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1 第 五 章 分 子 生 物 学 研 究 法 ( 上 ) DNA RNA 及 蛋 白 质 操 作 技 术

2 主 要 内 容 模 式 生 物 核 酸 的 操 作 和 分 析 技 术 蛋 白 质 的 分 离 和 分 析

3 什 么 是 模 式 生 物? 分 子 生 物 学 有 一 个 著 名 的 说 法 : 基 础 问 题 可 以 在 最 简 单 和 最 容 易 获 得 的 系 统 中 得 以 回 答 能 够 代 表 生 物 界 的 某 一 大 类 群 ; 对 人 体 和 环 境 无 害, 容 易 获 得 并 易 于 在 实 验 室 内 饲 养 和 繁 殖 ; 模 式 动 世 代 短 子 代 多 遗 传 背 景 清 楚 ; 物 容 易 进 行 实 验 操 作, 特 别 具 有 遗 传 的 操 作 手 段 和 表 型 分 析 的 方 法 共 性 通 过 对 选 定 的 生 物 物 种 进 行 科 学 研 究, 用 于 揭 示 某 种 具 有 普 遍 规 律 的 生 命 现 象, 这 种 被 选 定 的 生 物 物 种 即 为 模 式 生 物

4 模 式 动 物 与 动 物 模 型 的 区 别 基 本 生 命 现 象 ; 特 殊 固 有 的 ; 创 造 的 基 础 研 究 ; 应 用 研 究 结 构 简 单 ; 复 杂

5 常 见 模 式 生 物 点 燃 基 因 工 程 的 先 行 者 大 肠 杆 菌 和 它 的 噬 菌 体 食 品 与 酒 香 催 生 了 现 代 分 子 生 物 学 酿 酒 酵 母 植 物 遗 传 研 究 的 代 表 拟 南 芥 遗 传 学 史 上 地 位 显 赫 国 王 果 蝇 奠 定 现 代 发 育 生 物 学 里 程 碑 的 海 洋 中 刺 客 海 胆 丑 陋 的 爪 蟾 变 成 发 育 生 物 学 的 王 子 非 洲 爪 蟾 讲 述 细 胞 凋 亡 故 事 的 美 丽 公 主 线 虫 现 代 生 物 医 学 中 的 新 贵 族 斑 马 鱼 诺 贝 尔 奖 的 最 大 赢 家 小 鼠

6 分 子 生 物 学 家 聚 焦 于 大 肠 杆 菌 分 子 生 物 学 起 源 于 细 菌 和 噬 菌 体 模 式 系 统 的 实 验 细 菌 处 于 DNA 复 制 信 息 传 递 基 因 调 节 机 制 等 研 究 的 中 心 位 置 大 肠 杆 菌 容 易 培 养, 能 适 应 环 境 中 多 变 的 化 学 条 件, 并 且 繁 殖 很 快 为 单 细 胞 生 物, 所 有 DNA RNA 和 蛋 白 质 合 成 的 机 器 都 包 含 在 同 一 空 间 只 有 一 条 染 色 体 大 约 有 460 万 核 苷 酸, 并 能 制 造 4300 多 种 不 同 的 蛋 白 质 主 要 优 势 是 具 备 易 于 进 行 遗 传 交 换 的 系 统, 便 于 进 行 定 点 突 变 构 建 含 多 种 突 变 的 菌 株 等 细 菌 可 以 自 主 复 制, 细 菌 质 粒 可 用 作 克 隆 载 体

7 酿 酒 酵 母 (Saccharomycetaceae) 单 细 胞 真 核 生 物, 基 因 组 较 小, 基 因 数 目 也 较 少 ; 可 快 速 繁 殖, 从 单 个 细 胞 可 以 繁 殖 成 克 隆 群 体 ; 具 备 真 核 细 胞 的 主 要 特 征 ; 单 倍 体 和 双 倍 体 细 胞 的 存 在 促 进 了 酿 酒 酵 母 的 遗 传 分 析 ; 在 酵 母 中 容 易 产 生 精 确 的 突 变 ; 酿 酒 酵 母 细 胞 在 生 长 时 改 变 形 态 在 转 录 和 基 因 调 控 DNA 复 制 重 组 翻 译 等 研 究 中 非 常 重 要

8 2001 年 诺 贝 尔 生 理 学 或 医 学 奖 Leland H. Hartwell Tim Hunt Paul M. Nurse 2001 年 诺 贝 尔 生 理 学 或 医 学 奖 授 予 美 国 科 学 家 利 兰 哈 特 韦 尔 英 国 科 学 家 蒂 莫 西 亨 特 和 保 罗 纳 斯, 以 表 彰 他 们 发 现 了 细 胞 周 期 的 关 键 分 子 调 节 机 制 : 细 胞 周 期 蛋 白 依 赖 激 酶 分 子 和 细 胞 周 期 蛋 白 驱 动 细 胞 从 一 个 阶 段 到 下 一 个 阶 段

9 拟 南 芥 (Arabidopsis thaliana) -- 从 30 万 种 植 物 中 选 出 的 模 式 植 物 能 在 室 内 大 量 生 长,8-10 个 星 期 内 能 产 生 大 量 后 代 基 因 组 是 目 前 已 知 植 物 基 因 组 中 最 小 的, 已 完 成 全 部 序 列 的 测 序 容 易 获 得 各 种 代 谢 功 能 的 缺 陷 型 通 过 研 究 拟 南 芥 所 携 带 的 遗 传 信 息, 可 以 认 识 更 多 的 有 花 植 物 的 遗 传 学 分 子 生 物 学 和 进 化 对 于 农 作 物 或 其 他 植 物 种 类 的 发 育 和 生 理 学 也 非 常 对 于 农 作 物 或 其 他 植 物 种 类 的 发 育 和 生 理 学 也 非 常 有 用

10 黑 腹 果 蝇 ( Drosophila melanogaster) -- 理 解 动 物 发 育 的 一 把 钥 匙 作 为 模 式 生 物 用 于 遗 传 与 发 育 研 究 已 经 近 100 年 ; 生 活 周 期 很 短 ; 第 一 个 基 因 图 谱 在 果 蝇 中 产 生 ; 制 备 携 带 外 源 DNA 的 转 基 因 果 蝇 简 便 易 行 果 蝇 的 基 因 与 在 人 类 中 相 对 应 果 蝇 的 基 因 与 在 人 类 中 相 对 应 的 基 因 有 惊 人 的 相 似, 可 作 为 一 种 研 究 人 类 发 育 和 疾 病 的 模 式 动 物

11 果 蝇 ( Drosophila melanogaster) 研 究 揭 开 了 胚 胎 如 何 由 一 个 细 胞 发 育 成 完 美 的 特 化 器 官 有 助 于 解 释 人 类 先 天 性 畸 型 美 国 科 学 家 Richard Axel 和 Linda B.Buck 因 为 在 气 味 受 体 和 嗅 觉 系 统 的 研 究 贡 献 而 一 同 分 享 了 2004 年 的 诺 贝 尔 医 学 生 理 学 医 学 奖 : 发 现 了 果 蝇 在 嗅 觉 功 能 上 有 个 特 定 的 大 脑 区 域, 以 此 清 楚 地 阐 明 了 人 类 嗅 觉 系 统 的 工 作 方 式

12 海 胆 (Echinoidea) 最 早 被 使 用 的 模 式 生 物, 卵 子 和 胚 胎 对 早 期 发 育 生 物 学 的 发 展 有 举 足 轻 重 的 作 用 易 于 得 到 大 量 受 精 卵, 同 步 发 育, 胚 体 透 明, 孵 化 速 度 快 的 特 点 成 为 了 生 物 学 研 究 的 模 式 生 物 1891 年,Hans Driesh 实 验, 为 现 代 发 育 生 物 学 奠 定 了 第 一 块 观 念 里 程 碑 "Cell Interaction", ISBN

13 非 洲 爪 蟾 (Xenopus) 卵 母 细 胞 体 积 大 数 量 多, 易 于 显 微 操 作, 易 于 生 化 分 析 用 于 卵 母 细 胞 减 数 分 裂 机 理 研 究 中 具 有 不 可 替 代 的 作 用 Peter Agre 参 与 卵 母 细 胞 减 数 分 裂 的 重 要 蛋 白 激 酶 的 功 能 研 究 开 启 了 细 胞 周 期 调 控 的 分 子 机 理 之 门 1991 年, 美 国 科 学 家 Agre 发 现 第 一 个 水 通 道 蛋 白 CHIP28 Roderick MacKinnon

14 秀 丽 新 小 杆 ( 隐 杆 ) 线 虫 (Caenorhabditis elegans) 比 果 蝇 小 且 更 简 单 的 多 细 胞 动 物 (1mm), 具 有 很 多 合 适 的 特 性 : 生 活 周 期 很 短, 易 于 培 养, 只 吃 细 菌 12 h 内 胚 胎 完 成 发 育,40 h 内 成 为 一 个 性 成 熟 的 成 虫 (959 个 体 细 胞 ) 雌 雄 同 体 的 成 虫 4 d 可 产 生 300 个 自 身 后 代 基 因 组 含 9700 万 对 核 苷 酸, 编 码 了 约 个 基 因, 由 相 对 较 少 研 究 得 很 深 入 的 细 胞 谱 系 组 成 细 胞 死 亡 途 径 和 干 扰 RNA 都 是 在 线 虫 中 发 现 的 (Nobel 奖 )

15 线 虫 2002 年 诺 贝 尔 生 理 学 或 医 学 奖, 获 奖 的 原 因 是 在 20 世 纪 60 年 2002 年 诺 贝 尔 生 理 学 或 医 学 奖, 获 奖 的 原 因 是 在 20 世 纪 60 年 代 初 期 正 确 选 择 线 虫 作 为 模 式 生 物, 发 现 器 官 发 育 和 程 序 性 细 胞 死 亡 过 程 中 的 基 因 规 则

16 线 虫 Double stranded RNA Neg. control Uninjected Inject Antisense RNA dsrna 2006 年 诺 贝 尔 生 理 学 或 医 学 奖 RNA 干 扰 将 双 链 RNA 导 入 线 虫 基 因 中, 发 现 双 链 RNA 较 单 链 RNA 更 能 高 效 地 特 异 性 阻 断 相 应 基 因 的 表 达, 称 这 种 现 象 为 RNA 干 扰 Nature :

17 斑 马 鱼 (Brachydanio rerio) 用 于 研 究 脊 椎 动 物 发 育 的 模 式 生 物 基 因 与 人 类 基 因 的 相 似 度 达 到 87% 其 胚 胎 是 透 明 的, 能 在 活 体 中 观 察 细 胞 的 运 动 以 及 它 们 随 发 育 进 行 而 发 生 改 变 的 特 征 斑 马 鱼 的 细 胞 标 记 技 术 突 变 技 术 转 基 因 技 术 基 因 活 性 抑 制 技 术 等 已 经 成 熟 胚 胎 突 变 体 是 研 究 胚 胎 发 育 分 子 机 制 的 优 良 资 源, 易 于 药 物 对 其 体 内 器 官 影 响 的 观 察 与 研 究

18 小 鼠 (Mus musculus) 基 因 组 和 人 类 99% 同 源, 且 生 理 生 化 和 发 育 过 程 和 人 类 相 似 在 小 鼠 和 人 类 之 间 有 着 大 量 的 同 线 性 ;85% 以 上 的 基 因 是 一 一 对 应 的 ; 运 用 基 因 组 序 列 和 生 物 信 息 学 分 析, 发 展 新 型 的 基 因 组 改 造 方 法, 并 在 随 机 或 定 向 突 变 的 基 础 上, 在 整 体 动 物 表 型 水 平 进 行 分 析 同 源 重 组 为 单 个 基 因 的 选 择 性 去 除 提 供 了 机 会, 易 于 建 立 人 类 疾 病 的 小 鼠 模 型, 是 研 究 人 类 发 育 和 疾 病 的 优 良 模 型

19 小 鼠 (Mus( musculus) m ) 2007 年 诺 贝 尔 生 理 学 或 医 学 奖, 获 奖 的 原 因 for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells

20 现 代 分 子 生 物 学 技 术 基 因 操 作 主 要 包 括 DNA 分 子 的 切 割 与 连 接 细 胞 转 化 核 酸 序 列 分 析 以 及 基 因 人 工 合 成 表 达 定 点 突 变 和 PCR 扩 增 等, 是 分 子 生 物 学 研 究 的 核 心 技 术 基 因 工 程 是 指 在 体 外 将 核 酸 分 子 插 入 病 毒 质 粒 或 其 它 载 体 分 子, 构 成 遗 传 物 质 的 新 组 合, 使 之 进 入 原 先 没 有 这 类 分 子 的 寄 主 细 胞 内 并 进 行 持 续 稳 定 的 繁 殖 和 表 达

21 重 组 DNA 技 术 史 话 基 因 工 程 技 术 是 核 酸 操 作 技 术 的 一 部 分, 只 不 过 它 强 调 了 外 源 核 酸 分 子 在 另 一 种 不 同 的 寄 主 细 胞 中 的 繁 衍 与 性 状 表 达 事 实 上, 这 种 跨 越 物 种 屏 障 把 来 自 其 它 生 物 的 基 因 置 于 新 的 寄 主 生 物 细 胞 之 中 的 能 力, 是 基 因 工 程 技 术 区 别 于 其 它 生 命 科 学 技 术 的 根 本 特 征

22 重 组 DNA 技 术 史 上 的 主 要 事 件 年 份 事 件 1869 F.Miescher 首 次 从 莱 茵 河 鲑 鱼 精 子 中 分 离 DNA 1957 A.Kornberg 从 大 肠 杆 菌 中 发 现 了 DNA 聚 合 酶 I Uchoa 发 现 RNA 聚 合 酶 和 信 使 RNA, 并 证 明 mrna 决 定 了 蛋 白 质 分 子 中 的 氨 基 酸 序 列 1961 Nirenberg 破 译 了 第 一 个 遗 传 密 码 ;Jacob 和 Monod 提 出 了 调 节 基 因 表 达 的 操 纵 子 模 型 1964 Yanofsky 和 Brenner 等 人 证 明, 多 肽 链 上 的 氨 基 酸 序 列 与 该 基 因 中 的 核 苷 酸 序 列 存 在 着 共 线 性 关 系 1965 Holley 完 成 了 酵 母 丙 氨 酸 trna 的 全 序 列 测 定 ; 科 学 家 证 明 细 菌 的 抗 药 性 通 常 由 质 粒 DNA 所 决 定 1966 Nirenberg,Uchoa,Khorana,Crick 等 人 破 译 了 全 部 遗 传 密 码

23 1967 第 一 次 发 现 DNA 连 接 酶 1970 Smith,Wilcox 和 Kelley 分 离 了 第 一 种 限 制 性 核 酸 内 切 酶,Temin 和 Baltimore 从 RNA 肿 瘤 病 毒 中 发 现 反 转 录 酶 Boyer,Berg 等 人 发 展 了 DNA 重 组 技 术, 于 72 年 获 得 第 一 个 重 组 DNA 分 子,73 年 完 成 第 一 例 细 菌 基 因 克 隆 Sanger 与 Maxam 和 Gilbert 等 人 发 明 了 DNA 序 列 测 定 技 术,1977 年 完 成 了 全 长 5387bp 的 噬 菌 体 φ174 基 因 组 测 定 1978 首 次 在 大 肠 杆 菌 中 生 产 由 人 工 合 成 基 因 表 达 的 人 脑 激 素 和 人 胰 岛 素 1980 美 国 联 邦 最 高 法 院 裁 定 微 生 物 基 因 工 程 可 以 被 专 利 化 1981 Palmiter 和 Bi Brinster 获 得 转 基 因 小 鼠,SpradlingS 和 Rubin 得 到 转 基 因 果 蝇

24 1982 美 英 批 准 使 用 第 一 例 基 因 工 程 药 物 胰 岛 素, Sanger 等 人 完 成 了 入 噬 菌 体 48,502bp 全 序 列 测 定 1983 获 得 第 一 例 转 基 因 植 物 1984 斯 坦 福 大 学 获 得 关 于 重 组 DNA 的 专 利 1986 GMO 首 次 在 环 境 中 释 放 1988 Watson 出 任 人 类 基 因 组 计 划 首 席 科 学 家 1989 DuPont 公 司 获 得 转 肿 瘤 基 因 小 鼠 Oncomouse 1992 欧 共 体 35 个 实 验 室 联 合 完 成 酵 母 第 三 染 色 体 全 序 列 测 定 (315kb) 1994 第 一 批 基 因 工 程 西 红 柿 在 美 国 上 市 1996 完 成 了 酵 母 基 因 组 ( bp) 全 序 列 测 定 1997 英 国 爱 丁 堡 罗 斯 林 研 究 所 获 得 克 隆 羊 2000 完 成 拟 南 芥 的 全 序 列 测 定 ( bp) 2001 完 成 第 一 个 人 类 基 因 组 全 序 列 测 定 ( bp)

25 上 个 世 纪 中 下 叶 以 来, 现 代 分 子 生 物 学 的 迅 猛 发 展 源 自 工 具 酶 的 发 现 工 欲 善 其 事, 必 先 利 其 器.

26 重 组 DNA 实 验 中 常 见 的 主 要 工 具 酶 酶 类 功 能 限 制 性 核 酸 内 切 酶 DNA 连 接 酶 识 别 并 在 特 定 位 点 切 开 DNA 通 过 磷 酸 二 酯 键 把 两 个 或 多 个 DNA 片 段 连 接 成 一 个 DNA 分 子 DNA 聚 合 酶 I( 大 肠 杆 菌 ) 按 5' 到 3' 方 向 加 入 新 的 核 苷 酸, 补 平 DNA 双 链 中 的 缺 口 反 转 录 酶 按 照 RNA 分 子 中 的 碱 基 序 列, 根 据 碱 基 互 补 原 则 合 成 DNA 链 碱 性 磷 酸 酯 酶 末 端 转 移 酶 DNA 外 切 酶 III λ 噬 菌 体 DNA 外 切 酶 切 除 位 于 DNA 链 末 端 的 磷 酸 基 团 在 双 链 核 酸 的 3 末 端 加 上 多 聚 或 单 核 苷 酸 从 DNA 链 的 3' 末 端 逐 个 切 除 单 核 苷 酸 从 DNA 链 的 5' 末 端 逐 个 切 除 单 核 苷 酸

27 DNA 重 组 技 术 的 基 本 工 具 准 确 切 割 DNA 的 工 具 ( 分 子 手 术 刀 ) 限 制 性 核 酸 内 切 酶 DNA 片 段 的 连 接 工 具 ( 分 子 缝 合 针 ) DNA 连 接 酶 基 因 转 移 工 具 ( 分 子 运 输 车 ) 基 因 转 移 工 具 ( 分 子 运 输 车 ) 基 因 进 入 受 体 细 胞 的 载 体

28 ( 一 ) 限 制 性 核 酸 内 切 酶 分 子 手 术 刀 (1) 来 源 : 主 要 是 从 原 核 生 物 中 分 离 纯 化 出 来 的 (2) 化 学 本 质 : 蛋 白 质 (3) 作 用 催 化 作 用, 可 重 复 利 用 可 用 于 DNA 的 切 割 获 取 目 的 基 因 和 载 体 的 切 割 (4) 作 用 特 点 : 特 异 性, 即 限 制 酶 可 识 别 特 定 的 脱 氧 核 苷 酸 序 列, 切 割 特 定 位 点 (5) 切 割 方 式 错 位 切 : 产 生 两 个 相 同 的 黏 性 末 端 平 切 : 形 成 平 末 端

29 限 制 性 核 酸 内 切 酶 (Restriction endonuclease, RE) 能 够 识 别 DNA 上 的 特 定 碱 基 序 列 并 从 这 个 位 点 切 开 DNA 分 子 第 一 个 核 酸 内 切 酶 EcoRI 是 Boyer 实 验 室 在 1972 年 发 现 的, 它 能 特 异 性 识 别 GAATTC 序 列, 将 双 链 DNA 分 子 在 这 个 位 点 切 开 并 产 生 具 有 粘 性 末 端 的 小 片 段

30 限 制 性 内 切 酶 的 种 类 和 命 名 已 经 从 约 300 种 微 生 物 中 分 离 出 了 约 4000 种 限 制 性 内 切 酶 命 名 方 法 : 粘 质 沙 雷 氏 杆 菌 (Serratia marcesens) Sma I 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli R) EcoR I

31 限 制 酶 的 识 别 序 列 能 被 限 制 性 内 切 酶 特 异 性 识 别 的 切 割 部 位 都 具 有 回 文 序 列 : 在 切 割 部 位, 一 条 链 正 向 读 的 碱 基 顺 序 与 另 一 条 链 反 向 读 的 顺 序 完 全 一 致

32 ( 二 )DNA 连 接 酶 分 子 缝 合 针 1 种 类 : E coli DNA 连 接 酶 2 作 用 : T 4 DNA 连 接 酶 将 双 链 DNA 片 段 缝 合 起 来, 恢 复 被 限 制 酶 切 开 的 两 个 核 苷 酸 之 间 的 磷 酸 二 酯 键, 形 成 一 个 重 组 的 DNA 分 子

33 例 : 利 用 EcoRI 构 建 基 因 表 达 重 组 载 体

34 DNA 连 接 酶 能 把 不 同 的 DNA 片 段 连 接 成 一 个 整 体

35 E coli DNA 连 接 酶 与 T4 DNA 连 接 酶 比 较 类 型 E coli DNA 连 接 酶 T 4 DNA 连 接 酶 来 源 大 肠 杆 菌 T 4 噬 菌 体 相 同 点 功 能 差 别 恢 复 只 能 连 接 黏 性 末 端 磷 酸 二 酯 键 能 连 接 黏 性 末 端 和 平 末 端 ( 效 率 较 低 )

36 DNA 连 接 酶 与 DNA 聚 合 酶 的 比 较 DNA 聚 合 酶 DNA 连 接 酶 区 别 1 区 别 2 相 同 点 1) 只 能 将 单 个 核 苷 酸 连 1) 在 两 个 DNA 片 段 之 接 到 已 有 的 核 酸 片 段 上, 间 形 成 磷 酸 二 酯 键 形 成 磷 酸 二 酯 键 2) 以 一 条 DNA 链 为 模 板, 2) 将 DNA 双 链 上 的 两 将 单 个 核 苷 酸 通 过 磷 酸 个 缺 口 同 时 连 接 起 来, 二 酯 键 连 接 成 一 条 互 补 不 需 要 模 板 的 DNA 链 形 成 磷 酸 二 酯 键

37 仅 仅 能 在 体 外 利 用 限 制 性 核 酸 内 切 酶 和 DNA 连 接 酶 进 行 DNA 的 切 割 和 重 组, 还 不 能 满 足 基 因 工 程 的 要 求, 只 有 将 它 们 连 接 到 具 备 自 主 复 制 能 力 的 DNA 分 子 上, 才 能 在 寄 主 细 胞 中 进 行 繁 殖

38 ( 三 ) 基 因 进 入 受 体 细 胞 的 载 体 --- 分 子 运 输 车 具 备 自 主 复 制 能 力 的 DNA 分 子 就 是 分 子 克 隆 的 载 体 (vector) 载 体 的 作 用 1) 作 为 运 载 工 具, 将 目 的 基 因 导 入 受 体 细 胞 中 2) 在 受 体 细 胞 内 对 目 的 基 因 进 行 大 量 复 制 载 体 的 种 类 1 细 菌 的 质 粒 2 病 毒 :λ 噬 菌 体 衍 生 物 动 植 物 病 毒 等

39 表 达 载 体 需 具 备 的 几 个 条 件 (1) 有 一 至 多 个 不 同 的 限 制 酶 切 点 (MCS); (2) 对 受 体 细 胞 无 害 ; (3) 能 在 宿 主 细 胞 内 复 制 并 稳 定 地 保 存 ; (4) 具 有 某 个 筛 选 标 记, 便 于 利 用 含 抗 生 素 的 培 养 基 进 行 鉴 别 和 筛 选 ; (5) 含 有 一 个 复 制 起 始 点 ; (6) 载 体 DNA 分 子 应 大 小 适 中, 以 便 于 提 取 和 操 作

40 1 psc101 质 粒 载 体 ( 第 一 代 载 体 ) 长 9.09kb, 带 有 四 环 素 抗 性 基 因 (tet r ) 及 EcoRI HindIII BamHI SalI XhoI PvuII 以 及 SmaI 等 7 种 限 制 性 核 酸 内 切 酶 的 单 酶 切 位 点, 在 HindIII BamHI 和 SalI 等 3 个 位 点 插 入 外 源 基 因, 会 导 致 tet r 失 活 缺 点 : 它 是 一 种 严 紧 型 复 制 控 制 的 低 拷 贝 质 粒, 平 均 每 个 寄 主 细 胞 仅 有 1~2 个 拷 贝, 从 带 有 该 质 粒 的 寄 主 细 胞 中 提 取 psc101 DNA, 产 量 很 低

41 2 ColE1 质 粒 载 体 松 弛 型 复 制 控 制 的 多 拷 贝 质 粒 SmaI SacII ORF 1 EcoRI ColE kb AflII ori NruI ApaLI 一 般 情 况 下, 当 培 养 基 中 氨 基 酸 被 耗 尽, 或 是 在 细 胞 培 养 物 中 加 入 氯 霉 素 以 抑 制 蛋 白 质 的 合 成, 寄 主 染 色 体 DNA 的 复 制 便 被 抑 制, 细 胞 的 生 长 也 随 之 停 止 BelI ORF2 ClaI MscI 松 弛 型 质 粒 DNA 却 继 续 复 制 数 小 时, 使 每 个 寄 主 细 胞 中 ColE1 质 粒 的 拷 贝 数 达 到 1000~3000 个, 占 细 胞 总 DNA 的 50% 左 右

42 ColE1 质 粒 DNA 复 制 起 始 部 位 调 控 因 子 之 间 关 系 前 体 RNA(RNAII) 的 转 录 起 始 于 复 制 起 点 上 游, 需 经 RNaseH 加 工 后 产 生 有 555 个 核 苷 酸 的 引 物, 起 始 DNA 合 成 RNA 1 在 RNA 2 的 5 末 端, 转 录 方 向 相 反, 因 此 能 通 过 氢 键 配 对 与 后 者 相 互 作 用, 阻 止 RNaseH 加 工 RNA 2, 使 其 不 能 转 化 为 有 活 性 的 引 物, 阻 碍 复 制 起 始 没 有 Rop 蛋 白,RNA 1 基 因 就 不 能 起 始 转 录

43 3 pbr322 质 粒 载 体 由 三 个 不 同 来 源 的 部 分 组 成 的 : 第 一 部 分 氨 苄 青 霉 素 抗 性 基 因 (Amp R ); 第 二 部 分 四 环 素 抗 性 基 因 (tet r ); amp r 第 三 部 分 DNA 复 制 起 点 (ori) 优 点 : 具 有 较 小 的 分 子 量 (4363 bp) 能 携 带 6-8 kb 的 外 源 DNA 片 段, 操 作 较 为 便 利 有 两 种 抗 生 素 抗 性 基 因 作 为 转 化 子 的 选 择 标 记 有 较 高 的 拷 贝 数, 经 过 氯 霉 素 扩 增, 每 个 细 胞 可 累 积 1000~3000 个 拷 贝, 便 于 制 备 重 组 体 DNA

44 4 puc 质 粒 载 体 包 括 四 个 部 分 : 来 自 pbr322 质 粒 的 复 制 起 点 (ori) 氨 苄 青 霉 素 抗 性 基 因 (amp r ) 大 肠 杆 菌 β- 半 乳 糖 酶 基 因 (lacz) 启 动 子 及 编 码 α- 肽 链 的 DNA 序 列 特 称 为 lacz 基 因 位 于 lacz 基 因 5 - 端 的 一 段 多 克 隆 位 点 ( MCS ), 外 源 基 因 插 入 破 坏 lacz 基 因 功 能

45 LacZ 编 码 β- 半 乳 糖 苷 酶 氨 基 端 146 个 氨 基 酸 的 α- 肽, IPTG(( 异 丙 基 - β-d- 硫 代 半 乳 糖 苷 ) 诱 导 该 基 因 表 达, 所 合 成 的 β- 半 乳 糖 苷 酶 α- 肽 与 宿 主 细 胞 编 码 的 缺 陷 型 β- 半 乳 糖 苷 酶 互 补, 产 生 有 活 性 的 β- 半 乳 糖 苷 酶, 水 解 培 养 基 中 的 X-gal(5- 溴 -4- 氯 -3- 吲 哚 -β-d- 半 乳 糖 苷 ), 生 成 蓝 色 的 溴 氯 吲 哚 结 果 : 含 X-gal 培 养 基 中 非 转 化 菌 落 呈 蓝 色, 含 有 重 组 DNA 分 子 的 菌 落 为 白 色

46 优 点 : 更 小 的 分 子 量 和 更 高 的 拷 贝 数 在 pbr322 基 础 上 构 建 puc 质 粒 载 体 时, 仅 保 留 了 其 中 的 氨 苄 青 霉 素 抗 性 基 因 及 复 制 起 点, 其 分 子 小 了 许 多 由 于 缺 失 rop 基 因,pUC 质 粒 不 经 氯 霉 素 扩 增 时, 平 均 每 个 细 胞 即 可 达 500~700 个 拷 贝 可 用 X-gal 显 色 法 实 现 对 重 组 体 转 化 子 的 鉴 定 puc 质 粒 结 构 中 具 有 来 自 大 肠 杆 菌 lac 操 纵 子 的 lacz 基 因, 所 编 码 的 α- 肽 链 可 参 与 α- 互 补 作 用 具 有 多 克 隆 位 点 MCS 区 段, 可 以 把 具 两 种 不 同 粘 性 末 端 ( 如 EcoRI 和 BamHI) 的 外 源 DNA 片 段 直 接 克 隆 到 质 粒 载 体 上

47 5 pet 系 列 质 粒 pet 系 统 是 有 史 以 来 在 E.coli 中 克 隆 表 达 重 组 蛋 白 的 功 能 最 强 大 的 系 统 目 的 基 因 被 克 隆 到 pet 质 粒 载 体 上, 受 噬 菌 体 T7 强 转 录 及 翻 译 信 号 控 制, 表 达 由 宿 主 细 胞 提 供 的 T7RNA 聚 合 酶 诱 导 T7 RNA 聚 合 酶 机 制 十 分 有 效 并 具 选 择 性 : 充 分 诱 导 时, 几 乎 所 有 的 细 胞 资 源 都 用 于 表 达 目 的 蛋 白

48 pet 系 列 表 达 载 体

49 pet 载 体 的 抗 生 素 抗 性 pet 载 体 常 用 的 两 种 筛 选 标 记 是 Amp r+ 和 Kna r+ 因 为 内 酰 胺 酶 的 消 化 和 PH 的 降 低,AmpA r+ 的 选 择 性 易 于 丢 失 某 种 情 况 下 使 用 Kna r+ 更 为 有 利 Amp r+ 和 Kna r+ 的 另 一 个 不 同 是 两 种 基 因 的 转 录 方 向 不 同 Amp r+ 位 于 T7 启 动 子 下 游, 与 其 方 向 相 同 除 了 pet5 系 列,T7 转 录 终 止 序 列 位 于 内 酰 胺 酶 基 因 前 面, 但 是 这 个 终 止 序 列 只 有 70% 的 有 效 性 因 此,T7 聚 合 酶 能 够 通 读, 导 致 内 酰 胺 酶 的 积 累 相 反 Kna r+ 的 转 录 方 向 与 T7 启 动 子 方 向 相 反, 诱 导 时 并 没 有 Kna r+ 基 因 的 增 加

50 6 常 用 真 核 表 达 载 体 增 强 型 绿 色 荧 光 蛋 白 表 达 载 体 可 确 定 外 源 基 因 在 细 胞 内 的 表 达 和 / 或 组 织 中 的 定 位 主 要 由 CMVp 启 动 子 氨 苄 抗 性 基 因 和 抗 neo 基 因 以 及 puc 骨 架 构 成, 在 大 多 数 真 核 细 胞 内 都 能 高 水 平 稳 定 地 表 达 外 源 目 的 基 因

51 7 穿 梭 质 粒 载 体 (shuttle plasmid vector) 由 人 工 构 建 的 具 有 原 核 和 真 核 两 种 不 同 复 制 起 点 和 选 择 标 记, 可 在 不 同 的 寄 主 细 胞 内 存 活 和 复 制 的 质 粒 载 体 这 类 质 粒 载 体 可 保 证 外 源 DNA 序 列 在 不 同 物 种 ( 原 核 和 真 核 ) 的 细 胞 内 得 到 扩 增, 用 途 广 泛 如 用 于 枯 草 的 pbe2 酵 母 的 ppic9k 哺 乳 动 物 表 达 载 体 pmt2 和 用 于 植 物 细 胞 的 Ti 质 粒

52 细 菌 转 化 与 目 标 DNA 分 子 的 增 殖 获 得 了 用 外 源 DNA 片 段 和 载 体 分 子 重 组 而 成 的 杂 种 DNA 分 子 后, 还 必 须 通 过 一 个 被 称 为 细 菌 转 化 的 过 程 将 其 重 新 导 入 到 寄 主 细 胞 中, 才 能 保 证 重 组 DNA 分 子 的 增 殖 外 源 DNA 能 在 宿 主 细 胞 中 通 过 自 身 载 体 上 的 复 制 起 始 位 点 进 行 复 制 增 殖, 从 而 在 宿 主 细 胞 中 长 期 保 存, 并 以 完 整 的 形 式 从 细 胞 中 被 分 离 纯 化 出 来

53 重 组 DNA 操 作 过 程 细 菌 转 化 (transformation), 是 指 一 种 细 菌 菌 株 由 于 捕 获 了 来 自 供 体 菌 株 的 DNA 而 导 致 性 状 特 征 发 生 遗 传 改 变 的 过 程

54 细 菌 转 化 原 理 细 菌 处 于 容 易 吸 收 外 源 DNA 的 状 态 叫 感 受 态 为 提 高 效 率, 可 对 受 体 菌 进 行 物 理 或 化 学 处 理, 增 加 其 获 取 DNA 的 能 力 经 过 这 种 处 理 的 细 胞 被 称 作 感 受 态 细 胞 (competentt t cells) ) 目 前 应 用 较 广 的 转 化 方 法 有 两 种 : (1)CaCl 2 转 化 法 ( 化 学 转 化 法 ) (2) 电 转 化 法 ( 电 击 法 )

55 CaCl 2 法 2 将 快 速 生 长 期 大 肠 杆 菌 置 于 经 0 预 处 理 的 低 渗 CaCl 2 溶 液 中, 细 胞 膨 胀, 膜 通 透 性 改 变, 易 与 外 源 DNA 相 粘 附 将 该 体 系 转 移 到 42 下 做 短 暂 的 热 刺 激, 外 源 DNA 就 可 能 被 细 胞 吸 收 将 经 过 转 化 后 的 细 胞 置 于 选 择 性 培 养 基 上, 筛 选 阳 性 克 隆 转 化 效 率 可 达 到 ~ 个 转 化 子 /µg 超 螺 旋 质 粒 DNA

56 细 菌 转 化 及 蓝 白 斑 筛 选

57 电 击 法 电 脉 冲 可 以 在 细 胞 膜 上 造 成 小 凹 陷, 形 成 疏 水 孔 洞 随 着 跨 膜 电 压 增 加, 大 疏 水 性 孔 洞 会 转 变 为 亲 水 性 孔 洞, 介 质 中 的 DNA 进 入 细 胞 质 将 生 长 至 对 数 中 期 的 E. coli 菌 液 冷 却 至 4 后 离 心, 洗 菌 后 用 10% 的 甘 油 悬 浮, 将 高 密 度 菌 液 (~ /ml) 置 于 特 制 的 电 极 杯 中 进 行 电 击

58 获 得 最 大 转 化 效 率 时 场 强 一 般 为 12.5~15kV/cm, 5, 时 间 跨 度 一 般 为 4.5~5.5 毫 秒 电 击 转 化 与 温 度 有 关, 一 般 在 0~4 进 行 由 于 转 化 载 体 上 常 带 有 LacZ 基 因, 多 用 带 有 不 同 抗 生 素 的 选 择 性 培 养 基 结 合 α- 互 补 蓝 白 斑 筛 选 法 鉴 定 转 化 细 胞 缺 点 : 过 程 太 长, 因 而 不 是 大 规 模 研 究 的 最 好 方 法, 而 且 如 果 目 的 基 因 沉 默 引 起 胚 胎 和 发 育 早 期 过 程 中 死 亡, 这 种 方 法 将 不 会 凑 效

59 哺 乳 动 物 细 胞 表 达 系 统 由 哺 乳 动 物 细 胞 翻 译 后 再 加 工 修 饰 产 生 的 外 源 蛋 白 质, 在 活 性 方 面 远 胜 于 原 核 表 达 系 统 及 酵 母 昆 虫 细 胞 等 真 核 表 达 系 统, 更 接 近 于 天 然 蛋 白 质 哺 乳 动 物 细 胞 表 达 载 体 包 含 原 核 序 列 启 动 子 增 强 子 选 择 标 记 基 因 终 止 子 和 多 聚 核 苷 酸 信 号 等 转 染 (transfection) 指 真 核 细 胞 由 于 外 源 DNA 掺 入 而 获 得 新 的 遗 传 标 志 的 过 程

60 转 染 技 术 方 法 瞬 时 转 染 : 外 源 DNA/RNA 不 整 合 到 宿 主 染 色 体 中, 因 此 一 个 宿 主 细 胞 中 可 存 在 多 个 拷 贝 数, 产 生 高 水 平 的 表 达, 但 通 常 只 持 续 几 天, 多 用 于 启 动 子 和 其 它 调 控 元 件 的 分 析 超 螺 旋 质 粒 DNA 转 染 效 率 较 高, 在 转 染 后 小 时 内 分 析 结 果 稳 定 转 染 ( 永 久 转 染 ): 外 源 DNA 既 可 以 整 合 到 宿 主 染 色 体 中, 也 可 能 作 为 一 种 游 离 体 (episome) 存 在 尽 管 线 性 DNA 比 超 螺 旋 DNA 转 入 量 低 但 整 合 率 高 外 源 DNA 整 合 到 染 色 体 中 概 率 很 小, 大 约 1/10 4 转 染 细 胞 能 整 合, 需 要 通 过 一 些 选 择 性 标 记, 如 来 氨 丙 基 转 移 酶 (APH; 新 霉 素 抗 性 基 因 ), 潮 霉 素 B 磷 酸 转 移 酶 (HPH), 胸 苷 激 酶 (TK) 等 反 复 筛 选, 得 到 稳 定 转 染 的 同 源 细 胞 系 转 染 技 术 的 选 择 对 转 染 结 果 影 响 也 很 大, 许 多 转 染 方 法 需 要 优 化 DNA 与 转 染 试 剂 比 例, 细 胞 数 量, 培 养 及 检 测 时 间 等

61 将 外 源 基 因 导 入 哺 乳 动 物 细 胞 主 要 方 法 1. 感 染 性 病 毒 颗 粒 感 染 宿 主 细 胞 ; 2. 通 过 脂 质 体 法 显 微 注 射 法 磷 酸 钙 共 沉 淀 法 及 DEAE 一 葡 聚 糖 法 等 非 病 毒 载 体 的 方 式 将 基 因 导 入 到 细 胞 中 * 其 中, 病 毒 载 体 已 成 为 动 物 体 内 表 达 外 源 基 因 的 有 力 工 具, 在 临 床 基 因 治 疗 的 探 索 中 也 发 挥 了 重 要 作 用 * 逆 转 录 病 毒 感 染 效 率 高, 某 些 难 转 染 的 细 胞 系 也 可 通 过 其 导 入 外 源 基 因, 但 要 注 意 的 是 逆 转 录 病 毒 可 整 合 入 宿 主 细 胞 染 色 体, 具 有 潜 在 的 危 险 性

62 DEAE- 葡 聚 糖 法 DEAE- 葡 聚 糖 是 最 早 应 用 哺 乳 动 物 细 胞 转 染 试 剂 之 一 ; DEAE- 葡 聚 糖 是 阳 离 子 多 聚 物, 它 与 带 负 电 的 核 酸 结 合 后 接 近 细 胞 膜 而 被 摄 取 ; 用 DEAE- 葡 聚 糖 转 染 成 功 地 应 用 于 瞬 时 表 达 的 研 究, 但 用 于 稳 定 转 染 却 不 是 十 分 可 靠

63 磷 酸 钙 法 磷 酸 钙 共 沉 淀 法 是 由 Graham 等 人 于 1973 年 首 先 建 立 的, 因 为 试 剂 易 取 得, 价 格 便 宜 而 被 广 泛 用 于 瞬 时 转 染 和 稳 定 转 染 的 研 究 ; 先 将 DNA 和 氯 化 钙 混 合, 然 后 加 入 到 PBS 中 慢 慢 形 成 DNA 磷 酸 钙 沉 淀, 最 后 把 含 有 沉 淀 的 混 悬 液 加 到 培 养 的 细 胞 上, 通 过 细 胞 胞 膜 的 内 吞 作 用 摄 入 DNA 转 染 效 率 取 决 于 沉 积 反 应 和 形 成 颗 粒 的 大 小, 对 于 不 同 类 型 的 细 胞 其 转 染 效 率 有 所 不 同, 目 前 仅 用 于 体 外 培 养 细 胞 的 基 因 转 移 磷 酸 钙 似 乎 还 通 过 抑 制 血 清 中 和 细 胞 内 的 核 酸 酶 活 性 磷 酸 钙 似 乎 还 通 过 抑 制 血 清 中 和 细 胞 内 的 核 酸 酶 活 性 而 保 护 外 源 DNA 免 受 降 解

64 人 工 脂 质 体 法 人 工 脂 质 体 法 采 用 阳 离 子 脂 质 体, 具 有 较 高 的 转 染 效 率, 不 但 可 以 转 染 其 他 化 学 方 法 不 易 转 染 的 细 胞 系, 而 且 还 能 转 染 从 寡 核 苷 酸 到 人 工 酵 母 染 色 体 不 同 长 度 的 DNA, 以 及 RNA 和 蛋 白 质 LipoFiter TM 脂 质 体 转 染 试 剂 是 一 种 适 合 于 把 质 粒 或 其 它 形 式 的 核 酸, 以 及 核 酸 蛋 白 复 合 物 转 染 到 真 核 细 胞 中 的 高 效 阳 离 子 脂 质 体 转 染 试 剂 它 可 以 和 带 负 电 荷 的 核 酸 结 合 后 形 成 复 合 物, 当 复 合 物 接 近 细 胞 膜 时 被 内 吞 成 为 内 体 进 入 细 胞 质, 随 后 DNA 复 合 物 被 释 放 进 入 细 胞 核 内 同 时 适 用 于 瞬 时 表 达 和 稳 定 表 达, 可 以 介 导 DNA 和 RNA 转 入 动 物 和 人 的 体 内 用 于 基 因 治 疗

65 1 显 微 注 射 : 物 理 转 染 方 法 显 微 注 射 虽 然 费 力, 但 是 非 常 有 效 的 将 核 酸 导 入 细 胞 或 细 胞 核 的 方 法 这 种 方 法 常 用 来 制 备 转 基 因 动 物, 但 却 不 适 用 于 需 要 大 量 转 染 细 胞 的 研 究 2 电 穿 孔 : 电 穿 孔 法 常 用 来 转 染 如 植 物 原 生 质 体 这 样 的 常 规 方 法 不 容 易 转 染 的 细 胞 电 穿 孔 靠 脉 冲 电 流 在 细 胞 膜 上 打 孔 而 将 核 酸 导 入 细 胞 内 导 入 的 效 率 与 脉 冲 的 强 度 和 持 续 时 间 有 关 系 已 经 应 用 于 活 体 基 因 转 移 3 基 因 枪 ( 微 粒 子 轰 击 法 ): 基 因 枪 依 靠 携 带 了 核 酸 的 高 速 粒 子 而 将 核 酸 导 入 细 胞 内, 这 种 方 法 具 有 操 作 简 捷 安 全 有 效 不 损 伤 靶 细 胞 原 有 的 结 构 等 优 点 适 用 于 培 养 的 细 胞 核 在 体 的 细 胞

66 应 用 例 举 1978 年, 胰 岛 素 基 因 在 E.coli 中 表 达 组 成 :51 肽 功 能 : 抑 制 高 血 糖, 治 疗 糖 尿 病 效 益 : 全 世 界 糖 尿 病 患 者 6000 万, 美 国 200 万 8000 吨 胰 脏 1 Kg 胰 岛 素 1000 名 患 者 使 用 一 年, 每 名 患 者 每 年 需 用 8 吨 胰 脏 提 取 的 胰 岛 素 用 基 因 工 程 法 :2 吨 发 酵 液 650 吨 动 物 胰 脏 : 每 名 患 者 每 年 需 用 25 升 发 酵 液 66

67 1979 年, 人 生 长 素 基 因 在 E.coli 中 表 达 组 成 :191 肽 ( 脑 垂 体 分 泌 ) 功 能 : 治 疗 侏 儒 症 效 益 :50 个 人 脑 垂 体 1 名 患 者 用 一 年 基 因 工 程 法 :1 升 发 酵 液 卽 可 达 到 这 样 的 目 的 67

68 1980 年, 人 干 扰 素 基 因 在 E.coli 中 表 达 组 成 : α β 干 扰 素 由 166 个 氨 基 酸 组 成,γ 干 扰 素 由 146 个 氨 基 酸 组 成 功 能 : 调 节 免 疫 功 能, 抗 病 毒, 抗 肿 瘤 效 益 :1 升 发 酵 液 600 μg 干 扰 素 =1000 升 血 细 胞 提 取 物 基 因 工 程 以 前 :1 mg 干 扰 素 价 值 超 过 1 万 美 元 ; 基 因 工 程 以 后 :1 mg 干 扰 素 价 值 只 有 几 美 分 68

69 基 因 治 疗 遗 传 性 疾 病 的 基 因 治 疗 1990 年, 美 国 国 立 卫 生 院 的 科 学 家 用 反 转 录 病 毒 作 为 载 体, 把 腺 苷 脱 氨 酶 (adenosine deaminase,ada) 基 因 转 染 至 一 名 患 ADA 缺 陷 症 女 孩 的 淋 巴 细 胞, 使 这 个 患 者 先 天 缺 损 的 免 疫 系 统 趋 于 正 常 恶 性 肿 瘤 的 治 疗 用 反 转 录 病 毒 将 毒 素 基 因 导 入 癌 细 胞 中, 在 靶 细 胞 中 表 达 毒 素 并 发 挥 杀 伤 作 用, 但 对 其 他 细 胞 的 毒 性 较 低 传 染 病 的 基 因 治 疗 美 国 科 学 家 用 反 转 录 病 毒 将 编 码 CD4 分 子 的 基 因 导 入 上 皮 细 胞 及 小 鼠 的 成 纤 维 细 胞 并 使 之 表 达, 目 的 是 抑 制 艾 滋 病 病 毒 HIV 的 繁 殖 还 有 将 编 码 艾 滋 病 病 毒 RNA 降 解 的 核 酸 酶 基 因 转 染 淋 巴 细 胞, 可 以 抑 制 HIV 病 毒 的 传 播 利 用 类 似 的 方 法 还 可 以 治 疗 人 乳 头 瘤 病 毒 巨 细 胞 病 毒 及 肝 炎 病 毒 的 感 染

70 转 基 因 植 物 品 质 抗 虫 害 抗 逆 性 遗 传 改 良 用 马 铃 薯 生 产 人 糖 尿 病 疫 苗 用 烟 草 生 产 人 的 红 血 球 蛋 白 用 烟 草 生 产 人 的 溶 酶 素 用 烟 草 生 产 人 的 抗 癌 疫 苗 用 苜 蓿 生 产 人 的 免 疫 球 蛋 白 用 玉 米 生 产 人 的 牙 齿 保 健 抗 体 蛋 白 等 70

71 DNA 操 作 技 术 ( 一 ) 核 酸 的 凝 胶 电 泳 自 从 琼 脂 糖 ( agarose ) 和 聚 丙 烯 酰 胺 (polyacrylamide) 凝 胶 被 引 入 核 酸 研 究 以 来, 按 分 子 量 大 小 分 离 DNA 的 凝 胶 电 泳 技 术, 已 经 发 展 成 为 一 种 分 析 鉴 定 重 组 DNA 分 子 及 蛋 白 质 与 核 酸 相 互 作 用 的 重 要 实 验 手 段

72 凝 胶 电 泳 的 原 理 带 有 负 电 荷 的 核 苷 酸 链 (DNA 或 RNA), 依 靠 无 反 应 活 性 的 稳 定 的 介 质 和 缓 冲 液, 在 电 场 中 以 一 定 的 迁 移 率 从 负 极 移 向 正 极 电 泳 分 子 在 电 场 作 用 下 的 迁 移 速 度, 叫 做 电 泳 的 迁 移 率, 它 与 电 场 强 度 和 电 泳 分 子 本 身 所 携 带 的 净 电 荷 数 成 正 比, 与 片 段 大 小 成 反 比

73 电 泳 的 迁 移 率 取 决 于 核 酸 分 子 本 身 的 大 小 和 构 型 分 子 量 较 小 的 DNA 分 子, 比 分 子 量 较 大 的 DNA 分 子 迁 移 率 要 快 ; 同 等 分 子 量 的 不 同 构 型 的 核 酸 分 子, 构 型 紧 密 的 比 松 散 型 的 开 环 DNA 分 子 或 线 性 DNA 分 子 迁 移 率 要 快

74 两 种 主 要 凝 胶 基 质 1. 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 的 分 辨 力 高, 但 能 够 区 分 DNA 的 大 小 范 围 窄 其 分 辨 范 围 为 1 到 1000 个 碱 基 对 之 间 2. 琼 脂 糖 凝 胶 分 辨 力 不 如 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶, 但 能 够 区 分 几 十 至 几 百 Kb 大 小 的 DNA 片 段 凝 胶 浓 度 的 高 低 影 响 凝 胶 介 质 孔 隙 的 大 小, 浓 度 越 高, 孔 隙 越 小, 其 分 辨 能 力 就 越 强

75 琼 脂 糖 及 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 分 辨 DNA 片 段 的 能 力 凝 胶 类 型 及 浓 度 分 离 DNA 的 大 小 范 围 (bp) 0.3% 琼 脂 糖 ~ % 琼 脂 糖 ~ % 琼 脂 糖 6 000~ % 聚 丙 烯 酰 胺 1 000~ % 聚 丙 烯 酰 胺 500~ % 聚 丙 烯 酰 胺 50~1

76 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 参 数 缓 冲 液 :1 TAE(TBE TPE) 凝 胶 的 含 量 : 根 据 检 测 的 DNA 大 小 加 DNA 样 品 :<1μg,loading l buffer( 指 示 剂 ) 电 泳 条 件 : 大 片 断 低 电 压 长 时 间 ; 小 片 段 高 电 压 短 时 间 染 色 和 观 察 : 溴 化 乙 锭 (EB) 染 色, 在 300nm 波 长 的 紫 外 下 观 察 ( 凝 胶 成 像 仪 ) 可 看 到 0.05 μg 的 微 量 DNA;DNA 的 片 断 大 小 与 荧 光 强 度 成 正 比

77 溴 化 乙 锭 染 料 的 化 学 结 构 及 其 对 DNA 分 子 的 插 入 作 用 由 于 插 入 了 溴 化 乙 锭 分 子, 在 紫 外 光 照 射 下, 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 中 DNA 的 条 带 便 呈 现 出 橘 黄 色 荧 光, 易 于 鉴 定 嵌 入 DNA 堆 积 碱 基 之 间 的 一 个 三 环 平 面 基 团 溴 化 乙 锭 (ethidium bromide,eb) 是 高 灵 敏 的 荧 光 染 料 诱 变 能 力 大 大 降 低 SYBR Green I 是 高 灵 敏 的 DNA 荧 光 染 料, 诱 变 能 力 大 大 降 低, 适 用 于 各 种 电 泳 分 析 操 作 简 单 : 无 须 脱 色 或 冲 洗.

78 溴 化 乙 锭 的 净 化 处 理 由 于 溴 化 乙 锭 具 有 一 定 的 毒 性, 实 验 结 束 后, 应 对 含 EB 的 溶 液 进 行 净 化 处 理 再 行 弃 置, 以 避 免 污 染 环 境 和 危 害 人 体 健 康 (1) 对 于 EB 含 量 大 于 0.5 mg/ml 的 溶 液, 可 如 下 处 理 : 1 将 EB 溶 液 用 水 稀 释 至 浓 度 低 于 0.5 mg/ml; 2 加 入 一 倍 体 积 的 0.5 mol/l KMnO4, 混 匀, 再 加 入 等 量 的 25 mol/l HCl, 混 匀, 置 室 温 数 小 时 ; 3 加 入 一 倍 体 积 的 2.5 mol/l NaOH, 混 匀 并 废 弃 (2) EB 含 量 小 于 0.5 mg/ml 的 溶 液 可 如 下 处 理 : 1 按 1 mg/ml 的 量 加 入 活 性 炭, 不 时 轻 摇 混 匀, 室 温 放 置 1 小 时 ; 2 用 滤 纸 过 滤 并 将 活 性 碳 与 滤 纸 密 封 后 丢 弃

79 RNA 的 分 离 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 (RNA 变 性 凝 胶 电 泳 ) RNA 由 单 链 核 苷 酸 组 成, 其 局 部 可 形 成 双 链 的 二 级 结 构 或 三 级 结 构 因 此 欲 测 定 RNA 较 准 确 的 分 子 大 小, 必 须 在 变 性 条 件 下 进 行 电 泳 其 他 同 DNA 电 泳 上 样 前 使 用 的 变 性 剂 处 理, 如 甲 醛 乙 二 醛 羟 甲 基 汞, 它 们 能 和 RNA 分 子 反 应 而 防 止 碱 基 对 的 形 成 染 色 最 好 能 够 用 30 μg/ml 吖 啶 橙 浸 胶

80 脉 冲 电 场 凝 胶 电 泳 (PFGE pulse-field gel electrophoresis) 1984 年, D.Schwartz & C.Centor Centor 发 明, DNA 分 子 的 螺 旋 半 径 超 过 凝 胶 分 子 孔 径 能 够 分 离 超 大 分 子 量 的 DNA 分 子 (10 7 bp) 在 脉 冲 电 泳 中, 电 场 方 向 是 周 期 变 化 的, 头 一 个 脉 冲 电 场 方 向 与 核 酸 的 移 动 方 向 成 45 角, 下 一 个 脉 冲 的 电 场 方 向 与 核 酸 移 动 方 向 在 另 一 侧 成 45 角, 由 于 加 在 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 上 的 电 场 方 向 电 流 大 小 以 及 作 用 时 间 都 在 交 替 地 变 换 着, 这 就 使 得 DNA 分 子 必 须 随 时 调 整 其 泳 动 的 方 向, 来 适 应 凝 胶 孔 隙 的 无 规 则 变 化

81 ( 二 ) 聚 合 酶 链 式 反 应 (PCR) 聚 合 酶 技 链 术 式 反 应 是 快 速 扩 增 DNA 序 列 最 常 用 的 方 法 PCR 反 应 的 模 板 DNA 若 是 基 因 组 上 的 某 个 片 段, 就 称 为 genomic PCR, 若 是 mrna 反 转 录 产 生 的 cdna, 就 称 为 RT-PCR

82 PCR 指 数 扩 增 时 循 环 次 数 与 DNA 产 物 数 量 的 比 较

83 Khorana(1971) 等 提 出 在 体 外 经 DNA 变 性, 与 适 当 引 物 杂 交, 再 用 DNA 聚 合 酶 延 伸, 克 隆 DNA 的 设 想 1983 年,Mullis 发 明 了 PCR 技 术, 使 Khorana 的 设 想 得 到 实 现 1988 年 Saiki 等 将 耐 热 DNA 聚 合 酶 (Taq) 引 入 了 PCR 技 术 1989 年 美 国 Science 杂 志 列 PCR 为 十 余 项 重 大 科 学 发 明 之 首, 比 喻 1989 年 为 PCR 爆 炸 年,Mullis 荣 获 1993 年 度 诺 贝 尔 化 学 奖

84 1989 年 12 月, 著 名 的 自 然 科 学 杂 志 SCIENCE 将 PCR 和 它 所 使 用 的 聚 合 酶 命 名 为 第 一 个 年 度 分 子 主 编 Daniel Koshland Jr. 写 道 : 第 一 篇 有 关 PCR 的 论 文 发 表 于 1985 年 自 那 以 后,PCR 已 经 发 展 成 为 日 益 强 大 的 和 有 广 泛 用 途 的 技 术 有 了 PCR, 极 少 量 遗 传 物 质 也 能 扩 增 产 生 大 量 一 般 实 验 室 都 能 得 到 的 可 用 于 生 化 分 析 和 鉴 定 的 材 料

85 SCIENCE 确 实 在 1985 年 发 表 了 第 一 篇 关 于 PCR 的 论 文 但 是, 却 拒 绝 了 由 穆 利 斯 撰 写 的 描 述 PCR 技 术 的 论 文 编 辑 部 给 他 回 了 一 封 标 准 的 拒 稿 信 : 这 篇 文 章 虽 然 通 过 了 评 审 委 员 会 的 初 选, 但 不 幸 的 是, 专 家 们 对 本 文 的 评 审 结 论 并 没 有 像 对 同 时 期 拟 录 用 的 稿 件 那 样 积 极 所 以, 尊 稿 无 力 竞 争 本 刊 有 限 的 版 面

86 凯 利 穆 利 斯 (Kary y Mullis),1944 年 出 生, 1962 年 在 佐 治 亚 理 工 学 院 化 学 工 程 专 业 毕 业. 受 同 学 们 的 蛊 惑,1966 年 报 考 加 州 伯 克 利 大 学 生 化 专 业 研 究 生 被 录 取 1968 年 一 个 人 在 NATURE 发 表 时 间 反 演 的 宇 宙 学 意 义 论 文 并 侥 幸 通 过 了 博 士 生 资 格 考 试 1972 年, 以 微 生 物 铁 转 运 因 子 的 结 构 与 有 机 合 成 获 得 博 士 学 位 Kary B. Mullis 毕 业 后, 尝 试 写 小 说, 但 因 不 能 使 一 部 分 人 物 具 有 不 幸 的 遭 遇 而 失 败, 又 因 厌 恶 天 天 宰 杀 实 验 小 鼠 而 两 次 丢 掉 工 作

87 他 有 一 条 知 名 的 可 能 引 起 不 少 同 学 共 鸣 的 学 习 曲 线 : 刚 开 始 时, 对 拓 宽 自 身 知 识 面 表 现 出 极 大 的 兴 趣 知 识 迅 速 上 升, 然 后 徘 徊 不 前, 最 终 进 入 失 望 和 不 安 阶 段 辞 职 以 后 去 一 家 小 咖 啡 馆 当 了 两 年 经 理 1979 年 加 入 西 特 斯 公 司, 负 责 DNA 合 成 正 是 费 时 费 力 的 DNA 合 成 ( 单 引 物, 以 算 术 级 数 增 长 ), 激 发 了 他 的 思 维

88 1983 年 8 月, 穆 利 斯 第 一 次 在 公 司 正 式 作 了 一 个 有 关 PCR 原 理 的 学 术 报 告 人 们 对 这 个 报 告 的 反 应 冷 谈, 只 有 少 数 几 个 实 验 技 术 人 员 有 些 兴 趣 穆 利 斯 回 忆 说, 绝 大 多 数 人 要 么 在 我 结 束 报 告 之 前 就 离 开 了 会 场, 要 么 故 意 留 下 来 给 我 出 难 题 他 们 认 为 这 些 肯 定 是 胡 说 八 道 普 遍 的 观 点 是, 虽 然 我 不 够 聪 明, 没 看 出 问 题 的 要 害, 但 肯 定 有 理 由 证 明 这 个 方 法 不 行, 要 不 为 什 么 从 前 没 人 想 到 呢?

89 PCR 技 术 的 原 理 首 先 将 双 链 DNA 分 子 在 临 近 沸 点 的 温 度 下 加 热 分 离 成 两 条 单 链 DNA 分 子,DNA 聚 合 酶 以 单 链 DNA 为 模 板 并 利 用 反 应 混 合 物 中 的 四 种 脱 氧 核 苷 三 磷 酸 合 适 的 Mg 2+ 浓 度 和 实 验 中 提 供 的 引 物 序 列 合 成 新 生 的 DNA 分 子

90 PCR 技 术 需 要 加 入 4 种 物 质 : (1) 作 为 模 板 的 DNA 序 列 ; (2) 引 物 (20 个 左 右 碱 基 的 短 DNA 单 链 ), 与 被 分 离 的 目 的 基 因 两 条 链 各 自 5 端 序 列 相 互 补 ; (3)TaqDNA 聚 合 酶 ; (4)dNTP(dATP, dttp, dgtp 和 dctp)

91 变 性 退 火 延 伸 三 步 曲 变 性 : 双 链 DNA 解 链 成 为 单 链 DNA 退 火 : 部 分 引 物 与 模 板 的 单 链 DNA 的 特 定 互 补 部 位 相 配 对 和 结 合 延 伸 : 以 目 的 基 因 为 模 板, 合 成 互 补 的 新 DNA 链 经 不 断 重 复 循 环 之 后, 反 应 混 合 物 中 所 含 有 的 双 链 DNA 分 子 数, 即 两 条 引 物 结 合 位 点 之 间 的 DNA 区 段 的 拷 贝 数, 理 论 上 的 最 高 值 应 是 2 n, 实 得 1.8 n.

92 PCR 技 术 的 特 点 1. 特 异 性 强 ( 引 物 的 序 列 及 其 与 模 板 结 合 的 特 异 性 是 决 定 PCR 反 应 结 果 的 关 键 ) 2. 敏 感 性 高 3. 快 速 简 便 4. 可 扩 增 RNA 和 cdna 5. 对 起 始 材 料 要 求 低 6. 有 一 定 程 度 单 核 苷 酸 碱 基 错 误 掺 入 引 物 引 物 引 物 设 计 的 最 大 原 则 是 最 大 限 度 地 提 高 扩 增 效 率 和 特 异 性 ; 同 时 尽 可 能 减 少 非 特 异 性 扩 增

93 PCR 技 术 的 应 用 生 物 样 品 生 物 样 品 生 物 样 品 生 物 样 品 DNA DNA 片 段 片 段 基 因 诊 基 因 诊 基 因 治 基 因 治 基 因 工 基 因 工 法 医 学 法 医 学 人 类 学 人 类 学 诊 断 诊 断 治 疗 治 疗 工 程 产 品 工 程 产 品 学 检 测 学 检 测 学 研 究 学 研 究 品 品

94 实 时 定 量 PCR (real time quantitative PCR,Q-PCR) 由 于 PCR 敏 感 性 高, 扩 增 产 物 总 量 变 异 系 数 大, 定 量 不 准 确 90 年 代 末 期 出 现 了 Q-PCR, 利 用 荧 光 检 测 PCR 仪 绘 制 DNA 扩 增 过 程 中 的 累 积 速 率 动 态 变 化 图, 基 本 消 除 在 测 定 终 端 产 物 丰 度 时 变 异 系 数 较 大 的 问 题

95 SYBR Green I 作 探 针 的 实 时 定 量 PCR 混 合 在 PCR 反 应 液 中 的 荧 光 探 针 只 有 与 大 片 段 DNA 结 合 后, 才 能 够 被 激 发 出 荧 光 随 着 新 合 成 DNA 片 段 的 增 加, 由 于 结 合 到 DNA 上 的 荧 光 探 针 增 加, 被 激 发 产 生 的 荧 光 相 应 增 加 非 序 列 特 异 性 荧 光 染 料 SYBR Green I, 激 发 光 波 长 520 nm, 只 与 双 链 DNA 结 合

96 用 实 时 定 量 PCR 法 分 析 未 知 样 品 靶 基 因 的 绝 对 量 A 扩 增 曲 线 B 标 准 曲 线 荧 光 强 度 Log 值 循 环 数 循 环 数 以 个 循 环 的 荧 光 值 作 为 阈 值 或 基 线, 也 可 以 阴 性 对 照 荧 光 值 的 最 高 点 作 为 基 线 Ct 值 是 产 物 荧 光 强 度 首 次 超 过 设 定 阈 值 时,PCR 反 应 所 需 的 循 环 数 利 用 标 准 曲 线, 可 以 确 定 样 品 中 待 检 测 靶 DNA 的 绝 对 含 量

97 实 时 定 量 PCR 对 不 同 样 品 中 目 的 cdna 含 量 的 相 对 定 量 野 生 型 拟 南 芥 (WT) 突 变 体 拟 南 芥 (Mu) 相 对 比 值 Ct(AvgCt WT -AvgCt Mu ) (1.8 Ct ) Wus Ct 值 平 均 值 (Avg) 拟 南 芥 野 生 型 和 突 变 体 样 品 经 由 拟 南 芥 持 家 基 因 (UBQ10) 进 行 均 一 化 处 理

98 为 确 保 荧 光 检 测 的 确 实 是 靶 DNA, 又 设 计 了 仅 能 与 目 的 DNA 特 异 结 合 的 荧 光 探 针 TaqMan 探 针 是 一 段 与 靶 DNA 序 列 中 间 部 位 结 合 的 单 链 DNA, 长 50bp-150bp, 该 DNA 的 5 和 3 端 带 有 短 波 长 和 长 波 长 两 个 不 同 荧 光 基 团, 由 于 彼 此 距 离 靠 近, 在 荧 光 共 振 能 量 转 移 (FRET) 作 用 下 发 生 荧 光 淬 灭, 因 而 检 测 不 到 荧 光 随 着 PCR 反 应 的 进 行,TaqMan 探 针 结 合 到 目 的 DNA 序 列 上, 并 且 会 被 具 有 外 切 酶 活 性 的 Taq DNA 聚 合 酶 逐 个 切 除 而 降 解 切 下 来 的 荧 光 基 团 解 除 了 荧 光 淬 灭 的 束 缚, 会 在 激 发 光 下 发 出 荧 光, 因 此, 产 生 的 荧 光 强 度 直 接 反 映 了 所 扩 增 靶 DNA 的 总 量

99 TaqMan 探 针 实 时 定 量 PCR 技 术

100 重 亚 硫 酸 盐 测 序 技 术 (Bisulfite Sequencing) DNA 分 子 上 可 能 发 生 多 种 化 学 修 饰, 如 甲 基 化 乙 酰 化 等 在 不 改 变 DNA 序 列 的 情 况 下, 通 过 对 DNA 分 子 的 化 学 修 饰, 可 以 改 变 基 因 表 达 水 平 相 对 于 传 统 的 遗 传 学 即 只 有 DNA 序 列 变 化 才 能 导 致 基 因 表 达 的 改 变 而 言, 这 种 现 象 被 称 为 表 观 遗 传 学 (Epigenetics) pg 重 亚 硫 酸 盐 测 序 技 术 等 方 法 被 用 来 确 定 某 个 碱 基 位 点 的 甲 基 化 情 况

101 重 亚 硫 酸 盐 测 序 技 术 主 要 实 验 过 程 将 待 测 DNA 样 品 用 限 制 性 内 切 酶 处 理 或 超 声 波 破 碎 等 物 理 方 法 打 断 成 500~1000 bp 的 碎 片, 重 亚 硫 酸 盐 处 理 使 DNA 中 未 甲 基 化 的 胞 嘧 啶 脱 氨 基 变 成 尿 嘧 啶,PCR 扩 增 后 被 测 序 仪 读 为 胸 腺 嘧 啶 已 甲 基 化 的 胞 嘧 啶 由 于 甲 基 的 保 护 而 不 受 影 响 参 考 原 始 序 列 判 定 原 C 位 点 是 否 甲 基 化 未 甲 基 化 的 C 位 点 变 为 T, 甲 基 化 的 C 位 点 仍 保 持 为 C

102 重 亚 硫 酸 盐 测 序 (bisulfite sequencing) 脱 氨 基

103 因 为 没 有 甲 基 保 护 的 C 在 重 亚 硫 酸 盐 处 理 后 转 变 为 U, 引 物 设 计 时 要 将 该 位 点 相 应 改 为 T 由 于 DNA 上 的 C 位 点 通 常 不 是 百 分 之 百 甲 基 化 或 非 甲 基 化, 所 以 合 成 引 物 时 要 用 简 并 位 点, 正 向 引 物 中 为 Y (Y=C 或 T), 反 向 引 物 中 记 做 R (R=G 或 A) 重 亚 硫 酸 盐 测 序 分 析 时, 必 须 对 同 一 目 标 片 段 进 行 多 次 测 序, 通 常 要 求 至 少 测 序 11 次, 以 避 免 产 生 同 源 测 序 (sibling sequencing) 缺 点 : 耗 费 时 间 和 金 钱

104 谢 谢!