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没衿华
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1 通过表征药物 / 抗体比率分析抗体药物偶联物 Agilent 9 Infinity 二元液相色谱系统与 Agilent 6 ifunnel Q-TOF 联用应用简报生物制药作者 Ravindra Gudihal 和 Jing Chen 安捷伦科技公司前言抗体药物偶联物 (ADC) 是通过赖氨酸或半胱氨酸残基共价结合细胞毒性药物的单克隆抗体 ( 图 ) 抗体通过结合疾病状态( 如癌症 ) 相关细胞表面的表位, 可使给药具有特异性 ADC 到达其靶标后即释放出结合的药物, 以在局部创造一个高浓度的细胞毒性药物环境 ADC, 具备提高药效并降低副作用的潜力, 因此其市场份额逐渐增加偶联化学的特性决定了 ADC 本质上是载药量不同的抗体混合物由于药物 / 抗体比率 (DAR) 能够显著影响 ADC 效果, 因此 DAR 是衡量 ADC 质量的重要属性 ; 低载药量会降低效力, 而高载药量则会对药代动力学产生负面影响本研究描述了使用先进液相色谱 / 质谱联用技术与简单易用的数据分析软件测定完整 / 还原态赖氨酸偶联 ADC 的 DAR 图. ADC 示意图

实验部分材料 PNGase F 购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 快速 PNGase F 购自 New England Biolabs (Ipswich, MA) 其余全部化学品均购自 Sigma-Aldrich (St.

DAR 计算器计算 DAR, 该软件仅需极少用户输入即可快速轻松完成所有 DAR 峰的积分, 并能报告最终 DAR 值样品前处理用去离子 (DI) 水将冻干 ADC 复溶至 mg/ml 后分装, 使用前置于 -8 C 下储存分析完整 ADC 时, 采用.

) 中的 µl 单位 /µl PNGase F (Sigma- Aldrich) 加入 µl ADC ( µg) 中, 然后在 7 C 下过夜温育取 µl 完整 ADC 进行 LC/MS 分析在还原态 ADC 的分析中,ADC 的还原方法是将 µl 新鲜配制的二硫苏糖醇 (DTT) ( mm) 以及 µl mm Tris 缓冲液 (ph = 7.

2 实验部分材料 PNGase F 购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 快速 PNGase F 购自 New England Biolabs (Ipswich, MA) 其余全部化学品均购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 工作流程对 ADC 及其亚基的表征工作流程如以下图所示该工作流程包括将糖基化和去糖基化 ADC 制备为完整和还原态形式, 以及使用 Agilent 9 Infinity LC 与 Agilent 6 ifunnel Q-TOF LC/MS 系统联用进行样品分析对所得质谱图进行解卷积, 并使用 Agilent MassHunter BioConfirm 软件和安捷伦 DAR 计算器计算 DAR, 该软件仅需极少用户输入即可快速轻松完成所有 DAR 峰的积分, 并能报告最终 DAR 值样品前处理用去离子 (DI) 水将冻干 ADC 复溶至 mg/ml 后分装, 使用前置于 -8 C 下储存分析完整 ADC 时, 采用.% 甲酸水溶液将 ADC 复溶并稀释至 mg/ml, 在 LC/MS 分析前即用即配完整 mab 的去糖基化方法是将溶于 mm Tris-HCl 缓冲液 (ph 8.) 中的 µl 单位 /µl PNGase F (Sigma- Aldrich) 加入 µl ADC ( µg) 中, 然后在 7 C 下过夜温育取 µl 完整 ADC 进行 LC/MS 分析在还原态 ADC 的分析中,ADC 的还原方法是将 µl 新鲜配制的二硫苏糖醇 (DTT) ( mm) 以及 µl mm Tris 缓冲液 (ph = 7.) 加入一份 µl ( µg) 的 ADC 中, 然后在 C 下温育 min 在还原态去糖基化 ADC 的分析中,ADC 的去糖基化方法是将 µl 新鲜配制的 DTT ( mm) 和 µl PNGase F 试剂 ( 原液稀释倍, 购自 New England Biolabs) 溶于 mm Tris 缓冲液 (ph = 7.) 中, 再将这一混合物加入一份 µl ( µg) 的 ADC 中, 然后在 C 下温育 min 每种样品的 LC/MS 分析进样量为 µg LC/MS 分析仪器 LC/MS 系统 Agilent 9 Infinity 液相色谱系统包括 : Agilent 9 Infinity 二元泵 GA Agilent 9 Infinity 柱温箱 G6C Agilent 9 Infinity 进样器 G6A Agilent 9 Infinity 馏分收集器 / 自动进样器柱温箱 GB 配备安捷伦喷射流离子源的 Agilent 6 ifunnel Q-TOF LC/MS 系统 + + Agilent BioConfirm/DAR Agilent 9 Infinity HPLC Agilent 6 ifunnel Q-TOF 图. ADC 表征的工作流程

3 LC/MS 参数参数 Agilent 9 Infinity 液相色谱系统完整色谱柱 Agilent Poroshell SB-C8 色谱柱,. 7 mm, µm( 部件号 ) 还原态 Agilent PLRP-S Å. mm, 8 µm (PL9-8) 样品恒温箱 C C 流动相 A 含.% 甲酸的水溶液含.% 甲酸的水溶液流动相 B 7% 异丙醇 /% 乙腈 / 99.9% 乙腈 /.% 甲酸 % 水, 含.% 甲酸梯度 ( 分段 ) min & % B min & % B min & 7% B min & % B min & % B min & % B 6 min & 7% B min & 9% B. min & % B 后运行时间 min min 柱温 6 C 8 C 流速. ml/min. ml/min 参数 Agilent 6 Q-TOF LC/MS 系统完整还原态离子模式正离子模式正离子模式离子源安捷伦双喷射流安捷伦双喷射流干燥气温度 9 C 9 C 干燥气流速 L/min L/min 鞘气温度 C C 鞘气流速 L/min L/min 雾化器 psi psi 毛细管电压 V V 喷嘴电压 V V 碎裂电压 V V Oct RF Vpp 7 V 7 V 采集参数 MS 模式数据分析数据在 GHz 下采集, 仅 MS 模式, 数据在高 ( m/z) 质量数范围下采集, 质量数范围为 m/z GHz, 仅 MS 模式, 质量数范围为 8 m/z LC/MS 数据采用 Agilent MassHunter 定性分析软件与 BioConfirm 软件进行分析 mab 的解卷积质谱图采用最大熵解卷积算法获得, 并采用安捷伦 DAR 计算器导出为.csv 文件形式以便于计算 DAR 比率

4 结果与讨论完整 ADC 分析图所示为完整 ADC 和去糖基化完整 ADC 的 LC/MS 分析结果使用异丙醇 / 乙腈 / 水在 Agilent Poroshell SB-C8 色谱柱中得到了峰宽较窄的总离子流色谱图 ( 图 A 和图 D) 图还显示了完整 ADC 及其去糖基化形式的电荷态分布范围 ( 图 B 和图 E) 解卷积质谱图如图 C 所示完整质谱结果表明, 所研究的 ADC 质谱图由于糖基化形式与载药量不同而在不同 ADC 之间具有异质性正是这种异质性使完整 ADC 的解卷积质谱图变得非常复杂 ( 图 C) 为简化解卷积质谱图而对 ADC 进行了去糖基化去糖基化 ADC 质谱图中的电荷态之间实现了良好分离, 这表明 ADC 在去除糖基化后仅保留了共价结合的药物分子 ( 图 F) 解卷积质谱图则显示出了 8 种主要的药物连接类型 ( 图 F) DAR 计算由安捷伦 DAR 计算器完成, 该软件能够将峰积分自动结合, 仅需极少用户干预即可完成 DAR 计算图显示去糖基化 ADC 的 DAR 计算器界面 DAR 计算器 : 从 BioConfirm 软件中导入解卷积质谱图自动识别 DAR 值不同的峰计算每种 DAR 的相对峰面积计算平均 DAR 以及报告结果通过简单的用户界面可轻松实现目标待分析峰的手动调节 DAR 计算器使用以下公式 : DAR = Σ( 相对峰面积载药数量 )/ 采用每个峰的相对峰面积 (%) 以及解卷积质谱图中的相应载药量对 DAR 值进行计算将相对峰面积 (%) 与相应载药量相乘得到加权峰百分比, 这一百分比可用于衡量每一载药种类对 DAR 的贡献 ( 图 ) 手动计算的 DAR 与 DAR 计算器算出的 DAR 完全一致, 因此证明软件具有可靠性图显示采用 DAR 计算器得出的完整 ADC 的 DAR 计算结果, 此结果难以通过手动解析得出 DAR 计算器是一种用于复杂 ADC 样品 DAR 解析和计算的实用工具. 6 B 7 C A 7. TIC (min) (m/z) (amu) F 7 E. 8 D 7 TIC (min) (m/z) (amu) 图. 完整糖基化 ADC( 图 A B C) 和完整去糖基化 ADC( 图 D E F) 的总离子流色谱图 (TIC) 质谱图与解卷积质谱图

5 图. 使用安捷伦 DAR 计算器得出的去糖基化 ADC 的 DAR 计算结果 DAR 值. 显示于解卷积质谱图的右上角图. 使用安捷伦 DAR 计算器得出的完整糖基化 ADC 的 DAR 计算结果 DAR 值.6 显示于解卷积质谱图的右上角

6 还原态 ADC 分析 ADC 的一种主要形式因此各峰的信号强度图 6 显示了还原态糖基化和还原态去糖基化更高图 6 D 和 H 由于轻链未经 N-糖基 ADC 的 LC/MS 分析结果还原态 ADC 包括轻链和重链药物偶联物其中轻链 D 最合并 DAR = (重链 DAR + 轻链 DAR) 图 7 A 和 B 显示由 DAR 计算器生成的代表化因此去糖基化不会影响轻链相关药物偶性报告其中包括标注的解卷积质谱图轻联物的解卷积质谱图图 6 C 和 G 链和重链的各自 DAR 比率合并 DAR 比率先洗脱而重链 D 最后洗脱图 6 A 和 E 导出的糖基化和去糖基化 ADC 的轻链和重质量数范围为 6 - 图 6 B 和 F 链解卷积质谱图随后将加载至 DAR 计算器解卷积后分离出了 D D D 和 D 四种以对峰进行标记和积分软件将根据报告的轻链以及 D D D D 和 D 五种重链图 6 C D G 和 H 去糖基化简化重链显示理论与观测质量数的表格峰面积此外还报告了不同载药量 ADC 的峰面积百分比表显示载药量不同的还原态和去糖基合并 DAR 比率分别计算重链和轻链的 DAR 化 ADC 的理论和观测质量数峰面积以及比率峰面积百分比质谱图后仅保留了载药量不同的去糖基化 ण क़ (min) E TIC ण क़ (min).... ዊ 8 6 ዊ Բ (m/z) F ዊ 8 6 ዊ Բ (m/z)... C ਝओዊ. D ਝओዊ ዘ.. ਝओዊଉຕ (amu) G 6 ਝओዊ ਝओዊଉຕ (amu) 图 6. 还原态糖基化 ADC 图 A - D 和还原态去糖基化 ADC 图 E - H 轻链和重链的 TIC 质谱图与解卷积质谱图 6 B ਝओዊଉຕ (amu) H ਝओዊ ዘ TIC A ਝओዊଉຕ (amu)

7 DAR Report DAR Calculation Results ADC Information Data File Reduced-ADC Combined DAR. Processing Method Reduced Heavy Chain DAR. Report Time 9/6/ 9: AM Light Chain DAR. Property Theoretical (Da) Observed (Da) Heavy Chain DAR Mass Not Given 9 Light Chain DAR Mass Not Given 9. Drug/Linker Mass Not Given Heavy Chain Results Deconvoluted Spectrum DAR Peak List DAR Peak Theoretical Mass Observed Mass (Da) Area % Area (Da) Not Given 9.E+6. Not Given.8E+6.9 Not Given E+.7 Not Given E+ 8. Not Given 87.6E+.7 Page of 图 7A. 安捷伦 DAR 计算器得出的还原态糖基化 ADC 报告 ( 第页 ) 7

8 Light Chain Results Deconvoluted Spectrum DAR Peak List DAR Peak Theoretical Mass Observed Mass (Da) Area % Area (Da) Not Given 9..7E+6 6. Not Given E+. Not Given..7E+.7 Not Given 6..7E+.8 Page of 图 7B. 安捷伦 DAR 计算器得出的还原态糖基化 ADC 报告 ( 第页 ) 8

9 结论采用 Agilent 9 Infinity 液相色谱系统结合 Agilent 6 ifunnel Q-TOF 与安捷伦液相色谱柱的 ADC 反相色谱分析可凭借其优异性能广泛用于高重现地生成完整和还原态 ADC 的精确 DAR 值 Agilent MassHunter BioConfirm 软件和 DAR 计算器可共同实现高效的数据提取与解卷积, 并能轻松直观地计算并报告完整与还原态 ADC 的 DAR 值参考文献表. 安捷伦 DAR 计算器得出的还原态去糖基化 ADC 的 DAR 峰列表 DAR 峰重链结果理论质量数 (Da) 观测质量数 (Da) 峰面积峰面积百分比 E E E+6...9E E+.9 轻链结果 E E E E+.. Chari, R. V.; Miller, M. L.; Widdison, W. C. Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angew Chem. Int. Ed. Engl.,, (), pp Perez, H.L., et al., Antibody-drug conjugates: current status and future directions. Drug Discov Today,. 9(7): p

10 查找当地的安捷伦客户中心 : 免费专线 : ,-8-78( 手机用户 ) 联系我们 : LSCA-China_8@agilent.com 在线询价 : 仅限研究使用不可用作诊断方法本文中的信息说明和指标如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年月 8 日, 中国出版 99-6CHCN

AssayMAP Bravo 自动化样品前处理平台与安捷伦 LC/MS 和 MassHunter/ BioConfirm/DAR 计算器软件相结合, 能够针对 ADC DAR 计算提供可重现的便捷解决方案本应用简报中采用 Agilent AssayMAP Bravo 平台对经 / 未经去糖基化的完

AssayMAP Bravo 自动化样品前处理平台与安捷伦 LC/MS 和 MassHunter/ BioConfirm/DAR 计算器软件相结合, 能够针对 ADC DAR 计算提供可重现的便捷解决方案本应用简报中采用 Agilent AssayMAP Bravo 平台对经 / 未经去糖基化的完抗体药物偶联物 (ADC) 的药物 / 抗体比率 (DAR) 计算利用自动化样品前处理和新型 DAR 计算器软件应用简报作者 Jing Chen 和 Steve Murphy 安捷伦科技公司前言抗体药物偶联物 (ADC) 是制药公司药物开发途径中快速发展的一类新型生物治疗药物 ADC 的制备方法是通过化学方法将具有生物活性的小分子药物与单克隆抗体相连 ADC 通过结合高效细胞毒性药物与靶标特异性抗体将细胞毒性药物直接送达病变组织,