材料与方法 曲妥单抗购自当地药店并遵照制造商的使用说明进行储存 DL- 二硫苏糖醇 (DTT) 碘乙酰胺 (IAA) 甲酸和 LC/MS 级溶剂购自 Sigma-Aldrich 高品质测序级胰蛋白酶 ( 部件号 ) 来自安捷伦科技公司 胰蛋白酶酶解在用胰蛋白酶酶解 mab 曲妥单抗之前, 在变性条件

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1 用于肽谱分析分离的不同类型反相色谱柱的比较 技术概述 前言 基于 LC/MS 的肽谱分析已成为生物分子表征的必备工具 复杂胰蛋白酶酶解物中含有肽特征的混合物, 因此用于 LC/MS 分析的反相 (RP) 色谱柱选择对肽分离具有重要的作用 数据记录表明, 酸条件下的 LC/MS 肽谱分析分离得到的峰形较宽, 峰容量较低, 且结构相似肽的分离度较差 因此, 要实现成功的肽谱分析分离, 正确选择反相色谱柱至关重要 本研究评估具有不同粒径和孔径的几种市售反相肽分离色谱柱 使用单克隆抗体 (mab) 胰蛋白酶酶解物, 以甲酸为流动相进行 LC/MS 肽谱分析分离 为评估色谱柱性能, 需要对保留时间 峰宽和峰容量等肽谱分析的质量属性进行评价 结果证明了 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱在肽谱分析分离耐用性方面展现的优势

2 材料与方法 曲妥单抗购自当地药店并遵照制造商的使用说明进行储存 DL- 二硫苏糖醇 (DTT) 碘乙酰胺 (IAA) 甲酸和 LC/MS 级溶剂购自 Sigma-Aldrich 高品质测序级胰蛋白酶 ( 部件号 ) 来自安捷伦科技公司 胰蛋白酶酶解在用胰蛋白酶酶解 mab 曲妥单抗之前, 在变性条件下 ( 盐酸胍 ) 将二硫键还原 (DTT) 并烷基化 (IAA) 预处理可确保 mab 变性并溶解完全, 从而使蛋白酶与目标底物发生有效接触 还原和烷基化反应之后, 将溶液的 色谱柱 供应商 内径 (mm) 长度 (mm) 填料粒径 (µm) 孔径 (Å) Agilent AdvanceBio Peptide Plus.... 供应商 B.. 供应商 B.... 供应商 D.. 供应商 D.. 9 供应商 D.. LC/MS 条件 参数 Agilent 9 Infinity II 液相色谱仪 进样量 µl ( µg/µl) 样品恒温器 C 流动相 A.% 甲酸水溶液 流动相 B.% 甲酸乙腈溶液 ph 值调至, 在 C 下进行胰蛋白酶过夜酶解 ( 蛋白质与蛋白酶比例 :,w/w) 立即用 LC/MS 分析样品, 或将其储存在 C 下待用 梯度 min 时 % B min 时 % B min 时 % B min 时 9% B min 时 9% B. min 时 % B 用提取化合物色谱图根据以下公式计算峰容量 : 峰容量 (Pc) = + 仪器. 液相色谱系统 梯度时间 (t) 平均峰宽 (W h) Agilent 9 Infinity II 液相色谱仪 停止时间. 分钟 后运行时间 分钟 柱温 C 流速. ml/min 参数 Agilent 精确质量数四极杆飞行时间 离子模式 正离子模式, 双 AJS ESI (profile) 干燥气温度 C 干燥气流速 L/min 鞘气温度 C 鞘气流速 L/min 质谱系统配备安捷伦喷射流离子源的 Agilent 精确质量数四极杆飞行时间 (Q-TOF) 系统 雾化器毛细管电压碎裂电压锥孔电压 Oct RF Vpp 采集参数 MS 模式 psi V V V V 数据在 GHz 的扩展动态范围下采集 MS 质量数范围 m/z MS/MS 质量范围 m/z MS 扫描速率 ( 质谱图 / 秒 ): MS/MS 扫描速率 ( 质谱图 / 秒 ): 碰撞能量梯度电荷态斜率偏移. 及 以上.. 数据分析 Agilent BioConfirm 软件 B.

3 结果与讨论 图 显示了以甲酸作为流动相, 单克隆抗体和胰蛋白酶酶解物在八种反相色谱柱上得到的 LC/MS 色谱图比较 所有类型的反相色谱柱均表现出肽分离的多样性, 这些色谱柱的选择性差异同样十分明显 表 汇总了比较结果 在肽谱分析方法开发的过程中, 一条重要的色谱柱标准便是能够在给定的梯度洗脱条件下容纳大量峰 在相同的色谱柱尺寸 (. mm) 条件下, 供应商 D 的色谱柱鉴定出的峰最多 不过,AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱拥有更高的序列覆盖率 (99.%), 几乎覆盖了多数峰 此外, 序列覆盖率的 %RSD 值最低也说明 AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱得到的覆盖图重现性较高 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 供应商 B 供应商 B 供应商 D 供应商 D 供应商 D 采集时间 (min) 图. 八种反相色谱柱的 mab 肽谱分析曲线比较 表. 八种反相色谱柱的峰数量和序列覆盖率比较 (n = ) 供应商 平均峰数量 平均覆盖率 序列覆盖率 %RSD 最大压力 (bar) Agilent AdvanceBio 9 99.%. Peptide Plus.%.9 供应商 B 9.9%. 供应商 B.%.9 9.%. 供应商 D.%. 9 供应商 D.%. 供应商 D.%. 9

4 重现性 窄峰形和高峰容量是肽谱分析的关键质量属性 图 比较了八种反相色谱柱产生的 LC/MS 肽谱图 这些曲线是五次连续进样的叠加 AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱表现出较高的一致性, 重复进样间的色谱曲线无明显偏移 保留时间和峰宽重现性数据分别如图 和图 所示 在色谱运行过程中, 选择二十个提取化合物色谱图 (ECC) 的峰来评价色谱柱重现性 对 AdvanceBio Peptide Plus 而言, 所有保留时间的平均百分相对标准偏差均.% AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱获得的峰宽 (FWHM) 标准偏差较低, 证明了它对窄峰的性能非常出色 峰容量比较结果如图 所示 AdvanceBio Peptide Plus 和供应商 B 的色谱柱在峰容量上的表现相当 AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱的峰容量值增加了.% 的色谱柱产生的峰形更宽, 峰容量值更低, 且保留时间的重现性较差 AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱的反压不足亚 µm 色谱柱 ( 供应商 D) 的一半, 性能却超出后者 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 9 供应商 B 供应商 B 供应商 D 供应商 D 供应商 D 采集时间 (min) 图. 用不同种类的反相色谱柱分析 mab 胰蛋白酶肽谱 ( 五次重复进样 ) 的总离子流叠加色谱 图 数字标出的峰用于计算保留时间和峰宽重现性

5 %RSD 峰 峰 峰 峰 峰 峰 峰 峰 峰 9 峰 峰 峰 峰 峰 峰 峰 峰 峰 峰 9 峰. Agilent AdvanceBio Peptide Plus 供应商 B 供应商 B 供应商 D 供应商 D 供应商 D 图. 八种反相色谱柱的保留时间重现性比较 平均峰宽..... 峰 峰 峰 峰 峰 峰 峰 峰 峰 9 峰 峰 峰 峰 峰 峰 峰 峰 峰 峰 9 峰. Agilent AdvanceBio Peptide Plus 供应商 B 供应商 B 供应商 D 供应商 D 供应商 D 图. 八种反相色谱柱的峰宽 (FWHM) 重现性比较... 峰容量 平均峰宽 平均峰宽... 峰容量 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 供应商 B 供应商 B 供应商 D 供应商 D 供应商 D 图. 八种反相色谱柱的峰容量和峰宽比较

6 为进一步评估色谱柱性能, 还对重链和轻链互补性决定区域 (CDR) 的肽进行观察 CDR 是抗原结合区域,CDR 对应的肽序列易于被修饰 因此, 观察单克隆抗体的 CDR 非常重要 图 显示了每种色谱柱六个 CDR 肽的 ECC 采用 AdvanceBio Peptide Plus 和 的色谱柱对全部六个 CDR 肽进行鉴定 使用 AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱得到的这些肽的窄峰形和基线分离度, 证明了这款色谱柱强大的的分离能力. ASQDVNTAVAWYQQKPGK. LLIYSASFLYSGVPSR.. SGTDFTLTISSLQPEDFATYYQQHYTTPPT-. Agilent AdvanceBio Peptide Plus FGQGTK. DTYIHWVR.. IYPTNGYTR.. WGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTK 供应商 B 供应商 B 供应商 D 供应商 D 供应商 D 采集时间 (min) 图. 八种反相色谱柱对 CDR 肽序列的分离比较 六幅 ECC 叠加

7 图 比较了一条重链 CDR 肽的 ECC, 证明 AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱得到的 LC/MS 峰形较窄且信噪比较大 结论 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱展示了 : 可重现的肽谱分析 较高的峰容量值 高效肽分离, 峰形窄 在甲酸的流动相条件下 LC/MS 肽谱分析的最佳性能 采集时间 (min) 峰 色谱柱 FWHM 供应商 B. 供应商 D. 供应商 D. Agilent AdvanceBio Peptide Plus. 供应商 B. 供应商 D..9.9 图. CDR 肽的重链监测 八种反相色谱柱的叠加 ECC CDR 肽序列 : WGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTK

8 查找当地的安捷伦客户中心 : 免费专线 : --,--( 手机用户 ) 联系我们 : LSCA-China_@agilent.com 在线询价 : 仅限研究使用 不可用于诊断目的 本文中的信息 说明和指标如有变更, 恕不另行通知 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 月 日, 中国出版 99-ZHCN

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