4.1 液 相 色 谱 - 三 重 四 极 杆 质 谱 联 用 仪 4.2 天 平 4.3 超 声 波 清 洗 仪 4.4 离 心 机 4.5 涡 旋 混 合 仪 5 分 析 步 骤 5.1 标 准 系 列 溶 液 的 制 备 分 别 精 密 吸 取 10.0 µg/ml 的 标 准 工 作 溶 液

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1 附 件 1 化 妆 品 中 丙 烯 酰 胺 的 检 测 方 法 ( 征 求 意 见 稿 ) 1 范 围 本 方 法 规 定 了 化 妆 品 中 丙 烯 酰 胺 的 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 测 定 方 法 本 方 法 适 用 于 液 态 水 基 类 液 态 油 基 类 凝 胶 类 膏 霜 乳 液 类 粉 类 化 妆 品 中 丙 烯 酰 胺 的 测 定 2 方 法 提 要 样 品 提 取 净 化 后 用 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 测 定, 采 用 特 征 离 子 丰 度 比 进 行 定 性, 内 标 法 定 量 本 方 法 取 样 量 为 1.0 g 时, 检 出 浓 度 为 0.01 mg/kg, 最 低 定 量 浓 度 为 0.03 mg/kg 3 试 剂 和 材 料 除 另 有 规 定 外, 本 方 法 所 用 试 剂 均 为 分 析 纯 或 以 上 规 格, 水 为 GB/T 6682 规 定 的 一 级 水 3.1 丙 烯 酰 胺 标 准 品 ( 纯 度 98 %) 3.2 氘 代 丙 烯 酰 胺 (2,3,3-D3)( 纯 度 98 %) 3.3 甲 醇, 色 谱 纯 3.4 石 油 醚 (30 ~ 60 ), 分 析 纯 3.5 甲 酸, 色 谱 纯 3.6 5% 甲 酸 溶 液 : 吸 取 甲 酸 (3.5)5 ml, 加 水 95 ml, 摇 匀, 即 得 3.7 标 准 储 备 溶 液 (1.0 mg/ml): 称 取 丙 烯 酰 胺 (3.1)10 mg( 精 确 至 mg), 置 10 ml 容 量 瓶 中, 加 水 使 溶 解 并 定 容 至 刻 度, 摇 匀, 即 得 3.8 标 准 工 作 溶 液 (10.0 µg/ml): 精 密 量 取 标 准 储 备 溶 液 (3.7)1 ml, 置 100 ml 容 量 瓶 中, 加 水 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 即 得 3.9 内 标 标 准 储 备 溶 液 (0.1 mg/ml): 称 取 氘 代 丙 烯 酰 胺 (2,3,3-D3)(3.2)10 mg( 精 确 至 mg), 置 100 ml 容 量 瓶 中, 加 水 使 溶 解 并 定 容 至 刻 度, 摇 匀, 即 得 3.10 内 标 工 作 溶 液 (1.0 µg/ml): 精 密 量 取 内 标 储 备 溶 液 (3.9)1 ml, 置 100 ml 容 量 瓶 中, 加 水 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 即 得 4 仪 器 和 设 备 1

2 4.1 液 相 色 谱 - 三 重 四 极 杆 质 谱 联 用 仪 4.2 天 平 4.3 超 声 波 清 洗 仪 4.4 离 心 机 4.5 涡 旋 混 合 仪 5 分 析 步 骤 5.1 标 准 系 列 溶 液 的 制 备 分 别 精 密 吸 取 10.0 µg/ml 的 标 准 工 作 溶 液 (3.8)2.0 µl 5.0 µl 10 µl 20 µl 50 µl 100 µl 200 µl, 置 不 同 的 10 ml 容 量 瓶 中, 分 别 精 密 加 入 1.0 μg/ml 的 内 标 工 作 溶 液 (3.10) 200 μl, 用 水 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 配 制 得 浓 度 分 别 为 2.0 ng/ml 5.0 ng/ml 10 ng/ml 20 ng/ml 50 ng/ml 100 ng/ml 200 ng/ml 的 标 准 系 列 溶 液, 内 标 浓 度 为 20 ng/ml 5.2 样 品 处 理 称 取 样 品 1.0 g, 精 密 加 入 1.0 μg/ml 的 内 标 工 作 溶 液 (3.10)200 μl, 涡 旋 30 s, 加 水 10 ml 石 油 醚 (3.4)10 ml, 涡 旋 1 min, 超 声 处 理 10 min, 于 r/min 离 心 10 min, 取 水 层 3 ml, 加 5% 甲 酸 溶 液 (3.6)60 µl 石 油 醚 (3.4)3 ml, 涡 旋 30 s, 于 r/min 离 心 10 min, 取 水 层, 过 0.22 µm 微 孔 滤 膜, 滤 液 作 为 待 测 溶 液 5.3 参 考 液 相 色 谱 - 三 重 四 极 杆 质 谱 联 用 条 件 色 谱 条 件 色 谱 柱 :Prodigy C 18 柱 (4.6 mm 150 mm, 3.0 μm), 或 等 效 色 谱 柱 ; 流 动 相 A:0.05% 甲 酸 溶 液 ; 流 动 相 B: 甲 醇 ; 流 动 相 梯 度 洗 脱 程 序 见 表 1; 表 1 流 动 相 梯 度 洗 脱 程 序 时 间 /min V( 流 动 相 A)/% V( 流 动 相 B)/% 流 速 :0.3 ml/min; 2

3 柱 温 :25 ; 进 样 量 :10 μl 质 谱 条 件 离 子 源 : 电 喷 雾 离 子 源 (ESI 源 ); 监 测 模 式 : 正 离 子 监 测 模 式 ; 离 子 源 喷 雾 电 压 (IS): 5500 V; 气 帘 气 压 力 (CUR):45 psi; 雾 化 气 压 力 (GS1):80 psi; 辅 助 气 压 力 (GS2):60 psi; 离 子 源 温 度 (TEM):600 ; 碰 撞 气 : 氮 气 ; 其 它 质 谱 条 件 参 见 表 2; 表 2 三 重 四 极 杆 离 子 对 及 相 关 电 压 参 数 设 定 表 编 号 物 质 名 称 母 离 子 (m/z) 去 簇 电 压 (V) 子 离 子 (m/z) CE(V) 1 丙 烯 酰 胺 * 内 标 注 : * 为 丙 烯 酰 胺 定 量 离 子, 丙 烯 酰 胺 定 性 离 子 可 根 据 所 用 仪 器 的 实 际 情 况 进 行 选 择 5.4 定 性 判 定 用 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 对 样 品 进 行 定 性 判 定, 在 相 同 试 验 条 件 下, 样 品 中 应 呈 现 定 量 离 子 和 定 性 离 子 ( 至 少 一 个 ) 的 色 谱 峰, 样 品 中 各 离 子 的 保 留 时 间 应 与 标 准 溶 液 中 各 离 子 的 保 留 时 间 一 致 ; 样 品 色 谱 图 中 所 选 择 的 监 测 离 子 的 相 对 丰 度 比 与 相 当 浓 度 标 准 溶 液 的 离 子 相 对 丰 度 比 的 偏 差 不 超 过 表 3 规 定 范 围, 则 可 以 判 断 样 品 中 存 在 丙 烯 酰 胺 表 3 定 性 确 证 时 相 对 离 子 丰 度 的 最 大 允 许 偏 差 相 对 离 子 丰 度 (k) k 50% 50 %> k 20 % 20 %> k 10 % k 10 % 允 许 的 最 大 偏 差 ±20% ±25% ±30% ±50% 5.5 定 量 测 定 在 5.3 项 液 相 色 谱 - 三 重 四 极 杆 质 谱 联 用 条 件 下, 取 标 准 系 列 溶 液 (5.1) 分 别 进 样, 以 浓 度 为 横 坐 标, 峰 面 积 为 纵 坐 标, 进 行 线 性 回 归, 绘 制 标 准 曲 线, 其 线 性 相 关 系 数 应 大 于

4 取 5.2 项 下 处 理 得 到 的 待 测 溶 液 进 样, 将 峰 面 积 代 入 标 准 曲 线, 计 算 丙 烯 酰 胺 的 浓 度, 按 6 项 下 公 式, 计 算 样 品 中 丙 烯 酰 胺 的 质 量 分 数 6 分 析 结 果 的 表 述 6.1 计 算 ω = C 10 m 1000 式 中 :ω 化 妆 品 中 测 定 组 分 的 质 量 分 数,mg/kg; C 样 品 测 得 浓 度,ng/mL; m 样 品 称 取 量,g 在 重 复 性 条 件 下 获 得 的 两 次 独 立 测 试 结 果 的 绝 对 差 值 不 得 超 过 算 术 平 均 值 的 15% 6.2 回 收 率 和 精 密 度 四 家 实 验 室 的 方 法 回 收 率 为 90.2%~116.7%, 相 对 标 准 偏 差 小 于 10.0 % 7 图 谱 图 1 丙 烯 酰 胺 标 准 溶 液 的 HPLC-MS/MS 质 谱 图 1: 丙 烯 酰 胺 ;2: 内 标 4

5 化 妆 品 中 丙 烯 酰 胺 的 检 测 方 法 修 订 说 明 为 进 一 步 完 善 化 妆 品 中 禁 限 用 物 质 检 测 方 法 标 准 体 系, 加 强 化 妆 品 中 禁 限 用 物 质 的 监 督 管 理, 受 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 委 托, 我 所 对 化 妆 品 中 丙 烯 酰 胺 检 测 方 法 进 行 修 订 完 善, 现 就 方 法 完 善 工 作 有 关 情 况 说 明 如 下 : 1 方 法 完 善 的 必 要 性 目 前 化 妆 品 中 丙 烯 酰 胺 的 法 定 测 定 方 法 为 国 食 药 监 许 [2011]96 号 文 附 件 1 该 方 法 样 品 前 处 理 时 间 长, 净 化 效 果 不 佳, 在 一 部 分 样 品 测 定 中 方 法 灵 敏 度 差, 不 能 满 足 限 度 要 求 为 解 决 上 述 问 题, 有 必 要 对 化 妆 品 中 丙 烯 酰 胺 检 测 方 法 进 行 完 善 2 修 订 依 据 及 文 献 (1) 化 妆 品 卫 生 规 范 (2007 年 版 ) (2) 国 食 药 监 许 [2011]96 号 文 附 件 1 (3) 金 薇, 李 薇, 江 文 明, 等. 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 测 定 化 妆 品 中 丙 烯 酰 胺 单 体 残 留 量, 药 物 分 析 杂 志,2010,30(10): 1887~1890 (4) 马 强, 王 超, 白 桦, 等. 同 位 素 稀 释 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 测 定 化 妆 品 中 残 留 的 丙 烯 酰 胺, 色 谱,2009,27(6): 856~859 3 修 订 原 则 本 检 测 方 法 尽 量 采 用 目 前 化 妆 品 检 测 实 验 室 普 遍 具 备 的 先 进 的 分 析 技 术, 选 择 准 确 可 行 简 便 经 济 的 分 析 条 件, 保 证 检 测 方 法 的 可 操 作 性 和 重 现 性 4 修 订 过 程 受 中 检 院 委 托, 我 所 对 化 妆 品 中 丙 烯 酰 胺 的 检 测 方 法 进 行 了 完 善 研 究 首 先 对 现 有 方 法 的 缺 陷 进 行 了 整 理 其 次 选 择 存 在 这 些 缺 陷 的 样 品, 分 别 从 样 品 前 处 理 方 法 仪 器 分 析 方 法 进 行 优 化 处 理 再 分 别 考 察 了 液 态 水 基 类 液 态 油 基 类 凝 胶 类 膏 霜 乳 液 类 粉 类 化 妆 品 的 前 处 理 方 法 和 仪 器 分 析 方 法, 最 终 形 成 了 可 克 服 现 有 方 法 缺 陷 的 检 测 方 法 建 立 的 方 法 分 别 经 浙 江 省 食 品 药 品 检 验 研 究 院 辽 宁 省 药 品 检 验 检 测 院 广 西 壮 族 自 治 区 食 品 药 品 检 验 所 进 行 了 验 证 复 核 5 重 点 说 明 的 问 题 5

6 (1) 关 于 体 例 本 检 测 方 法 的 体 例 主 要 参 照 国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 已 发 布 的 化 妆 品 中 禁 限 用 物 质 检 测 方 法 的 体 例, 便 于 化 妆 品 检 验 领 域 相 关 检 验 人 员 的 阅 读 和 实 际 操 作 (2) 关 于 检 测 方 法 的 建 立 和 验 证 色 谱 柱 的 选 择 是 本 方 法 的 关 键 之 一 若 减 小 色 谱 柱 的 内 径 至 液 质 联 用 法 中 常 用 的 2.1 mm, 则 在 进 样 体 积 为 10μL 时, 峰 形 将 变 差 另 外, 若 色 谱 柱 的 柱 效 低 于 本 方 法 的 柱 效, 则 可 能 存 在 较 强 的 基 质 效 应 (3) 关 于 定 性 离 子 由 于 各 子 离 子 在 不 同 厂 家 的 液 质 联 用 仪 中 存 在 响 应 差 异, 因 此 设 定 m/z 27.0 m/z 44.0 m/z 54.0 作 为 参 考 定 性 离 子, 各 实 验 室 可 根 据 实 际 情 况 选 择 定 性 离 子, 以 满 足 检 测 灵 敏 度 的 需 要 6

7 化 妆 品 中 丙 烯 酰 胺 的 检 测 方 法 编 制 说 明 1 任 务 来 源 根 据 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 与 上 海 市 食 品 药 品 检 验 所 签 订 的 协 议, 上 海 市 食 品 药 品 检 验 所 承 担 化 妆 品 中 丙 烯 酰 胺 的 检 测 方 法 完 善 工 作 2 研 究 背 景 丙 烯 酰 胺 是 一 种 无 色 无 味 的 结 晶 性 固 体, 对 人 体 具 有 神 经 毒 性 致 癌 毒 性 及 致 畸 毒 性 丙 烯 酰 胺 可 用 于 合 成 聚 丙 烯 酰 胺 等 聚 合 物 聚 丙 烯 酰 胺 本 身 并 无 毒 性, 在 化 妆 品 中 具 有 多 种 用 途, 例 如, 可 用 作 稳 定 剂 起 泡 剂 润 滑 剂, 但 残 留 的 丙 烯 酰 胺 单 体 常 被 发 现 存 在 于 化 妆 品 中 因 此, 有 必 要 对 化 妆 品 中 的 丙 烯 酰 胺 单 体 进 行 严 格 监 控 目 前 我 国 化 妆 品 卫 生 规 范 (2007 年 版 ) 规 定 驻 留 类 护 肤 产 品 中 丙 烯 酰 胺 单 体 残 留 量 不 得 过 0.1 mg/kg, 其 它 产 品 的 限 量 为 0.5 mg/kg [1] 3 研 究 现 状 目 前 化 妆 品 中 丙 烯 酰 胺 的 测 定 方 法 有 GC 法 [2] [3] [4-7] HPLC 法 和 LC-MS/MS 法 等 GC 法 和 HPLC 法 的 灵 敏 度 与 专 属 性 较 差, 不 能 满 足 测 定 要 求 LC-MS/MS 法 是 目 前 化 妆 品 中 丙 烯 酰 胺 的 主 要 测 定 方 法, 但 由 于 丙 烯 酰 胺 极 性 较 强, 在 普 通 C 18 柱 上 保 留 能 力 较 差, 且 化 妆 品 中 的 极 性 基 质 较 多, 故 在 LC-MS/MS 测 定 中 常 发 生 较 强 的 基 质 抑 制 效 应, 造 成 方 法 灵 敏 度 不 能 满 足 要 求 另 外, 由 于 丙 烯 酰 胺 极 性 较 强, 故 提 取 溶 剂 主 要 为 水 以 水 为 提 取 溶 剂 时, 有 些 样 品 的 提 取 液 难 以 离 心 分 层, 在 过 滤 和 固 相 萃 取 时 因 阻 力 过 大 而 无 法 进 一 步 实 验 [7] 有 文 献 采 用 极 性 有 机 溶 剂 ( 丙 酮 ) 提 取 化 妆 品 中 的 丙 烯 酰 胺, 吹 干 复 溶 后 直 接 测 定 或 以 固 相 萃 取 技 术 进 一 步 净 化 后 测 定 但 固 相 萃 取 法 分 析 成 本 较 高, 前 处 理 时 间 较 长, 部 分 样 品 仍 存 在 较 强 的 基 质 抑 制 效 应 因 此, 有 必 要 对 现 有 方 法 进 行 完 善 研 究 本 课 题 拟 在 现 有 方 法 的 基 础 上, 优 化 前 处 理 方 法 和 仪 器 分 析 方 法, 建 立 耐 用 性 较 强 的 丙 烯 酰 胺 测 定 方 法 4 方 法 概 述 4.1 仪 器 超 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 配 备 自 动 进 样 器 二 元 泵 脱 气 机, 美 国 Waters 公 司 ); API 4000 质 谱 仪 ( 美 国 AB SCIEX 公 司 ); 超 高 效 液 相 色 谱 仪 与 质 谱 仪 串 联 MS3 涡 旋 振 荡 器 ( 德 国 IKA 公 司 ) 5810R 离 心 机 ( 德 国 Eppendorf 公 司 ) 7

8 4.2 试 剂 丙 烯 酰 胺 标 准 品 (Dr. Ehrenestorfer GmBH 公 司, 批 号 90806, 纯 度 99.5%) 氘 代 丙 烯 酰 胺 (2,3,3-D3)(ALDRICH 公 司, 批 号 SZ2027, 纯 度 98%) 甲 醇 甲 酸 ( 色 谱 纯 ) 石 油 醚 (30 ~ 60 )( 分 析 纯 ) 甲 酸 ( 色 谱 纯 ) 4.3 方 法 色 谱 条 件 色 谱 柱 :Prodigy C 18 柱 (4.6 mm 150 mm, 3.0 μm), 或 等 效 色 谱 柱 ; 流 动 相 A:0.05% 甲 酸 溶 液 ; 流 动 相 B: 甲 醇 ; 流 动 相 梯 度 洗 脱 程 序 见 表 1; 表 1 流 动 相 梯 度 洗 脱 程 序 时 间 /min V( 流 动 相 A)/% V( 流 动 相 B)/% 流 速 :0.3 ml/min; 柱 温 :25 ; 进 样 量 :10 μl 质 谱 条 件 离 子 源 : 电 喷 雾 离 子 源 (ESI 源 ); 监 测 模 式 : 正 离 子 监 测 模 式 ; 离 子 源 喷 雾 电 压 (IS):5500 V; 气 帘 气 压 力 (CUR):45 psi; 雾 化 气 压 力 (GS1):80 psi; 辅 助 气 压 力 (GS2):60 psi; 离 子 源 温 度 (TEM):600 ; 其 它 质 谱 条 件 参 见 表 2; 8

9 表 2 三 重 四 极 杆 离 子 对 及 相 关 电 压 参 数 设 定 表 编 号 物 质 名 称 母 离 子 (m/z) 去 簇 电 压 (V) 子 离 子 (m/z) CE(V) 1 丙 烯 酰 胺 * 内 标 注 : * 为 定 量 离 子 标 准 系 列 溶 液 的 制 备 分 别 精 密 吸 取 10.0 µg/ml 的 标 准 工 作 溶 液 2.0 µl 5.0 µl 10 µl 20 µl 50 µl 100 µl 200 µl, 置 于 不 同 的 10 ml 容 量 瓶 中, 分 别 精 密 加 入 1.0 μg/ml 的 内 标 工 作 溶 液 200 μl, 用 水 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 配 制 得 浓 度 分 别 为 2.0 ng/ml 5.0 ng/ml 10 ng/ml 20 ng/ml 50 ng/ml 100 ng/ml 200 ng/ml 的 标 准 系 列 溶 液, 内 标 浓 度 为 20 ng/ml 样 品 处 理 称 取 样 品 1.0 g, 精 密 加 入 1.0 μg/ml 的 内 标 工 作 溶 液 200 μl, 涡 旋 30 s, 加 水 10 ml 石 油 醚 (30 ~ 60 )10 ml, 涡 旋 1 min, 超 声 处 理 10 min, 于 r/min 离 心 10 min, 取 水 层 3 ml, 加 5% 甲 酸 溶 液 60 µl 石 油 醚 (30 ~ 60 )3 ml, 涡 旋 30 s, 于 r/min 离 心 10 min, 取 水 层, 过 0.22 µm 微 孔 滤 膜, 滤 液 作 为 待 测 溶 液 计 算 根 据 峰 面 积, 于 校 准 曲 线 上 得 出 丙 烯 酰 胺 的 质 量 浓 度 若 样 品 中 丙 烯 酰 胺 浓 度 超 出 标 准 曲 线 上 限, 应 适 当 减 小 取 样 量 后 再 重 新 测 定 5 方 法 研 究 5.1 样 品 前 处 理 现 行 标 准 的 缺 陷 目 前 丙 烯 酰 胺 的 法 定 检 验 方 法 为 国 食 药 监 许 [2011]96 号 文 附 件 1 [6] 该 方 法 主 要 以 乙 腈 作 为 溶 剂 进 行 样 品 的 提 取, 但 缺 点 是 部 分 样 品 的 方 法 灵 敏 度 差, 不 能 满 足 限 度 要 求 另 有 GB/T [7] 分 别 采 用 HPLC 法 和 LC-MS/MS 法 测 定 化 妆 品 中 的 丙 烯 酰 胺, 但 HPLC 法 的 灵 敏 度 不 高, 不 能 满 足 测 定 要 求 ;LC-MS/MS 法 需 要 丙 酮 提 取 - 固 相 萃 取 步 骤, 成 本 较 高, 前 处 理 时 间 较 长, 部 分 样 品 的 固 相 萃 取 净 化 效 果 不 佳, 在 LC-MS/MS 测 定 中 存 在 较 强 的 基 质 抑 制 效 应 文 献 方 法 的 缺 陷 [3] 有 文 献 报 道 以 固 相 萃 取 方 法 进 行 样 品 前 处 理 但 缺 点 是 部 分 样 品 水 提 液 以 滤 膜 过 滤 时

10 存 在 困 难, 浑 浊 的 溶 液 上 样 后 流 速 极 慢, 无 法 进 行 后 续 操 作 另 外, 固 相 萃 取 的 分 析 成 本 较 高, 故 暂 不 考 虑 [4] 另 有 文 献 报 道 以 0.1% 甲 酸 溶 液 石 油 醚 (30 ~ 60 ) 作 为 提 取 溶 剂 进 行 样 品 的 前 处 理, 但 缺 点 是 部 分 样 品 溶 液 以 滤 膜 过 滤 时 存 在 困 难 我 所 的 方 法 摸 索 本 研 究 先 将 样 品 加 水 石 油 醚 (30 ~ 60 ) 进 行 提 取, 离 心 石 油 醚 (30 ~ 60 ) 的 作 用 主 要 是 帮 助 样 品 分 散 并 去 除 一 部 分 脂 溶 性 基 质 离 心 后 的 水 层 液 加 甲 酸 的 目 的 是 帮 助 化 妆 品 中 酸 不 溶 性 成 分 的 析 出 此 时 部 分 样 品 的 提 取 液 以 滤 膜 过 滤 时 仍 阻 力 较 大, 但 再 加 石 油 醚 (30 ~ 60 ) 提 取 后, 以 滤 膜 过 滤 时 阻 力 明 显 变 小, 滤 液 体 积 可 满 足 进 样 需 求 取 样 品, 分 别 加 水 甲 酸, 使 甲 酸 的 含 量 分 别 为 0.1% 0.5%, 再 加 石 油 醚 (30 ~ 60 ), 涡 旋 离 心, 结 果 甲 酸 浓 度 为 0.1% 的 样 品 溶 液 分 层 效 果 较 好, 水 提 液 较 易 滤 过, 因 此, 将 甲 酸 的 浓 度 定 为 0.1% 取 样 品, 加 水 后 分 别 加 二 氯 甲 烷 石 油 醚 (30 ~ 60 ) 进 行 涡 旋 离 心, 取 水 液 进 行 液 质 联 用 分 析, 结 果 加 石 油 醚 (30 ~ 60 ) 的 样 品 响 应 较 高 因 此, 选 择 石 油 醚 (30 ~ 60 ) 进 行 脂 溶 性 成 分 的 提 取 5.2 流 动 相 有 机 相 的 选 择 分 别 选 择 甲 醇 乙 腈 进 行 试 验, 结 果 以 乙 腈 为 有 机 相 时, 虽 然 丙 烯 酰 胺 的 峰 形 较 好, 但 保 留 时 间 较 短, 易 受 到 基 质 的 干 扰, 导 致 响 应 变 弱 ; 减 小 流 动 相 中 乙 腈 的 含 量 后, 虽 可 延 长 丙 烯 酰 胺 的 保 留 时 间, 但 流 动 相 中 乙 腈 的 含 量 偏 少, 不 利 于 色 谱 柱 的 保 护 若 选 择 甲 醇 为 有 机 相, 丙 烯 酰 胺 的 保 留 时 间 增 长, 有 利 于 丙 烯 酰 胺 与 干 扰 基 质 的 分 离, 并 且 流 动 相 中 的 甲 醇 含 量 保 持 在 10% 以 上, 有 利 于 色 谱 柱 的 保 护, 因 此 选 择 甲 醇 作 为 有 机 相 水 相 的 选 择 水 相 的 选 择 主 要 考 察 水 中 不 同 甲 酸 浓 度 的 影 响 以 甲 醇 为 有 机 相, 分 别 以 0.01% 甲 酸 溶 液 0.02% 甲 酸 溶 液 0.05% 甲 酸 溶 液 0.1% 甲 酸 溶 液 0.3% 甲 酸 溶 液 为 水 相, 考 察 丙 烯 酰 胺 在 实 际 样 品 中 的 分 析 效 果 选 择 的 实 际 样 品 为 以 国 食 药 监 许 [2011]96 号 文 附 件 1 方 法 检 测 时 基 质 抑 制 效 应 较 高 的 样 品 结 果 不 同 浓 度 的 甲 酸 溶 液 不 影 响 丙 烯 酰 胺 的 保 留 时 间, 但 可 影 响 样 品 基 质 中 干 扰 成 分 的 保 留, 从 而 影 响 丙 烯 酰 胺 在 实 际 样 品 中 的 响 应 在 水 相 为 0.05% 甲 酸 溶 液 时, 丙 烯 酰 胺 的 响 应 最 高, 基 质 抑 制 效 应 最 小 因 此, 选 择 0.05% 甲 酸 溶 液 作 为 水 相 10

11 5.3 色 谱 柱 的 选 择 本 研 究 曾 选 择 4 种 色 谱 柱 对 基 质 抑 制 效 应 较 强 的 3 个 膏 霜 类 样 品 1 个 液 态 油 基 类 样 品 进 行 试 验, 色 谱 柱 分 别 为 :(1)HSS T3 柱 (1.8 μm, 2.1 mm 100 mm) (2)Capcell core C 18 柱 ( 2.7 μm, 4.6 mm 150 mm) (3)Poroshell 120 EC-C 18 柱 ( 2.7 μm, 4.6 mm 100 mm) (4) Prodigy C 18 柱 (3.0 μm,4.6 mm 150 mm), 流 动 相 均 为 甲 醇 -0.05% 甲 酸 溶 液 (10:90), 结 果 丙 烯 酰 胺 在 色 谱 柱 (4) 上 的 保 留 时 间 最 长, 基 质 抑 制 效 应 最 小, 因 此 选 择 色 谱 柱 (4) 作 为 分 析 柱 5.4 监 测 离 子 的 选 择 国 食 药 监 许 [2011]96 号 文 附 件 1 规 定 了 丙 烯 酰 胺 的 监 测 离 子 对 为 m/z 72.0 m/z 55.0 m/z 72.0 m/z 44.0 及 m/z 72.0 m/z 27.0 在 实 际 样 品 中,m/z 72.0 m/z 55.0 的 响 应 较 高, 适 于 定 量 分 析, 但 m/z 72.0 m/z 44.0 和 m/z 72.0 m/z 27.0 的 本 底 信 号 均 较 高, 信 噪 比 低, 不 能 满 足 灵 敏 度 要 求 经 扫 描 丙 烯 酰 胺 的 子 离 子, 发 现 子 离 子 除 m/z 44.0 和 m/z 27.0 外, 尚 有 m/z 54.0( 见 图 1) [8,9] 经 试 验, m/z 54 的 本 底 信 号 较 低, 信 噪 比 较 高 ( 见 图 2), 可 满 足 灵 敏 度 要 求 因 此, 本 研 究 选 择 m/z 72.0 m/z 55.0 和 m/z 72.0 m/z 54.0 作 为 监 测 离 子 对 由 于 丙 烯 酰 胺 在 不 同 厂 家 的 质 谱 仪 中 具 有 不 同 的 碎 片 离 子 响 应, 故 在 检 验 方 法 正 文 中 同 时 列 出 m/z 72.0 m/z 54.0 m/z 72.0 m/z 44.0 及 m/z 72.0 m/z 27.0 三 种 定 性 离 子 对, 不 同 检 测 机 构 可 根 据 实 际 情 况 进 行 选 择 图 1 丙 烯 酰 胺 的 子 离 子 扫 描 图 11

12 图 2 加 标 样 品 (0.05mg/kg) 典 型 MRM 图 注 : 丙 烯 酰 胺 m/z 72.0 m/z 54.0 图 谱 经 过 平 滑 处 理 5.5 方 法 特 异 性 分 别 取 液 态 水 基 类 液 态 油 基 类 凝 胶 类 膏 霜 乳 液 类 粉 类 5 个 基 质 的 空 白 样 品, 依 法 测 定, 结 果 5 种 化 妆 品 基 质 中 存 在 的 物 质 对 丙 烯 酰 胺 的 测 定 无 干 扰 ( 见 图 3) 图 3 空 白 样 品 的 典 型 MRM 图 5.6 线 性 范 围 在 设 定 条 件 下, 取 浓 度 (X) 为 2.0 ng/ml 5.0 ng/ml 10 ng/ml 20 ng/ml 50 ng/ml 100 ng/ml 200 ng/ml 的 标 准 溶 液 ( 内 标 浓 度 均 为 20 ng/ml), 进 样 测 定, 计 算 丙 烯 酰 胺 与 12

13 其 内 标 的 峰 面 积 比 (Y)( 见 表 3), 以 Y 对 X 进 行 线 性 回 归 计 算, 结 果 线 性 良 好, 线 性 方 程 为 Y = X (r = , 权 重 系 数 = 1/X) 表 3 不 同 浓 度 下 丙 烯 酰 胺 与 其 内 标 的 响 应 比 相 同 浓 度 下 样 品 中 丙 烯 酰 胺 浓 度 峰 面 积 比 丙 烯 酰 胺 浓 度 与 其 内 标 的 (ng/ml) (Y) 与 其 内 标 的 (mg/kg) 浓 度 比 响 应 比 响 应 比 响 应 比 平 均 值 RSD 重 复 性 试 验 取 液 态 水 基 类 液 态 油 基 类 凝 胶 类 膏 霜 乳 液 类 粉 类 5 个 不 同 基 质 的 空 白 样 品, 分 别 加 入 10 µg/ml 的 标 准 溶 液 10 µl, 振 荡 混 匀 后, 静 置 2 h, 制 得 浓 度 为 0.1 mg/kg 的 加 标 样 品, 然 后 按 供 试 品 溶 液 的 处 理 方 法 进 行 操 作, 计 算 含 量 及 其 相 对 标 准 偏 差 (RSD) 结 果 ( 见 表 4) 表 明 方 法 重 复 性 良 好 表 4 方 法 重 复 性 实 验 结 果 基 质 类 型 添 加 水 平 测 得 含 量 (mg/kg) RSD (mg/kg) 平 均 (%) 水 基 油 基 凝 胶 霜 粉 精 密 度 试 验 日 内 精 密 度 试 验 取 液 态 水 基 类 空 白 样 品, 分 别 加 入 10 µg/ml 的 标 准 溶 液 µl, 振 荡 混 匀 后, 静 置 2 h, 制 得 浓 度 分 别 为 0.03mg/kg 1 mg/kg 的 加 标 样 品, 然 后 按 供 试 品 溶 液 的 处 理 方 法 进 行 操 作, 制 得 低 浓 度 精 密 度 试 验 用 供 试 品 溶 液 和 高 浓 度 精 密 度 试 验 用 供 试 品 溶 液 连 续 进 样 6 次, 计 算 含 量 及 其 RSD 结 果 ( 见 表 5) 表 明 日 内 精 密 度 良 好 13

14 表 5 日 内 精 密 度 试 验 结 果 编 号 添 加 水 平 (mg/kg) 平 均 RSD(%) 日 间 精 密 度 试 验 取 液 态 水 基 类 空 白 样 品, 分 别 精 密 加 入 10 µg/ml 的 标 准 溶 液 5 µl 20 µl, 振 荡 混 匀 后, 静 置 2 h, 制 得 浓 度 分 别 为 0.05 mg/kg 0.2 mg/kg 的 加 标 样 品, 然 后 按 供 试 品 溶 液 的 处 理 方 法 进 行 操 作, 进 样 测 定 每 个 浓 度 每 天 制 备 2 份 溶 液 进 行 测 定, 共 测 定 4 天 计 算 测 得 含 量 平 均 值 的 RSD 结 果 ( 见 表 6) 表 明 日 间 精 密 度 良 好 表 6 日 间 精 密 度 试 验 结 果 添 加 水 平 测 得 含 量 (mg/kg) 平 均 RSD(%) 0.05mg/kg mg/kg 稳 定 性 试 验 日 内 稳 定 性 试 验 取 液 态 水 基 类 液 态 油 基 类 凝 胶 类 膏 霜 乳 液 类 粉 类 5 个 不 同 基 质 的 空 白 样 品, 分 别 加 入 10 µg/ml 的 标 准 溶 液 µl, 振 荡 混 匀 后, 静 置 2 h, 制 得 浓 度 分 别 为 0.1 mg/kg 1 mg/kg 的 加 标 样 品, 然 后 按 供 试 品 溶 液 的 处 理 方 法 进 行 操 作 在 一 天 内 分 数 次 进 样 测 定, 计 算 含 量 及 其 RSD 结 果 ( 见 表 7) 供 试 品 溶 液 在 24h 内 基 本 保 持 稳 定 表 7 日 内 稳 定 性 试 验 结 果 基 质 水 基 油 基 凝 胶 霜 粉 14

15 类 型 时 间 浓 度 (mg/kg) 浓 度 (mg/kg) 浓 度 (mg/kg) 浓 度 (mg/kg) 浓 度 (mg/kg) (h) 平 均 值 RSD 日 间 稳 定 性 试 验 取 液 态 水 基 类 液 态 油 基 类 凝 胶 类 膏 霜 乳 液 类 粉 类 5 个 不 同 基 质 的 空 白 样 品, 分 别 加 入 10 µg/ml 的 标 准 溶 液 µl, 振 荡 混 匀 后, 静 置 2 h, 制 得 浓 度 分 别 为 0.1 mg/kg 1 mg/kg 的 加 标 样 品, 然 后 按 供 试 品 溶 液 的 处 理 方 法 进 行 操 作 每 天 测 定 1 次, 计 算 含 量 及 其 RSD 结 果 ( 见 表 8) 供 试 品 溶 液 在 4 天 内 基 本 保 持 稳 定 表 8 日 间 稳 定 性 试 验 结 果 基 质 类 型 水 基 油 基 凝 胶 霜 粉 时 间 浓 度 (mg/kg) 浓 度 (mg/kg) 浓 度 (mg/kg) 浓 度 (mg/kg) 浓 度 (mg/kg) (h) 第 1 天 第 2 天 第 3 天 第 4 天 平 均 值 RSD 最 低 检 出 浓 度 (LOD) 和 最 低 定 量 浓 度 (LOQ) 分 别 取 液 态 水 基 类 液 态 油 基 类 凝 胶 类 膏 霜 乳 液 类 粉 类 5 个 基 质 的 样 品 进 行 LOD 和 LOQ 测 定 取 上 述 样 品, 分 别 精 密 加 入 不 同 量 的 丙 烯 酰 胺, 涡 旋 混 匀 后 依 法 测 定, 计 算 m/z 72.0 m/z 55.0 的 信 噪 比 结 果 在 丙 烯 酰 胺 添 加 浓 度 为 0.01 mg/kg 时, 信 噪 比 约 为 3( 见 图 4), 在 添 加 浓 度 为 0.03 mg/kg 时, 信 噪 比 约 为 10 分 别 以 信 噪 比 为 3 10 时 的 浓 度 作 为 LOD LOQ, 结 果 LOD LOQ 分 别 为 0.01 mg/kg 0.03 mg/kg LOD LOQ 满 足 化 妆 品 卫 生 规 范 (2007 年 版 ) 的 要 求 15

16 图 4 加 标 样 品 (0.01mg/kg) 典 型 MRM 图 注 : 丙 烯 酰 胺 m/z 72.0 m/z 54.0 图 谱 经 过 平 滑 处 理 5.11 准 确 度 取 液 态 水 基 类 液 态 油 基 类 凝 胶 类 膏 霜 乳 液 类 粉 类 5 个 不 同 基 质 的 空 白 样 品, 分 别 加 入 10 µg/ml 的 标 准 溶 液 µl, 振 荡 混 匀 后, 静 置 2 h, 制 得 浓 度 分 别 为 0.03mg/kg 0.1 mg/kg 1 mg/kg 的 加 标 样 品, 然 后 按 供 试 品 溶 液 的 处 理 方 法 进 行 操 作, 以 标 准 曲 线 计 算 回 收 率 及 其 RSD 结 果 ( 见 表 9) 回 收 率 良 好 表 9 5 种 基 质 的 加 标 回 收 率 结 果 基 质 类 型 水 基 油 基 凝 胶 霜 粉 添 加 水 平 回 收 率 (%) RSD (mg/kg) 平 均 (%) 样 品 测 定 16

17 利 用 本 法, 对 265 批 包 含 上 述 5 种 基 质 的 样 品 进 行 测 定, 结 果 :(1) 滤 过 均 不 存 在 明 显 困 难, 个 别 样 品 的 滤 液 较 少, 可 装 在 内 衬 管 中 以 满 足 进 样 要 求 ;(2) 由 于 丙 烯 酰 胺 的 响 应 约 为 内 标 响 应 的 80%( 见 表 3), 故 可 根 据 内 标 的 响 应 判 断 丙 烯 酰 胺 在 特 定 样 品 中 的 灵 敏 度 ; 与 标 准 溶 液 中 内 标 的 响 应 相 比, 所 有 样 品 中 内 标 的 响 应 均 较 好, 故 可 判 断 265 批 样 品 中 丙 烯 酰 胺 的 灵 敏 度 均 符 合 要 求 ;(3)28 批 样 品 中 检 出 丙 烯 酰 胺, 但 均 不 大 于 0.1 mg/kg( 见 表 10), 另 外 1 批 面 膜 样 品 中 检 出 含 丙 烯 酰 胺 8.0 mg/kg, 超 出 限 度 要 求 ;(4) 经 过 试 验 表 明, 本 法 样 品 前 处 理 操 作 简 便 回 收 率 高 色 谱 峰 重 现 性 好 ( 见 图 5) m/z 图 5 典 型 样 品 色 谱 图 1: 丙 烯 酰 胺 ;2: 内 标 表 批 样 品 测 定 结 果 17

18 编 号 样 品 名 称 测 得 结 果 (mg/kg) 1 净 化 美 白 霜 橄 榄 精 油 嫩 白 沐 浴 露 润 白 洁 面 啫 喱 修 复 晚 霜 营 养 滋 润 霜 紧 实 眼 袋 眼 霜 长 翘 睫 毛 膏 五 色 眼 影 婴 儿 洗 发 沐 浴 露 婴 儿 柔 嫩 沐 浴 露 儿 童 防 晒 霜 美 白 洗 面 奶 婴 儿 泡 泡 浴 露 美 白 精 华 液 婴 儿 沐 浴 露 儿 童 清 凉 沐 浴 露 幼 嫩 安 敏 低 泡 洗 发 沐 浴 露 紧 致 特 润 修 护 精 华 眼 霜 浓 密 睫 毛 膏 花 萃 嫩 白 保 湿 洗 颜 霜 柔 白 清 润 洁 面 乳 美 白 保 湿 乳 薰 衣 草 美 白 霜 珍 珠 粉 面 膜 透 白 乳 液 修 复 晚 霜 控 油 洗 面 奶 植 物 精 华 霜 其 它 化 妆 品 基 质 类 别 的 研 究 情 况 简 介 化 妆 品 中 添 加 了 以 丙 烯 酰 胺 为 合 成 单 体 的 原 料, 从 而 不 可 避 免 地 带 有 微 量 的 丙 烯 酰 胺 的 单 体 残 留 物, 进 而 在 化 妆 品 中 检 出 丙 烯 酰 胺 可 能 会 用 到 这 些 原 料 的 化 妆 品 主 要 有 膏 霜 乳 液 类 液 态 水 剂 类 及 凝 胶 类 样 品, 少 数 粉 类 样 品 及 个 别 液 态 油 基 类 样 品 从 历 年 日 常 监 督 的 产 品 类 型 及 基 质 ( 约 2000 余 批 次 ) 来 看, 需 要 进 行 丙 烯 酰 胺 检 验 的 样 品 一 般 也 仅 是 针 对 膏 霜 乳 液 类 液 态 水 剂 类 凝 胶 类 粉 类 及 液 态 油 基 类 样 品, 并 未 涉 及 液 态 气 雾 剂 类 液 态 有 机 溶 剂 类 及 蜡 基 类 3 类 基 质 的 样 品 本 研 究 曾 取 液 态 气 雾 剂 类 液 态 有 机 溶 剂 类 及 蜡 基 类 3 类 化 妆 品 样 品 同 步 进 行 了 研 究, 但 由 于 这 3 类 样 品 的 基 质 类 型 特 殊, 即 使 反 复 摸 索 ( 改 变 净 化 方 法 调 节 流 动 相 比 例 更 换 色 谱 柱 及 优 化 质 谱 参 数 等 ), 其 检 测 灵 敏 度 和 回 收 率 难 以 满 足 要 求 18

19 综 上, 本 方 法 经 研 究 验 证, 现 将 方 法 适 用 范 围 限 定 为 膏 霜 乳 液 类 液 态 水 剂 类 凝 胶 类 粉 类 及 液 态 油 基 类 样 品, 可 以 适 应 普 遍 的 实 际 检 验 需 求 而 液 态 气 雾 剂 类 液 态 有 机 溶 剂 类 及 蜡 基 类 3 类 基 质 由 于 上 述 原 因 未 被 纳 入 适 用 范 围 5.14 验 证 结 果 评 价 浙 江 省 食 品 药 品 检 验 研 究 院 辽 宁 省 药 品 检 验 检 测 院 广 西 壮 族 自 治 区 食 品 药 品 检 验 所 按 照 化 妆 品 中 禁 用 物 质 和 限 用 物 质 检 测 方 法 验 证 技 术 规 范 ( 国 食 药 监 许 [2010]455 号 文 ) 的 要 求 分 别 对 修 订 后 的 方 法 进 行 了 验 证 结 果 表 明, 本 方 法 在 0.02 mg/kg ~ 2 mg/kg 范 围 内 线 性 关 系 良 好, 若 取 1.0g 样 品 进 行 测 定, 本 方 法 最 低 检 出 浓 度 为 0.01 mg/k, 最 低 定 量 浓 度 为 0.03 mg/kg 经 验 证, 该 方 法 的 特 异 性 最 低 检 出 浓 度 线 性 范 围 回 收 率 精 密 度 稳 定 性 重 复 性 等 各 项 指 标 均 满 足 国 食 药 监 许 [2010]455 号 化 妆 品 中 禁 用 物 质 和 限 用 物 质 检 测 方 法 验 证 技 术 规 范 要 求 关 于 丙 烯 酰 胺 子 离 子 的 选 择, 由 于 各 子 离 子 在 不 同 厂 家 的 液 质 联 用 仪 中 存 在 响 应 差 异, 广 西 所 建 议 设 定 m/z 27.0 m/z 44.0 m/z 54.0 作 为 参 考 定 性 离 子, 各 实 验 室 可 根 据 实 际 情 况 选 择 定 性 离 子 以 满 足 检 测 灵 敏 度 的 需 要 我 所 同 意 采 纳 该 意 见 表 11 3 家 单 位 验 证 结 果 验 证 单 位 浙 江 院 辽 宁 院 广 西 所 线 性 良 好 良 好 良 好 重 复 性 (RSD,%) 0.8~ ~ ~1.2 日 内 精 密 度 (RSD,%) 0.5~ ~ ~0.8 日 间 精 密 度 (RSD,%) 1.2~ ~ ~2.6 日 内 稳 定 性 (RSD,%) 1.0~ ~ ~1.6 日 间 稳 定 性 (RSD,%) 0.4~ ~ ~2.2 回 收 率 (%) 90.5~ ~ ~99.2 最 低 检 出 浓 度 (mg/kg) 符 合 要 求 符 合 要 求 符 合 要 求 参 考 文 献 [1] 化 妆 品 卫 生 规 范 (2007 年 版 ):65 [2] 李 宏 亮, 詹 铭, 蒋 志 华, 等. 固 相 萃 取 - 衍 生 化 - 气 相 色 谱 法 测 定 化 妆 品 中 丙 烯 酰 胺. 中 国 卫 生 检 验 杂 志,2012,22 (7) : [3] 郭 新 东, 冼 燕 萍, 杜 志 峰, 等. 固 相 萃 取 - 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 化 妆 品 中 丙 烯 酰 胺. 日 用 化 学 工 业,2009,39 (4):294~296 19

20 [4] 金 薇, 李 薇, 江 文 明, 等. 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 测 定 化 妆 品 中 丙 烯 酰 胺 单 体 残 留 量, 药 物 分 析 杂 志,2010,30(10): 1887~1890 [5] 马 强, 王 超, 白 桦, 等. 同 位 素 稀 释 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 测 定 化 妆 品 中 残 留 的 丙 烯 酰 胺, 色 谱,2009,27(6): 856~859 [6] 国 食 药 监 许 [2011]96 号 文 附 件 1 [7] GB/T [8] E. Bermudo, E. Moyano, L. Puignou, et al. Determination of acrylamide in foodstuffs by liquid chromatography ion-trap tandem mass-spectrometry using an improved clean-up procedure. Analytica Chimica Acta, 2006, 559: [9] Eden Tareke, Per Rydberg, Patrik Karlsson, et al. Analysis of Acrylamide, a Carcinogen Formed in Heated Foodstuffs. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2002, 50: