 µm RRHD, 3.0 x 150 mm, 1.8 µm RRHD 3.0 x 100 mm, 1.8 µm RRHD 3.0 x 50 mm, 1.8 µm StableBond SB- C18 (USP L1) StableBond SB-C8 (USP L7) StableBond SB-Phenyl (USP L11) StableBond SB-CN (USP L10) RRHD 2.1 x 150 mm, 1.8 µm RRHD 2.1 x 100 mm, 1.8 µm RRHD 2.1 x 50 mm, 1.8 µm RRHD 3.0 x 150 mm, 1.8 µm RRHD 3.0 x 100 mm, 1.8 µm RRHD 3.0 x 50 mm, 1.8 µm Eclipse PAH (USP L1) StableBond SB-Aq HILIC Plus Eclipse Plus Phenyl-Hexyl RRHD 2.1 x 150 mm, 1.8 µm RRHD 2.1 x 100 mm, 1.8 µm RRHD 2.1 x 50 mm, 1.8 µm RRHD 3.0 x 100 mm, 1.8 µm RRHD 3.0 x 50 mm, 1.8 µm Bonus-RP RRHD 2.1 x 50 mm, 1.8 µm RRHD 2.1 x 100 mm, 1.8 µm RRHD 2.1 x 150 mm, 1.8 µm 我 们 还 将 继 续 开 发 更 多 RRHD 固 定 相 如 需 可 提 供 部 件 号 的 全 部 列 表, 请 访 问 用 于 蛋 白 质 和 多 肽 分 析 的 300Å 色 谱 柱 StableBond StableBond StableBond HILIC 300SB-C18 300SB-C8 300SB-C3 (USP L56) Diphenyl (USP L11) RRHD 2.1 x 50 mm, 1.8 µm RRHD 2.1 x 100 mm, 1.8 µm RRHD 2.1 x 150 mm, 1.8 µm

181 安 捷 伦 液 相 色 谱 色 谱 柱 ZORBAX Eclipse Plus 尺 寸 (mm) 粒 径 (µm) Eclipse Plus C18 (USP L1) Eclipse Plus C8 (USP L7) Eclipse Plus Phenyl-Hexyl Eclipse Plus PAH (USP L1) (USP L11) 分 析 柱 4.6 x 分 析 柱 4.6 x 分 析 柱 4.6 x 分 析 柱 4.6 x 快 速 分 离 柱 4.6 x 快 速 分 离 柱 4.6 x 快 速 分 离 柱 4.6 x 快 速 分 离 柱 4.6 x 快 速 分 离 柱 4.6 x 快 速 分 离 高 通 量 柱, 4.6 x bar 快 速 分 离 高 通 量 柱, 4.6 x bar 快 速 分 离 高 通 量 柱, 4.6 x bar 快 速 分 离 高 通 量 柱, 4.6 x bar 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 溶 剂 节 省 RRHD 柱, 3.0 x bar 溶 剂 节 省 RRHD 柱, 3.0 x bar 溶 剂 节 省 RRHD 柱, 3.0 x bar 溶 剂 节 省 高 通 量 柱, 3.0 x bar 溶 剂 节 省 高 通 量 柱, 3.0 x bar 窄 径 柱 2.1 x 窄 径 柱 2.1 x 窄 径 柱 2.1 x 转 下 页 179

182 安 捷 伦 液 相 色 谱 色 谱 柱 ZORBAX Eclipse Plus 尺 寸 (mm) 粒 径 (µm) Eclipse Plus Eclipse Plus Eclipse Plus Eclipse Plus C18 (USP L1) C8 (USP L7) Phenyl-Hexyl PAH (USP L1) (USP L11) 窄 径 快 速 分 离 柱 2.1 x 窄 径 快 速 分 离 柱 2.1 x 窄 径 快 速 分 离 柱 2.1 x 窄 径 快 速 分 离 柱 2.1 x 窄 径 RRHD 柱, 1200 Bar 窄 径 RRHD 柱, 1200 Bar 窄 径 RRHD 柱, 1200 Bar 窄 径 RRHT 柱, 600 Bar 窄 径 RRHT 柱, 600 Bar 窄 径 RRHT 柱, 600 Bar 2.1 x x x x x x ZORBAX Eclipse Plus: 保 护 柱 卡 套 尺 寸 (mm) 粒 径 (µm) Eclipse Plus Eclipse Plus Eclipse Plus Eclipse Plus C18 (USP L1) C8 (USP L7) Phenyl-Hexyl PAH (USP L1) (USP L11) 保 护 柱 卡 套,4/ 包 4.6 x 保 护 柱 卡 套,4/ 包 2.1 x 保 护 柱 硬 件 工 具 包 以 上 只 是 固 定 相 和 色 谱 柱 的 部 分 列 表 安 捷 伦 具 有 一 系 列 BioHPLC 色 谱 柱, 可 快 速 准 确 的 分 离 蛋 白 质 和 多 肽 如 需 可 提 供 部 件 号 的 完 整 列 表, 请 访 问 索 取 最 新 的 安 捷 伦 色 谱 与 光 谱 产 品 目 录 或 BioHPLC 色 谱 柱 选 择 指 南 180

183 安 捷 伦 毛 细 管 和 接 头 为 您 的 应 用 选 择 合 适 的 毛 细 管 使 用 合 适 的 毛 细 管 对 于 得 到 最 佳 分 析 性 能 至 关 重 要 下 表 是 推 荐 用 于 传 统 高 效 液 相 色 谱 和 超 高 压 液 相 色 谱 系 统 的 接 头 标 准 系 统 毛 细 管 柱 :1290 系 列 Bar 起 始 端 (A) 结 束 端 (B) 材 料 内 径 (mm) 长 度 (mm) 接 头 类 型 起 始 端 接 头 类 型 结 束 端 备 注 部 件 号 泵 自 动 进 样 器 SS S S A 和 B 上 已 预 装 配 泵 恒 温 自 动 进 样 器 SS S S A 和 B 上 已 预 装 配 自 动 进 样 器 TCC SS S S A 上 已 预 装 配 色 谱 柱 DAD SS S S A 上 已 预 装 配 系 统 CTC 自 动 进 样 器 CTC 自 动 进 样 器 SS S SH A 上 已 预 装 配 色 谱 柱 SS S S 检 测 器 废 液 容 器 PTFE * 不 包 括 手 紧 接 头 ( , 2/ 包 ) 材 料 缩 写 SS S SH SL SLV SX M 描 述 不 锈 钢 Swagelok 内 径 1.6 mm 接 口 Swagelok 内 径 1.6 mm 接 口, 长 接 头 Swagelok 内 径 1.6 mm 接 口, 长 接 头 Swagelok 内 径 1.6 mm 接 口, 长 接 头,1200 bar Swagelok 内 径 1.6 mm 接 口, 超 长 接 头 Metric M4 内 径 0.8 mm 接 口 181

184 1290 阀 头 连 接 :600 和 1200 Bar 起 始 端 (A) 结 束 端 (B) 材 料 内 径 (mm) 自 动 进 样 器 带 Swagelok 接 口 的 阀 自 动 进 样 器 自 动 进 样 器 自 动 进 样 器 带 10/32 Swagelok 接 口 的 阀 带 M4 接 口 的 阀 短 色 谱 柱 短 色 谱 柱 长 色 谱 柱 短 色 谱 柱 带 Swagelok 接 口 的 阀 带 M4 接 口 的 阀 带 M4 接 口 的 阀 长 度 (mm) 接 头 类 型 起 始 端 接 头 类 型 结 束 端 备 注 阀 信 息 部 件 号 SS S SX A 上 已 预 装 配 SS S SX B 上 已 预 装 配 G4231A/B 2 位 / 6 通 阀 阀 头, 600/1200 bar SS SLV M G4232A 2 位 /10 通 微 量 阀 阀 头,600 bar SS SLV M G4234A/B 6 种 色 谱 柱 选 择 阀, 600/1200 bar 热 交 换 器 SS SX S A 和 B 上 已 预 装 配 G4231A/B 2 位 / 6 通 阀 阀 头, 600/1200 bar 热 交 换 器 SS M SL B 上 已 预 装 配 G4232A 2 位 /10 通 微 量 阀 阀 头,600 bar 带 M4 接 口 的 阀 带 M4 接 口 的 阀 带 M4 接 口 的 阀 带 Swagelok 接 口 的 阀 短 色 谱 柱 带 10/32 Swagelok 接 口 的 阀 长 色 谱 柱 带 Swagelok 接 口 的 阀 SS SV M G4234A/B 6 种 色 谱 柱 选 择 阀, 600/1200 bar SS SV M G4232A 2 位 /10 通 微 量 阀 阀 头,600 bar SS SV M G4232A 2 位 /10 通 微 量 阀 阀 头,600 bar SS SL SX B 上 已 预 装 配 G4231A/B 2 位 / 6 通 阀 阀 头, 600/1200 bar SS SL SX G4232B 2 位 / 10 通 阀 阀 头, 1200 bar SS SL SX B 上 已 预 装 配 G4231A/B 2 位 / 6 通 阀 阀 头, 600/1200 bar 转 下 页 182

185 1290 阀 头 连 接 :600 和 1200 bar 从 (A) 从 (B) 材 料 ID (mm) 带 Swagelok 接 口 的 阀 长 色 谱 柱 带 Swagelok 接 口 的 阀 带 M4 接 口 的 阀 热 交 换 器 色 谱 柱 色 谱 柱 色 谱 柱 G4232A 2 位 / 10 通 阀 阀 头, 1200 bar 长 度 (mm) 接 头 类 型, 从 接 头 类 型, 到 检 测 器 SS SX S A 和 B 上 已 预 装 配 带 Swagelok 接 口 的 阀 备 注 阀 信 息 部 件 号 G4231A/B 2 位 / 6 通 阀 阀 头, 600/1200 bar SS SL SX G4232B 2 位 /10 通 阀 阀 头,1200 bar 检 测 器 SS SX S A 上 已 预 装 备 G4232B 2 位 /10 通 阀 阀 头,1200 bar 检 测 器 SS M SLV G4232A 2 位 /10 通 微 量 阀 阀 头,600 bar 带 M4 接 口 的 阀 带 M4 接 口 的 阀 带 M4 接 口 的 阀 带 M4 接 口 的 阀 SS SL M A 上 已 预 装 备 G4232A 2 位 /10 通 阀 阀 头,1200 bar SS SV M G4232A 2 位 /10 通 阀 阀 头,1200 bar SS SV M G4232A 2 位 /10 通 阀 阀 头,1200 bar SS SV M G4232A 2 位 /10 通 阀 阀 头,1200 bar SS SL M A 上 已 预 装 备 G4232A 2 位 /10 通 阀 阀 头,1200 bar 接 头 说 明 缩 写 包 装 部 件 号 Swagelok 1.6 mm 不 锈 钢 接 头 S 10 个 / 包 Swagelok 1.6 mm 不 锈 钢 接 头, 长 螺 栓 SL 10 个 / 包 Swagelok 1.6 mm 不 锈 钢 接 头, 超 长 螺 栓 SX 10 个 / 包 Swagelok 1.6 mm 1200 bar 可 拆 卸 接 头 SV 1 个 / 包 Swagelok 1.6 mm 1200 bar 可 拆 卸 接 头, 长 螺 栓 SLV 1 个 / 包 Swagelok 1.6 mm 1200 bar 可 拆 卸 接 头, 超 长 螺 栓 SXV 1 个 / 包

186 A-Line Quick Connect Fittings 快 速 连 接 接 头 组 件 * 适 用 范 围 毛 细 管 接 头 长 度 (mm) 部 件 号 色 谱 柱 到 检 测 器 0.12 x 色 谱 柱 到 检 测 器 0.12 x 热 交 换 器 到 色 谱 柱 0.12 x 热 交 换 器 到 色 谱 柱 0.12 x 热 交 换 器 到 色 谱 柱 x * 所 有 组 件 均 包 括 一 个 连 接 到 合 适 毛 细 管 上 的 Quick Connect 接 头 以 及 一 个 未 装 配 的 Swagelok 接 头 ( 在 另 一 端 ) Quick Connect 接 头 只 可 用 于 该 表 给 出 的 毛 细 管 A-Line Quick Connect Fittings 快 速 连 接 接 头 独 立 部 件 描 述 部 件 号 毛 细 管 不 锈 钢 0.12 x 280 mm, 包 括 1 个 未 装 配 的 Swagelok 接 头 毛 细 管 不 锈 钢 0.12 x 220 mm, 包 括 1 个 未 装 配 的 Swagelok 接 头 毛 细 管 不 锈 钢 0.12 x 150 mm, 包 括 1 个 未 装 配 的 Swagelok 接 头 毛 细 管 不 锈 钢 0.12 x 105 mm, 包 括 1 个 未 装 配 的 Swagelok 接 头 毛 细 管 不 锈 钢 x 105 mm, 包 括 1 个 未 装 配 的 Swagelok 接 头 前 密 封 垫 圈 独 立 Quick Connect 接 头 ( 与 合 适 的 毛 细 管 配 合 使 用, 用 于 系 统 设 置 ) 更 多 有 关 Agilent A-Line Quick Connect Fittings 快 速 连 接 接 头 的 信 息, 请 访 问 184

187 A-Line Quick Turn 接 头 和 密 封 垫 圈 描 述 部 件 号 Quick Turn UHPLC 接 头 前 密 封 垫 圈 A-Line Quick Turn 毛 细 管 描 述 部 件 号 不 锈 钢, mm, 带 长 套 管 不 锈 钢, mm, 带 长 套 管 不 锈 钢,0.17 x 200 mm, 带 长 套 管 不 锈 钢, mm, 带 长 套 管 不 锈 钢, mm, 带 长 套 管 不 锈 钢, mm, 带 长 套 管 不 锈 钢, mm, 带 长 套 管 不 锈 钢, mm, 带 长 套 管 不 锈 钢, mm, 带 长 套 管 不 锈 钢, mm, 带 长 套 管 不 锈 钢, mm, 带 长 套 管 Quick Turn 接 头 需 使 用 本 表 给 出 的 毛 细 管 更 多 有 关 Agilent A-Line Quick Turn 接 头 的 信 息, 请 访 问 185

188 安 捷 伦 液 相 色 谱 检 测 器 光 源 带 给 您 耐 久 的 性 能 使 用 非 标 准 液 相 色 谱 灯 可 导 致 光 强 度 不 一 致 基 线 噪 音 高 系 统 停 机 以 及 成 本 增 加 为 了 确 保 液 相 色 谱 系 统 的 准 确 性 重 现 性 和 可 靠 性, 请 使 用 严 格 按 照 ISO 9001 标 准 制 造 的 安 捷 伦 认 证 氘 灯 安 捷 伦 氘 灯 的 与 众 不 同 之 处 在 于 : 性 能 最 优 精 准 的 操 作 电 压 一 致 的 光 强 度 以 及 准 直 定 位 使 用 寿 命 比 其 他 产 品 长 50% 可 达 2000 小 时 信 噪 比 更 高 发 光 孔 径 更 窄, 从 而 提 高 了 光 强 度, 降 低 了 噪 音 灵 敏 度 更 高 扩 展 了 1200 Infinity 系 列 和 6100 Series 四 极 杆 质 谱 仪 的 检 测 能 力, 可 运 行 任 何 现 有 HPLC 或 RRLC 方 法 二 极 管 阵 列 检 测 器 / 多 波 长 检 测 器 检 测 器 灯 描 述 部 件 号 G1315A/B G1365A/B 长 寿 命 氘 灯 G4212A/B 长 寿 命 HiS 氘 灯 (8 针 ), 带 有 RFID 识 别 标 签 G1315C/D G1365C/D G1315A/B/C/D G1365A/B/C/D 长 寿 命 氘 灯, 带 有 RFID 识 别 标 签 钨 灯 G 可 变 波 长 检 测 器 检 测 器 灯 描 述 部 件 号 G1314D/E/F 长 寿 命 氘 灯, 带 有 RFID 识 别 标 签 G G1314A/B/C 1120 Infinity 液 相 色 谱 1220 Infinity 液 相 色 谱 长 寿 命 氘 灯 G

189 Agilent Captiva 优 级 注 射 式 过 滤 器 样 品 在 进 入 高 效 液 相 色 谱 超 高 效 液 相 色 谱 气 相 色 谱 气 质 联 用 系 统 或 液 质 联 用 系 统 分 析 前 进 行 过 滤, 对 获 取 最 佳 系 统 性 能 起 着 决 定 性 的 作 用 Agilent Captiva 增 强 型 注 射 式 过 滤 器 拥 有 业 内 最 高 流 速 和 载 样 量, 使 得 进 程 比 过 去 更 快 请 根 据 个 人 需 求 挑 选 不 同 的 膜 类 型 和 孔 径 有 关 Captiva 过 滤 产 品 的 详 细 信 息 及 其 它 产 品 信 息, 请 访 问 优 级 注 射 式 过 滤 器 (100/ 包 ) 直 径 / 孔 径 滤 膜 类 型 4 mm 15 mm 25 mm 0.2 µm 0.45 µm 0.2 µm 0.45 µm 0.2 µm 0.45 µm PTFE 尼 龙 PES 再 生 纤 维 素 醋 酸 纤 维 素 * * 玻 璃 微 纤 维 * 深 层 过 滤 器 : 玻 璃 /PTFE 深 层 过 滤 器 : 玻 璃 / 尼 龙 备 注 :* 较 大 直 径 为 28 mm( 并 非 25 mm) 以 蓝 色 显 示 的 部 件 号 产 品 经 过 LC/MS 系 统 验 证 ; 其 它 产 品 均 经 过 LC/UV 系 统 验 证 187

190 安 捷 伦 溶 剂 安 全 盖 提 高 实 验 室 安 全 性 Agilent A-Line Stay Safe 溶 剂 瓶 安 全 盖 能 够 阻 止 99.9% 的 溶 剂 释 放 到 空 气 中, 从 而 保 护 您 与 同 事 的 健 康 溶 剂 的 密 度 随 着 时 间 的 延 长 可 能 会 发 生 变 化, 从 而 影 响 您 色 谱 分 析 的 结 果 使 用 气 密 性 的 A-Line 溶 剂 瓶 安 全 盖 保 存 溶 剂 可 以 避 免 这 个 问 题, 确 保 溶 剂 稳 定 性 以 及 色 谱 分 析 结 果 的 准 确 性 A-Line 溶 剂 瓶 安 全 盖 带 有 一 个 时 间 标 签, 用 于 提 醒 您 何 时 需 要 更 换 放 空 阀 A-Line Stay Safe 溶 剂 瓶 安 全 盖 GL45 描 述 插 口 放 空 阀 过 滤 器 废 液 1 个 插 口 1 个 带 时 间 标 签 的 放 空 阀 ( ) 1 x 3.2 mm 个 插 口 1 个 带 时 间 标 签 的 放 空 阀 ( ) 2 x 3.2 mm 个 插 口 1 个 带 时 间 标 签 的 放 空 阀 ( ) 3 x 3.2 mm 个 插 口 1 个 泄 漏 管 2 x 3.2 mm 1 x 2.3 mm 1 x 1.6 mm 更 多 有 关 A-Line Stay Safe 溶 剂 瓶 安 全 盖 的 信 息, 请 访 问 188

191 用 于 NS29/32 磨 口 瓶 安 全 盖 II, 带 2 个 插 口 - 用 于 NS29/ 个 基 础 瓶 盖, 聚 丙 烯, 蓝 色, 用 于 NS29/32, 带 PTFE 锥,2 个 插 口 内 含 2 个 一 体 接 头,PFA 3.2 mm(1 蓝 色,1 红 色 ) 内 含 1 个 1 µm 放 空 阀,PTFE 滤 膜 内 含 用 于 GL 45 螺 纹 口 溶 剂 瓶 安 全 盖 II, 带 2 个 插 口 的 - 用 于 GL 个 基 础 盖, 聚 丙 烯, 蓝 色,GL45, 带 PTFE 锥,2 个 接 口 内 含 2 个 接 头,PFA 3.2 mm(1 蓝 色,1 红 色 ) 内 含 1 个 放 空 阀,1 µm,ptfe 滤 膜 内 含 安 全 盖 I, 带 1 个 插 口 的 - 用 于 GL 个 基 础 盖, 聚 丙 烯, 蓝 色,GL45, 带 PTFE 锥,1 个 插 口 内 含 1 个 一 体 接 头,PFA,3.2 mm, 黑 色 内 含 1 个 放 空 阀,1 µm,ptfe 滤 膜 内 含 安 全 盖 II, 带 2 个 关 闭 阀 用 于 GL 个 基 础 盖, 聚 丙 烯, 蓝 色,GL45, 带 PTFE 锥,2 个 插 口 2 个 关 闭 阀 内 含 2 个 接 头,PFA,3.2 mm(1 蓝 色,1 红 色 ) 内 含 2 个 接 头,PTFE,3.2 mm( 白 色 ) 内 含 1 个 放 空 阀,1 µm,ptfe 滤 膜 内 含 安 全 盖 I, 带 1 个 关 闭 阀 - 用 于 GL 个 基 础 盖, 聚 丙 烯, 蓝 色,GL45, 带 PTFE 锥,1 个 插 口 1 个 关 闭 阀 内 含 1 个 一 体 接 头,PFA,3.2 mm, 黑 色 内 含 1 个 接 头,PTFE,3.2 mm( 白 色 ) 内 含 1 个 放 空 阀,1 µm,ptfe 滤 膜 内 含 安 捷 伦 安 全 盖 是 能 够 自 由 旋 转 的 PTFE 和 PFA 螺 口 盖, 适 用 于 实 验 室 中 高 效 液 相 色 谱 系 统 的 所 有 溶 剂 瓶 和 废 液 瓶 最 高 可 减 少 70% 的 溶 剂 排 放, 并 能 有 效 防 止 可 能 改 变 色 谱 结 果 的 溶 剂 泄 漏 和 蒸 发 瓶 盖 采 用 自 由 旋 转 设 计, 更 加 便 于 溶 剂 的 更 换 操 作, 有 助 于 避 免 容 器 更 换 过 程 中 发 生 管 路 缠 绕 189

192 安 捷 伦 在 线 过 滤 器 保 护 您 的 液 相 色 谱 系 统 色 谱 柱 进 样 口 滤 芯 污 染 可 能 增 大 柱 反 压 并 降 低 柱 效 由 于 进 样 口 滤 芯 直 径 小, 微 径 色 谱 柱 堵 塞 成 为 一 个 值 得 关 注 的 问 题 为 了 防 止 堵 塞, 请 始 终 在 液 相 色 谱 系 统 中 使 用 适 当 的 过 滤 器 安 捷 伦 有 几 种 类 型 的 高 压 在 线 过 滤 器 工 具 包 可 用 于 任 何 高 效 液 相 色 谱 系 统 低 扩 散 在 线 过 滤 器 : 直 接 置 于 色 谱 柱 之 前, 可 去 除 样 品 和 进 样 系 统 中 的 微 粒 由 于 过 滤 器 具 有 直 径 仅 2.1 mm 的 滤 芯 及 锥 形 插 件, 从 而 使 谱 带 展 宽 最 小 此 过 滤 器 适 用 于 任 何 微 径 高 速 或 标 准 的 分 析 柱 通 用 型 在 线 过 滤 器 : 安 装 于 液 相 色 谱 泵 和 进 样 器 之 间, 去 除 溶 剂 中 的 颗 粒, 使 用 高 容 量 过 滤 器 滤 芯 置 于 插 件 的 锥 形 边 缘 之 间, 使 溶 剂 能 够 均 匀 地 分 布 于 滤 芯 的 表 面 上 高 效 液 相 色 谱 在 线 过 滤 器 说 明 滤 芯 孔 径 滤 芯 入 口 内 径 注 释 部 件 号 可 更 换 的 滤 芯 (µm) (mm) RRLC 在 线 过 滤 器, 连 接 毛 细 管 最 高 耐 压 600 bar , 10 个 / 包 RRLC 在 线 过 滤 器, 连 接 毛 细 管 最 高 耐 压 600 bar , 10 个 / 包 低 扩 散 在 线 过 滤 器, 包 括 两 个 滤 芯 <1 ml/min , 10 个 / 包 (2 µm) , 10 个 / 包 (0.5 µm). 通 用 在 线 过 滤 器, 两 个 滤 芯, 带 衬 垫, ml/min , 2 个 / 包 mm 连 接 毛 细 管 半 制 备 过 滤 器 ml/min 高 压 半 制 备 过 滤 器 ml/min , 10 个 / 包 制 备 过 滤 器 ml/min , 可 更 换 玻 璃 滤 芯 G1311A 泵 的 在 线 过 滤 器 建 议 在 盐 溶 度 较 高 时 使 用 G Infinity 在 线 过 滤 器 (0.3 µm) bar , 5 个 / 包 190

193 Agilent 1200 Infinity 系 列 液 相 色 谱 产 品 组 合 Agilent 1200 Infinity 系 列 产 品 继 承 了 安 捷 伦 40 年 来 开 发 和 生 产 最 高 质 量 液 相 色 谱 仪 的 优 良 传 统, 迄 今 为 止 已 销 售 100 多 万 台 仪 器 在 1200 Infinity 系 列 与 之 前 的 1100 或 1200 系 列 之 间, 安 捷 伦 提 供 了 无 限 制 的 组 件 和 系 统 兼 容 性 安 捷 伦 保 值 承 诺 可 以 让 任 何 安 捷 伦 液 相 色 谱 仪 灵 活 地 逐 步 升 级 无 论 是 现 在 还 是 未 来! 无 限 超 值 Agilent 1220 Infinity LC 是 用 于 常 规 HPLC 和 先 进 的 UHPLC 分 析 的 高 质 量 集 成 系 统, 为 您 的 投 资 带 来 最 大 的 回 报 600 bar 的 性 能 范 围 最 高 达 5 ml/min 的 流 速 和 80 Hz 的 检 测 器 速 率 让 您 的 实 验 室 充 分 利 用 最 新 的 液 相 色 谱 柱 技 术 带 来 的 优 势 与 1200 Infinity 系 列 中 的 所 有 其 他 安 捷 伦 检 测 器 和 6100 系 列 四 极 杆 质 谱 仪 完 全 兼 容 使 用 与 1260 Infinity 和 1290 Infinity II 液 相 色 谱 系 统 相 同 的 技 术 和 部 件 无 限 信 心 1260 Infinity 液 相 色 谱 仪 建 立 了 更 高 的 性 能 标 准, 可 提 高 结 果 的 可 信 度 它 兼 顾 UHPLC 水 平 的 分 析 效 率 数 据 质 量 和 稳 定 性 价 格 却 仅 仅 相 当 于 普 通 的 HPLC 系 统 具 有 600 bar 的 性 能 范 围 最 高 达 10 ml/min 的 流 速 80 Hz 的 检 测 器 速 率 和 提 高 了 10 倍 的 UV 检 测 灵 敏 度 足 以 应 对 现 在 和 未 来 的 挑 战 与 您 的 所 有 HPLC 方 法 完 全 兼 容, 确 保 无 风 险 地 完 成 对 现 有 仪 器 的 替 换 以 相 同 的 预 算 获 得 更 大 价 值 价 格 与 以 前 的 1200 系 列 HPLC 相 当, 却 能 提 供 UHPLC 性 能 无 限 高 效 新 的 1290 Infinity II LC 代 表 着 UHPLC 的 未 来 发 展 趋 势 拥 有 安 捷 伦 提 供 的 无 与 伦 比 的 可 靠 性 和 稳 定 性, 以 及 突 破 性 的 色 谱 性 能 和 最 高 的 效 率 最 大 化 分 析 效 率 : 无 可 比 拟 的 分 离 和 检 测 性 能, 可 提 供 最 高 质 量 的 分 析 数 据, 让 您 对 结 果 充 满 信 心 最 大 化 仪 器 效 率 : 最 高 的 样 品 容 量 最 快 的 进 样 周 期 以 及 前 所 未 有 的 可 用 性 使 仪 器 在 任 何 应 用 中 均 可 实 现 最 高 的 通 量 最 大 化 实 验 室 效 率 : 可 与 实 验 室 现 有 架 构 无 缝 整 合, 从 原 有 设 备 实 现 平 稳 无 干 扰 地 的 方 法 转 移, 从 而 获 得 最 高 的 分 析 效 率 和 最 低 的 使 用 维 护 成 本 随 时 了 解 来 自 安 捷 伦 仪 器 的 无 限 卓 越 的 技 术, 请 访 问 191

194 采 用 智 能 化 系 统 模 拟 技 术 (ISET) 的 Agilent 1290 Infinity II 液 相 色 谱 采 用 智 能 化 系 统 模 拟 技 术 (ISET) 解 决 不 同 液 相 色 谱 之 间 进 行 方 法 转 换 时 的 各 种 问 题 不 同 液 相 色 谱 仪 之 间 的 设 计 差 别 例 如 功 能 范 围 延 迟 体 积 混 合 性 能 温 度 控 制 柱 外 体 积 和 检 测 器 流 通 池 设 计 等 都 会 影 响 从 一 个 系 统 向 另 一 系 统 的 方 法 转 换 因 此, 在 不 同 液 相 色 谱 仪 上 使 用 相 同 的 液 相 色 谱 方 法 可 能 会 出 现 不 同 的 保 留 时 间 和 色 谱 分 离 度 延 迟 体 积 和 梯 度 混 合 的 影 响 液 相 色 谱 系 统 的 延 迟 ( 驻 留 ) 体 积 决 定 了 混 合 溶 剂 多 快 能 够 到 达 色 谱 柱 而 且, 混 合 性 能 影 响 着 梯 度 曲 线 延 迟 / 驻 留 体 积 和 混 合 性 能 均 由 仪 器 的 设 计 决 定, 方 法 转 换 将 使 得 保 留 时 间 和 分 离 度 出 现 差 异 [mau] R S = 1.15 R S = min 条 件 色 谱 柱 : Poroshell 120, 3 x 50 mm (2.7 um) 流 速 : 0.85 ml /min 流 动 相 : 水, 乙 腈 梯 度 : 0 min (10% 乙 腈 ), 3 min (90% 乙 腈 ) 流 动 相 : 四 氢 呋 喃 (THF) 由 不 同 延 迟 体 积 和 梯 度 混 合 性 能 造 成 的 色 谱 柱 溶 剂 组 成 不 同 将 产 生 不 同 的 保 留 时 间 和 分 离 度 192

195 仪 器 间 方 法 转 换 的 解 决 方 案 : 配 备 智 能 化 系 统 模 拟 技 术 (ISET) 的 1290 Infinity II 液 相 色 谱 智 能 化 系 统 模 拟 技 术 使 得 1290 Infinity II 液 相 色 谱 成 为 世 界 上 第 一 台 真 正 意 义 上 的 通 用 液 相 色 谱 系 统, 无 需 修 改 原 方 法 或 改 动 仪 器 硬 件, 即 可 运 行 任 何 传 统 的 HPLC 方 法 或 最 新 的 UHPLC 方 法, 得 到 与 原 方 法 相 同 的 色 谱 结 果 仅 需 点 击 鼠 标 即 可 [mau] (ISET) 1290 Infinity 1100 R S = 1.87 R S = min 3.5 结 果 : 保 留 时 间 和 分 离 度 均 相 同, 无 需 修 改 仪 器 或 原 方 法 有 效 提 高 方 法 开 发 和 质 量 管 理 / 质 量 控 制 (QA/QC) 的 效 率, 并 降 低 成 本 使 用 1290 Infinity II 液 相 色 谱 和 智 能 化 系 统 模 拟 技 术 (ISET) 可 以 利 用 超 高 效 液 相 色 谱 性 能 加 快 方 法 开 发 的 速 度, 然 后 通 过 模 拟 目 标 系 统 对 方 法 进 行 微 调 使 方 法 更 可 靠 地 按 预 期 方 式 运 行 简 单 即 可 模 拟 开 发 原 方 法 的 液 相 色 谱 系 统 使 用 智 能 化 系 统 模 拟 技 术 (ISET) 继 续 运 行 传 统 方 法 的 同 时 还 能 够 充 分 利 用 1290 Infinity II 液 相 色 谱 的 超 高 压 液 相 色 谱 速 度 分 离 度 和 灵 敏 度 优 势 有 了 智 能 化 系 统 模 拟 技 术 (ISET), 就 无 需 再 保 留 您 的 旧 液 相 色 谱 系 统 了 要 了 解 有 关 此 技 术 的 更 多 信 息, 及 时 跟 踪 安 捷 伦 仪 器 无 限 卓 越 的 最 新 技 术, 请 访 问 193

196 备 注 194

197 备 注 195

198 备 注 196

199 备 注 197

200 Agilent CrossLab 集安捷伦科的创新实验室服务 软件和消耗品 供应于一体 为您提供了与全球科学技术专家团队直接交流的 途径 他们可针对不同层级的实验室环境提供重要且可执行见 解 从而最大限度提高性能 降低实验室运作的复杂性 助力客户实现更高效的经济 运营 与科学成果 唯有 Agilent CrossLab 独特地结合了创新产品与全面解决方案 可确保实验室效率得到快速 持久的改善 我们愿与全球客户携手前行 不断探索实验室领域的新机遇 如需了解更多信息 请访问 查找当地的安捷伦客户中心 免费专线 手机用户 联系我们 在线询价 安捷伦科技大学 浏览和订阅 Access Agilent 电子期刊 本文中的信息 说明和指标 如有变更 恕不另行通知 安捷伦对本文可能存在的错误或由于提供 展示或使用本文所造成的间接损 失不承担任何责任 安捷伦科技 中国 有限公司 年 2 月 1 日 中国出版 出版号 CHCN 液相色谱手册 液相色谱柱与方法开发指南 了解更多信息 液相色谱手册 液相色谱柱与方法开发指南