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1 Agilent ZORBAX

2 Agilent ZORBAX HPLC... phzorbax

3 ...2 ZORBAX ZORBAX ZORBAX USP ZORBAX...19 ZORBAX Eclipse Plus ZORBAX Eclipse XDB ZORBAX 80Å StableBond ZORBAX Rx ZORBAX 80Å Extend-C ZORBAX Bonus-RP ZORBAX ZORBAX ZORBAX ZORBAX ZORBAX 1.8 µm ZORBAX 3.5 µm ZORBAX ZORBAX 1.0 mm ZORBAX ZORBAX PrepHT Ultron ZORBAX...89 ZORBAX 300Å StableBond ZORBAX 300Å Extend-C ZORBAX Poroshell ZORBAX Eclipse (AAA) ZORBAX GF-250 GF ZORBAX SAX SCX

4 ZORBAX Eclipse Plus LC Eclipse Plus 600 bar ZORBAX (RRHT) 1.8 µm LC ZORBAX Eclipse LC

5 Agilent HPLC 40 Agilent 1200 ZORBAX RRHT 1.8 µm LC 60% , ZORBAX RRHT 1200 HPLC 3

6 ZORBAX Eclipse ZORBAX Eclipse Eclipse Eclipse Eclipse 1.8 µm 7 µm... ph 1.8 µm 7 µm 600 bar ZORBAX 20 60% 4

7 ZORBAX USP Agilemt ZORBAX HT Eclipse Plus USP ph ph 5

8 LC H 2 O H 2 O 19 > > "Practical HPLC Methodology and Applications," Brian A. Bidlingmeyer, John Wiley & Sons, Inc., New York, p

9 ZORBAX ZORBAX ZORBAX RP-HPLC Eclipse Plus ph µm QA/QC Eclipse XDB StableBond (SB) ph (ph 2-9) µm ph C18 90 C C8 C3 Aq 80 C ph C18 C8 C3 CNAq (TFA) LC/MS (TFA) µm ZORBAX Rx Bonus-RP Extend-C18 ph SB Rx-C8 SB-C8 ph ph ph 3.5 µm pka ph ph 11.5 LC/MS ph 3.5 µm ZORBAX ZORBAX ph SB SB ph 51 ZORBAX ODS Classic ph SB XDB

10 ZORBAX HPLC HPLC ZORBAX MW < 2000 MW > Å 300Å 80-20Å 300Å (300SB) Eclipse Plus C18 StableBond 300SB-C18 C18 C mm 4.6 mm LC/MS (mm) mg ml/min ug ml/min + HPLC ug ml/min ++ LC/MS ug µl/min ++++ LC/MS 0.5, ug 1-15 µl/min LC/MS 0.1, ng nl/min LC/MS mg 5-10 ml/min mg mg ml/min 1 8

11 ZORBAX MW < 2000 MW > µm 5µm 5 µm 3.5µm HT 1.8µm 3.5µm 5 µm 60% 1.8 µm 200% 3.5µm Poroshell 5µm 3.5 µm Poroshell 150 mm 150 mm 5 µm 150 mm 250 mm (3.5 µm) 75 mm 50 mm 150mm (3.5 µm) (50 mm) Eclipse Plus C x 150 mm, 5 µm Eclipse Plus C x 75 mm, 3.5 µm ZORBAX 300SB-C x 150 mm, 5 µm ZORBAX 300SB-C x 50 mm, 3.5 µm bar Eclipse Plus C x 50 mm, 1.8 µm ZORBAX Poroshell 300SB-C x 75 mm, 5 µm

12 HPLC 5000 (60-100Å) 300Å HPLC 5 µm 3.5 µm 1.8 µm 3.5 µm 1.8 µm 3.5 µm LC 50 mm 1.8 µm RRHT LC LC 400 bar 4.6 x 150 mm 4.6 x 75 mm (4.6 x 250 mm) mm ZORBAX ZORBAX SIL ZOR- BAX Rx-SIL ZORBAX SIL ZORBAX Rx-SIL ZORBAX Rx-SIL Eclipse StableBond ZORBAX SIL 10

13 ZORBAX C18 C8 C3 CN C8 C18 C8 ph (THF) 200 nm ph ph ph ph ph 2 4 ph HPLC / 11

14 USP (USP) USP USP L1 L1 L7 L11 (RRHT) USP USP (µm) (Å) L µm 1.8, 3.5, 5, 7 ZORBAX Eclipse Plus C18 ZORBAX Eclipse Plus XDB-C18 ZORBAX StableBond SB-C18 ZORBAX Extend-C18 ZORBAX Rx-C18 ZORBAX ODS ZORBAX ODS Classic L µm ZORBAX Sil ZORBAX Rx-Sil L7 L8 L10 L11 L13 L14 L20 L33 L35 L56 L µm 10 µm 3 10 µm µm 3 10 µm 10 µm 3 10 µm 4, ,000 ph 3 10 µm 5 µm 120 ZORBAX Eclipse Plus C8 ZORBAX Eclipse XDB-C8 ZORBAX SB-C8 ZORBAX Rx-C8 ZORBAX C8 3, , 3.5, 5, 7 3.5, 5 3, ZORBAX NH ZORBAX Eclipse XDB-CN ZORBAX SB-CN ZORBAX CN ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl ZORBAX SB-Phenyl ZORBAX 3.5, 5 3.5, 5 3, 5 3.5, 5 1.8, ZORBAX TMS 5 70 ZORBAX SAX 5 70 ZORBAX GF ZORBAX GF ZORBAX GF ZORBAX SB-C3 3.5, 5 80 Ultron ES-OVM

15 ZORBAX ph 1-12 ph ph ph ph ph ph 1 ph ph ph ph ph 1 HPLC ph pka ph pka 6.5 ph < 3 - A ph 7 - B ph > 9 - C ph RP-HPLC / ph ph LC/MS ph (TFA) pka ph ph SiOH ph 4-5 SiO TEA Rx-SIL Rx-SIL ph 13

16 ph (ph 2-3) ph ph 2-3 ph ph ph ph mm (ph 2-3) LC/MS ph LC/MS ph ZORBAX Eclipse Plus ZORBAX Eclipse Plus C18 C8 ph Eclipse Plus Eclipse Eclipse Plus ph 2-9 ph

17 ZORBAX ph ph Eclipse Plus Eclipse XDB C18 C8 StableBond SB-C18 SB-C8 SB-Phenyl SB-CN SB-C3 SB-Aq ph ph ph 1-2 StableBond ph 15

18 ph (4-9) ZORBAX Eclipse Plus ph ph Eclipse Plus C18 ph Eclipse Plus ph 9 ph - ph ph 6-9 ph ph ph Eclipse Plus C18 ph=7 ph ph LC/MS ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl CN Bonus-RP ph ph Eclipse XDB-Phenyl Eclipse XDB-CN Bonus-RP Bonus-RP 100% 16

19 ZORBAX ph 3 2a Eclipse XDB 60 C Stablebond C ph 7 ph 9 1 ZORBAX Eclipse Plus C18 C8 ph 2.5 (2-3) mm T=30 C 60 C 0.5 < k < % (v/v) < k < Eclipse XDB-C18 C8 SB-CN AQ Bonus-RP 1 5 ZORBAX Eclipse Plus C18 C8 ph 7 (6-9) mm T = 30 C 40 C 0.5 < k < % (v/v) < k < ZORBAX Eclipse XDB Bonus-RP 5 9 ZORBAX Extend-C18 ph 10.5 (9-11.5) 5-20 mm mm T = 25 C 40 C 0.5 < k < 20 ph ph 1a ZORBAX SB-C18 SB-C8 ph mm T = 30 C 90 C 0.5 < k < 20 1c 5% (v/v) 5c 5% (v/v) 1b 10 mm mm ph < k < 20 1d 5% (v/v) 1e 0.5 < k < 20 5a 10 mm mm ph < k < 20 5b 5d 0.5 < k < 20 10a < k < 20 HPLC 17

20 HPLC Agilent HPLC mm ZORBAX 400 bar PEEK 1/16 LC ZORBAX 3.5 µm 1.8 µm ZORBAX ZORBAX Prep LC/MS LC/MS/MS Eclipse XDB ph 2-9 StableBond ph 2000 psi 135 bar 13.5 MPa 1/16 LC mm 18

21 ZORBAX ZORBAX ZORBAX ph ZORBAX ZORBAX Eclipse Plus HPLC ZORBAX Eclipse XDB HPLC ZORBAX StableBond HPLC ph ZORBAX Rx HPLC ph 9 ZORBAX Extend-C18 HPLC ph ZORBAX Bonus-RP HPLC - ZORBAX ZORBAX ZORBAX HPLC A 19

22 ZORBAX Eclipse Plus LC... Eclipse Plus Eclipse Plus Eclipse Eclipse Plus Eclipse Plus µm LC LC LC Eclipse 1.8 µm 7 µm 20

23 ZORBAX ph HPLC 1.8µm Eclipse Plus ph ZORBAX Eclipse Plus C18 95Å 160 m 2 /g 60 C % ZORBAX Eclipse Plus C8 95Å 160 m 2 /g 60 C % 21

24 Eclipse Plus: : Eclipse Plus C18 Ace 5 C18 SunFireC18 XBridgeC18 Eclipse Plus C x 100 mm, 5 µm 1 2 : : : : A 60% B 40% 1.0 ml/min UV 254 nm EN DiscoveryHS C18 LunaC18 (2) GeminiC18 XTerra MS C min Eclipse Plus C18 C8 RRHT RR A B Eclipse Plus C x 50 mm, 1.8 µm Eclipse Plus C x 50 mm, 3.5 µm 1. Oxybenzone 2. Internal Std. 3. Octylmethoxycinnamate : : (30:70) : 2.0 ml/min : 30 C : UV 230 nm 100 C 0.45 µm bar N: 8800 Pw: min. TF: 1.20 N: Pw: min. TF: 1.06 N: Pw: min TF: min N: 5000 Pw: min. TF: 1.09 N: 6600 Pw: min. TF: 0.99 N: 6300 Pw: min. TF: min. 88 bar min C8 RRHT C8 22

25 ZORBAX ph 2 ph 7 : Eclipse Plus C x 50 mm, 5 µm 1 : % B/3 min ph 2.7 A 0.1% B 0.1% fa ph 7.0 A 20 mm B: Excedrin ph m 1 ph min m Eclipse Plus C18 C8 ph Eclipse Plus C8 Eclipse Plus C18 A B Eclipse Plus C x 100 mm, 5 µm Eclipse Plus C x 100 mm, 5 µm : : : 80% 8mM K 2 HPO 4 ph ml/min UV 215 nm 0.05 µg/µl 0.5 µl Tf= min Tf= min C8 C18 Eclipse Plus C8 C

26 ZORBAX Eclipse Plus A XBridge C x 150mm 5µm A 1 N = Tf = N = Tf = B Eclipse Plus C x 150 mm, 5 µm min B 1 N = Tf = 1.01 N = Tf = min : A 0.1% B 0.1% : 1.0 ml/min : 0.0 min 10% B 15 min 30% B : 40 C : UV 254 nm EN Eclipse Plus A Eclipse Plus C x 50 mm, 1.8 µm A Tf = 1.00 O O N + Cl - OCH 3 1. : A 50% 8 mm K2HPO4 ph 7 B 50% ACN : 1.0 ml/min : : UV 254 nm EN 0.4 mg/ml 2 ul OCH min B Eclipse Plus C x 150 mm, 5 µm B Tf = min 24

27 ZORBAX ZORBAX Eclipse Plus Eclipse Plus C18 USP L1 Eclipse Plus C8 USP L7 (mm) (µm) 4.6 x x x x x x x x x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x x x x bar 3.0 x bar 3.0 x x x x x x x bar 2.1 x bar 2.1 x bar 2.1 x / 4.6 x / 2.1 x

28 O CH 3 Si ZORBAX Eclipse XDB O O CH 3 CH 3 Si CH 3 CH 3 Si CH 3 ph (ph 2-9) 1.8 µm 7 µm CH 3 CH 3 O Si CH 3 CH 3 CH 3 O Si CH 3 Eclipse XDB Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18 C8 ph (ph 2-9) Eclipse XDB ph (2-3) ph (6-8) ph Eclipse XDB ph µm Eclipse XDB C18 ph ZORBAX Eclipse XDB-C18 80Å 180 m 2 /g 60 C % ZORBAX Eclipse XDB-C8 80Å 180 m 2 /g 60 C % ZORBAX Eclipse XDB- 80Å 180 m 2 /g 60 C % Phenyl ZORBAX Eclipse XDB-CN 80Å 180 m 2 /g 60 C % 26

29 ZORBAX ZORBAX Eclipse XDB ph : Eclipse XDB-C x 150 mm, 5 µm : 1.5 ml/min : 40 C A : ph % 25 mm ph % B : ph % 20 mm ph % ACN N- 3. N- ZORBAX Eclipse XDB ph ph 2-9 ph 3 60 C : ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm : Eclipse XDB-C x 150 mm, 5 µm : 70% 50 mm NaAc-HCl ph % ACN 65% 35% : 1.0 ml/min : 60 C : ZORBAX SB-C8 P/N ZORBAX Eclipse XDB-C8 P/N Competitive C Eclipse XDB ph ph Eclipse ph 3 SB-C8 60 C ph 3 12,000 (amitriptyline) Eclipse XDB 27

30 ph 7.0 : Eclipse XDB-C x 150 mm, 5 µm : 60% ACN 40% 250 mm ph 7.0 : 1.5 ml/min : 60 C : Rx-Sil sil-gel - ph 7 (60 C) (250 mm)- Eclipse XDB StableBond A Eclipse XDB-C x 75 mm, 3.5 µm B ZORBAX Rx/SB-C x 75 mm, 3.5 µm : 70% 25 mm NaH2PO4 ph % : 1.0 ml/min : 35 C Time (min) Time (min) Eclipse XDB StableBond 28

31 ZORBAX Eclipse XDB A B C Eclipse XDB-Phenyl x 150 mm, 3.5 µm Eclipse XDB-C x 150 mm, 3.5 µm Eclipse XDB-C x 150 mm, 3.5 µm : 15% :85% : 1.0 ml/min : 35 C : O Eclipse XDB C18 C8 Eclipse XDB-Phenyl Eclipse XDB-C8 : Eclipse XDB-C x 150 mm, 5 µm : 85% 25 mm Na 2 HPO 4 ph 7:15% : 1.0 ml/min : 35 C : Cefoxatime Eclipse XDB-C8 A Eclipse XDB-C x 150 mm, 5 µm B C Eclipse XDB-CN x 150 mm, 5 µm Eclipse XDB-C x 150 mm, 5 µm : A. 60:40 : B. 60:40 : C. 77:23 : : 1.0 ml/min : 25 C : Eclipse XDB-C18 Eclipse XDB-CN 29

32 ZORBAX Eclipse XDB (mm) (µm) XDB-C18 USP L1 XDB-C8 USP L7 XDB-Phenyl USP L11 XDB-CN USP L10 (, 400 bar) 9.4 x x x x x x x x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x x x x x x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x x x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x bar** 2.1 x bar** 2.1 x bar** 2.1 x bar** 2.1 x * 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x / 1.0 x / 4.6 x / 2.1 x *RR 3.5 µm **RRHT 1.8 µm 30

33 ZORBAX ZORBAX Eclipse XDB (mm) (µm) XDB-C18 USP L1 XDB-C8 USP L7 (PrepHT) ( ) PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 17 x PrepHT 2/ XDB-Phenyl USP L11 XDB-CN USP L10 (mm) ( ) 4.6 x x x x / 4.0 x (, 400 bar) 4.6 x / 4.6 x (µm) XDB-C18 USP L1 2.1 x / 2.1 x XDB-C8 USP L7 31

34 ZORBAX Eclipse XDB (mm) (µm) XDB-C18 USP L1 XDB-C8 USP L7 ( ) 4.6 x / 4.6 x x / 4.6 x x / 2.1 x x / 2.1 x x / 4.6 x x / 4.6 x x / 4.6 x x / 2.1 x x / 2.1 x x / 2.1 x x x x x x x x x x

35 ZORBAX ZORBAX 80Å StableBond ph ph 1 ph SB-C18 SB-C8 SB-CN SB-Phenyl SB-C3 SB- Aq B Agilent ZORBAX StableBond (SB-C18) SB-C8 SB-C3 SB-Phenyl SB-CN SB-Aq ph StableBond StableBond ph ZORBAX StableBond O OH O OH R Si R R Si R R R 1 R 1 * ph * ZORBAX 80Å 180 m 2 /g 90 C % SB-C18 ZORBAX 80Å 180 m 2 /g 80 C % SB-C8 ZORBAX 80Å 180 m 2 /g 80 C % SB-C3 ZORBAX 80Å 180 m 2 /g 80 C % SB-Phenyl ZORBAX 80Å 180 m 2 /g 80 C % SB-CN ZORBAX 80Å 180 m 2 /g 80 C SB-Aq *StableBond ph ph 6-8 <40 C M ph Eclipse XDB Bonus-RP O Si R StableBond R

36 StableBond SB-C18 ph ph C : ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm : ZORBAX Rx-C x 150 mm, 5 µm : 50% /50% 1.0% : 90 C Relative Retention Stablebond SB-C18 -C18 ZORBAX Rx-C18 -C18 A-C18 B-C18 C-C18 D-C18 E-C18 Column Volumes of Mobile Phase Purge PH (0.8) (90 C) StableBond SB-C18 ZORBAX Rx-C18 StableBond SB-C18 ZORBAX SB-CN ph (ph C) : ZORBAX SB-CN x 150 mm, 5 µm % k Remaining ZORBAX StableBond SB-CN StableBond ph CN Column Volumes SB-CN A ZORBAX SB-C x 75 mm, 3.5 µm B ZORBAX SB-CN x 75 mm, 3.5 µm : 30% 70% 25mM NaH 2 PO 4 ph 2.5 : 1.0 ml/min : 35 C Time (min) Time (min) SB-CN 50% 34

37 ZORBAX RRHT mau : (40%): 60% ph=2.4 25mM NaH 2 PO 4 : 1.85 ml/min 5 3, 4 & A SB-C x 50 mm, 1.8 µm B SB-C x 50 mm, 1.8 µm C ZORBAX SB-Phenyl x 50 mm, 1.8 µm D ZORBAX SB-CN x 50 mm, 1.8 µm min DAD 254 nm LC Agilent 1200 RR LC 1 µl StableBond 5 SB-Aq A ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm D ZORBAX SB-Phenyl x 150 mm, 5 µm B ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm E ZORBAX SB-CN x 150 mm, 5 µm C ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm SB-C3 StableBond SB-C3 Rx-SIL : 18.8 min 0-100% B A 50 mm NaH 2 PO 4 ph % / 5% B 50 mm NaH 2 PO 4 ph % / 53% : 1.0 ml/min : 26 C : : 254 nm d

38 ZORBAX 80Å StableBond (mm) (µm) SB-C18 USP L1 SB-C8 USP L7 SB-CN USP L10 SB-C3 USP L56 SB-Phenyl USP L11 SB-Aq (, 400 bar) 9.4 x x x x x x x x x x x x x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 3.0 x x x x x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 2.1 x x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x *RR 3.5 µm **RRHT 1.8 µm 36

39 ZORBAX ZORBAX 80Å StableBond SB-C18 SB-C8 SB-CN SB-C3 SB-Phenyl (mm) (µm) USP L1 USP L7 USP L10 USP L56 USP L11 SB-Aq 2.1 x bar** 2.1 x bar** 2.1 x bar** 2.1 x bar** 2.1 x bar** * 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x x / 2/ 9.4 x / 4.6 x / 2.1 x x (PrepHT) ( ) PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 17 x / PrepHT 2/ *RR 3.5 µm **RRHT 1.8 µm ( ) 4.6 x (mm) (µm) SB-C18 USP L1 SB-C8 USP L7 4.6 x x / 4.0 x

40 ZORBAX 80Å StableBond (mm) (µm) SB-C18 USP L1 SB-C8 USP L7 (, 400 bar) 4.6 x / 4.6 x x / 2.1 x ( ) 4.6 x / 4.6 x x / 4.6 x x / 2.1 x x / 2.1 x x / 4.6 x x / 4.6 x x / 4.6 x x / 2.1 x x / 2.1 x x / 2.1 x x x x * 0.5 x x x x x x *RR 3.5 µm **RRHT 1.8 µm 38

41 ZORBAX ZORBAX Rx Eclipse XDB-C18 StableBond SB-C18 Rx-C18 ph StableBond SB-C18 12% 10% ph Rx-C18 Rx-C18 ph 9 Rx-C8 SB-C8 ph ZORBAX Rx-C18 80Å 180 m 2 /g 60 C % ZORBAX Rx-C8 80Å 180 m 2 /g 60 C % Rx-C18 : : : ZORBAX Rx-C x 250 mm, 5 µm 35% :65% 0.5 ml/min Rx-C18 (USP) 4.6 x 250 mm 3.0 mm Rx- C18 60% 39

42 ZORBAX Rx Rx-C18 Rx-C8 (mm) (µm) USP L1 USP L7** 9.4 x x x x x x x x x x x * 2.1 x / 9.4 x / 4.6 x / 2.1 x x (PrepHT) ( ) PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 2/ PrepHT 2/ *RR 3.5 µm **Rx-C8 SB-C8 40

43 ZORBAX ZORBAX 80Å Extend-C18 ph ph 11.5 ph LC/MS O Si C18 ZORBAX Extend-C18 C18-C18 ph ph ph ph ph ph 10.5 LC/MS ph Extend-C18 ph Extend-C18 ph * ph ZORBAX Extend-C18 80Å 180 m 2 /g 60 C % * ph 8 60 C ph C O Si C18 Silica Support Extend C-18 C18-C

44 Extend-C18 ph : : : : : : ZORBAX Extend-C x 150 mm, 5 µm ph 7 30% 20 mm Na2HPO4 70% ph 11 30% 20 mm 70% 1.0 ml/min 254 nm ph ph Extend-C18 ph Time (min) Time (min) Extend-C18 ph : : : : ZORBAX Extend-C x 150 mm, 5 µm 20% 80% 0.1 M ph ml/min ph W ZORBAX Extend-C18 ph Amount of Dissolved Silica (mg) ZORBAX Extend-C18 W Volume Eluent (L) 42

45 ZORBAX Extend-C18 ph : ZORBAX Extend-C x 150 mm, 5 µm : 80% 25 mm NaH2PO4 ph % : 1.0 ml/min : 35 C : 254 nm : Extend-C18 ph Extend-C18 ph ph Time (min) ZORBAX 80Å Extend-C18 (mm) (, 400 bar) 4.6 x x x x x x x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x x x x x x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x (µm) 43

46 ZORBAX 80Å Extend-C18 (mm) (µm) 2.1 x x * 2.1 x * 2.1 x bar** 2.1 x bar** 2.1 x bar** 2.1 x bar** 2.1 x * 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x / 1.0 x / 4.6 x / 2.1 x (PrepHT) ( ) PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 2/ PrepHT 2/ 17 x *RR 3.5 µm **RRHT 1.8 µm 44

47 ZORBAX ZORBAX Bonus-RP ph ph 100% O CH 3 R 1 Si R 1 PG R Agilent ZORBAX Bonus-RP ph Bonus-RP C18 C8 Si CH 3 CH 3 R 1 O Si R 1 PG R CH 3 * ph ZORBAX Bonus-RP 80Å 180 m 2 /g 60 C % * ph 8 60 C ph C Si CH 3 CH 3 R 1 O Si R 1 PG R Bonus-RP ZORBAX Bonus-RP A ZORBAX Bonus-RP x 150 mm, 5 µm B Eclipse XDB-C x 150 mm, 5 µm : 75% 25 mm ph 6 25% : 1.0 ml/min : : 254 nm : 3 µl Time (min) Bonus-RP 45

48 Bonus-RP : Alkye-C8 4.6 x 150 mm 5 µm : 75% 25 mm NH 4 Ac ph % : 1.5 ml/min : 40 C : 254 nm C8 Bonus-RP ph Bonus-RP TF Time (min) Bonus-RP 2 : ZORBAX Bonus-RP x 150 mm, 5 µm : 80% 25 mm NH 4 Ac ph % : 1.5 ml/min : 40 C : 254 nm TF Time (min) 46

49 ZORBAX ph ph ZORBAX Bonus-RP : ZORBAX Bonus-RP x 150 mm, 5 µm : 60% 25 mm ph 7.0:40% ACN : 1.5 ml/min : 23 C Toluene Plate Height, cm / Bonus-RP Column Volume of Purge Bonus-RP ph 7 10,000 -C18/ Bonus-RP : : : : ZORBAX Bonus-RP x 150 mm, 5 µm 50% 50% 0.1% 80% 20% 1.0 ml/min 60 C 23 C Toluene Plate Height, cm -C18/ Bonus-RP Column Volume of Purge ph 47

50 ZORBAX Bonus-RP (mm) (, 400 bar) 4.6 x x x x x x x x x x x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x / 1.0 x / 4.6 x / 2.1 x (PrepHT) ( ) PrepHT 21.2 x *RR 3.5 µm (µm) PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 2/ PrepHT 2/ 17 x

51 ZORBAX ZORBAX ph 2-9 Eclipse ph StableBond ph (1-11.5) ph ph ZORBAX StableBond 4.6 x 150 mm 5 µm SB-C18 SB-CN SB-Phenyl StableBond 4.6 x 75 mm 3.5 µm SB-C18 SB-CN Eclipse XDB 4.6 x 150 mm 5 µm XDB-C18 XDB-C8 XDB-Phenyl Eclipse XDB 4.6 x 75 mm 3.5 µm XDB-C18 XDB-C8 ph 4.6 x 150 mm 5 µm SB-C18 XDB-C18 Extend-C18 ph 4.6 x 75 mm 3.5 µm SB-C18 XDB-C18 Extend-C x 150 mm 5 µm SB-Aq Bonus RP SB-C x 75 mm 3.5 µm SB-Aq Bonus RP SB-C

52 ZORBAX ZORBAX HPLC (302) [email protected]

53 ZORBAX ZORBAX ZORBAX A (mm) (µm) ODS (C18) USP L1 C8 USP L7 USP L11 USP L10 TMS USP L13 (, 400 bar) 9.4 x x x x x x ( ) 2/ 9.4 x / 4.6 x x (PrepHT) ( ) PrepHT 21.2 x PrepHT 2/

54 Zorbax ZORBAX Rx-SIL (>99.995%) ZORBAX-SIL ZORBAX Rx-SIL HILIC ZORBAX Eclipse XDB-CN Rx-SIL ZORBAX Rx-SIL ZORBAX CN ZORBAX SIL ZORBAX SIL ZORBAX NH2 - ZORBAX SIL HPLC A D 52

55 ZORBAX ph ZORBAX Rx-SIL 80Å 180 m 2 /g ZORBAX Eclipse XDB-CN 80Å 180 m 2 /g % ZORBAX SIL 70Å 300 m 2 /g ZORBAX CN 70Å 300 m 2 /g % ZORBAX NH 2 70Å 300 m 2 /g % ZORBAX CN ZORBAX CN : ZORBAX CN x 250 mm, 5 µm : A B 2- / (50/50) : 2 ml/min : 10 min. B 2-20% 20% : 50 C : 278 nm (n = 10) Time (min) 53

56 Zorbax (mm) (µm) XDB-CN USP L10 Rx-SIL (, 400 bar) 9.4 x x * 4.6 x * 2.1 x * 2.1 x ( ) 2/ 9.4 x / 4/ 4.6 x x x (PrepHT) ( ) PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 2/ PrepHT 2/ 17 x * 54

57 ZORBAX (3.5 µm) (1.8 µm) Eclipse XDB StableBond Eclipse Plus RR RRHT ZORBAX 4.6 mm 50% HPLC LC/MS ZORBAX HPLC 2.1 mm 5 ZORBAX ZORBAX Ultron 55

58 ZORBAX (RR) ZORBAX 600 bar RRHT Agilent % 1.8 µm ZORBAX LC RRHT LC, (RR) (RRHT) ZORBAX 1.8 µm Agilent HPLC 30-40% 56

59 ZORBAX 1.8 µm 1.8 µm [600 bar] 2 25% 95% HPLC mm ZORBAX (1.8 µm) 1.8 µm 250 mm 95% 80 RRHT ZORBAX Eclipse Plus ZORBAX (Eclipse XDB StableBond Extend) 3.5 µm 1.8 µm HT HPLC 600 bar Agilent 1200 RRHT-1100 LC Agilent

60 1100 Agilent 1100 RRHT LC 1100 (VWD) 4.6 x 50 mm 1.8 µm (3) VWD 5 µl DAD SL DAD (MWD) 4.6 x 50 mm 1.8 µm (2) DAD 5 µl 2.1 x 50 mm 1.8 µm (2) DAD 1.7 µl LC/MS : : : : : 50 C : Eclipse XDB-C x 30 mm, 1.8 µm A 0.1% FA B 0.075% FA 18 65% B/2 min 65-88% B/3 min 276 nm 2g 10 ml + 10 µl 10 min 0.45 µm 1 µl mau mau mau Naringin confirmed by LCMS Grapefruit Rind min Hesperidin confirmed by LCMS Lime Rind min Citrus Flavonoids min

61 20X : : : : ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm , A:H2O B: ACN 1.2 ml/min, 1.0 ml/min, 2.4 ml/min 0.0 min 50% B 11/1.2/0.4 min 100% B : 40 C, 40 C, 95 C : UV 254 nm : Alkylphenones A 0 B 0 C min min 1. C3-Alkylphenone 2. C4-Alkylphenone 3. C5-Alkylphenone 4. C6-Alkylphenone 5. C7-Alkylphenone 6. C8-Alkylphenone 7. C9-Alkylphenone 8. C10-Alkylphenone 9. C12-Alkylphenone min : ZORBAX SB-C x 50 mm, 3.5 µm : ZORBAX SB-C x 50 mm, 3.5 µm (N) (N) : : : : 25% 75% 1.5 ml/min 254 nm µm 59

62 A B C D : : : : Eclipse XDB-C x 250 mm, 5 µm Eclipse XDB-C x 150 mm, 3.5 µm Eclipse XDB-C x 75 mm, 3.5 µm Eclipse XDB-C x 50 mm, 1.8 µm 73% : 27% 25 mm ph ml/min 254 nm A 25 cm 5 µm 11.5 min (3.5 µm) B C HT 2.2 min 80% A B : : : Eclipse XDB-C x 100 mm, 1.8 µm Eclipse XDB-C x 100 mm, 3.5 µm A B 0.5 ml/min 0.0 min 50% B 20.0 min 100% B : 40 C : UV 254 nm : A B mau min mau min C3-3. C4-4. C5-5. C6-6. C7-7. C8-8. C9-9. C C C14- : SB-C x 50 mm, 1.8 µm : A 60% B 40% : 1 ml/min : 80 C : UV 254 nm : QC 60

63 (1.8µm) (3.5µm) N (3.5 µm)* N (1.8 µm) ,000 32, ,000 24, ,500 17,000** , N 1/2 * 5 µm HPLC 40% N 4.6 mm ** ZORBAX 600 bar 9000 psi Eclipse Plus C18 (mm) (µm) USP L1 600 bar 4.6 x Eclipse Plus C8 USP L7 Eclipse XDB-C18 USP L1 Eclipse XDB-C8 USP L7 Extend- C18 USP L1 600 bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 2.1 x bar 2.1 x bar 2.1 x bar 2.1 x bar 1.0 x bar 1.0 x

64 ZORBAX 600 bar 9000 psi SB-C18 SB-C8 SB-Phenyl SB-CN (mm) (µm) USP L1 USP L7 USP L11 USP L10 SB-Aq 600 bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 4.6 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 3.0 x bar 2.1 x bar 2.1 x bar 2.1 x bar 2.1 x bar 2.1 x bar 1.0 x

65 Zorbax 400 bar 6000 psi XDB-C18 XDB-C8 SB-C18 SB-C8 Extend-C18 (mm) (µm) USP L1 USP L7 USP L1 USP L7 USP L1 4.6 x / 4.6 x x / 2.1 x ( ) 4.6 x x / 2.1 x x / 4.6 x x / 2.1 x x / 4.6 x x / 2.1 x x /

66 ZORBAX 3.5 µm (4.6 mm) (2.1 mm) 5 µm Agilent ZORBAX 3.5 µm 5 µm mm mmlc/ms 3.5 µm 5 µm ZORBAX A ZORBAX Bonus-RP x 150 mm, 5 µm B ZORBAX Bonus-RP x 75 mm, 3.5 µm Time (min) C ZORBAX Bonus-RP x 50 mm, 3.5 µm : 80% 25 mm NH 4 Ac ph % : 1.5 ml/min 1.5 ml/min 0.3 ml/min : 40 C : 254 nm Time (min) Time (min) µm LC/MS 64

67 : ZORBAX SB-C x 75 mm, 3.5 µm : A 25 mm NaH 2 PO 4 ph 3.0 B : 2.0 ml/min : 35 C : 254 nm Time (min) Time (min) Time (min) 4.6 x 75 mm 3.5 µm ZORBAX 3.5 µm Eclipse (mm) Eclipse Plus C18 USP L1 Eclipse Plus C8 USP L7 Eclipse XDB-C18 USP L1 Eclipse XDB-C8 USP L7 Eclipse XDB-Phenyl USP L11 Eclipse XDB-CN USP L10 (µm) 4.6 x x x x x x x x x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x / 1.0 x / 4.6 x / 2.1 x *RR 3.5 µm 65

68 ZORBAX 3.5 µm StableBond SB-C18 SB-C8 SB-CN SB-Phenyl SB-C3 (mm) (µm) USP L1 USP L7 USP L10 USP L11 USP L56 SB-Aq 4.6 x x x x x x x x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x * 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x x / 4/ 4.6 x / 2.1 x *RR 3.5 µm 66

69 ZORBAX 3.5 µm Rx Bonus-RP Extend-C18 *RR 3.5 µm Rx-C18 Rx-C8 Extend-C18 (mm) (µm) USP L1 USP L7 Bonus-RP USP L1 4.6 x x x x x x x * 2.1 x * 2.1 x * 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x / 1.0 x / 4.6 x / 2.1 x

70 ZORBAX 4.6 mm 60% S/N 2 3 LC/MS LC ZORBAX 3.0 mm 4.6mm 50% LC/MS 0.5 ml/min (APCI) (APPI) MS 4.6 mm 2 3 HPLC 60% A B : : ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm 20% : 80% 0.2 M Na2HPO M ph Time (min) Time (min) mm 50% 68

71 A B : : ZORBAX SB-C x 150 mm, 3.5 µm ZORBAX SB-C x 150 mm, 3.5 µm 25% : 75% 0.4% 254 nm ,7-4.6 mm 2-3 HPLC Time (min) LC/MS : ZORBAX SB-C x 100 mm, 3.5 µm A 70% + 0.4% B 30% + 0.4% ml/min A UV 254 nm B APCI C LC/MS MS APCI 0.5 ml/min Time (min) 69

72 ZORBAX 80Å StableBond SB-C18 SB-C8 SB-CN SB-C3 SB-Phenyl (mm) (µm) USP L1 USP L7 USP L10 USP L56 USP L11 SB-Aq 3.0 x x x x ZORBAX 300Å StableBond 300SB-C18 300SB-C8 300SB-CN 300SB-C3 (mm) (µm) USP L1 USP L7 USP L10 USP L x x ZORBAX 80Å Eclipse XDB XDB-C18 XDB-C8 XDB-Phenyl XDB-CN (mm) (µm) USP L1 USP L7 USP L11 USP L x x x x x ZORBAX 80Å Bonus-RP Rx Rx-C18 Rx-C8 (mm) (µm) Bonus-RP USP L1 USP L7 3.0 x x x x ZORBAX 80Å Extend-C18 Extend-C18 (mm) (µm) USP L1 3.0 x x x x x

73 ZORBAX 1.0 mm LC/MS 1 mm 2.1 mm 5 50 µl/ HPLC 400 bar StableBond SB-C18 SB-C8 300SB-C18 Eclipse XDB-C18 XDB-C8 Bonus RP Extend C-18 Poroshell 1.8 µm ZORBAX 300SB-C18 : ZORBAX 300SB-C x 150 mm, 3.5 µm : 60 min 2-60% B A 0.1% B 0.075% /80% : 50 µl/min : 50 C : 215 nm 2 µl rhgh 1.0 mm 71

74 ZORBAX 1.0 mm SB-C18 SB-C8 300SB-C18 300SB-C8 (mm) (µm) USP L1 USP L7 USP L1 USP L7 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x SB-CN USP L10 ** 1.0 x / 1.0 x XDB-C18 XDB-C8 Extend-C18 (mm) (µm) USP L1 USP L7 Bonus-RP USP L1 * 1.0 x * 1.0 x * 1.0 x bar** 1.0 x / 1.0 x (mm) (µm) Poroshell Poroshell 300SB-C18 300SB-C8 Poroshell 300SB-C3 Poroshell 300Extend-C x / 1.0 x *RR 3.5 µm **RRHT 1.8 µm 72

75 ZORBAX LC/MS mm 80Å 300Å / Agilent ZORBAX mm mm HPLC LC/MS SCX 73

76 A B C D E F ZORBAX 300SB-C x 150 mm, 3.5 µm ZORBAX Eclipse XDB-C x 150 mm, 5 µm ZORBAX Eclipse XDB-C x 150 mm, 5 µm ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm ZORBAX 300SB-C x 150 mm, 3.5 µm ZORBAX 300Extend-C x 150 mm, 3.5 µm : % ph = 2.2 = A % = B 0.5%B/min 0 min = 1%B 60 min = 31%B 70 min = 50%B 75 min = 85%B 80 min = 85%B 81 min = 1%B 110 min = 1%B : 5.5 µl/min µl/min : 30 C : 206/10 nm 450/80 nm 0.1 µl ng/100 nl ng/100 nl ng/100 nl ng/100 nl 5. II 20 ng/100 nl Time (min) ZORBAX

77 : : : : ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm ZORBAX SB-C x 150 mm, 3.5 µm ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm 200 ng 0.3 mm 4.6 mm mm mm 2000 Time (min) 75

78 : ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm : A 75% 0.4% B 25% 0.4% : 20 µl/min : 25 C : 0.1 µl StableBond-C x 150 mm 5 µm (k) 0.8% RSD (a) 0.4% RSD Time (min) 76

79 LC/MS ZORBAX HPLC 1100/ SCX 1100/ /1200 LC/MSD 1100/ SCX 1100/ /1200 LC/MSD 77

80 HPLC 2-D HPLC : : : : : MS : ZORBAX 300SB-C x 5 mm, 5 µm ZORBAX 300SB-C x 150 mm, 3.5 µm : 3% /0.1% : A =, 0.1%, B =, 0.1% : 30 µl/min : 300 nl/min : : 6 min = 3%B, 120 min = 60%B, 125 min = 80%B, 130 min = 80% B, 131 min = 3%B, 140 min = 3% B : Nano ESI, : 5L/min,.: 225 C. : : 1:35 V, : 115 V, 1:12 V, 2:3.5 V, : 80 V. ICC: on, : 4, : 150 ms; ,, MS/MS : 1-8 µl Salt Step Elution: 8ml 10 mm-100 mm KCI ( 10 mm ), 125 mm, 150 mm, 200 mm, 300 mm, 500 mm, 1M. Time (min) 30 mm KCI 60 mm KCI 75 mm KCI 120 mm KCI (BSA) HPLC BSA 78

81 ZORBAX Poroshell Eclipse 300SB- 300Extend Bio-SCX (mm) (µm) SB-C18 XDB-C18 C18 300SB-C8 300SB-C8 C18 II 0.8 x x x x x * 0.5 x x x x x * 0.3 x * 0.3 x * 0.3 x * 0.3 x / *RR 3.5 µm 300SB-C18 (mm) (µm) USP L1 ** 0.1 x ** x SB-C8 USP L7 * x /5/ 0.3 x / *RR 3.5 µm 79

82 ZORBAX PrepHT ZORBAX 2000 mg 5 7 µm 5000 psi/350 bar ZORBAX PrepHT Eclipse XDB StableBond Bonus-RP Extend-C18 ZORBAX PrepHT 5 7 µm ZORBAX 100 ml/min ZORBAX PrepHT 21.2 mm 150 mm 7 µm 80

83 ZORBAX PrepHT DAD Vial Vial Vial MSD Time (min) ZORBAX SB-C EN >90% 2000 mg ZORBAX PrepHT 21.2 mm 150 mm 7 µm ZORBAX SB-C18 (ml/min) (µl) 1 50 x 150 mm mm x 150 mm mm x 150 mm mm x 150 mm mm mm 50 mm Time (min) 81

84 ZORBAX PrepHT StableBond ZORBAX PrepHT 80ÅStableBond SB-C18 SB-C8 SB-CN SB-Phenyl (mm) (µm) USP L1 USP L7 SB-Aq USP L10 USP L11 PrepHT * 21.2 x x x x x PrepHT 17 x 7.5 2/ ** ZORBAX PrepHT 300Å StableBond 300SB-C18 300SB-C8 300SB-C3 300SB-CN (mm) (µm) USP L1 USP L7 USP L56 USP L10 PrepHT * 21.2 x PrepHT 2/ ** 21.2 x x x x x * PrepHT ** ( ) 1 ZORBAX PrepHT Eclipse XDB XDB-C18 XDB-C8 (mm) (µm) USP L1 USP L7 PrepHT * 21.2 x PrepHT, 2/ ** 21.2 x x x x x * PrepHT ** ( )

85 ZORBAX PrepHT Bonus-RP Extend-C18 (mm) (µm) Bonus-RP PrepHT * 21.2 x x Extend-C18 USP L x x x PrepHT 2/ ** 17 x * PrepHT ** ( ) 1 ZORBAX PrepHT ODS (C18) C8 (mm) (µm) USP L1 USP L7 USP L10 PrepHT * 21.2 x * PrepHT ZORBAX PrepHT Rx-SIL SIL (mm) (µm) USP L3 PrepHT * 21.2 x Rx-C18 USP L x PrepHT 2/ ** 17 x * PrepHT ** ( ) 1 ZORBAX PrepHT PrepHT 2/

86 4.6 mm 50 mm 21.2 mm ph mm mm 5 10 µm 21.2 mm 4.6 mm C18 ph C18 100Å 400 m 2 /g 60 C* % 100Å 400 m 2 /g ** N/A N/A * ph 8 60 C ph C ** ph 84

87 Agilent Prep C18 : Agilent Prep-C x 150 mm, 5 µm : 50% 0.1% : 50% : 1 ml/min 10 µl / mg/ml Prep Prep A Agilent Prep-C x 150 mm, 5 µm B x 150 mm, 5 µm C x 150 mm, 10 µm D x 150 mm, 10 µm : : 55% :45% 0.7 ml/min ml/min ml/min ml/min 240 nm : : 2 µl 42.4 µl 170 µl 488 µl mg/mL Prep-C

88 (, 400 bar) (mm) (µm) C18 Scalar 4.6 x Scalar 4.6 x Scalar 4.6 x Scalar 4.6 x (PrepHT) ( )* PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 2/ (, 400 bar) Prep x Prep x Prep x Prep x Prep x Prep x Prep x Prep x Prep x Prep x ( ) PrepHT 2/ 21.2 x PrepHT (1kg) * PrepHT mm PrepHT mm

89 Ultron Ultron ES-OVM ES-Pepsin HPLC 87

90 (Prozac) : Ultron ES-OVM x 150 mm, 5 µm : 25:75 (v/v) EtOH / 20 mm KH 2 PO 4, ph 5.5 ( NaOH) : : UV (225 nm) Courtesy of D. S. Risley and V. S. Sharp of Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Co Retention Time (min) ULTRON ES-OVM : Ultron ES-OVM x 150 mm, 5 µm : 20 mm KH 2 PO 4 (ph 4.6) : 1 ml/min : 25 C : 220 nm H Cl N H C 2 H C 5 H 2 N S NH S O O O O T ime (min) (mm) (µm) ES-OVM ES-Pepsin 10 x x x x A A 2.0 x x

91 ZORBAX HPLC HPLC Agilent ZORBAX ZORBAX 300StableBond ZORBAX 300Extend ph 10 LC/MS ZORBAX Poroshell ZORBAX Eclipse (AAA) cm 24 15cm ZORBAX GF-250/450 GF-250 GF-450 4, ,000 ZORBAX (SAX) (SCX) Bio-SCX 89

92 ZORBAX ZORBAX < 2000 (300Å) MW < 50 kda MW < 1,000 kda StableBond 300SB-C8 300 SB C8 C18 C8 C3 C4 CN Poroshell 300SB-C18 Poroshell 300SB Poroshell Poroshell C18 C8 C3 StableBond 300SB-C8 4.6 x 150mm µm A 95% H 2 O:5% 0.1% B 5% H 2 O:95% 0.085% 60 min 0-60% B C 1 ml/min Poroshell 300SB-C x 75mm 5µm A 95% H 2 O:5% 0.1% B 5% H 2 O:95% 0.085% 10 min 0-60% B C 2 ml/min 90

93 ZORBAX ph 0.1% 300Å min Poroshell ph ZORBAX 300StableBond Poroshell 300SB ZORBAX 300Extend-C18 ph 6-8 M 5% 6 M + / DMSO 0.1%-1% DMSO StableBond 300SB - 80 C Poroshell 300SB - 80 C ph ph ph ph ph ph ZORBAX 300Extend-C18 ph 300Extend-C x 150 mm 5 µm A 20 mm NH 4 OH H 2 O B 20 mm NH 4 OH 80% % B C (<60 C) 1 ml/min 91

94 ph ph MW < 50 kda 300SB-C8 4.6 x 150 mm, 3.5 µm MW < 1000 kda Poroshell 300SB-C x 75 mm, 5 µm MW < 25 kda 300 Extend-C x 150 mm, 3.5 µm LC/MS LC/MS LC/MS LC/MS LC/MS MS LC/MS LC/MS 2.1 mm Poroshell ph ph MW < 50 kda 300SB-C8 2.1 x 150 mm, 3.5 µm MW < 1000 kda Poroshell 300SB-C x 75 mm, 5 µm MW < 25 kda 300Extend-C x 150mm, 3.5µm mm 0.3 mm ph mm LC/MS C

95 ZORBAX ph ph MW < 50 kda 300SB-C x 150 mm, 3.5 µm MW < 1000 kda Poroshell 300SB-C8 0.5 x 74 mm, 5 µm MW < 25 kda 300Extend-C x 150 mm, 3.5 µm / LC/MS SCX 0.3 x 35 mm, 5 µm x 150 mm, 3.5 µm ph ph LC/MS % 1% ph LC/MS mm NH 4 OH ph 93

96 R ZORBAX 300Å StableBond O Si R 1 ZORBAX 300StableBond OH R R 300Å 300StableBond ph ph LC/MS 300StableBond C18 C8 C3 O Si R C 300StableBond 300SB-C18 300SB-C8 OH R R mm mm LC/MS O Si R 1 R 300StableBond * ph * ZORBAX 300SB-C18 300Å 45 m 2 /g 90 C % ZORBAX 300SB-C8 300Å 45 m 2 /g 90 C % ZORBAX 300SB-C3 300Å 45 m 2 /g 90 C % ZORBAX 300SB-CN 300Å 45 m 2 /g 90 C % *300 StableBond ph ph 6-8 <40 C M ph ph 300Extend-C18 ph StableBond 300Å kDa 80Å 4000Da 94

97 ZORBAX ZORBAX 300SB-C3 ph ZORBAX 300SB-C x 150 mm, 5 µm 80 min 0-100% B A 0.5% TFA B0.5% TFA 1-50% A 50% B 1.0 ml/min 60 C % k Phenyltheptane Remaining ZORBAX 300 SB-C3 C4 Volume of Mobile Phase (ml) 300SB A ZORBAX 300SB-C x 150 mm, 5 µm B ZORBAX 300SB-C x 150 mm, 5 µm C 4. C ZORBAX 300SB-C x 150 mm, 5 µm CDR 7. D ZORBAX 300SB-CN x 150 mm, 5 µm S-100β 10. S-100α 40 min 25-70% B A 0.1% TFA B 0.09% TFA 80% /20% 1.0 ml/min 60 C 3 µg Time (min) 300SB-C18 C8 C3 CN 300SB-CN 95

98 HPLC UV MS : ZORBAX 300SB-C x 150 mm, 5 µm UV : : : MS : 50 min 5-55% B min 85% B A 0.1% B 0.1% 5.5 µl/min 206 nm LC/MS:ESI LC/MSD -Vcap 4000 V 7 L/min 250 C 15 psi 50 V 300 ms 3 3 m/z 1.0 V 100 nl (4 pmol) UV at 206 nm % Relative Abundance MS Time (min) ZORBAX 300SB-C mm UV MS MS Time (min) LC/MS ZORBAX : ZORBAX 300SB-C x 150 mm, 3.5 µm Intens. : : : : A + 0.1% B + 0.1% 600 nl/min 25 min 2% B 52% B MS 100 fm (1 µl) 8 ZORBAX Nano HPLC mm LC/MS Time (min) 96

99 ZORBAX ZORBAX 300Å StableBond (mm) (, 400 bar) (µm) 300SB-C18 USP L1 300SB-C8 USP L7 300SB-CN USP L10 300SB-C3 USP L x x x x x x x x x x x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x x * 1.0 x * 1.0 x / 1.0 x / 9.4 x / 4.6 x / 2.1 x x (PrepHT) ( ) PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 21.2 x PrepHT 2/ PrepHT 2/ 17 x

100 ZORBAX 300Å StableBond ( ) (mm) (µm) 300SB-C18 USP L1 300SB-C8 USP L7 0.5 x x x * 0.5 x * 0.5 x x x x * 0.3 x * 0.3 x * 0.3 x * 0.3 x (PEEK ) ** 0.1 x ** x * x /5/ 0.3 x / *RR 3.5 µm 300SB-CN USP L10 300SB-C3 USP L56 98

101 ZORBAX ZORBAX 300Å Extend-C18 ph ph ph ph LC/MS ZORBAX 300Extend C-18 HPLC ph ph ph ph ph LC/MS O O Si Si C18 C18 * ph ZORBAX 300Extend-C18 80Å 180 m 2 /g 60 C % * ph 8 60 C ph C Silica Support 300Extend-C18 ph Extend-C18 C18-C18 ZORBAX Extend-C x 150 mm, 5 µm 20% 20 mm NH4OH ph % 1.5 ml/min 24 C 40 C k Values Column Volumes of Mobile Phase 10,

102 Extend-C18 StableBond SB-C18 ph A B C ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm ZORBAX Extend-C x 150 mm, 5 µm ZORBAX Rx-C x 150 mm, 5 µm 50% 50% + 1% TFA 60% 40% 1.5 ml/min 90 C Fraction of Toluene k Remaining A B C Column Volumes Mobile Phase 300Extend-C18 ph ph ph 2 ph Extend-C18 ph ph ph Extend-C18 LC/MS ZORBAX Extend-C x 150 mm, 5 µm A 0.1% TFA B0.085% TFA 80% A 10 mm NH 4 OH B 10 mm NH 4 OH 80% 0.2 ml/min 15 min 15-50% B 35 C MS ESI - Vf 70V 4.5 kv, N2-35 psi, 12 L/min. 325 C 2.5 µl 50 pmol I II III B.E Boyes Separation and Analysis of Peptides at High ph Using RP-HPLC/ESI-MS, 4th WCBP, San Francisco, CA Jan TIC ( m/z) TIC ( m/z) min min ph ph ph ph Extend-C18 ph m/z m/z 100

103 ZORBAX ZORBAX 300Å Extend-C18 (mm) (µm) 4.6 x x x x x * 2.1 x * 2.1 x * 2.1 x / 4.6 x / 2.1 x *RR 3.5 µm * 0.3 x * 0.3 x * 0.3 x * 0.3 x

104 (Poroshell) Porous Shell SOLID CORE 5 µm (Poroshell) 300Å SB-C18 SB-C8 SB-C3 ph ZORBAX Poroshell 1,000 kda Poroshell 300SB ph 300Extend-C18 ph 300SB-C18 300SB-C8 300SB-C3 300Extend-C18 ZORBAX Poroshell Poroshell HPLC 500-1,000 kda Poroshell StableBond ph 2-10 Poroshell 300Extend-C18 LC/MS HPLC Poroshell 102

105 ZORBAX Poroshell ZORBAX Poroshell 300SB-C x 75 mm, 5 µm A 0.1% TFA B 0.07% TFA 3.0 ml/min 1.0 min 5-100% B 70 C 260 bar 215 nm 1. II ZORBAX Poroshell 300SB 90% A B ZORBAX Poroshell 300SB-C x 75 mm, 5 µm ZORBAX 300SB-C x 150 mm, 5 µm A 95% 5% 0.1% TFA B 5% 95% 0.07% TFA 1 ml/min ml/min 0-100%B = 12 min 0-100%B = 120 min 70 C 20 µl (0.22 µg/1 µl) BSA pmol ZORBAX Poroshell 1/

106 ZORBAX Poroshell LC/MS ZORBAX Poroshell 300SB-C x 75 mm, 5 µm A + 0.1% B + 0.1% 600 µl/min 5.5 min % B 80 C MS LC/MS ESI V 12 L/min 350 C 45 psi 140 V amu 0.06 min 1 µl ZORBAX Poroshell 2.1 mm 1.0 mm 0.5 mm LC/MS 1.0 mm 0.5 mm Poroshell LC/MS Poroshell pmole MS Poroshell MS ZORBAX Poroshell Poroshell Poroshell Poroshell Poroshell (mm) (µm) 300SB-C18 300SB-C8 300SB-C3 300Extend-C x x x / 2.1 x / 1.0 x

107 ZORBAX ZORBAX Eclipse (AAA) 24 OPA FMOC Agilent 1100/1200 ZORBAX Eclipse AAA 7.5 cm cm Agilent 1100/1200 HPLC OPA FMOC 5-50 pmol DAD FLD ZORBAX Eclipse-AAA 24 ZORBAX Eclipse AAA x 150 mm, 3.5 µm A 40 mm Na 2 HPO 4 ph 7.8 B 45:45:10 v/v 2 ml/min 40 C Asp 2. Glu 3. Asn 4. Ser 5. Gln 6. His 7. Gly 8. Thr 9. Cit 10. Arg 11. Ala 12. Tyr 13. Cys 14. Val 15. Met 16. Nva 17. Trp 18. Phe 19. Ile 20. Leu 21. Lys 22. Hyp 23. Sar 24. Pro Time (min) x 75 mm Eclipse AAA

108 ZORBAX Eclipse (AAA) (mm) (µm) 4.6 x FLD 4.6 x x x / 4.6 x L- L- L- L- L- L- L- L- L- L- L- L- L- L- L- L-, 10 x 1 ml * 1 nmol/µl pmol/µl pmol/µl pmol/µl pmol/µl g * g OPA, (OPA) M mg/ml, 6 x 1 ml FMOC, mg/ml ml, 10, 100 ml DTDPA (),, 5 g

109 ZORBAX ZORBAX GF-250 GF-450 ph (ph 3-8) ZORBAX GF-250 GF-450 GF-250 GF-450 4, ,000 GF-250/GF-450 >90% ph ph 3 ph 8 GF-250 GF ml/min (<25%) ph ZORBAX GF Å 4 µm 4, ,000 ZORBAX GF Å 6 µm 10, , m 2 /g <3.0 ml/min 50 m 2 /g <3.0 ml/min 350 bar 350 bar 107

110 ZORBAX GF-250 SEC ZORBAX GF x 250 mm, 4 µm 200 mm ph ml/min 254 nm BioRad ,000 Da 2. g- 158,000 Da 3. 44,000 Da 4. 17,000 Da 5. B-12 1,350 Da ZORBAX GF-250 GF-450 Time (min) A BSA BSA 2 2 B BSA 2. BSA IgG 2. IgG 1K (MOPC 31C) 3. Tris Na 2 HPO 4 NaCl Inj. #1 Inj. # Time (min) Retention Time (min) ZORBAX GF x 250 mm, 6 µm ZORBAX GF x 250 mm, 6 µm PBS ph ml/min 220 nm BSA BSA 200 mm ph 7.0/0.1% 2 ml/min 225 nm 10 mg 50 mm ph

111 ZORBAX 9.4 x 250 mm ZORBAX GF-250 ZORBAX GF x 250 mm, 4 µm 130 mm NaCl/20 mm KCl/ 50 mm Na 2 HPO 4 ph ml/min 210 nm IgM 900,000 Da ,000 Da 3. ß- 200,000 Da 4. 67,000 Da 5. 45,000 Da 6. 13,700 Da Da Time (min) ZORBAX GF-250 GF-250 K* K* K* BSA Ovalbumin Lysozyme NaN 3 K* BSA Ovalbumin Lysozyme NaN Column Volumes Column Volumes 109

112 ZORBAX GF-250 GF-450 (mm) (µm) GF Å 9.4 x GF Å 4.6 x GF Å 9.4 x ( ) GF-250 Diol2/ 9.4 x GF-250 Diol4/ 4.6 x GF-450 Diol2/ 9.4 x GF-250 Diol4/ 4.6 x x PrepHT PrepHT GF Å 21.2 x PrepHT GF Å 21.2 x PrepHT 2/ PrepHT GF-2502/ 17 x PrepHT GF-4502/ 17 x

113 ZORBAX ZORBAX SAX SCX ZORBAX SAX 300SCX Zorbax ph 2-7 ZORBAX Bio-SCX II Zorbax (SAX) (300SCX) 5 µm Zorbax Bio-SCX II LC/MS 3.5 µm Zorbax ph ZORBAX SAX 70Å 300 m 2 /g bar ZORBAX 300SCX 300Å 50 m 2 /g bar ZORBAX Bio-SCX II 300Å 90 m 2 /g bar ZORBAX SAX SCX (mm) (µm) SAX 300SCX 9.4 x x x x x x x Bio-SCX II 0.3 x x / 4.6 x

114 HPLC HPLC HPLC

115 ZORBAX Eclipse Plus Eclipse Plus Eclipse Plus ph Eclipse Plus /40 / Eclipse Plus C18 Ace 5 C18 SunFire C18 XBridge C18 Discovery HS C18 Luna C18 (2) Gemini C18 XTerra MS C18

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