前言 本研究开发出的高效固相萃取 (SPE) 样品前处理流程适用于同时提取血浆中的变肾上腺素 去甲变肾上腺素和 3- 甲氧酪胺 ( 图 1) 将不同浓度的各种分析物加入至洁净血浆中可制得校准物 液相色谱 / 三重四极杆质谱仪 (LC/MS/MS) 非常适用于像上述多种分析物的快速分析 色谱系统采用

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1 利用 LC/MS/MS 定量分析血浆中的变肾上腺素类化合物和 3- 甲氧酪胺 使用 Agilent SimpliQ WCX SPE 129 Infinity 液相色谱和 646 三重四极杆液质联用系统 应用简报 临床研究 作者 Linda Côté 与 Christophe Deckers 加拿大安捷伦科技公司 St-Laurent, Québec, Canada 摘要本研究中开发出了一种用于血浆中变肾上腺素 去甲变肾上腺素和 3- 甲氧酪胺定量的灵敏度高 特异性好的 LC/MS/MS 分析方法 该方法利用固相萃取 (SPE) 流程提取分析物并除去血浆干扰物, 可实现所需的功能灵敏度, 同时还能对相当宽动态范围内的分析物进行定量分析 所有化合物均表现出出色的重现性 (CV < 6 %), 且所有校准曲线都获得了绝佳的线性 (R 2 >.9996)

2 前言 本研究开发出的高效固相萃取 (SPE) 样品前处理流程适用于同时提取血浆中的变肾上腺素 去甲变肾上腺素和 3- 甲氧酪胺 ( 图 1) 将不同浓度的各种分析物加入至洁净血浆中可制得校准物 液相色谱 / 三重四极杆质谱仪 (LC/MS/MS) 非常适用于像上述多种分析物的快速分析 色谱系统采用 Agilent Pursuit 五氟苯基 (PFP) 色谱柱以及甲醇与.2% 甲酸水溶液组成的流动相 研究中对定量和定性 MRM 离子对进行监测, 并加入了每种分析物的氘代内标以确保定量分析的准确性与重现性 实验部分液相色谱方法 液相色谱系统由 Agilent 129 Infinity 液相色谱二元泵 配备恒温箱的孔板进样器以及柱温箱组成 如果使用的液相色谱系统具有不同的延迟体积, 则可能需要调节并验证梯度以重现出相同的色谱分析结果 质谱方法安捷伦 MS/MS 系统由采用安捷伦喷射流技术的 Agilent 646 三重四极杆质谱仪和 Agilent MassHunter 软件 B.7. 组成 H (MN) H HN 图 1. 变肾上腺素类和 3- 甲氧酪胺的结构 液相色谱条件 参数 色谱柱 值 H H (NMN) NH 2 H 3- (3-MT) NH 2 Agilent Pursuit PFP 柱,2 15 mm,3 µm( 部件号 A35115X2) 保护柱 Agilent Pursuit PFP MetaGuard 柱,2Å 2 mm,3 µm(3/ 包, 部件号 A351MG2) 流动相 柱温 4 C 自动进样器温度 4 C 进样量 2 µl A).2% 甲酸水溶液 B).2% 甲酸的甲醇溶液 进样针清洗 1:1:1:1 甲醇 : 乙腈 : 异丙醇 : 水 +.1 % 甲酸 ( 冲洗进样口 2 s) 流速.3 ml/min 梯度 时间 (min) %B 流速 (ml/min) MS 条件 参数 值 电离模式 安捷伦喷射流 ESI+ 干燥气温度 35 C 干燥气 ( 氮气 ) 流速 5 L/min 雾化器气体 ( 氮气 ) 压力 4 psi 鞘气 ( 氮气 ) 温度 4 C 鞘气流量 11 L/min 毛细管电压 3 V 喷嘴电压 V Q1/Q3 分辨率.7 个质量单位 驻留时间 4 ms Delta EMV 2 V 2

3 化学品与试剂校准物购自 Cerilliant (Round Rock, TX) 剑桥同位素实验室 (Tewksbury, MA) 以及 Medical Isotopes 公司 (Pelham, NH) DC Mass Spect Gold 血浆 MSG3 购自 Golden West Biologicals (Temecula, CA) 血浆内分泌物对照品 1 和 2 购自 ChromSystems Burdick & Jackson LC/MS 级甲醇和试剂购自 VWR 和 Sigma-Aldrich 将 575 mg NH 4 H 2 P 4 溶解于 5 ml 水中, 并使用 3% 的 NH 4 H 将其 ph 调节为 6.5, 制得 ph 6.5 的 1 mm NH 4 H 2 P 4 缓冲液 样品前处理通过将每种分析物加标至 DC Mass Spect Gold 血浆中制得标准校准物 通过利用 DC Mass Spect Gold 血浆进行连续稀释来获得其余标准校准物浓度 SPE 流程如下 : 1. 样品预处理 : 向.5 ml 血浆中加入 5 µl 内标混合物和.5 ml 1 mm NH 4 H 2 P 4 缓冲液 (ph 6.5) 2. 依次用 1 ml 甲醇和 1 ml 1 mm NH 4 H 2 P 4 缓冲液 (ph 6.5) 活化固相萃取柱 (Agilent SimpliQ WCX,3 mg, 1 ml, 部件号 ) 3. 加入经预处理的样品 4. 依次用 1 ml H 2 1 ml 甲醇和 1 ml.2 % 甲酸的乙腈溶液清洗, 然后在全真空下抽干 5 分钟 5. 用 25 µl 2% 甲酸的乙腈溶液洗脱两次, 然后在 5 英寸汞柱真空下抽干 6 秒 6. 滤液在氮气流下于 4 C 蒸干 7. 用 1 µl.2% 甲酸水溶液复溶 将样品转移至自动进样器样品瓶中, 并进样至 LC/MS/MS 系统 表 1. MRM 离子对 化合物 * = 定量离子对 数据分析 母离子 (m/z) 子离子 (m/z) 利用 Agilent MassHunter 定量数据分析软件 (B.7.) 进行数据分析 在校准曲线的线性回归中采用 1/x 作为加权因子 在 MassHunter 定量软件中, 利用色谱峰面积与已知浓度内标的峰面积之比进行定量 碎裂电压 (V) CE (V) 3- 甲氧酪胺 * 甲氧酪胺 甲氧酪胺 -D 去甲变肾上腺素 * 去甲变肾上腺素 去甲变肾上腺素 -D 变肾上腺素 * 变肾上腺素 变肾上腺素 -D CAV (V) 结果与讨论 通过安捷伦 PFP 色谱柱实现了所有分析物的 色谱分离 ( 图 2) 变肾上腺素与 3- 甲氧酪 胺之间的分离尤为关键, 因为这些化合物会产生相同的碎片 并且, 尽管未采用该方法进行测定, 肾上腺素与去甲变肾上腺素之间的分离因为同样的原因也同等重要 如果不根据保留时间进行适当分离, 这些化合物将相互干扰, 导致不准确的定量结果 图 3 显示了这些化合物获得的分离结果 (min) 图 2. 变肾上腺素类和 3- 甲氧酪胺的色谱图 3

4 为研究 SPE 萃取流程的基质效应和回收率, 本研究配制并分析了三组溶液 A B 和 C 这些混合物中包含 9 个不同浓度的全部三种分析物及其内标 将溶液 A 加标至.2% 甲酸水溶液中, 并进样分析 萃取溶液 B 中的洁净血浆, 然后进行加标 ( 萃取后 ) 对溶液 C 中的洁净血浆进行加标后对其进行萃取 ( 萃取前 ) 基质效应和回收率的计算公式如下 : 基质效应 % = B/A 1 回收率 % = C/B 1 A = 净标准溶液 B = 萃取后加标的血浆 ( 萃取后 ) C = 加标后萃取的血浆 ( 萃取前 ) 基质效应介于 36% - 78% 之间, 而回收率介于 88% - 14% 之间 ( 表 2) 因此, 虽然在实验中观察到了基质效应, 但是通过内标补偿后获得了可接受的回收率, 如表 3 和表 4 所示 (min) 图 3. 儿茶酚胺类 变肾上腺素类和 3- 甲氧酪胺的色谱图 表 2. SPE 流程的基质效应和回收率 化合物 表 3. 分析物的分析性能汇总 基质效应 % (n = 9) 回收率 % (n = 9) 平均值 SD 平均值 SD 3- 甲氧酪胺 去甲变肾上腺素 变肾上腺素 化合物 R 2 浓度浓度准确度 % 日内 CV% 日间 CV% (n = 3) (pg/ml) (nmol/l) (n = 3) (n = 3) (n = 5) 3- 甲氧酪胺 去甲变肾上腺素 变肾上腺素

5 分别于连续三天以及一天中三次萃取校准标样, 以确定日间和日内的精密度与准确度 三种分析物均得到可接受的日内准确度, 并且线性范围内所有浓度的日间和日内变异系数均小于 5%( 表 3) 连续三天萃取 ChromSystems 对照样品, 所得到的变异系数均小于 6%( 表 4) 该方法在浓度为 pg/ml 的测定范围内具有出色的线性,R 2 值均大于.9996( 图 4) 结论 本研究中开发出了一种用于血浆中变肾上腺素类 去甲变肾上腺素和 3- 甲氧酪胺定量分析的稳定方法 离线固相萃取在用于同时提取血浆中全部三种分析物时可实现出色的回收率 研究中还开发出了与 LC/MS/MS 条件兼容的分析物的色谱分离方法 典型方法的性能结果均符合可接受标准 表 4. 利用 LC/MS/MS 得到的 ChromSystems 对照品结果 浓度 1 (n = 3) 浓度 2 (n = 3) 化合物 测定值 (pg/ml) CV % 测定值 (pg/ml) CV % 3- 甲氧酪胺 去甲变肾上腺素 变肾上腺素 H 2 3. y =.328*x.2957 R 2 = (pg/ml) 1 1 -H y =.2862*x R 2 = (pg/ml) 3- -H 2 y =.3448*x R 2 = (pg/ml) 图 4. 变肾上腺素类和 3- 甲氧酪胺的校准曲线 5

6 参考文献 1. Whiting, M. J. Simultaneous measurement of urinary metanephrines and catecholamines by liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection. Ann. Clin. Biochem. 29, 46, Gabler, J. A sensitive and interferencefree liquid chromatography tandem mass spectrometry method for measuring metanephrines in plasma. J. Chromatograph. Separat. Techniq. 212, S2 查找当地的安捷伦客户中心 : 免费专线 : , ( 手机用户 ) 联系我们 : LSCA-China_8@agilent.com 在线询价 : clinicalresearch 仅限研究使用 不可用作诊断方法 本文中的信息 说明和指标如有变更, 恕不另行通知 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 1 月 15 日, 中国出版 CHCN

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