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1 动 物 学 研 究 2008,Aug. 29(4): CN /Q ISSN Zoological Research doi: /sp.j 利 用 修 饰 的 随 机 引 物 构 建 非 洲 爪 蟾 酵 母 双 杂 交 定 向 cdna 文 库 武 景 阳 1,2, 李 朝 翠 1, 孔 清 华 1,2, 毛 炳 宇 (1. 中 国 科 学 院 昆 明 动 物 研 究 所 遗 传 资 源 与 进 化 国 家 重 点 实 验 室, 云 南 昆 明 ;2. 中 国 科 学 院 研 究 生 院, 北 京 ) 摘 要 : 描 述 了 一 种 新 的 构 建 cdna 文 库 的 方 法, 其 中 用 来 合 成 cdna 第 一 链 的 随 机 引 物 5 - 端 被 加 上 碱 基 d (AC), 在 cdna 双 链 合 成 后 所 添 加 的 连 接 头 的 末 端 含 有 碱 基 d(gtcg) 在 cdna 双 链 3 - 端, 连 接 头 连 接 上 后 会 形 成 一 个 完 整 的 SalI 酶 切 位 点 d(gtcgac), 而 在 5 - 端 几 乎 不 会 形 成 SalI 位 点 在 SalI 酶 切 后 利 用 形 成 的 3 - 粘 性 末 端 与 5 -EcoRI 粘 性 末 端 一 起 将 cdna 双 链 定 向 导 入 线 性 化 的 质 粒 载 体, 再 通 过 转 化 细 菌 获 得 cdna 文 库 利 用 此 方 法 构 建 了 一 个 不 同 发 育 时 期 非 洲 爪 蟾 胚 胎 酵 母 双 杂 交 cdna 文 库 检 测 了 文 库 中 空 载 体 的 比 例, 插 入 片 段 大 小 和 不 同 基 因 的 表 达 水 平 几 个 指 标, 都 符 合 预 期, 但 是 同 时 发 现 定 位 于 mrna 的 3 - 端 的 插 入 片 段 比 例 比 较 低 这 种 倾 向 性 符 合 文 献 报 道, 应 该 是 实 验 系 统 的 倾 向 性, 不 影 响 进 一 步 的 酵 母 双 杂 交 实 验 这 些 数 据 证 明 成 功 地 构 建 了 定 向 非 洲 爪 蟾 酵 母 双 杂 交 cdna 文 库 关 键 词 : 非 洲 爪 蟾 ; 酵 母 双 杂 交 ; 随 机 引 物 ; 定 向 cdna 文 库 中 图 分 类 号 :Q343.1;Q78;Q959.5 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 : (2008) ,* Construction and Analysis of A Directional Xenopus laevis Embryonic cdna Library for Yeast Two-hybrid Using Modified Random Primers WU Jing-yang 1,2,LI Chao-cui 1,KONG Qing-hua 1,2,MAO Bing-yu 1, * (1. State Key Laboratory of Genetic Resources and Evolution,,Kunming Institute of Zoology,the Chinese Academy of Sciences,Kunming , China; 2. Graduate University of the Chinese Academy of Sciences, Beijing , China) Abstract: Here we describe a new strategy for cdna library construction, in which the random primers directing the first strand cdna synthesis contain additional d (AC) at their 5 -ends, and the linkers which will be added to the double strand cdna contain d(gtcg) at the 5 -ends. When the linker is added to the 3 -end of the cdna, a complete SalI site d(gtcgac) will form at the 3 -end but not at the 5 -end of the cdna fragment. After SalI digestion, the 3 -cohesive and the pre-existing 5 -EcoRI cohesive ends are used to introduce the double stranded cdna into the linearized plasmid vectors. The ligation products were used to transform E.coli to produce a cdna library. Using this method, we constructed a directional Xenopus laevis embryonic cdna library for yeast two-hybrid. We checked the ratio of empty vectors, the size of inserts and existence of several genes, the results showed that cdna library construction was successful. Key words: Xenopus laevis; Yeast two-hybrid; Random primer; Directional cdna library 构 建 cdna 文 库 的 第 一 步 是 逆 转 录 mrna 成 为 它 的 cdna 拷 贝 其 中 起 催 化 作 用 的 逆 转 录 酶 需 要 一 个 短 片 段 的 DNA 或 者 RNA 作 为 引 物 来 添 加 核 苷 酸 目 前 构 建 cdna 文 库 所 用 的 引 物 有 两 种, 一 种 也 是 最 常 见 的 是 含 有 限 制 性 酶 切 位 点 的 Oligo (dt) 的 引 物, 另 外 一 种 是 6 聚 或 9 聚 脱 氧 核 糖 核 苷 酸 (dn 6 或 者 dn 9 ) 引 物 (Sambrook et al,2001) 用 含 有 限 制 性 酶 切 位 点 的 Oligo(dT) 的 引 物 所 构 建 的 cdna 文 库 是 单 方 向 的, 同 时 具 有 比 较 好 的 代 表 性, 真 实 地 反 应 了 组 织 中 mrna 的 表 达 水 平 这 种 方 法 的 缺 点 是 具 有 序 列 的 倾 向 性, 所 克 隆 的 基 因 片 段 往 往 位 于 基 因 的 3 - 端, 原 因 是 mrna 的 二 级 收 稿 日 期 : ; 接 受 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 杰 出 青 年 科 学 基 金 ( ); 国 家 自 然 科 学 基 金 重 点 项 目 ( ) * 通 讯 作 者 (Corresponding author), [email protected]

2 4 期 武 景 阳 等 : 利 用 修 饰 的 随 机 引 物 构 建 非 洲 爪 蟾 酵 母 双 杂 交 定 向 cdna 文 库 369 结 构 和 逆 转 录 酶 易 于 从 长 片 段 上 脱 离 (Kimmel et al, 1987) 如 果 基 因 含 有 长 的 3 -UTR,cDNA 往 往 不 能 包 含 基 因 的 开 放 阅 读 框 用 随 机 引 物 构 建 的 cdna 文 库 也 具 有 比 较 好 的 代 表 性, 一 定 的 条 件 下 cdna 位 于 基 因 的 5 - 端 3 - 端 或 中 间 的 可 能 性 是 差 不 多 的 (Haymerle et al, 1986) 它 的 缺 点 是 插 入 的 cdna 片 段 具 有 两 个 方 向, 尤 其 是 对 于 表 达 性 的 文 库, 约 50% 的 cdna 克 隆 含 有 反 向 插 入 片 段 所 以 是 没 有 用 的 尽 管 有 各 种 各 样 的 克 隆 全 长 cdna 的 技 术, 比 如 SMART, 但 是 对 于 酵 母 双 杂 交 cdna 文 库 来 说, 全 长 未 必 有 太 大 的 意 义 酵 母 双 杂 交 用 于 探 测 蛋 白 与 蛋 白 之 间 的 相 互 的 作 用, 这 是 以 蛋 白 的 结 构 域 (domain) 或 者 结 构 元 件 (motif) 为 基 础 的, 一 般 长 度 从 几 个 到 几 百 个 氨 基 酸 含 有 太 长 的 cdna 插 入 片 段 的 载 体 难 以 用 常 规 的 醋 酸 锂 化 学 转 化 方 法 转 化 进 入 酵 母, 或 者 所 转 录 和 翻 译 出 来 的 大 的 蛋 白 因 为 对 酵 母 有 毒 性 而 使 酵 母 不 能 生 长, 或 者 大 的 蛋 白 由 于 缺 少 高 等 真 核 细 胞 里 的 稳 定 性 修 饰 最 后 被 降 解 常 规 的 商 业 化 的 酵 母 双 杂 交 cdna 文 库 的 插 入 片 段 长 度 一 般 在 kb 之 间, 峰 值 在 1.5 kb 左 右 这 里 我 们 介 绍 一 种 以 修 饰 的 随 机 引 物 合 成 第 一 链 为 基 础 的 单 向 非 洲 爪 蟾 酵 母 双 杂 交 cdna 文 库 的 构 建 方 法, 克 服 了 经 典 的 随 机 引 物 文 库 中 插 入 片 段 方 向 上 的 随 机 性, 插 入 的 cdna 是 单 方 向 的, 使 得 有 效 克 隆 数 量 大 大 的 增 加, 并 且 能 够 很 好 的 覆 盖 基 因 的 读 码 框, 这 对 于 探 测 蛋 白 - 蛋 白 的 相 互 作 用 非 常 有 利 1 研 究 材 料 与 方 法 1.1 材 料 实 验 动 物 成 体 非 洲 爪 蟾 购 自 美 国 Nasco 公 司 爪 蟾 的 培 养 体 外 受 精 和 胚 胎 培 养 按 照 Gawantka et al (1995) 的 方 法 进 行 爪 蟾 胚 胎 发 育 的 时 期 按 照 Nieuwkoop & Faber(1967) 所 描 述 的 来 确 定 1.2 总 RNA 和 mrna 的 提 取 分 别 取 不 同 时 期 的 胚 胎, 包 括 期 期 期 38 期 和 44 期, 合 并 在 一 起 后 加 入 TRIzol 试 剂 (Invitrogen) 并 进 行 匀 浆, 按 照 产 品 说 明 书 操 作 直 到 得 到 总 RNA 并 且 溶 于 DEPC 处 理 的 纯 净 水 中 然 后 用 Oligotex mrna Mini Kit (Qiagen) 从 总 RNA 中 提 取 mrna 1.3 双 链 cdna 的 合 成 首 先 进 行 cdna 第 一 链 的 合 成, 将 修 饰 的 随 机 引 物 5 - pacnnnnnn-3 与 定 量 后 的 mrna 按 照 引 物 /mrna 质 量 比 0.25 混 合 (Morris et al,1995), 在 70 放 置 10 min 后 置 于 冰 上, 然 后 分 别 加 入 datp dgtp dttp ( Promega ) 和 dm 5 CTP (Fermentas),5 first strand buffer 0.1 mol/l DTT 和 逆 转 录 酶 SuperScriptII RT(Invitrogen), 混 合 好 后 先 在 25 放 置 10 min, 然 后 升 温 到 37 进 行 逆 转 录 反 应 40 min 第 一 链 的 合 成 结 束 后, 在 反 应 液 中 加 入 5 second strand buffer dntp E. coli DNA ligase E. coli DNA polymerase I 和 E. coli RNaseH (Invitrogen), 混 合 好 后 在 16 放 置 2 h, 然 后 加 入 T4 DNA polymerase(invitrogen) 在 16 继 续 反 应 5 min 第 二 链 的 合 成 结 束 后, 加 入 0.5 mol/l EDTA 来 终 止 反 应 产 物 用 酚 氯 仿 抽 提 后, 加 入 100% 乙 醇 3 mol/l ph5.2 NaAc 和 糖 原 进 行 沉 淀 沉 淀 然 后 溶 于 纯 净 水, 并 进 行 定 量 1.4 加 连 接 头, 限 制 性 酶 切 与 目 的 cdna 片 段 获 得 连 接 头 共 有 3 套 :A B 和 C, 分 别 比 前 一 个 在 中 间 的 序 列 上 多 出 一 个 核 苷 酸 ( 如 下 划 线 所 示 ) 连 接 头 单 链 的 序 列 如 下 : A 5 -AATTCCCACGCGTGTCG-3, A 5 -pcgacacgcgtggg-3 B 5 -AATTCCCAACGCGTGTCG-3, B 5 -pcgacacgcgttggg-3 C 5 -AATTCCCAAACGCGTGTCG-3, C 5 -pcgacacgcgtttggg-3 在 10 DNA oligo annealing buffer(100 mmol/l Tris HCl,pH7.5,1 mol/l NaCl,10 mmol/l EDTA) 存 在 的 条 件 下,A 和 A,B 和 B 以 及 C 和 C 以 终 浓 度 100 µmol/l 进 行 混 合 在 95 变 性 5 min, 然 后 在 65 放 置 20 min, 自 然 冷 却 然 后 将 3 套 连 接 头 等 比 例 混 合, 同 双 链 cdna 按 照 摩 尔 比 的 比 例 在 16 进 行 连 接 所 用 的 连 接 酶 是 Invitrogen 的 T4 DNA Ligase, 因 为 它 的 缓 冲 液 中 含 有 PEG8000, 便 利 于 平 端 的 连 接 连 接 产 物 用 酚 氯 仿 抽 提 后, 加 入 100% 乙 醇,3 mol/l ph5.2 NaAc 和 糖 原 进 行 沉 淀 沉 淀 溶 于 纯 净 水 中 后, 加 入 限 制 性 酶 SalI(Fermentas) 进 行 酶 切 反 应 反 应 结 束 后, 将 反 应 液 在 含 有 EB 的 1% 琼 脂 糖 凝 胶,0.5 TBE 缓 冲 液 中 进 行 电 泳, 回 收 大 小 在 bp 的 DNA, 然 后 用 MiniElute Gel Extraction Kit(Qiagen) 纯 化 双 链 cdna 片 段, 并 进 行 定 量

3 370 动 物 学 研 究 29 卷 1.5 cdna 文 库 的 构 建, 文 库 DNA 的 提 取 与 克 隆 鉴 定 将 纯 化 的 cdna 片 段 与 用 EcoRI 和 XhoI 双 酶 切 (XhoI 与 SalI 所 切 出 的 粘 性 末 端 互 相 匹 配 ) 的 线 性 化 载 体 pgadt7(clontech), 按 照 摩 尔 比 7 1 的 比 例 进 行 连 接 连 接 产 物 用 酚 氯 仿 抽 提 后 沉 淀, 溶 于 15 µl 纯 净 水 中, 然 后 转 化 XL1-Blue Electroporation-Competent Cells(Stratagene) 转 化 后 的 细 菌 按 照 每 块 培 养 皿 150,000 克 隆 的 密 度 涂 布 于 15 cm 直 径 的 培 养 皿 中, 在 37 恒 温 条 件 下 培 养 14 h 然 后 用 含 有 25% 甘 油 的 LB 溶 液 将 克 隆 刮 下 来, 用 Qiagen plasmid Midi kit 提 取 质 粒 DNA, 将 所 提 取 的 所 有 的 DNA 合 并, 混 匀 后 以 小 份 分 装 并 且 冰 冻 储 存 1.6 cdna 文 库 质 量 的 鉴 定 挑 取 30 个 细 菌 单 克 隆 溶 于 10 µl LB 溶 液 中, 取 1 µl 作 为 模 板 进 行 PCR 所 用 的 引 物 是 MATCHMAKER 5 和 3 AD LD-Insert Screening Amplimer(Clontech), 专 门 用 于 扩 增 pgadt7 系 列 载 体 的 插 入 片 段 将 阳 性 的 克 隆 进 行 测 序, 然 后 与 相 应 的 mrna 进 行 序 列 对 比 以 确 定 插 入 片 段 在 基 因 中 的 位 置 最 后 取 一 定 量 的 文 库 总 DNA, 通 过 PCR 检 测 是 否 包 含 了 部 分 已 知 基 因 我 们 选 择 了 Sox2 krox20 slug Nkx6.3 Brunol2b Brunol4 mcpha 和 mcphb 共 8 个 基 因, 所 扩 增 的 片 段 长 度 分 别 为 和 360 bp 2 结 果 与 讨 论 2.1 总 RNA 与 mrna 质 量 的 鉴 定 在 总 RNA 提 取 后, 取 少 量 的 样 品 进 行 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳, 电 泳 后 在 紫 外 线 下 观 察 到 18S 和 28S RNA 的 条 带 清 晰 可 见, 无 降 解 现 象 在 进 一 步 纯 化 得 到 mrna 后, 取 少 量 的 样 品 进 行 RT-PCR 来 检 测 一 些 基 因 的 表 达, 显 示 mrna 的 代 表 性 良 好 2.2 双 链 cdna 的 合 成 为 了 克 服 常 规 随 机 引 物 构 建 文 库 所 导 致 的 插 入 片 段 方 向 上 的 随 机 性, 我 们 在 随 机 引 物 的 5 - 端 加 上 SalI 酶 切 位 点 的 最 后 两 位, 所 以 合 成 的 随 机 引 物 序 列 为 5 - pacnnnnnn-3 (Morris et al,1995) 没 有 加 上 完 整 的 酶 切 位 点 甚 至 更 多 的 保 护 性 碱 基 的 原 因, 是 考 虑 到 太 多 的 碱 基 可 能 会 产 生 序 列 上 的 倾 向 性 酶 切 位 点 的 另 外 4 个 碱 基, 是 在 连 接 头 双 链 的 后 四 位, 只 有 当 连 接 头 与 随 机 引 物 连 接 时 才 会 形 成 一 个 完 整 的 SalI 酶 切 位 点 连 接 头 在 5 - 端 将 保 持 一 个 粘 性 的 EcoRI 位 点 双 链 cdna 在 用 SalI 酶 消 化 后, 将 具 有 两 个 不 同 的 粘 性 末 端, 可 以 定 向 导 入 线 性 化 的 载 体 中 为 了 防 止 双 链 cdna 片 段 内 部 具 有 SalI 位 点 而 被 切 开, 我 们 用 dm 5 CTP 来 代 替 dctp, 产 生 甲 基 化 的 酶 切 位 点 GTm 5 CGAC, 从 而 不 能 被 SalI 切 开 ( 图 1) 与 Oligo(dT) 引 物 为 基 础 构 建 文 库 的 方 法 不 同, 在 使 用 随 机 引 物 的 情 况 下, 可 以 通 过 调 节 随 机 引 物 和 RNA 模 板 的 比 例 来 控 制 所 产 生 的 双 链 cdna 的 大 小 我 们 构 建 文 库 的 目 的 是 用 于 筛 选 蛋 白 - 蛋 白 相 互 作 用, 这 是 以 蛋 白 的 结 构 域 或 者 结 构 元 件 为 基 础 的, 不 需 要 cdna 全 长 我 们 用 36 期 的 胚 胎 总 RNA 为 模 板, 加 入 与 模 板 质 量 比 分 别 和 1 的 随 机 引 物 来 合 成 双 链 DNA 我 们 发 现 随 机 引 物 和 RNA 模 板 的 质 量 比 小 于 0.25 时, 产 生 的 双 链 cdna 的 量 比 较 少 ; 当 质 量 比 大 于 0.25 的 时 候, 产 生 的 cdna 的 量 比 较 多, 但 合 成 的 片 段 比 较 小 ; 比 例 在 0.25 的 时 候, 合 成 的 cdna 片 段 大 小 在 bp 之 间, 峰 值 约 在 1 kb 左 右, 产 生 的 cdna 的 量 也 合 适, 符 合 我 们 的 需 要 ( 图 2A) 我 们 利 用 2.5 µg 起 始 mrna, 采 用 的 随 机 引 物 与 mrna 的 质 量 比 为 0.25, 合 成 的 双 链 cdna 电 泳 结 果 如 图 2B 所 示 我 们 同 时 使 用 了 相 差 一 个 碱 基 的 3 套 连 接 头, 以 期 获 得 尽 量 多 的 含 有 正 确 读 码 框 的 克 隆 在 加 上 连 接 头 后, 我 们 采 用 胶 回 收 的 方 法, 获 得 大 小 在 bp 之 间 的 cdna 片 段, 然 后 用 Qiagen 的 MinElute gel extraction kit 进 行 纯 化, 获 得 双 链 cdna 约 1.2 µg 2.3 cdna 文 库 的 构 建 与 质 量 的 鉴 定 纯 化 的 双 链 cdna 与 EcoRI/XhoI 双 酶 切 的 pgadt7 载 体 进 行 连 接 连 接 产 物 纯 化 后, 先 取 少 量 来 确 定 电 转 化 细 菌 的 效 率, 然 后 全 部 进 行 转 化, 按 照 每 块 培 养 皿 ( 直 径 15 cm) 约 150,000 个 克 隆 涂 平 板, 总 共 获 得 约 个 独 立 克 隆, 每 块 培 养 皿 提 取 出 约 150 µg DNA, 我 们 最 后 得 到 了 约 7 mg 文 库 总 DNA 对 于 cdna 文 库 质 量 的 鉴 定, 首 先 是 检 测 不 含 有 插 入 片 段 的 空 克 隆 比 例 我 们 挑 出 30 个 单 克 隆 进 行 PCR, 发 现 有 两 个 不 含 有 插 入 片 段, 空 克 隆 比 例 为 6.67%, 小 于 预 期 的 10% 其 它 的 阳 性 克 隆 所 含 有 插 入 片 段, 大 小 基 本 上 都 在 bp 之 间,

4 4 期 武 景 阳 等 : 利 用 修 饰 的 随 机 引 物 构 建 非 洲 爪 蟾 酵 母 双 杂 交 定 向 cdna 文 库 371 图 1 利 用 修 饰 的 随 机 引 物 构 建 定 向 cdna 文 库 的 设 计 思 路 与 流 程 Fig. 1 Strategies for the construction of directional cdna libraries using modified random primers 图 2 双 链 cdna 的 合 成 Fig. 2 Synthesis of the double-stranded cdna A: 不 同 随 机 引 物 /RNA 比 例 所 获 得 的 双 链 cdna 的 片 段 大 小 与 产 量 有 所 不 同 ;B: 实 际 实 验 中 所 获 的 双 链 cdna 的 电 泳 图 A: amount and fragment size of the cdna products produced using different random primer/template ratios; B: the cdna products for the library construction. M, DNA 分 子 量 标 记 (DNA molecular weight marker);kb, 千 碱 基 对 (kilobase pairs) 也 符 合 预 期 值 ( 图 3) 为 了 检 测 文 库 中 插 入 序 列 的 方 向 性 及 代 表 性, 上 述 28 个 阳 性 克 隆 被 测 序, 其 中 20 个 克 隆 检 索 到 了 对 应 的 全 长 mrna, 其 插 入 方 向 都 是 正 确 的 我 们 分 析 了 克 隆 片 段 在 相 应 mrna 中 的 位 置 如 果 将 全 长 mrna 平 均 分 为 3 份, 插 入 片 段 位 于 mrna 的 5 - 端 中 间 和 3 - 端 的 比 例 为 ( 包 括 重 叠 的 部 分 ) 如 果 仅 仅 计 算 mrna 长 于 3 kb 的 7 个 克 隆, 比 例 为 ( 包 括 重 叠 的 部 分 ) 表 明 我 们 构 建 的 cdna 文 库 含 有 的 插 入 片 段 位 于 基 因 3 - 端 的 倾 向 性 较 低 Morris et al(1995) 所 报 告 的 插 入 片 段 位 于 基 因 的 5 - 和 3 - 端 的 百 分 比 分 别 为 62% 和 29%, 与 我 们 的 结 果 相 似 这 种 倾 向 性 的 原 因 尚 不 明 确 由 于 我 们 建 库 的 目 的 是 检 测 蛋 白 之 间 的 相 互 作 用 ( 用 于 酵 母 双 杂 交 ), 这 种 序 列 上 的 倾 向 性 应 该 对 将 来 筛 选 文 库 没 有 太 大 的 影 响 首 先, 基 因 尤 其 是 较 长 基 因 的 3 - 端 通 常 是 较 长 的 非 翻 译 区 而 不 是 编 码 蛋 白 的 读 码 框 ; 其 次 可 以 通 过 增 加 文 库 筛 选 的 克 隆 数 量 来 弥 补 这 种 倾 向 性 为 了 检 测 cdna 文 库 是 否 具 有 原 始 总 RNA 材 料 的 代 表 性, 我 们 选 择 了 Sox2 krox20 slug Nkx6.3

5 372 动 物 学 研 究 29 卷 图 3 cdna 文 库 空 载 率 和 插 入 片 段 大 小 的 PCR 检 测 Fig. 3 Detection of the ratio of empty clones and the size of the inserts by PCR *, 含 有 空 载 体 的 克 隆 (clones with empty vectors) 图 4 从 cdna 文 库 中 扩 增 不 同 基 因 片 段 的 结 果 Fig. 4 Detection of the presence of 8 known genes in the cdna library M, DNA 分 子 量 标 记 (DNA molecular weight marker); bp, 碱 基 对 (base pairs) Brunol2b Brunol4 mcpha 和 mcphb8 个 基 因 进 行 PCR 检 测 这 8 个 基 因 表 达 量 有 高 有 低, 其 中 Sox2 和 Brunol2b 表 达 水 平 比 较 高,Brunol4 和 mcpha 比 较 低,mcphB 尤 其 低 Brunol4 的 mrna 长 度 有 6 kb, 所 用 的 引 物 约 位 于 5 - 端 的 1.2 kb 处 PCR 的 结 果 表 明, 即 使 是 表 达 量 很 低 同 时 也 位 于 长 的 mrna 的 5 - 端 的 基 因 片 段 仍 然 可 以 从 文 库 中 扩 增 出 来, 证 明 文 库 能 够 真 实 地 反 映 总 RNA 材 料 的 代 表 性 ( 图 4) 根 据 以 上 的 分 析, 我 们 认 为 此 非 洲 爪 蟾 酵 母 双 杂 交 cdna 文 库 的 构 建 是 成 功 的 这 种 以 随 机 引 物 为 基 础 的 定 向 cdna 文 库 的 构 建 方 法 应 该 适 用 于 以 检 测 蛋 白 之 间 的 相 互 作 用 为 目 的 的 文 库 构 建, 比 如 酵 母 双 杂 交 和 噬 菌 体 展 示 文 库 等 参 考 文 献 : Gawantka V, Delius H, Hirschfeld K, Blumenstock C, Niehrs C Antagonizing the Spemann organizer: role of the homeobox gene Xvent-1 [J]. EMBO J, 14 (24): Haymerle H, Herz J, Bressan GM, Frank R, and Stanley KK Efficient construction of cdna libraries in plasmid expression vectors using an adaptor strategy [J]. Nucleic Acids Res. 14 (21): Kimmel AR, Berger SL Preparation of cdna and the generation of cdna libraries: Overview [J]. Methods Enzymol, 152: Morris B, Hammer B, Mierendorf R A novel strategy for directional cloning of random primed cdna [J]. Novagen innovations Newsletter, 3: 1-4. Nieuwkoop PD, Faber J Normal Table of Xenopus laevis (Daudin) [M]. Amsterdam: North-Holland Publishing Co. Sambrook J, Russell DW Molecular cloning: A Laboratory Manual, 3 rd ed [M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.