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1 液 相 色 谱 / 质 谱 / 质 谱 (LC/MS/MS) 法 分 析 血 液 中 的 苯 二 氮 类 药 物 应 用 临 床 和 法 医 毒 理 学 作 者 azel Rivera and G. Stewart Walker Flinders University Adelaide, South Australia Australia Peter Stockham and D. oel Sims Forensic Science South Australia Adelaide, South Australia Australia John M. ughes Agilent Technologies, Inc. Pleasanton, CA USA 摘 要 本 文 报 导 了 一 个 用 安 捷 伦 公 司 的 液 相 色 谱 / 离 子 阱 质 谱 仪 (Agilent LC/MSD Trap) 同 时 扫 描 和 鉴 定 人 血 中 种 苯 二 氮 类 药 物 及 其 5 种 代 谢 物 的 高 灵 敏 及 高 选 择 性 的 方 法 该 方 法 先 使 用 液 - 液 萃 取, 然 后, 采 用 反 相 LC/MS/MS( 液 相 色 谱 / 串 接 质 谱 法 ) 该 技 术 适 用 于 筛 查 分 析, 仅 仅 需 要 5 µl 的 血 液, 使 用 安 捷 伦 的 原 有 型 号 ( 经 典 的 )LC/MSD 离 子 阱 质 谱 仪, 就 可 以 对 所 报 道 的 最 低 治 疗 浓 度 的 分 析 物 进 行 鉴 定, 并 具 有 高 置 信 度 该 方 法 已 成 功 地 应 用 于 低 浓 度 苯 二 氮 类 药 物 分 析 的 法 医 分 析 案 例 引 言 苯 二 氮 类 是 一 类 重 要 的 药 物, 具 有 广 泛 的 治 疗 效 果, 包 括 镇 痛 催 眠 抗 焦 虑 肌 肉 松 弛 和 抗 惊 厥 [] 由 于 它 们 的 广 泛 用 途, 苯 二 氮 类 药 物 有 可 能 与 其 它 中 枢 神 经 系 统 镇 静 剂 相 互 作 用, 后 者 可 危 及 生 命 或 损 害 健 康 苯 二 氮 类 药 物 现 在 是 最 常 用 的 处 方 药, 这 增 加 了 成 瘾 和 滥 用 的 可 能 性, 并 且 在 药 物 相 关 的 死 亡 事 件 或 药 物 驱 动 的 性 暴 力 案 例 中, 经 常 可 以 发 现 它 们 与 其 它 药 物 相 结 合 [] 由 于 这 些 原 因, 法 医 分 析 和 临 床 毒 理 学 家 对 苯 二 氮 类 药 物 的 检 测 具 有 很 大 的 兴 趣 免 疫 测 定 通 常 特 异 性 不 够 强, 或 者 对 于 低 剂 量 的 苯 二 氮 类 药 物 不 够 灵 敏, 特 别 在 血 液 里, 所 以 对 这 些 化 合 物 的 检 测 还 有 一 些 问 题 苯 二 氮 类 药 物 使 用 过 气 相 色 谱 / 氮 磷 检 测 器 (GC/PD)[] 气 相 色 谱 / 电 子 捕 获 检 测 器 (GC/ECD)[] 和 气 相 色 谱 / 质 谱 仪 (GC/MS)[,5] 进 行 检 测 许 多 苯 二 氮 类 药 物 都 是 极 性 和 热 不 稳 定 的, 这 使 得 它 们 不 可 能 或 难 于 不 经 过 衍 生 就 用 GC 或 GC/MS 分 析 某 些 化 合 物 不 能 通 过 衍 生 来 改 善 其 色 谱 行 为 苯 二 氮 类 药 物 的 筛 查 也 可 以 用 PLC 和 UV 检 测 来 完 成 [6], 但 该 技 术 缺 乏 法 医 分 析 应 用 所 需 的 灵 敏 度 和 特 异 性 而 且, 一 些 新 的 苯 二 氮 类 药 物, 如 氟 硝 西

2 泮, 有 很 低 的 治 疗 范 围 和 较 快 的 清 除 率, 因 此 需 要 在 更 低 水 平 鉴 定 液 相 色 谱 / 质 谱 (LC/MS) 是 用 于 分 析 这 个 系 列 的 化 合 物 的 理 想 技 术, 该 技 术 不 需 要 衍 生, 因 此, 节 省 时 间 费 用, 并 降 低 了 实 验 难 度 该 类 化 合 物 不 论 采 用 电 喷 雾 电 离 (ESI), 还 是 大 气 压 化 学 电 离 (APCI) 模 式, 都 能 很 好 地 被 电 离 因 此, 可 以 容 易 地 测 定 µg/ml 含 量 及 更 低 含 量 大 量 的 苯 二 氮 类 药 物 及 相 关 物 质 也 已 用 安 捷 伦 的 单 四 极 杆 液 相 色 谱 / 质 谱 仪 (LC/MSD), 以 APCI 和 选 择 离 子 检 测 (SIM) 模 式 进 行 了 测 定 [7] 安 捷 伦 LC/MSD 离 子 阱 的 全 扫 描 灵 敏 度 允 许 在 一 次 分 析 中 同 时 鉴 定 / 确 认 和 定 量, 并 且 多 反 应 监 测 (MRM) 模 式 能 进 行 复 杂 基 体 ( 如, 血 液 ) 中 更 具 特 异 性 的 检 测 本 项 研 究 在 一 次 分 析 中 测 定 了 种 苯 二 氮 类 药 物 及 5 种 代 谢 物 [ 表 ], 大 约 需 要 分 钟 本 文 源 自 澳 大 利 亚 实 验 室 中 进 行 的 工 作 及 以 前 出 版 的 参 考 文 献 8 表. 分 析 的 化 合 物 苯 二 氮 类 代 谢 物 阿 普 唑 仑 溴 西 泮 氯 巴 占 氯 硝 安 定 7- 氨 基 - 氯 硝 安 定 安 定 去 甲 西 泮 氟 硝 西 泮 7- 氨 基 - 氟 硝 西 泮 氟 胺 安 定 -desalkylflurazepam 劳 拉 西 泮 米 达 唑 仑 硝 基 安 定 7- 氨 基 - 硝 基 安 定 去 甲 羟 基 安 定 羟 基 安 定 三 唑 仑 普 拉 安 定 ( 内 标 ) 实 验 样 品 制 备 将 每 一 种 分 析 物 的 参 考 溶 液 进 行 混 合, 用 水 稀 释 并 加 入 到 不 含 药 物 的 血 液 中, 加 入 内 标, 来 制 备 每 一 种 药 物 低 中 和 高 治 疗 浓 度 的 校 准 溶 液 典 型 的 低 治 疗 浓 度 和 高 治 疗 浓 度 列 于 表 萃 取 方 法 与 GC/ECD 和 GC/MS 对 这 些 药 物 进 行 筛 分 时 所 用 的 方 法 一 样, 省 略 了 衍 生 步 骤, 最 后 残 渣 溶 于 初 始 流 动 相 而 不 是 一 种 典 型 的 GC 溶 剂 表. 分 析 物 的 浓 度 范 围 (mg/l 或 µg/ml) 苯 二 氮 / 代 谢 物 低 治 疗 浓 度 高 治 疗 浓 度 阿 普 唑 仑.. 溴 西 泮.8. 氯 巴 占. 氯 硝 安 定 氨 基 - 氯 硝 安 定.. 安 定.5 去 甲 西 泮.5 氟 硝 西 泮 氨 基 - 氟 硝 西 泮.. 氟 胺 安 定.5.8 -desalkylflurazepam..5 劳 拉 西 泮.. 米 达 唑 仑.8.5 硝 基 安 定.. 7- 氨 基 - 硝 基 安 定.. 去 甲 羟 基 安 定.5 羟 基 安 定. 三 唑 仑.. 在 一 个 装 有.5 ml 血 液 的 玻 璃 螺 旋 口 试 管 中, 加 入 5 µl 新 制 备 的 内 标 工 作 溶 液 (5 µg/ml 的 水 溶 液 ) 在 该 试 管 中 再 加 入.75 ml.5% 的 氨 水 溶 液 和 ml 的 - 氯 丁 烷, 然 后 将 试 管 中 溶 液 在 一 个 机 械 混 合 器 中 滚 动 分 钟 离 心 分 离 后, 取 出 溶 剂, 转 移 到 一 个 干 净 的 玻 璃 管 中 并 在 Jouan 离 心 蒸 发 器 中 蒸 发 至 干 残 渣 用 µl 流 动 相 溶 解 LC/MS/MS 仪 器 本 研 究 中 使 用 的 LC/MS/MS 系 统 包 括 Agilent 系 列 真 空 脱 气 机 二 元 泵 自 动 进 样 器 柱 温 箱 带 微 量 流 通 池 的 二 极 管 阵 列 检 测 器 (DAD) LC/MSD 离

3 子 阱 经 典 型 (G5A 型, 与 目 前 VL 型 性 能 相 当 ) 以 及 G97A APCI 源 全 部 系 统 控 制 和 数 据 分 析 由 Agilent LC/MS ChemStation 提 供 LC/MS 方 法 细 则 LC 条 件 色 谱 柱 : Agilent ZRBAX Eclipse XDB-C8, 5.6 mm, 5 µm(p/n ) 流 动 相 : A = mm 甲 酸 铵, p 9 水 溶 液 B = 甲 醇 流 速 :.7 ml/min 梯 度 : 5 分 钟 6% B 6 分 钟 开 始 % B 到 分 钟 % B 柱 后 - 时 间 ( 色 谱 柱 再 平 衡 ):5 分 钟 ( 足 以 使 保 留 时 间 重 复 ) 进 样 量 : 5 µl MS 条 件 离 子 源 : Positive APCI 雾 化 器 : 6 psig 汽 化 温 度 : C 干 燥 气 流 速 : 5 L/min 干 燥 气 温 渡 : 5 C 毛 细 管 电 压 : V 电 晕 针 电 流 : µa 扫 描 : m/z 5 平 均 数 : SPS 设 置 : 目 标 质 量 m/z 化 合 物 稳 定 性 6%(Skim : V, 毛 细 管 出 口 补 偿 电 压 :69 V) 离 子 阱 驱 动 %( 结 果 值 7) 母 离 子 分 离.5 u 宽 度 : 阈 值 : 5%( 对 这 些 化 合 物 为 75 m/z) MRM: 八 个 时 间 片 段 列 于 表 结 果 和 讨 论 讨 论 对 用 ESI 和 APCI 分 析 这 些 化 合 物 进 行 了 评 价 通 常, 两 者 对 于 该 方 法 需 要 的 低 治 疗 水 平 都 给 出 了 良 好 的 灵 敏 度 然 而, 氟 硝 西 泮 和 劳 拉 西 泮 两 者 在 ESI 中 响 应 较 低, 尽 管 流 动 相 在 合 理 的 时 间 内 给 出 了 最 好 的 色 谱 分 离 由 于 业 已 证 明 APCI 比 ESI 较 少 受 到 基 质 抑 制 的 影 响, 而 且 氟 硝 西 泮 和 劳 拉 西 泮 都 显 示 出 对 APCI 具 有 较 好 的 灵 敏 度, 所 以 它 被 选 择 为 更 适 合 的 离 子 化 方 法 对 各 种 流 动 相 进 行 了 评 价, 目 的 是 在 简 单 的 LC 方 法 合 理 的 短 运 行 时 间 以 及 分 析 物 的 色 谱 分 辨 率 的 最 大 化 之 间 选 择 最 好 的 折 中 条 件 条 件 选 择 包 括 等 梯 度 法 和 梯 度 洗 脱 法, 使 用 mm 甲 酸 铵 在 p 或 p 9, 或 使 用.% 甲 酸 一 旦 将 APCI 选 作 更 喜 欢 的 离 子 化 方 法, 甲 醇 将 是 比 乙 腈 更 有 利 的 有 机 组 分 选 项, 因 为 在 APCI 中 它 具 有 更 好 的 灵 敏 度 并 且 不 会 在 APCI 电 晕 针 上 沉 积 碳 乙 腈 比 甲 醇 的 气 相 碱 性 高 ; 因 为 在 APCI 里 离 子 化 发 生 在 气 相 ( 而 不 是 象 ESI 发 生 在 液 相 ), 乙 腈 可 同 分 析 物 分 子 竞 争 可 利 用 的 质 子 化 工 作 本 项 研 究 发 现 用 甲 醇 碱 性 水 相 作 为 有 机 相, 可 以 获 得 最 好 的 分 离 色 谱 峰 形 和 灵 敏 度 ZRBAX Eclipse C8 柱 在 这 个 流 动 相 的 有 效 p 上 是 长 期 稳 定 的 C8 固 定 相 被 证 实 有 充 分 的 保 留 能 力, 甚 至 对 极 性 代 谢 物 也 一 样 ;C8 会 需 要 更 长 的 运 行 时 间 重 组 初 始 流 动 相 中 样 品 的 提 取 物, 发 现 一 个 可 推 荐 用 于 PLC 的 实 例, 它 比 使 用 简 单 的 甲 醇 / 水 给 出 更 好 的 峰 形, 并 由 此 带 来 更 好 的 灵 敏 度 这 对 早 洗 脱 出 来 的 极 性 分 析 物 尤 为 重 要 选 择 普 拉 西 泮 为 合 适 的 内 标, 因 为 它 与 其 他 分 析 物 的 结 构 相 似, 而 且 它 在 澳 大 利 亚 是 非 处 方 药 向 MS/MS 注 入 5 µg/ml 的 单 一 化 合 物 溶 液, 来 确 定 每 个 分 析 物 的 最 佳 碎 片 幅 度, 增 加 碎 片 幅 度 直 到 母 离 子 强 度 减 少 到 其 主 要 子 离 子 响 应 的 %-% 结 果 值 被 用 于 数 据 采 集 方 法, 如 表 所 示

4 表. 用 于 MRM 的 数 据 采 集 参 数 组 号 苯 二 氮 / 代 谢 物 保 留 时 间 母 离 子 主 要 子 离 子 碎 片 电 压 碎 片 宽 度 (min) (m/z) (V) (m/z) 7- 氨 基 - 硝 基 安 定.6 5. [..] 7- 氨 基 - 氯 硝 安 定 氨 基 - 氟 硝 西 泮 溴 西 泮 [. 5.7] 氯 硝 安 定 [ ] 硝 基 安 定 氟 硝 西 泮 氯 巴 占 [ ] 氟 胺 安 定 三 唑 仑 阿 普 唑 仑 劳 拉 西 泮 去 甲 羟 基 安 定 desalkylflurazepam [8.8.] 羟 基 安 定 去 甲 西 泮 [..] 7 安 定 [. 7.] 米 达 唑 仑 普 拉 安 定 [7..] 尽 管 Agilent LC/MSD 离 子 阱 具 有 极 快 的 扫 描 速 度 ( 目 前 型 号 可 为 6, u/s), 但 是, 要 设 定 MRM 方 法 使 其 重 复 步 骤 通 过 所 有 的 母 离 子 和 所 有 8 种 分 析 物 以 及 内 标, 也 会 导 致 不 能 接 受 的 长 循 环 时 间, 以 及 用 以 确 定 和 定 量 每 种 分 析 物 的 每 秒 数 据 点 不 充 分 因 此 分 析 按 时 间 段 设 定, 在 这 些 时 间 段 内, 在 一 个 色 谱 图 给 定 部 分 少 数 几 个 分 析 物 进 行 多 反 应 监 测, 如 表 所 示 如 果 使 用 手 动 碎 片 裂 解 阈 值, 在 监 测 大 量 分 析 物 的 组 与 组 之 间 的 切 换 会 出 现 时 间 延 迟 该 时 间 延 迟 可 以 通 过 下 面 方 法 避 免, 即 在 所 有 的 组 中 将 阈 值 选 择 ( 可 以 在 离 子 阱 控 制 窗 口 的 MS/MS 部 分 中 的 裂 解 (Frag- mentation) 下 面 找 到 ) 设 置 到 一 个 母 离 子 质 量 的 合 适 百 分 值, 或 缺 省 值 (Default), 而 不 是 对 每 一 个 分 析 物 设 立 一 个 手 动 值 该 方 法 的 原 版 是 对 每 一 MRM 使 用 5 m/z 手 动 阈 值, 这 样 的 值 导 致 了 延 迟 将 阈 值 设 定 为 5% 而 不 是 缺 省 值 7%, 这 些 分 析 物 的 灵 敏 度 得 到 改 善 这 主 要 是 因 为 离 子 阱 集 中 在 出 现 分 析 物 的 主 要 子 离 子 的 m/z 区, 而 不 捕 获 那 些 对 鉴 定 和 定 量 基 本 没 有 用 的 低 质 量 离 子 MS/MS 获 取 的 最 优 化 的 结 果 可 以 从 图 的 色 谱 图 看

5 氨 基 - 硝 基 安 定. 7- 氨 基 - 氯 硝 安 定. 7- 氨 基 - 氟 硝 西 泮. 溴 西 泮 5. 氯 硝 安 定 6. 硝 基 安 定 7. 氟 硝 西 泮 8. 氯 巴 占 9. 三 唑 仑. 阿 普 唑 仑. 劳 拉 西 泮. 去 甲 羟 基 安 定. -desalkylfurazepam. 羟 基 安 定 5. 去 甲 西 泮 6. 安 定 7. 米 达 唑 仑. Intensity Time [min] 图. 主 要 子 离 子 色 谱 叠 加 图 出, 它 显 示 了 本 分 析 中 所 有 分 析 物 的 主 产 物 离 子 色 谱 叠 加 图 第 一 组, 从. 到. 分 钟, 包 括 了 三 个 化 合 物 的 MRM 分 析, 它 们 几 乎 是 同 时 洗 脱 的 第 二 组 仅 包 含 一 个 化 合 物, 第 三 组 包 含 另 外 三 个 化 合 物 第 四 组 包 含 六 个 化 合 物, 它 降 低 了 分 析 每 一 化 合 物 的 循 环 效 率 不 论 化 合 物 是 否 洗 脱,MRM 都 要 通 过 六 个 不 同 的 母 离 子 循 环 不 过, 色 谱 峰 足 够 宽, 保 证 对 每 一 分 析 物 产 生 足 够 的 数 据 点 子 离 子 谱 以 全 扫 描 模 式 获 取, 全 扫 描 允 许 MS/MS 质 谱 自 动 地 添 加 到 用 户 谱 图 库 中, 以 备 筛 查 和 化 合 物 鉴 定 这 样 的 谱 图 库 已 在 本 实 验 室 以 及 其 他 毒 理 学 领 域 的 实 验 室 得 到 使 用 对 于 大 量 药 物 的 筛 查,AutoMS n 分 析 模 式 可 以 得 到 MS 和 MS/MS( 甚 至 MS/MS/MS, 或 MS ) 谱 图, 这 些 谱 图 可 以 从 由 使 用 权 威 标 准 的 相 同 MS n 参 数 建 立 的 谱 图 库 里 检 索 打 开 SmartFrag 选 项, 可 提 供 一 些 定 性 分 析 的 优 点, 主 要 是 谱 图 重 现 性 和 子 离 子 的 丰 度 关 闭 SmartFrag 选 项, 以 使 少 数 子 离 子 的 强 度 最 大 化, 会 有 助 于 低 含 量 定 量 分 析 图 -8 是 分 析 物 的 结 构 和 在 本 方 法 条 件 下 分 析 被 测 物 的 MS/MS 谱 图 谱 图 说 明 一 些 共 同 丢 失 和 在 结 构 发 生 较 小 变 化 时, 裂 解 行 为 中 发 生 相 应 的 有 趣 变 化 图 是 含 米 达 唑 仑 和 三 唑 仑 的 MS/MS 谱 图, 它 们 在 这 些 条 件 下 失 去 氯 三 唑 仑 的 五 元 含 氮 环 也 显 示 主 要 碎 片 离 子 来 自 于 开 环 和 氮 原 子 的 丢 失 图 显 示 三 个 苯 二 氮 类 药 物, 它 们 在 MS/MS 谱 中 的 5

6 .5 米 达 唑 仑 MS(6.),.-5.6 min 9. [M+-] +.5 C. Intensity 5.75 F m/z 三 唑 仑 C MS(.), min 8. [M+-] + Intensity 5 [M+- ] m/z 图. 米 达 唑 仑 和 三 唑 仑 结 构 和 MS/MS 谱 图 基 峰 相 当 于 失 去 此 图 还 显 示 每 个 母 体 药 物 的 代 谢 物 谱 图, 其 中 的 硝 基 被 还 原 为 氨 基 在 每 种 情 况 下, 结 构 变 化 给 出 不 同 的 碎 片 :7- 氨 基 - 氯 硝 安 定 失 去 ;7- 氨 基 - 硝 基 安 定 失 去 C, 明 显 地 经 过 打 开 七 - 元 环 ; 以 及 7- 氨 基 - 氟 硝 西 泮 失 去 F 注 意, 这 些 分 析 物 失 去 和 F 的 结 构 相 似 性 氟 胺 安 定 和 普 拉 安 定 失 去 碱 性 基 团 见 图, 并 且 6

7 6 氯 硝 安 定 7. MS(6.), min [M+ _ ] + Intensity 6 Intensity m/z 硝 基 安 定 MS(8.), min 6. [M+ _ ] m/z 6 5 氟 硝 西 泮 C 68. [M+ _ ] + MS(.), min Intensity 5 F m/z 图. 氯 硝 安 定 硝 基 安 定 氟 硝 西 泮 7- 氨 基 氯 硝 安 定 7- 氨 基 硝 基 安 定 和 7- 氨 基 氟 硝 安 定 的 结 构 和 MS/MS 谱 图 7

8 .. 7- 氨 基 - 氯 硝 安 定 5. [M+ _ ] + MS(86.),.5-.9 min.8 Intensity m/z. MS(5.),.-. min 7- 氨 基 - 硝 基 安 定 [M+ _ C] + Intensity m/z MS(8.),.8-.7 min 氨 基 - 氟 硝 西 泮 [M+ _ F] C Intensity 5 6. F m/z 图 ( 续 ). 氯 硝 安 定 硝 基 安 定 氟 硝 安 定 7- 氨 基 硝 基 安 定 和 7- 氨 基 氟 硝 安 定 的 结 构 和 MS/MS 谱 图 8

9 desalkylflurazepam 代 谢 物 失 去 整 个 碱 性 氨 取 代 基, 产 生 与 相 应 失 去 C 的 主 要 离 子 不 同 的 裂 解 行 为 图 5 显 示 在 这 些 条 件 下 阿 普 唑 仑 失 去 它 的 结 构 与 三 唑 仑 ( 图 ) 的 结 构 非 常 相 似, 后 者 也 失 去, 大.5 5. AII, min 氟 胺 安 定 [M+ _ (C 5 ) ] +. C C (C 5 ) Intensity x 6.75 F m/z 6. MS(89.), min 6. -desalkylflurazepam. [M+ _ C] + Intensity x F Intensity x m/z 7. 普 拉 安 定 MS(5.), min, C [M+-C 6 ] m/z 图. 氟 胺 安 定 -desalkylflurazepam 和 普 拉 安 定 的 结 构 和 MS/MS 谱 图 9

10 概 也 是 从 五 元 环 上 丢 失 的 图 6 显 示 另 外 几 个 苯 二 氮 类 药 物, 它 们 失 去 C, 象 图 中 -desalkyl 氟 胺 安 定 有 意 思 的 是 它 们 三 者 都 阿 普 唑 仑 C 8. MS(9.), min [M+ _ ] + Intensity x m/z 图 5. 阿 普 唑 仑 的 结 构 和 MS/MS 谱 图 从 7- 环 失 去 C, 尽 管 它 们 在 苯 并 环 的 7- 位 上 都 有 一 个 卤 素 注 意 从 7- 氨 基 氯 硝 安 定 和 7- 氨 基 氟 胺 安 定 ( 图 ) 上 失 去 X, 卤 素 是 在 非 苯 并 环 的 '- 位 氯 硝 安 定 显 示 一 个 简 单 的 MS/MS 谱 图 及 独 特 的 C C 丢 失, 见 图 7

11 .5.5 Br 溴 西 泮 MS(6.), min [M+ _ C] + Intensity x m/z. 57. MS(85.),.-. min.5 安 定 C [M+ _ C] + Intensity x m/z.5 去 甲 西 泮 8. MS(7.),.7-.6 min.5. [M+ _ C] +. Intensity x m/z 图 6. 溴 西 泮 安 定 和 去 甲 西 泮 的 结 构 和 MS/MS 谱 图

12 图 8 显 示 其 余 苯 二 氮 类 药 物 的 MS/MS 谱 图, 使 用 8 氯 硝 安 定 MS(.), min 59. C [M+ _ C C] + 6 Intensity x m/z 图 7. 氯 硝 安 定 的 结 构 和 MS/MS 谱 图 Agilent LC/MSD 离 子 阱 质 谱 仪 的 一 个 重 要 功 能 来 获 得 在 MS/MS 质 谱 方 法 优 化 的 最 初 实 验 中, 发 现 劳 拉 西 泮 去 甲 羟 基 安 定 和 羟 基 安 定 都 有 失 去 水 元 素 的 主 要 子 离 子 由 于 这 不 是 可 以 作 为 鉴 定 目 的 的 最 特 别 的 丢 失, 使 用 下 列 技 术 对 每 个 成 分 获 取 更 信 息 更 丰 富 的 MS/MS 谱 图 通 过 加 大 裂 解 窗 口, 从 u 到 u ( 以 母 离 子 质 量 为 中 心 ± u), 裂 解 能 量 加 到 和 [M+ ] + 离 子 上, 这 样 的 MS/MS 谱 图 极 具 鉴 定 特 异 性 例 如, 对 羟 基 安 定, 在 m/z 8. 裂 解 导 致 了 丢 失 水

13 .5 劳 拉 西 泮 75. [M+ C] + MS(.), min Intensity x m/z. MS(87.), min 去 甲 羟 基 安 定 [M+ C] + Intensity x m/z 55. MS(.), 9.-. min 羟 基 安 定 C [M+ C] + Intensity x m/z 图 8. 劳 拉 西 泮 去 甲 羟 基 安 定 和 羟 基 安 定 的 结 构 和 MS/MS 谱 图

14 离 子, 在 m/z 55. 失 去 水 加 C 的 离 子 如 果 裂 解 能 量 不 仅 加 到 准 分 子 离 子 m/z., 而 且 通 过 u 的 裂 解 窗 口 加 到 失 去 水 的 离 子,m/z 55. 的 强 度 将 被 增 强, 从 而 更 有 利 于 测 定 和 鉴 定 应 用 于 法 医 案 例 从 各 种 案 例 提 取 的 血 液 样 品, 包 括 超 剂 量 复 方 药 物 性 暴 力 受 害 者 和 机 动 车 事 故 受 害 者, 用 此 LC/MS/MS 方 法 进 行 分 析 许 多 苯 二 氮 类 药 物 用 此 筛 查 方 法 被 鉴 定 出, 并 用 后 续 的 GC/ECD 或 PLC-UV 定 量 选 择 的 案 例 和 他 们 血 液 药 物 浓 度 见 表 用 离 子 色 谱 测 定 案 例 中 血 液 样 品 检 测 出 硝 基 安 定 7- 氨 基 硝 基 安 定 安 定 去 甲 安 定 和 普 拉 西 泮, 见 图 9 案 例 中 多 种 药 物 是 不 常 见 的, 该 方 法 可 以 容 易 地 在 一 表. 药 物 及 其 在 血 液 中 浓 度 的 实 例 实 例 苯 二 氮 / 代 谢 物 浓 度 mg/l 硝 基 安 定. 7- 氨 基 - 硝 基 安 定.8 安 定. 去 甲 西 泮. 安 定.6 氯 硝 安 定.9 7- 氨 基 - 氯 硝 安 定. 溴 西 泮. 阿 普 唑 仑.6 安 定.5 去 甲 西 泮. 5 安 定.58 去 甲 西 泮.66 去 甲 羟 基 安 定. 羟 基 安 定. 6 氯 巴 占. (mg/l 化 合 物 或 µg/ml) 7-- 硝 基 安 定.8 硝 基 安 定. 去 甲 西 泮. Intensity x Intensity x Intensity x BEZ6.D: EIC ±MS(5.), Smoothed (.,, GA).6 min 7- 氨 基 - 硝 基 安 定 BEZ6.D: EIC 6 ±MS(8.), Smoothed (.,, GA) 6. min 氟 硝 西 泮 BEZ6.D: EIC ±MS(7.), Smoothed (.7,, GA). min 去 甲 西 泮 安 定. 普 拉 安 定 ( 内 标 ) Intensity x 5 Intensity x BEZ6.D: EIC 57 ±MS(85.), Smoothed (.,, GA). min 安 定 BEZ6.D: EIC 7 ±MS(5.), Smoothed (.,, GA) 9. min 普 拉 安 定 Time [min] 图 9. 案 例 样 品 的 离 子 色 谱 图

15 次 分 析 中 测 定 确 证 和 定 量 多 种 苯 二 氮 谢 物, 就 象 这 个 案 例 证 实 的 一 样 类 药 物 和 代 典 型 的 空 白 血 样 的 离 子 色 谱 图 见 图 注 意 在 案 例 ( 见 表 ) 能 够 测 定.6 mg/l(6 ng/ml) 的 阿 普 西 泮, 同 时 可 由 全 扫 描 MS/MS 谱 图 得 到 明 确 鉴 定 案 例 包 括 低 水 平 的 苯 二 氮 类 药 物 的 测 定, 阿 普 西 泮 在 6 µg/l(6 ng/ml) 的 水 平 Intensity Intensity 5 5 DS8\BEZ7.D: EIC ±MS(5.) DS8\BEZ7.D: EIC 6 ±MS(8.) DS8\BEZ7.D: EIC ±MS(7.) Intensity Intensity DS8\BEZ7.D: EIC 57 ±MS(85.) Intensity x DS8\BEZ7.D: EIC 7 ±MS(5.) 9. min 普 拉 安 定 Time [min] 图. 加 入 内 标 的 空 白 血 样 的 离 子 色 谱 图 5

16 结 论 在 此 介 绍 的 LC/MS/MS 方 法, 为 澳 大 利 亚 医 学 广 泛 使 用 的 苯 二 氮 类 药 物 及 其 代 谢 物 的 鉴 定 应 用 提 供 了 一 个 分 析 过 程 对 现 有 的 GC/MS 样 品 制 备 过 程 做 了 简 单 改 进, 并 且 不 需 要 衍 生 化 MS/MS 谱 图 为 药 品 提 供 了 高 可 靠 性 鉴 定 技 术 该 技 术 适 用 于 筛 查 分 析, 仅 用 5 µl 的 血, 就 能 鉴 定 在 最 低 报 道 治 疗 浓 度 的 苯 二 氮 类 药 物 表 中 的 数 据 和 图 9 说 明, 该 过 程 能 够 鉴 定 实 际 样 品 中 治 疗 和 亚 治 疗 浓 度 的 苯 二 氮 类 药 物 本 方 法 成 功 用 于 法 医 案 例 中 各 种 低 浓 度 苯 二 氮 类 药 物 的 快 速 鉴 定 参 考 文 献. Goodman and Gilman s The Pharmacological Basis of Therapeutics, th edition, McGraw-ill, Drummer, () Forensic Sci. Rev.,,.. Y. Gaillard, J. Gay-Montchamp and M. llagnier, (99) J. Chromatogr. 6, 97.. D. Black, G. ark, V. aver, J. Garbin and A. Saxon, (99) J. Anal. Toxicol. 8, M. Elsohly, S. Feng, S. Salomone and R. Brenneisen, (999) J. Anal. Toxicol., I. McIntyre, M. Syrjanen, K. Crump, S. oromidis, A. Peace and. Drummer, (99) J. Anal. Toxicol. 7,. 7. C. Kratzsch,. Tenberken, F. T. Peters, A. A. Weber, T. Kraemer and.. Maurer, () J. Mass Spectrom. 9, M. Rivera, G. S. Walker, D.. Sims, and P. C. Stockham, () European Journal of Mass Spectrometry, 9, 关 于 本 文 的 详 细 内 容, 请 与 安 捷 伦 科 技 的 John ughes 联 系 致 谢 特 别 感 谢 澳 大 利 亚 作 者 分 享 他 们 的 方 法, 并 感 谢 他 们 在 撰 写 本 文 的 过 程 中 给 予 的 耐 心 同 时 感 谢 安 捷 伦 同 事 Michael Zumwalt 给 予 的 鼓 励 和 初 稿,Jeff Keever 给 予 的 审 阅 和 评 论 如 需 详 细 信 息 如 需 获 得 有 关 我 们 产 品 和 服 务 的 更 多 信 息, 请 访 问 我 们 的 网 站 : 安 捷 伦 对 本 资 料 中 出 现 的 错 误, 以 及 由 于 提 供 或 使 用 本 资 料 所 造 成 的 有 关 损 失 不 承 担 责 任 本 资 料 中 所 涉 及 的 信 息 说 明 和 指 标, 如 有 更 改, 恕 不 另 行 通 知 安 捷 伦 科 技 公 司,6 中 国 印 刷 6 年 月 CC