分析证书经验证, 在两步法 RT-qPCR 中, 对于不同起始量 (5 ng-0.5 fg) 的 RNA 逆转录产物, 使用 Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qpcr 预混液进行 qpcr 扩增其反应效率在 % 之间, 曲线斜率在 -

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荣齑依尔觉罗
5 years ago
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1 产品信息 Thermo Scientific Maxima 第一链 cdna 合成试剂盒 ( 适用于 RT-qPCR) #K1641,#K

2 分析证书经验证, 在两步法 RT-qPCR 中, 对于不同起始量 (5 ng-0.5 fg) 的 RNA 逆转录产物, 使用 Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qpcr 预混液进行 qpcr 扩增其反应效率在 % 之间, 曲线斜率在和之间, 且相关系数 >0.99 质量授权人 : Jurgita Zilinskiene 2

3 目录页码试剂盒组分... 4 贮存条件... 4 产品描述... 4 重要提示... 5 RT-qPCR 实验方案... 6 对照反应... 6 疑难解答... 7 参考文献

4 试剂盒组分 Maxima 第一链 cdna 合成试剂盒 ( 适用于 RT-qPCR) #K 次 #K 次 Maxima Enzyme Mix 100 μl 400 μl 5 反应混合液 200 μl 800 μl 无核酸酶的水 1.25 ml ml 贮存条件所有试剂盒成分都应贮存于 -20 C 产品描述 Thermo Scientific Maxima 第一链 cdna 合成试剂盒是合成 cdna 第一链的方便系统, 适用于两步法实时定量 RT-PCR(RT-qPCR) 中的 cdna 合成试剂盒采用先进的 Maxima 反转录酶 (RT), 该酶源自 M-MuL V 逆转录酶的体外进化这种酶相比 M-MuL V 逆转录酶热稳定性高, 扩增效果强劲且具有更高的 cdna 合成效率 Maxima 第一链 cdna 合成试剂盒能够在较高温度下 (55-65 ), 在很宽的总 RNA 量范围内 ( 从 1 pg 到 5 μg) 合成 cdna 合成反应能在分钟内完成 Maxima 第一链 cdna 合成试剂盒的各组分经预混合, 以节约时间和减少移液错误试剂盒由 Maxima Enzyme Mix 5 反应混合液无核酸酶的水三部分组成 Maxima Enzyme Mix 包含 Maxima 反转录酶和 Thermo Scientific Ribolock RNase 抑制剂重组的 Ribolock RNase 抑制剂能有效保护 RNA 模板在高于 55 时不被 RNase A B 和 C 降解 5 反应混合液包含剩余的反应组分 : 反应缓冲液 dntps Oligo(dT) 18 和随机引物无核酸酶的水用于反应体系的配制和 RNA 样本的溶解已通过相关检验证明其中不含脱氧核糖核酸内切酶脱氧核糖核酸外切酶核糖核酸酶和磷酸酶 4

5 重要提示避免核糖核酸酶污染 RNA 的纯度和完整性对于合成全长 cdna 至为重要 RNA 能够被 RNase A 降解, 而在任何实验环境中都能发现这种稳定的污染物本试剂盒中所有成分都经过严格检测, 确保其不含 RNase 为了避免污染, 实验环境以及所准备的试剂溶液都必须不含 RNase 避免 RNase 污染的一般建议 : 使用确保无核酸酶的实验器具, 或者用 DEPC 水处理 cdna 合成中所用到的反应管和枪头等整个实验过程中请戴手套, 因为皮肤是 RNA 酶的一个常见来源同时实验过程中注意经常更换手套使用无核酸酶的试剂, 包括高纯度的水 ( 如无核酸酶的水,#R0581) 未使用试剂盒时请严格密封保存在反转录过程中, 所有反应管要确保扣严模板 RNA 通过标准方法分离的总细胞 RNA 适用于该试剂盒纯化的 RNA 需确保不含盐分金属离子乙醇和苯酚, 以防其抑制 cdna 合成反应对于 RT-PCR, 模板 RNA 需确保没有 DNA 污染在 cdna 合成之前, 可先用无核酸酶的 DNase I(#EN0521) 去除痕量 DNA 实验中需要逆转录酶负对照反应该反应含有除 Maxima Enzyme Mix 以外的所有其他 RT 反应组分 RNA 样本质量在合成 cdna 之前需对 RNA 的完整性进行评估真核生物总 RNA 能够通过琼脂糖凝胶电泳后进行 EB 染色来分析检测如果总 RNA 电泳后有 18S 和 28S rrna 的锐利条带, 可认为 RNA 是完整的 28S RNA 条带的亮度大约为 18S rrna 条带的两倍 rrna 条带出现任何拖尾现象都表示 mrna 存在降解如果这种情况发生, 需重新制备总 RNA 样品另外, 也可用生物分析仪器 ( 如 Agilent 2100) 分析总 RNA, 该仪器能对 RNA 样本的大致状况,RNA 的完整数 (RIN)(2) 进行定量内参基因 / 目的基因 3 :5 完整性分析 (3) 也能用于检测 RNA 样本的完整性引物 Maxima 第一链 cdna 合成试剂盒包含 Oligo(dT) 18 引物和随机引物, 以引导第一链 cdna 的合成该引物混合物可确保检测低拷贝转录物时的高灵敏性 5

6 RT-qPCR 实验方案开始前请阅读本手册的重要提示部分 ( 第 5 页 ) 第一链 cdna 合成第一链 cdna 合成反应可以以单个反应进行, 而对于不同的 RNA 模板, 也可以进行一系列的平行反应因此, 反应混合液既可以通过将各组分溶液单独混合, 也可以将 RT 反应中除了 RNA 模板外的所有组分制成预混液解冻后, 轻轻涡旋并短暂离心试剂盒所有组分冰上放置 1. 在冰上, 将以下试剂按标明的顺序加入到无菌的无 RNase 的反应管中 5 反应混合液 4 μl Maxima Enzyme Mix 2 μl RNA 模板 1 pg-5 μg 无核酸酶的水 to 20 μl 总体积 20 μl 2. 轻轻混匀并离心孵育 10 分钟, 之后再 50 孵育 15 分钟注 : 若 RNA 模板量大于 1 μg, 则延长反应时间至 30 分钟若 RNA 模板富含 GC 或含有大量的二级结构, 可将反应温度提高至加热 5 分钟以终止反应该反转录反应产物能够直接用于 qpcr, 或者在 -20 条件下存放一周如需长时间贮存, 推荐贮存于 -70 另外应避免 cdna 的反复冻融 qpcr 第一链 cdna 合成的产物能够直接用于 qpcr 加入的合成的 cdna 第一链产物体积不应超过 PCR 反应总体积的 1/10 通常情况下, 在 25 μl 体系的 qpcr 反应中加入 2 μl 合成的 cdna 第一链作为模板 Maxima 第一链 cdna 合成试剂盒适于和 Maxima qpcr master mixes (#K0221 #K0231 #K0241 #K0251 #K0261) 搭配使用对照反应实验中应利用如下负对照来确认第一链 cdna 合成的结果 Reverse transcriptase minus(rt-) 负对照 :RT-PCR 和 RT-qPCR 中应利用此负对照来检验 RNA 样本中基因组 DNA 的污染情况此负对照 RT- 反应含有除 Maxima Enzyme Mix 以外的所有组分无模板负对照 (NTC): 此负对照用来检验试剂污染情况 NTC 反应含有除模板以外的所有组分 6

7 疑难解答问题没有 qpcr 产物或者 qpcr 产物出现很晚在 RT-minus 对照中出现 RT-qPCR 产物可能的原因及解决方案 RNA 模板不完整 RNA 的纯度和完整性对于 cdna 的合成和定量至关重要 cdna 合成之前需检测 RNA 的完整性 ( 见第 5 页 ) 按照所给的建议, 避免 RNA 污染 ( 第 5 页 ) 及弃掉低质量 RNA 使用新鲜制备的 RNA 不推荐使用多次反复冻融的 RNA 样本也不建议多次冻融合成的 cdna 模板纯度低 (RNA 样本中存在抑制剂 ) RNA 纯化过程中的残留试剂可能保留在溶液中, 抑制第一链的合成, 如 SDS EDTA 胍盐磷酸盐焦磷酸盐聚胺亚精胺为去除残留污染物, 重新用乙醇沉淀 RNA 并用 75% 乙醇冲洗模板量不足在第一链合成反应中按照推荐的水平增加 RNA 模板量在 DNase I 处理后, 在存在 EDTA( 结合 Mg 2+ ) 条件下通过加热使酶失活, 以此来终止反应若无螯合剂加入, 加热时 RNA 会发生水解模板 GC 含量高若 RNA 模板富含 GC 或含有大量的二级结构, 可将反应温度提高至 65 qpcr 中加入过量的 cdna 减少 qpcr/pcr 中 cdna 的量加入的合成的 cdna 产物体积不应超过 PCR 反应总体积的 1/10 RNA 模板存在 DNA 污染在负对照中出现 PCR 产物意味着反应中存在 DNA 污染为了避免基因组 DNA 参与扩增, 在外显子 - 外显子边缘设计引物, 或者在反转录前用 DNase I 消化 7

8 参考文献 1. Wiame, I., et al., Irreversible heat inactivation of DNaseI without RNA degradation, BioTechniques, 29, , Fleige, S., Pfaffl, M.W., RNA integrity and the effect on the real-time qrt-pcr performance, Mol. Aspects Med., 27, , Nolan, T., et al., Quantification of mrna using real-time RT-PCR, Nat. Protoc., 1, , 注 : 本产品或使用本产品都必须遵守美国专利申请 US A1 及相应的副本购买本产品包括购买非转让许可, 以便买方可将本产品用于其内部研究本产品的所有其他商业用途, 包括但不限于诊断用途原装或改装转售或利用产品提供商业服务, 均需要一份单独的许可证欲了解更多关于许可申请的信息, 请联系 ltvil.info@thermofisher.com 产品使用限制本产品的开发设计及销售专供研究和体外试验使用本产品不得用于诊断试验或药物开发, 也不适合向人或动物注射了解本产品的材料安全数据表, 请浏览 Thermo Fisher Scientific 公司, 版权所有所有其他商标均归 Thermo Fisher Scientific 公司或其子公司所有 8

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<4D F736F F D204B CBB5C3F7CAE9A3A8B5DAD2BBC1B463444E41BACFB3C9CAD4BCC1BAD0A3A92D312E646F63> RevertAid 第一链 cdna Synthesis 试剂盒 #K1621, #K1622 分析证明书 #K1621 Lot 质量控制采用 100 fg 对照 GAPDH RNA 和对照引物进行 RT-PCR 反应, 通过在 1% 琼脂糖上进行凝胶电泳和溴化乙锭染色显示得到足够量的 496 bp 的产物质量认证人 :Jurgita Zilinskiene 目录页码试剂盒组成.2 存储条件.2

分析证书 经验证, 在两步法 RT-qPCR 中, 对于不同起始量 (5 ng-0.5 fg) 的 RNA 逆转录产物, 使用 Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qpcr 预混液进行 qpcr 扩增 其反应效 率在 % 之间, 曲线斜率在 -

分析证书经验证, 在两步法 RT-qPCR 中, 对于不同起始量 (5 ng-0.5 fg) 的 RNA 逆转录产物, 使用 Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qpcr 预混液进行 qpcr 扩增其反应效率在 % 之间, 曲线斜率在 -