利用全自动毛细管等电聚焦-质谱联用技术鉴定单克隆抗体的电荷异构体

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侦崩赵
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1 应用简报制药与生物制药利用全自动毛细管等电聚焦 - 质谱联用技术鉴定单克隆抗体的电荷异构体作者 Tony Wang,James Xia, Rena Wang CMP Scientific Corp, Brooklyn, NY, USA Jens Meixner 安捷伦科技有限公司 Waldbronn, Germany 摘要本应用简报介绍了使用质谱 (MS) 直接测定单克隆抗体 (mab) 电荷异构体的方法所采用的工作流程包括配备 CMP Scientific EMASS-II 毛细管电泳 / 质谱 (CE/MS) 离子源的 Agilent 71A 毛细管电泳仪质谱实验在 Agilent 63 精确质量数 TOF LC/MS 或 Agilent 655 Q-TOF LC/MS 上进行

2 前言由于存在翻译后修饰, 例如脱酰胺基化 C 端赖氨酸糖基化赖氨酸糖化和 N 端焦谷氨酸等,mAb 治疗药物往往表现出电荷异质性等电聚焦凝胶电泳毛细管等电聚焦 (CIEF) 和成像毛细管等电聚焦方法通常用于生物治疗药物的电荷异构体定量分析然而, 每种潜在的电荷异构体的质谱鉴定一直都充满挑战本文中, 我们展示了在 Agilent 71A 毛细管电泳仪和 TOF/Q-TOF 系统上使用 CMP Scientific EMASS-II CE/MS 离子源对 mab 治疗药物的电荷异构体直接进行质谱鉴定实验部分材料载体两性电解质 ph 范围为 3. 至 1. 的 Pharmalyte mab 标准品和 SILu Lite SigmaMAb 通用人抗体标准品 ( 目录号 MSQC-1MG) 均购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 用 5% 的甘油配制浓度为 5 mg/ml 的 SigmaMAb 储备液, 并于 C 储存水甲酸氢氧化铵乙腈和甲醇等 LC/MS 级试剂均购自 Millipore-Sigma (Burlington, MA) 在线 CIEF-MS 使用 EMASS-II CE/MS 离子源 (CMP Scientific Corp, Brooklyn, NY, USA) 在 71A 毛细管电泳仪 ( 安捷伦科技公司, Santa Clara, CA, USA) 与 63 精确质量数 TOF LC/MS 或 655 Q-TOF LC/MS 的联用系统上进行在线 CIEF-MS 分析用于在线 CIEF-MS 分析的电喷雾发射器 ( 外径 mm, 内径.75 mm, 喷嘴尺寸 3 μm) 和用于分离的中性涂层 PS1 毛细管 ( 外径 36 μm, 内径 5 μm) 均购自 CMP Scientific 阴极液是含. mol/l 氢氧化铵的 15% 甘油 (v/v) 阳极液是含 1% 甲酸的 15% 甘油 (v/v) 电喷雾电离正电压 ( 介于. kv 和. kv 之间 ) 由 EMASS-II 离子源附带的外部台式高压电源提供鞘流溶液为 % 乙酸和 5% 乙腈 (v/v) 的混合溶液将 63 和 655 的毛细管电压 (Vcap) 设置为使用单孔在线纳流喷雾罩防止干燥气体进入 MS, 最大程度减小对 EMASS-II 离子源纳流喷雾的干扰通过显微镜摄像头将发射器喷嘴到质谱仪的距离调整为 3 到 mm 之间样品 (.1.5 mg/ml) 配制于 5 mmol/l 乙酸铵 1% 1.5% 两性电解质和 15% 甘油中表 1. CIEF-MS 方法参数毛细管电泳质谱 CE/MS 联用分离毛细管阳极液阴极液鞘流溶液样品缓冲液参数 71A CE 样品进样和分离在 75 cm 长的毛细管 ( 内径 5 μm) 中, 在 95 mbar 的条件下进行 1 秒的阴极液注入, 然后进行 75 秒的样品溶液进样然后在毛细管进样口端施加 CE 分离正电压 (18.8 kv) 以开始电聚焦在毛细管进样口施加恒定压力 (5 1 mbar), 使其产生流体动力学流动, 缩短分析时间质谱参数将 Q-TOF 毛细管电压设置为干燥气温度为 365 C, 流速为 6 L/min; 碎裂电压为 38 V 使用 Agilent MassHunter 工作站软件 (B.9 版 ) 进行 CE/MS 方法设置数据采集和分析表 1 汇总了此 CIEF-MS 方法 63 精确质量数 TOF LC/MS;655 Q-TOF LC/MS 值 CMP Scientific EMASS-II CE/MS 离子源 75 cm PS1 毛细管 (CMP Scientific Corp) 1% 甲酸,15% 甘油. mol/l 氢氧化铵,15% 甘油 % 乙酸,5% 乙腈 5 mmol/l 乙酸铵,1% 1.5% Pharmalyte 3-1,15% 甘油进样冲洗,1 秒 ( 阴极液 ) 冲洗,75 秒 ( 样品溶液 ) 分离 kv,5 1 mbar 电喷雾发射器喷嘴尺寸 3 µm (CMP Scientific Corp) ESI 电压. kv 发射器与质谱仪之间的距离 mm 毛细管末端与发射器喷嘴之间的距离.8 mm 碎裂电压 38 V 毛细管电压 V 干燥气流速 6 L/min 干燥气温度 365 C

结果与讨论全自动 CIEF-MS 方法的原理有关在线 CIEF-MS 方法的详细介绍, 请参阅参考文献部分列出的文章 1 简言之, 为了在分离毛细管内建立 ph 梯度, 首先应通过毛细管进样口注入一小段氢氧化铵 ( 图 1, 步骤 1) 然后从毛细管进样口注入一长段与两性电解质混合的样品样品溶液将氢氧化铵推向毛细管出口, 形成阴极液末端, 用于随后的等电聚焦 ( 图 1, 步骤 )

3 结果与讨论全自动 CIEF-MS 方法的原理有关在线 CIEF-MS 方法的详细介绍, 请参阅参考文献部分列出的文章 1 简言之, 为了在分离毛细管内建立 ph 梯度, 首先应通过毛细管进样口注入一小段氢氧化铵 ( 图 1, 步骤 1) 然后从毛细管进样口注入一长段与两性电解质混合的样品样品溶液将氢氧化铵推向毛细管出口, 形成阴极液末端, 用于随后的等电聚焦 ( 图 1, 步骤 ) 当在毛细管内部形成 ph 梯度时, 使用酸性鞘流溶液逐渐滴定氢氧化铵对于单克隆抗体, 最佳鞘流溶液为 % 乙酸和 5% 乙腈的混合溶液一旦阴极液完全耗尽, 聚焦的蛋白区域就会开始向毛细管出口迁移这种迁移的原理与传统的两步法 CIEF-MS 方法相同 ( 图 1, 步骤 3) 因此, 聚焦 ( 利用毛细管内的氢氧化铵 ) 和迁移 ( 通过酸性鞘流溶液完全滴定氢氧化铵 ) 连续进行这极大地简化了操作, 同时大幅提高了电荷异构体分析的成功率使用碱性蛋白质混合物检查 Agilent-CMP CE/MS 系统的性能我们建议通过进样少量溶菌酶和核糖核酸酶 A 的混合物来评估 Agilent-CMP CE/MS 系统的性能利用含 1 mmol/l 乙酸铵的 % 乙酸 (v/v) 配制样品, 其中溶菌酶浓度为.1 mg/ml, 核糖核酸酶 A 为.3 mg/ml 背景电解质为 1% 的乙酸 (v/v) 鞘流溶液为 5% 乙酸和 1% 甲醇 (v/v) 的混合溶液进样压力为 1 mbar, 进样 7 秒分离电压为 3 kv 图显示了在性能良好的系统上获得的该碱性蛋白质混合物的毛细管区带电泳 (CZE)- 质谱结果应检查是否符合以下标准 : 两个蛋白第 1 步 : 注入 NH OH NH OH NH OH 第步 : 进样蛋白质样品 ( 与两性电解质混合 ) 样品与两性电解质的混合溶液第 3 步 : 聚焦 / 迁移甲酸甲酸蛋白质样品与两性电解质的混合溶液甲酸 pl 3 pl 1 图 1. CIEF-MS 方法原理 NH OH 酸性鞘流溶液酸性鞘流溶液酸性鞘流溶液 A 溶菌酶 RA.5. +ESI BPC B 溶菌酶核糖核酸酶 A 质荷比 (m/z) 质峰均不出现明显拖尾 ; 溶菌酶和核糖核酸酶 A 之间的分离窗口超过 1 分钟 ; 峰高相似 ; 峰宽小于 3 秒图. 使用溶菌酶与核糖核酸酶 A 蛋白质混合物检查 Agilent-CMP CE/MS 系统性能 3

4 使用单克隆抗体标准品进行 Agilent-CMP CE/MS 系统性能验证在开展 CIEF-MS 实验进行 mab 电荷异构体分析之前, 通过进样 mab 样品进一步测试系统性能是一种很好的做法以 SigmaMAb 为例, 预计 IgG 分子在分钟后进行迁移 ( 图 3) 这一长迁移时间表明 PS1 毛细管上存在极小的电渗流没有出现峰拖尾则表明毛细管壁的蛋白质吸附率很小实验条件如下 : 样品 :. mg/ml SigmaMAb, 溶于 1 mmol/l 乙酸铵和 % 乙酸 (v/v) 的混合溶液背景电解质 :3% 乙酸 (v/v) 鞘流溶液 :% 乙酸,5% 乙腈进样 : 样品在 95 mbar 下进样 3 秒, 然后在 95 mbar 下对背景电解质进样 3 秒分离 :3 kv 使用蛋白质标准品进行 Agilent-CMP CIEF/MS 系统性能验证在 CZE-MS 评估后, 可以使用 (pi 值 1.3) 和肌红蛋白 (pi 值 7. 和 6.8) 的混合物测试 CIEF-MS 方法图显示了这种混合物在 1 cm PS1 毛细管上的 CIEF-MS 结果实验条件如下 : 样品 :.1 mg/ml,.8 mg/ml 肌红蛋白, 溶于 1.% Pharmalyte 3-1 mmol/l 乙酸铵和 1% 甘油的混合溶液阳极液 :1% 甲酸,15% 甘油阴极液 :. mol/l 氢氧化铵,15% 甘油鞘流溶液 :3% 乙酸进样 : 阴极液在 95 mbar 下进样 5 秒, 然后在 95 mbar 下对样品进样 11 秒聚焦和迁移 :15 kv,1 mbar mab. 盐盐图 3. 使用单克隆抗体标准品检查分离毛细管的性能肌红蛋白 pl pl 肌红蛋白 pl 图. 使用与肌红蛋白的混合物检查 CIEF-MS 系统性能

达雷木单抗的 CIEF-MS 分析达雷木单抗是一种商业化的治疗性 IgG1 单克隆抗体图 5 为达雷木单抗样品在 CIEF-MS 分析过程中,Agilent MassHunter 数据采集软件的屏幕截图在左边中间的图中, 蓝线为总离子电泳图 (TIE), 红线为 CE 电流图在样品中加入, 其显示为 TIE 中的第一个峰的 pi 值为 1.

5 达雷木单抗的 CIEF-MS 分析达雷木单抗是一种商业化的治疗性 IgG1 单克隆抗体图 5 为达雷木单抗样品在 CIEF-MS 分析过程中,Agilent MassHunter 数据采集软件的屏幕截图在左边中间的图中, 蓝线为总离子电泳图 (TIE), 红线为 CE 电流图在样品中加入, 其显示为 TIE 中的第一个峰的 pi 值为 1.3, 因此, 它适合作为 ph 3 1 范围内的两性电解质的前标记物如图 5 所示, 达雷木单抗处的两性电解质背景最低, 表明电喷雾电离条件有利于抗体分子的分析研究表明,% 乙酸和 5% 乙腈组成的鞘流溶液适用于许多 mab 治疗药物实验条件如下: 样品 :.33 mg/ml 达雷木单抗,.11 mg/ml, 溶于 5 mmol/l AA 1% Pharmalyte 3-1 和 15% 甘油的混合溶液阴极液 :. mol/l 氢氧化铵,15% 甘油阳极液 :1% 甲酸,15% 甘油鞘流溶液 :% 乙酸,5% 乙腈进样 : 阳极液在 95 mbar 下进样 1 秒, 然后在 95 mbar 下对样品进样 75 秒聚焦和迁移 :18.8 kv,5 mbar 在上述条件下, 在 75 cm PS1 毛细管上, 通常在分钟后出峰达雷木单抗在随后的 5 分钟内出峰图 5. 达雷木单抗样品在 CIEF-MS 分析过程中的 MassHunter 数据采集软件的屏幕截图 5

6 通过 CIEF-MS 分析鉴定达雷木单抗电荷异构体图 6 为鉴定出的达雷木单抗电荷异构体其中 1 个为碱性异构体, 个为酸性异构体使用 MassHunter BioConfirm 软件进行解卷积后, 基于电荷异构体峰和主峰的完整质量数差异, 鉴定出这几种电荷异构体为 N- 端焦谷氨酸 ( 碱性异构体, 峰 B1) 脱酰胺基化( 酸性异构体, 峰 A1) 和赖氨酸糖化 ( 酸性异构体, 峰 A) 1 7 A B1:N 端焦谷氨酸 M: 主峰 A1: 脱酰胺基化 A: 赖氨酸糖化 M A1. B1 A B B1 M A1 A 质荷比 (m/z) 图 6. 使用全自动 CIEF-MS 方法分析达雷木单抗的电荷异构体 6

7 达雷木单抗的 CIEF-MS 重复进样图 7 显示了达雷木单抗样品 5 次 CIEF-MS 过夜进样的结果氢氧化铵在毛细管内长时间停留会损害毛细管的中性涂层因此, 我们使用高压 (95 mbar) 进行阴极液和样品进样, 以便将氢氧化铵从毛细管入口快速移至出口这一高流速阴极液和样品进样可能产生层流, 导致氢氧化铵前端扩散, 使样品与氢氧化铵混合因此, 不同进样之间的氢氧化铵和样品区的有效长度可能略有不同这可能会导致峰迁移时间产生变化使用作为前标记物时, 达雷木单抗主峰的相对迁移时间更加稳定相对迁移时间 RSD 的计算结果为 5.8% 结论本应用简报展示了在 71 毛细管电泳仪和 TOF/Q-TOF 质谱仪上进行的全自动在线 CIEF-MS 方法使用电动泵送鞘流溶液纳米喷雾 CE/MS 联用技术实现该 CIEF-MS 工作流程碱性蛋白和单克隆抗体的 CZE-MS 结果以及达雷木单抗电荷异构体分析的 CIEF-MS 结果表明, EMASS-II CE/MS 离子源在安捷伦系统上具有出色的性能还提供了 CEIF-MS 方法的详细信息, 包括毛细管性能验证和系统性能检查在此 Agilent-CMP CIEF-MS 工作流程中, 对于通过毛细管等电聚焦分离得到的完整 mab 电荷异构体, 可以直接进行质谱鉴定达雷木单抗达雷木单抗达雷木单抗达雷木单抗达雷木单抗图 7. 达雷木单抗 5 次 CIEF-MS 进样的重现性 7

8 参考文献 1. Zhu, G.; Sun, L.; Dovichi, N. J. Simplified Capillary Isoelectric Focusing with Chemical Mobilization for Intact Protein Analysis. J. Sep. Sci. 17, (), Dai, J.; et al. Capillary Isoelectric Focusing-Mass Spectrometry Method for the Separation and Online Characterization of Intact Monoclonal Antibody Charge Variants. Anal. Chem. 18, 9(3) 3. Dai, J.; Zhang, Y. A Middle-Up Approach with Online Capillary Isoelectric Focusing/Mass Spectrometry for In-Depth Characterization of Cetuximab Charge Heterogeneity. Anal. Chem. 18, 9(), Ouyang, Y.; et al. Negative-Ion Mode Capillary Isoelectric Focusing Mass Spectrometry for Charge-Based Separation of Acidic Oligosaccharides. Anal. Chem. 19, 91(1), 查找当地的安捷伦客户中心 : 免费专线 : ,-8-378( 手机用户 ) 联系我们 : LSCA-China_8@agilent.com 在线询价 : 本文中的信息说明和指标如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司,19 19 年月 1 日, 中国出版 ZHCN

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