西安交通大学学报 医学版 第 卷 现阶段基因治疗因为产生严重的副作用及较弱 的靶向性而遇到了巨大挑战 肿瘤组织靶向性是肿瘤基因治疗成功的关键 因为治疗基因的过表达可以对肿瘤组织周围的正常组织细胞产生毒性作用 所以 寻找靶向性更强启动效率更高的治疗载体是肿瘤基因治疗的重大挑战之一 含有肿瘤组织特异启动

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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'& & 基础研究 热诱导肿瘤特异性基因治疗载体的靶向性鉴定 王孝珑 周培华 郑见宝 魏光兵 陈南征 姚建锋 孙小菊 孙学军 西安交通大学第一附属医院普通外科 陕西西安 陕西省人民医院普外一科 陕西西安 # 西安交通大学第二附属医院手术室 陕西西安 $ 摘要 目的 检测已构建热反应元件修饰的端粒酶逆转录酶 %&'% 基因启动子 #&%&'% 调控的基因表达载体肿瘤特异性和热诱导特性 方法 '%'("") *+ 和免疫细胞化学检测细胞内 %&'%,'-. 和蛋白表达水平 选择 %&'% 高表达和低表达的细胞株作为该研究阳性细胞株和阴性细胞株 收集前期已包装成功的热反应元件 #& 和人端粒酶逆转录酶启动子 %&'% 联合调控自杀基因 - 表达的慢病毒表达载体 # 病毒液 感染 %&'% / ($# 细胞及 %&'% 0 1-# 细胞 %&'% 0 1' 细胞 细胞免疫荧光技术检测该治疗载体的肿瘤特异性及热反应特性 并用 ("") *+ 和 '%' 分别检测热刺激条件下目的基因 - 在不同 %&'% 水平细胞株中的表达水平 结果 %&'%,'-. 及蛋白在 ($# 细胞中高表达 在 1-# 细胞和 1' 细胞中低表达甚至阴性表达 免疫荧光 '%' 和 ("") *+ 结果显示 #&%&'% 调控的目的基因 - 只有在 $ 处理下的 ($# 细胞中呈现高表达 而在阴性细胞株 1-# 和 1' 中 - 表达较少 而常温下 ($# 细胞中 - 的表达水平明显低于热处理组 结论 #& 修饰的 %&'% 启动子可以明显提高治疗载体的肿瘤特异性及热反应特性 关键词 热反应 %&'% 启动子 自杀基因 - 治疗载体 ("") *+'%' 细胞免疫荧光中图分类号 # 文献标志码.!"!#$%""%&" (.- 23+* "2!3 5& (&9!3424 &- -3:"4 ;.6823" ! 7-!"! "3),"+"")3*!)4")"2).2*23"+23* ")2 23 "3),"6 "+"")3*!)4")332)+223* "+*"+23*23 #"3),"+6")32+ '++,""+.2*23"+23* ")223 $23 '' "## ##'"( #) #*$+"+, & -+,."(,/,0("## & #(#1%#*$++,'1#*#+, "##*$+.#.##"".##"&#*.#" +, / $0$##+, 0!'##"+, 0!,/#"##. "( ##&0(",/,."--'" "#"&+,,'"-.$0$##(.!'#"!,/#&-'",'#*$0$##.( #" ""#".#.#"( 0(,/,"##& #-' ",'#*!'#"#*!,/#.. ""#"& +,""( #*$+## ### "& ( ) +, #"' #0(,/, ## 收稿日期 $ 修回日期 基金项目 国家自然科学基金资助项目 -+#-+# 陕西省科技统筹创新工程计划项目 -+%#!+)""-32+3*-3!)3*2""+! #-+#3"++)23"39 +32" *3 )+"+2""3%" +* )+2"-+%# 通讯作者 孙学军 &,32*!,32*!"! 优先出版 <2"<,"32*'#,*

2 西安交通大学学报 医学版 第 卷 现阶段基因治疗因为产生严重的副作用及较弱 的靶向性而遇到了巨大挑战 肿瘤组织靶向性是肿瘤基因治疗成功的关键 因为治疗基因的过表达可以对肿瘤组织周围的正常组织细胞产生毒性作用 所以 寻找靶向性更强启动效率更高的治疗载体是肿瘤基因治疗的重大挑战之一 含有肿瘤组织特异启动子和可诱导转录元件的治疗载体可能成为一种肿瘤 基因治疗有效的手段 人端粒酶逆转录酶!,3 "*+,")3")"")")3)23"%&'% 启动子是一种具有较好肿瘤组织特异性的启动子 但是其启动 效率较低 为了进一步提高该启动子在肿瘤组织中的表达特异性并增强其转录活性 并联合肿瘤热疗的综合治疗手段 根据热反应元件 "3+<"*","& 是肿瘤热疗中的关键调控元件 本课题组前期构建完成 # 个拷贝的 &#& 由 # 个重复的理想化的 & 片段...%%%... $ 构成 中间用 个任意碱基分开 和 %&' % 组成双靶向联合调控元件 调控大肠杆菌 - 基因表达的慢病毒表达载体 =>#&%&' %-=.# 并完成病毒包装及滴度测定 利用 # 病毒感染 %&'% / ($# 细胞及 %&'% 1-#1' 细胞 并在热刺激条件下检测稳定转染细胞株中目的基因 - 的表达 研究热处理对治疗载体 # 表达的调控作用 为利用热疗联合肿瘤慢病毒基因治疗提供实验依据 同时为下一步的细胞实验奠定了基础 * 材料与方法 ** 细胞系及主要试剂 %&'% / 人结肠癌细胞株 ($# 为实验组细胞 %&'% 0 人胃癌细胞株 1-# 和 %&'% 0 人胚肺上皮成纤维细胞株 1' 为对照组细胞 慢病毒表达载体 # 及对照慢病毒表达载体 =>72=.6- 病毒液均由本课题组前期保存 胎牛血清和 '19$1&1 培养基购自 2+ 公司 逆转录试剂盒及 ' 所用试剂和酶均购自 %33'3 公司 引物由上海生工生物工程有限公司合成 细胞 '9. 蛋白裂解液及?. 蛋白定量试剂盒均购自赛默飞世尔生物科技 中国 有限公司 =. 单克隆抗体购自 24,3 公司 %&'% 单克隆抗体购自上海生工生物工程有限公司 '-. 提取试剂盒 3 购自先锋生化科技有限公司 *+ 方法 *+*'%'("") *+ 和免疫细胞化学法筛选 %&'% 高表达及低表达细胞株 在, 培养皿中培养本课题组保存细胞株 融合时 弃培养液 冷? 冲洗 按 '-. 提取试剂盒 3 说明书提取总 '-. 取 = 总 '-.=)2," )2'% 13")12 和 = 无 '-. 酶水 在 = 体系中进行 -. 合成反应 %&'% 上游引物 A.%...%%...A 下游引物 A%.%.%%%...%A 扩增片段 内参照 32 上游引物 A%%..%..A 下游引物 A.%% %%..A 扩增片段 ' 条件均为 $ 变性,2 然后进行 个循环的扩增 $,2 %&'%' 循环数为 32 ' 循环数为 以 32 为内参照分析 %&'%,'-. 相对灰度水平 在, 培养皿中培养本课题组保存细胞株 融合时 弃培养液 '9. 裂解法提取上述细胞总蛋白?. 法测定蛋白浓度 与 B 凝胶加样缓冲液混合 #,2 使蛋白变性 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 湿转于 > 膜 >,2 以含脱脂奶粉的 %?% 封闭 加 %&'% 一抗 C 32 一抗 C $ 过夜 二抗 C 室温 &= 显影 凝胶成像系统扫描并计算相对灰度 将清洁 灭菌处理的盖玻片铺于 $ 孔板底部 将处于对数期生长课题组保存的上述细胞 B $,= 接种于板内 $# 待细胞长成单层后 取出盖玻片 用,,+*=? 冲洗两遍 再以多聚甲醛固定,2 %)2+ 固定,2 使用 %&'% 兔抗人一抗 C34+ 2+"$ 孵育过夜 空白对照采用? 代替一抗 加入 C 生物素化羊抗兔二抗室温孵育 然后滴加.? 试剂 孵育,2 最后用.? 显色 苏木素复染 光镜下观察拍照 2 软件计算图片相对灰度 *++ 细胞免疫荧光法检测目的蛋白 - 的表达 将清洁 灭菌处理的盖玻片铺于 $ 孔板底部 稳定转染细胞株 B $,= 接种于板中 待细胞贴壁后经过 或 $ 处理 $ 后 多聚甲醛固定 小牛血清封闭 兔 =. 单克隆抗体室温孵育 C 24,3 羊抗兔 9% 抗体 C 稀释室温孵育 "?2+2""3 2"4+.7. 然后将细胞用,,+*=? 清洗 加入.9C 孵育,2 冲去 阴性对照采用? 代替一抗 载玻片以甘油封片照相 *+,("") *+ 检测热刺激调控下细胞内 - 蛋白的表达水平 复苏实验所需细胞株 传代后分常温组和高温组 分别在 和 $ 培养 常温组

3 期 王孝珑 周培华 郑见宝 等 热诱导肿瘤特异性基因治疗载体的靶向性鉴定 及未感染细胞在普通培养环境中培养 $ 后 '9. 裂解法提取上述细胞总蛋白?. 法测蛋白浓度 与 B 凝胶加样缓冲液混合 #,2 使蛋白变性 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 湿转于 > 膜 >,2 以含脱脂奶粉的 %?% 封闭 加 =. 一抗 C 32 一抗 C $ 过夜 二抗 C 室温 &= 显影 凝胶成像系统扫描并计算相对灰度 *+-'%' 检测热刺激调控下细胞内 -,'-. 的表达水平 复苏实验所需细胞株 传代分为常温组和高温组 分别在 和 $ 处理 常温组及未感染细胞在普通培养环境中培养 # 后 用先锋 3'-. 提取试剂盒按说明书要求提取细胞总 '-. 并逆转录为 -. 以 32 为内参照 根据 "?3< 中大肠杆菌 - 基因片段序列 - $$ 设计如下引物并由上海生工生物科技有限公司合成 用 ' 方法扩增 - 其上游引物 A.%%...%%A 下游引物 A %%.%%%%.%.A 扩增片段 内参照 32 上游引物 A%%..%..A 下游引物 A.%%%%.. A 扩增片段 反应条件均为 = 的反应体系 $ 预变性,2 $ 变性 退火 延伸,2 - 个循环 32 个循环 最后 延伸,2 最后至 $ 终止 琼脂糖凝胶电泳观察结果 以 32 为内参照分析 %&'%,'-. 相对灰度水平 *, 统计学分析 软件分析数据 数据首先进行了正态性分布和方差齐性检查 组间比较采用两独立样本均数 检验 各组数据以 D 表示 为差异有统计学意义 + 结 果 +.* 细胞中 #/' 及蛋白的表达水平 为评估 %&'% 启动子在不同细胞中的启动活性 我们用 '%'("")*+ 和免疫细胞化学检测本课题组保存细胞中 %&'%,'-. 及蛋白水平 从实验得知 ($# 中的 %&'% 在,'-. 和蛋白水平上都呈现最高水平 而在 1-# 和 1' 细胞中 %&'% 呈现最低水平表达 甚至阴性表达 图 免疫细胞化学实验图片通过 2 软件分析得出 ($# 相对灰度为 D1-# 相对灰度为 D#1' 相对灰度为 D ($# 相对灰度高于 1-# 和 1' 差异具有统计学意义 均 且 ($# 相对灰度在我们课题组所选细胞株中最高 1-# 和 1' 相对灰度最低 2 统计图片数为 据此 我们选择 ($# 细胞作为该研究的阳性细胞株 选择 1-# 和 1' 作为阴性细胞株 图 *)-01/+0 和 细胞中 #/' 及蛋白表达水平 24%&'%,'-.3)+"2 ")"2+2 ($#1-#3 1'"*. 种细胞株中 %&'%,'-. 水平? 种细胞株中 %&'% 32,'-. 相对灰度值 免疫细胞化学检测 种细胞株中 %&'% 蛋白表达水平 B$2 软件计算免疫细胞化学检测的 种细胞 %&'% 蛋白染色的相对灰度值 & 种细胞株中 %&'% 蛋白的 ("") *+ 检测结果 %&'% 32 蛋白条带的相对灰度值

4 西安交通大学学报 医学版 第 卷 +.+0$% 呈现明显的肿瘤组织特性及热诱导性 重组慢病毒 # 和对照病毒 6- 感染 %&'% / ($# 细胞及 %&'% 0 1-#1' 细胞 嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞株 分别给予热处理及对照处理 $ 后 细胞免疫荧光技术检测 ($# 细胞 #($# 和 6-($# 1-##1-# 和 6-1-# 和 1' #1' 和 6-1' 细胞中 - 的表 达 #($# 细胞镜下可见胞质内有绿色荧光 且以 $ 处理组更为明显 而 #1-# 和 #1' 细胞质内无绿色荧光或荧光极弱 6- 病毒感染及未感染细胞中无绿色荧光 图 由此说明 #&%&'% 启动子能够调控治疗载体 # 仅在 %&'% 阳性细胞中表达 而在 %&'% 阴性细胞中不表达 且表达具有明显的热诱导特性 图 + 不同温度条件下目的蛋白 / 的表达 24-)+"2 ")"2+!")2")"",")3!)"B$ +., 热刺激上调 0)-01 细胞内 /#/' 的表达 '%' 结果显示 ($# 细胞 1-# 细胞及 1' 细胞中 -,'-. 表达阴性 6- 病毒感染 种细胞的 -,'-. 表达阴性 # 病毒感染 种细胞中 -,'-. 表达阳性 且 #($# 细胞 -,'-. 表达明显高于 #1-# 细胞 和 #1' 细胞 $ 处理组 -,'-. 水平高于常温处理组 琼脂糖电泳显示为 大小的特异性条带 图 以上显示 热诱导刺激可以通过对 #& 增强子的作用明显上调 - 基因的转录水平 且具有肿瘤特异性 图, 不同温度条件下目的基因 /#/' 的表达 24-,'-.")"2+!")2")"",")3!)".($# 细胞株?1-# 细胞株 1' 细胞株 不同温度条件下细胞株中 -,'-. 灰度比较 +.- 热刺激上调 0)-01 细胞内 / 蛋白的表达 ("")*+ 结果显示 ($# 细胞 1-# 细胞及 1' 细胞中 - 蛋白表达阴性 6- 病毒 种细胞 - 蛋白表达阴性 # 病毒转染 ($# 和 1-# 细胞中 - 表达阳性 #1' 未检测到 - 蛋白表达 且 #1-# 细胞中 - 蛋白表达水平极低 $ 处理使 #1-# 细胞中 - 蛋白表达水平上升 #($# 细胞 $ 处

5 期 王孝珑 周培华 郑见宝 等 热诱导肿瘤特异性基因治疗载体的靶向性鉴定 理组 - 蛋白水平明显高于 组 图 $ 以上显示 热诱导刺激可以通过对 #& 增强子的作用明显 上调 - 蛋白水平 且具有肿瘤特异性 图 - 不同温度条件下目的蛋白 / 的表达 24$-)+"2 ")"2+!")2")"",")3!)".($# 细胞株?1-# 细胞株 1' 细胞株 不同温度条件下细胞株中 - 蛋白灰度比较, 讨 论基因治疗是现阶段肿瘤治疗中一种颇具潜力的治 疗手段 但是 鉴于肿瘤治疗较差的靶向性 多数靶 # 基因可以引起正常细胞组织的附带毒性 所以提高肿瘤基因治疗中的靶向性是基因治疗发展的一大挑战 近年来有些研究通过改造载体及利用组织特异性靶基因可以达到一定程度的改善 我们是通过改造肿瘤组织特异性启动子来提高基因表达调控的靶向性 既往研究中涉及了许多此种类型的肿瘤特异性启动子 并取 得了很多令人满意的结果 包括 %&'% 启动子. 启动子 &. 启动子和纤维肉瘤中的刺激诱导 的 4)#?2 启动子 其中 %&'% 启动子已被证实 $ 具有较为广泛的肿瘤特异性 我们在该研究中发现 %&'% 启动子活性具有明显的肿瘤组织特异性 在高表达 %&'% 细胞株 ($# 中其转录活性较高 而在低表达或阴性表达 %&'% 的 1-# 和 1' 细胞中其活性极低 尽管如此 单纯 %&'% 启动子转录活性较弱 即使在 %&'% 高表达细胞株 ($# 中 为了解决这一问题及进一步增加肿瘤基因治疗的靶向性 并鉴于联合热疗的肿瘤综合治疗手段 我们将 %&'% 启动子和热反应元件 #& 联合 荧光素酶实验结果显示 #&%&'% 启动子活性获得了较大程度提升 尤其是在热处理后 本文未显示 从该研究中 我们可以得到 #& 可以明显增加 %&'% 启动子转录活性 但是该促进作用具有肿瘤特异性和热诱导特性 在 %&'% 低表达细胞株或常温作用下该促进作用极弱 只有在 %&'% 高表达细胞株且热刺激条件作用下才表现出其明显的促进作用 但是该研究采用单样本的 '%' 检测,'-. 水平表达 存在一定缺陷性 & 作为热诱导 基因转录表达的核心 组件 已被广泛应用于肿瘤基因治疗中 前期研究显示高温处理条件下 热休克转录因子 "3 +<)3)22+ 3+) 可以激活 基因启动子区域的 & 元件 这是热诱导基因治疗 的一个重要机制 表达受? 1. 蛋白 -? # 和 (% 调控 同时 & 的增强子活性可能受 和 影响 但是该机制需要进一步证实 总之 我们在体外实验中证实 #& 的导入可以明显增强 %&'% 启动子转录活性 且该促进作用具有明显的肿瘤特异性及热诱导特性 #& %&'% 只有在 %&'% 高表达的肿瘤细胞 ($# 中 且在热刺激条件下具有较高转录活性 而在 %&'% 低表达的肿瘤细胞 1-# 及人正常细胞 1' 中 其活性极低 我们研究显示 作为传统肿瘤综合治疗的一部分 热疗可以作为一种增强基因治疗靶向性的手段 同时 本研究成功的对热刺激诱导的肿瘤特异性基因治疗载体 # 的 %&'% 靶向性及热诱导性进行了鉴定 为后续该治疗载体 # 在体内及体外的功能研究奠定了基础 参考文献 2,+, +'++13+/!&##( #### "# &",#$& '++13+/!4,!+%!511+,,& " &" $$#& 贺赛 郑见宝 孙学军 等 & 缺氧诱导的肿瘤特异性基因治疗载体的靶向性鉴定 & 西安交通大学学报 医学版 $$ $$& 下转第 # 页

6 # 西安交通大学学报 医学版 第 卷 参考文献,+&##"# &##"$33$##$#$& *'1+, /1+1' /$,%+,+& ## &2# & $$$'2 1'$1/&$ &/#1#& $12/*' 66' 1&( ## ## " # 1$1 1$1,*"-/ # &! / # & 21322! /*7'0& (( &!"!!"$$& +$$+'3,2/ 1$%0+,37&!- #&/ $& 李月光 马波 李文林 等 & 胰腺癌组织中胰腺星状细胞的活化和基质金属蛋白酶 的表达 & 郑州大学学报 医学版 # $$& #$/*'++,*' 07'+1!&# ###!! ####"## -""/! &/$# & '++,+*!'!*1+'3,',02$3,2/ 3&*-#".# "# ##"# #"#"###&# & /,'+112!,2 &#"#!"(!#") &!#(!3,#& 张涓娟 蒲宇 李勇 等 & 和!+, 信号通路对胰腺癌 '/ 细胞 %+ 表达的影响 & 川北医学院学报 $$$$#& ' '/ 2 7&#( ##-("( (# ####"-##&2 #$$$$& /*+' 02' 6* &3#(!! -!""##"#& /3#& $6'/!1++1'//&#$#""! #" '"#" - -""*/#&3 ####& **'+/2/!'$&+- #( "# "#"".&2# $#$##& ' */7*' '&$"!! ""#" "####&/# & 216/*' */1+ *&$###!!-+,$. &/ $& 编辑 韩维栋 上接第 页 $2,'+, %$,/*1+,/&!#" #"-#"#&/,#$$$& $*+' 1/*+' 7*' 6&!6/'#8 (".##8# ") " " &$ # & 贺赛 孙学军 郑见宝 等 &+,/+ 及 /!% 启动子在人结肠癌细胞株中的转录活性比较 & 中国普通外科杂志 & ''$11+'+,+++1$+'!1& ##.".""&!"& # 易芳 陈建业 & 重组腺病毒载体在肿瘤基因治疗中的应用 & 川北医学院学报 $$& 王宏芳 吴嘉慧 刘纯岩 等 & 携带,1 基因的条件复制型腺病毒载体的构建及其辐射诱导表达 & 吉林大学学报 医学版 $$$$& '++ 6+,$*!!2'2$&* -( ####.## # "#&'###", & 王炜 孙学军 王伟 等 & 缺氧微环境对 $$ 诱导的抗 /+/ 结肠癌 1% 细胞免疫治疗的调控 & 中国肿瘤生物治疗杂志 #$& 李锦洲 祁岩超 罗超权 等 &/+ 重组痘苗病毒对实验性 /+ 阳性肝癌的预防和治疗作用 & 郑州大学学报 医学版 $&,76$1!'',$'&#.""#""# "#&!/# & $1!*12717*26&+,(" ###,.&2#, #$& $',631'+!+,$12%&# " *$. " *$+ (#&$$#$&!4'+72,7!2'1,$1/+2&*#) # &/2# &,++1!+' %*02'!&/# ).#)#(" *$3" #)"#&$ $& # 崔艳 曹小平 & 核转录因子 3 的研究进展 & 川北医学院学报 $&!,*6!+&*$ "##&/# $#& 1+/*!3+$01+, 1&*# #( *"#." (!"" # & #& 编辑 韩维栋

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