FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit RC101 Vazyme Biotech Co., Ltd. Web: Tel: 400-600-9335 Sales: sales@vazyme.com Support: support@vazyme.com Service: service@vazyme.com Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 8.1
目 录 Contents 01/产品概述 本试剂盒可从动物细胞或组织中快速提取总RNA 试剂盒基于硅胶柱纯化技术 提取过程中无需 使用有毒的酚/氯仿抽提 全程仅需30 min 试剂盒中gDNA-Filter Columns能够有效地分离上清 并吸附去除gDNA RNAPure Columns能高效地结合RNA 配以优化后的Buffer溶液 使得到的 总RNA纯度高 无蛋白和其他杂质污染 可用于RT-PCR Real-Time PCR 芯片分析等多种下 游实验 02/产品组分 组分 Buffer RL1 Buffer RL2 Buffer RW1 Buffer RW2 RNase-free ddh2o Buffer RDD DNase I RNase-free gdna-filter Columns (each in a 2 ml Collection Tube) RNAPure Columns (each in a 2 ml Collection Tube) RNase-free Collection Tubes 1.5 ml RC101-01 (50 rxn) 30 ml 15 ml 60 ml 36 ml 10 ml 6 ml 250 μl Buffer RL1 提供动物组织和细胞裂解所需的环境 Buffer RL2 提供RNA特异性上柱环境 Buffer RW1 去除RNA中的蛋白质 DNA等杂质 Buffer RW2 去除RNA中的盐离子残留 RNase-free ddh2o 洗脱纯化柱膜上的总RNA Buffer RDD 提供DNase I消化所需的缓冲环境 DNase I RNase-free 去除gDNA的残留 gdna-filter Columns DNA吸附柱 并除去裂解杂质 RNAPure Columns 特异性吸附RNA 01/产品概述... 02 02/产品组分... 02 03/保存条件... 03 04/适用范围... 03 05/自备材料... 03 06/注意事项... 03 07/实验原理与流程概要... 04 Collection Tubes 2 ml 滤液收集管 RNase-free Collection Tubes 1.5 ml RNA收集管 03/保存条件 DNase I置于-20 保存 Buffer RL1在加入β-巯基乙醇后 可在4 保存1个月 其余组分均可在常温(15-25 )干燥条件下保存 08/使用方案... 05 08-1/样本处理... 05 08-2/RNA提取... 05 09/常见问题及解决方案... 07 01/ 02
04/适用范围 07/实验原理与流程概要 1-20 mg动物组织 <5 106 培养细胞 05/自备材料 β-巯基乙醇 无水乙醇 RNase-free枪头等 步骤一 步骤一 动物组织 10-20 mg 收集细胞 2-5 106 个细胞 组织匀浆 500 μl Buffer RL1 裂解细胞 500 μl Buffer RL1 06/注意事项 操作前在 Buffer RL1 中加入β- 巯基乙醇至终浓度为 1% 如每 1 ml Buffer RL1 中加入 10 μl β- 巯基乙醇 此裂解液建议现配现用 Buffer RL1 加入β- 巯基乙醇后可在 4 保 存 1 个月 若试剂盒于 2-8 保存 使用前请检查 Buffer RL1 和 Buffer RW2 中是否有晶体析出 步骤二 转移组织匀浆液或细胞裂解液转移到 gdna-filter Columns 13,000 g 离心 2 min 后收集滤液 若有晶体析出 可将 Buffer 放置室温或者 37 加热使晶体溶解 混匀后方可使用 首次 使用前 请参考瓶上标签 在 Buffer RL2 与 Buffer RW2 中加入相应的无水乙醇 标注后 室温储存 所有操作步骤 如果没有特别指出 均在常温 (15-25 ) 下进行 样品处理量控制在 10-20 mg 组织或 2-5 106 个细胞 样品量过多会导致基因组 DNA 残留或产量降低 并可能会导致 gdna-filter Columns 柱堵塞 使用本试剂盒时 请穿戴实验服 一次性乳胶手套 一次性口罩 使用 RNase-free 耗材 等 最大程度的避免 RNase 污染 样本的选择及保存在很大程度上会影响 RNA 的产量及质量 应尽可能的采用新鲜的动 物组织或细胞进行 RNA 提取 如果采集的样本不能及时进行提取 可以将新采集的样本 立即置于液氮中速冻后于 -70 保存 并避免反复冻融 或者将样本立即置于 Buffer RL1 裂解液中匀浆后 置于 -70 保存 为了避免 RNA 的降解 样本的采集与保存应尽可能 迅速进行 样本破碎需彻底 样本破碎不充分将影响 RNA 的产量以及进行裂解物分离操作时容易 发生离心柱堵塞 匀浆时尽量控制温度 防止因匀浆过程产生的热量导致 RNA 降解 本试剂盒可去除体系中 95% 的 DNA 污染 纯化获得的 RNA 通常无需使用 DNase I 处 理即可用于下游实验操作 如果下游实验对微量 DNA 十分敏感 可以使用本产品所提供 的 DNase I 进一步清除 DNA 污染 具体过程详见 08-2/ 第 7 步 步骤三 添加 1.6 倍体积 Buffer RL2 到收集的滤液中 步骤四 将上述混合液加到 RNAPure Columns 中 13,000 g 离心 1 min, 弃废液 步骤五 去蛋白 加入 500 μl Buffer RW1(13,000 g 离心 1 min) 弃废液 脱盐 加入 700 μl Buffer RW2(13,000 g 离心 1 min) 弃废液 步骤六 ( 可选 ) 去除 gdna 残留 向膜中央加入 70 μl 的 DNase I 反应液 室温静置 15-30 min 重复步 骤五 步骤七 加入 700 μl Buffer RW2(13,000 g 离心 1 min) 去除残留乙醇 13,000 g 空管离心 2 min 步骤八 洗脱 50-200 μl RNase-free ddh2o 室温孵 育 2-5 min 13,000 g 离心 2 min 收集 RNA 03/ 04
08/使用方案 请在实验前仔细阅读此操作说明 本试剂盒适用于动物细胞及组织总RNA提取 请严格 按照其操作流程进行 本试剂盒已经过严格的测试 请在使用过程中勿改变各试剂使用 量 操作前在Buffer RL1中加入β-巯基乙醇并使其终浓度为1% 每1 ml Buffer RL1中加 入10 μl β-巯基乙醇 此裂解液建议现配现用 08-1/样本处理 动物组织 匀浆处理 取新鲜组织每10-20 mg 加入500 μl Buffer RL1 已加入β-巯基乙醇 用玻璃匀 浆器或者电动匀浆器将组织彻底研磨均匀 液氮研磨 将液氮研磨好的粉末立即转移到Buffer RL1 已加入β-巯基乙醇 中 按照每 10-20 mg 加入500 μl Buffer RL1 用移液器吹打均匀至无明显的粉末团 使用前在Buffer RL1加入β-巯基乙醇至终浓度为1% 如1ml Buffer RL1中加入10 μl β-巯基乙醇 尽量现配现用 组织量不要超过 20 mg 肝脏 脾脏 肾脏等组织DNA/RNA含量丰富的样本请勿超过10 mg 否 则会导致Total RNA的提取质量下降 匀浆过程尽量保证温度不超过25 防止匀浆过程中因为温度升高导致的Total RNA降解 匀浆完或者液氮研磨后混合均匀的液体如不立即进行下一步操作 可以置于-70 保存 培养细胞 贴壁细胞 不需消化 可直接使用Buffer RL1 已加入β-巯基乙醇 进行消化 裂解 或用胰酶消化后离心收集细胞加入Buffer RL1 已加入β-巯基乙醇 每2-5 106 个细胞 加入500 μl Buffer RL1 用移液器反复吹打混匀直至看不到细胞团为止 悬浮细胞 直接离心收集细胞 加入Buffer RL1 已加入β-巯基乙醇 每2-5 106 个细 胞加入500 μl Buffer RL1 用移液器反复吹打混匀直至看不见细胞团为止 使用前在Buffer RL1加入β-巯基乙醇至终浓度为1% 如1ml Buffer RL1中加入10 μl β-巯基乙醇 尽量现配现用 每2-5 106 个细胞加入500 μl Buffer RL1 2. 向收集管内上清液中加入 1.6 倍体积 Buffer RL2 已加入无水乙醇 轻柔混匀 上清液的体积一般为 500 μl 需加入 800 μl Buffer RL2 Buffer RL2 的加入量请按照实际操作过程中上清液的 体积按照相应比例进行添加 如果加入 Buffer RL2 后 溶液出现浑浊或絮状沉淀 属正常现象 吹打混匀后可直接进行下一步操作 3. 取步骤 2 混合液转移至 RNAPure Columns 中 RNAPure Columns 已放入收集管中 13,000 g 离心 1 min 吸附柱容积为 700μl 请分两次进行离心 请将步骤 2 里面出现的絮状沉淀混匀后一并转移到 RNAPure Columns 中进行离心 4. 弃掉废液后将 RNAPure Columns 吸附柱放回收集管中 将剩余的液体全部加入吸附柱中 13,000 g 离心 1 min 5. 向 RNAPure Columns 中加入 500 μl Buffer RW1 6. 向 RNAPure Columns 中加入 700 μl Buffer RW2 已加入无水乙醇 弃 废液 7. 痕量 DNA 去除 ( 可选 ) a.dnase I 反应工作液的配制 取 65 μl Buffer RDD 加入 RNase-free 离心管中 加入 5 μl 的 DNase I 轻柔混匀 b.向膜中央加入 70 μl 的 DNase I 反应工作液 室温静置 15-30 min c.向 RNAPure Columns 中加入 500 μl Buffer RW1 d.向 RNAPure Columns 中加入 700 μl Buffer RW2 8. 重复步骤 6 9. 将 RNAPure Columns 吸附柱放回收集管中 13,000 g 离心 2 min 以彻底去 RNAPure Columns 中残留的 Buffer RW2 向吸附柱中央部位悬空滴加 10. 将吸附柱转移至新的 RNase-free Collection Tubes 1.5 ml 离心管中 50-200 μl 的 RNase-free ddh2o 室温放置 2 min 13,000 g 离心 1 min 洗脱 RNA RNase-free ddh2o 的洗脱体积不应低于 50 μl 体积过小会影响洗脱效率 为提高 Total RNA 产量 可将 RNase-free ddh2o 提前 65 预热 并将 RNA 洗脱液重新加到 RNAPure Columns 纯化柱中 室温放置 2 min 13,000 g 离心 1min 弃掉 RNAPure Columns 11. 提取的 Total RNA 可直接用于下游实验或于 -70 保存 细胞裂解完后若不立即进行下一步操作 可以置于-70 保存 08-2/RNA提取 以下过程请在无RNase 污染的超净台中进行 1. 将处理好的匀浆转移到gDNA-Filter Columns中 gdna-filter Columns已放入收集管中 13,000 g 离心2 min 弃掉gDNA-Filter Columns 保留收集管内上清液 如果匀浆或研磨不彻底 组织使用量大于20 mg 先将匀浆液移至 1.5 ml离心管中 13,000 g 离心5 min后 再将上清转移到gDNA-Filter Columns中13,000 g 离心2 min 如果gDNA-Filter Columns收集管底部有沉淀产生 请将上清转移至新的RNase-free离心管中再进 行后续操作 切勿将沉淀吸入上清液中 05/ 06
09/常见问题分析 gdna-filter Columns堵塞问题 gdna-filter Column 堵塞通常会有以下原因造成 超量的组织 1. 样品用量太多 本试剂盒适用于提取 10-20 mg 动物组织或者 2-5 106 个细胞 会降低产量以及纯度 操作时应减少样本使用量 2. 样品富含肌纤维 肌肉 心脏以及皮肤等富含肌纤维 肌纤维的分子量大 会引起柱子堵塞 提取的RNA影响下游实验 1. 洗脱后 RNA 中有盐离子残留 纯化柱需要进行两次 Buffer RW2 洗涤 如果两次洗涤后还存 在盐离子残留 则在加入 Buffer RW2 后 室温放置 5 min 再进行离心操作 以最大程度上去除 盐离子污染 2. 洗脱后 RNA 有乙醇残留 确认 Buffer RW2 洗涤后 按操作说明所需的离心转速进行空管离 心操作 如果还有乙醇残留 可在空管离心后在室温放置 5 min 以最大程度上去除乙醇残留 样本处理时采用液氮研磨方式会降低堵柱现象 3. 组织研磨或者匀浆不充分 研磨或者匀浆不充分时 碎片有可能导致柱堵塞 将裂解后的液体 先进行 13,000 g 离心 5 min 取上清再加入 gdna-filter Columns 提取的RNA有基因组DNA污染 不同种类组织细胞 DNA RNA 含量相差很大 请勿超过 20 mg 组织和 5 106 细胞 如肝脏 脾 脏和肾脏 DNA 含量丰富 请勿超过 10 mg 否则会导致基因组残留过多 gdna-filter Columns 提取不到RNA或者RNA产量低 能够有效的去除体系中大部分 DNA 污染 如果下游实验对微量 DNA 十分敏感 可根据具体情 况选择选择使用以下方案 Total RNA 的提取过程中回收效率低通常会有以下原因造成 1. 用试剂盒提供的 DNase I 进行膜上消化清除 DNA 污染 具体过程详见 08-2/ 第 7 步 1. 样本保存不当或者样本保存时间过久 样本保存不当或者保存时间过长都有可能导致 2. 逆转录时选择含有基因组去除模块的逆转录试剂 推荐使用 HiScript II Q RT SuperMix for RNA 的降解 采集新鲜样本或经过液氮速冻后保存于 -70 或液氮中的样本 2. 匀浆或者液氮研磨不充分 匀浆或者液氮研磨不充分 裂解不充分 导致 RNA 的释放 qpcr (+gdna wiper) Vazyme #R223 3. 设计引物时选用跨内含子的引物 从而避免基因组 DNA 模板参与扩增反应 不充分 3. 洗脱不充分 RNase-free ddh2o 滴加到纯化柱膜中央 纯化柱的洗脱体积为 50-200 μl 若洗脱效果不理想 可以加入在 65 预热的 RNase-free ddh2o 后 延长室温放置时间 离心后进行第二次洗脱 RNA降解 纯化后的RNA降解与样本质量 是否被RNase 污染 操作方式等因素有关 1. 样本因为没有及时保存 导致RNA降解 组织样本或者细胞在收集后若不及时进行后 续实验 液氮速冻后于-70 保存 2. 样本反复冻融 组织样本保存时 分小块保存 避免因反复冻融导致的降解 3. 电泳原因 常见的RNA降解现象部分因为电泳过程引起的 电泳前将电泳槽用3 双 氧水浸泡20 min 然后用RNase-free ddh2o进行冲洗 电泳缓冲液用RNase-free ddh2o 配置 4. 确保提取过程中使用的枪头和离心管均为RNase-free 07/ 08