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1 将 中 国 药 典 测 定 胰 岛 素 的 方 法 转 换 为 使 用 Agilent Poroshell 色 谱 柱 的 方 法 应 用 报 告 生 物 制 药 作 者 Rongjie Fu 安 捷 伦 科 技 有 限 公 司 ( 上 海 ) 英 伦 路 4 号 上 海 3 中 国 摘 要 中 国 药 典 (Ch. P) 规 定 的 检 验 胰 岛 素 的 方 法 需 使 用 传 统 的 mm 或 mm, 5 µm 的 C8 液 相 色 谱 柱 这 两 种 柱 长 的 传 统 5 µm 填 料 色 谱 柱 的 胰 岛 素 峰 柱 效 都 很 低 本 应 用 报 告 采 用 Agilent Poroshell EC-C8 色 谱 柱 或 Agilent Poroshell SB-C8 色 谱 柱 取 代 传 统 的 色 谱 柱 进 行 胰 岛 素 分 析 采 用 Poroshell 色 谱 柱 后 调 整 的 方 法 显 著 提 高 了 柱 效 和 分 离 度, 并 且 仍 满 足 Ch. P 或 美 国 药 典 (USP) 规 定 方 法 的 要 求
2 引 言 胰 岛 素 是 由 5 个 氨 基 酸 组 成 的 一 种 肽 类 激 素, 分 子 量 为 588 道 尔 顿 它 产 生 于 胰 腺 中 的 朗 格 汉 斯 岛 ( 胰 岛 ) 不 同 动 物 之 间 胰 岛 素 的 结 构 略 有 差 异 由 于 碳 水 化 合 物 代 谢 控 制 作 用 不 同, 导 致 动 物 胰 岛 素 的 效 力 与 人 类 胰 岛 素 不 同 牛 胰 岛 素 与 人 胰 岛 素 只 有 三 个 氨 基 酸 残 基 不 同, 猪 胰 岛 素 与 人 胰 岛 素 最 接 近 胰 岛 素 已 广 泛 用 于 型 和 某 些 型 糖 尿 病 的 治 疗 Ch. P [] 和 USP [] 规 定 了 长 耗 时 的 等 度 洗 脱 方 法 进 行 胰 岛 素 的 含 量 测 定 及 长 耗 时 的 梯 度 洗 脱 方 法 进 行 胰 岛 素 的 有 关 物 质 检 查 这 两 种 方 法 的 含 量 测 定 采 用 了 相 同 的 HPLC 条 件, 但 用 于 有 关 物 质 分 析 的 梯 度 洗 脱 方 法 略 有 不 同 本 应 用 报 告 首 先 按 照 Ch. P 规 定 的 HPLC 方 法 条 件, 采 用 Agilent ZORBAX SB-C8,4.6 5 mm,5 µm 色 谱 柱 或 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8,4.6 5,5 µm 色 谱 柱 测 定 胰 岛 素 的 含 量 和 有 关 物 质 然 后 将 方 法 转 移 至 表 面 多 孔 颗 粒 的 Agilent Poroshell 色 谱 柱 上, 该 色 谱 柱 可 达 到 与 用 于 快 速 分 离 的 亚 µm 色 谱 柱 相 似 的 柱 效 材 料 与 方 法 Ch. P 中 测 定 猪 胰 岛 素 有 关 物 质 和 含 量 的 HPLC 条 件 : 色 谱 柱 十 八 烷 基 硅 烷 键 合 硅 胶 (C8) 流 速. ml/ 进 样 量 µl 柱 温 4 C 检 测 波 长 4 nm 用 于 有 关 物 质 检 查 的 流 动 相 : 流 动 相 A. mol/l 硫 酸 盐 缓 冲 液 ( 将 8.4 g 无 水 硫 酸 钠 溶 于 ml 水 中, 加 入.7 ml 磷 酸, 并 用 乙 醇 胺 调 ph 至.3, 混 匀 )- 乙 腈 (8:8) 流 动 相 B 乙 腈 : 水 (5:5) 参 考 以 下 梯 度 洗 脱 程 序, 调 整 流 动 相 的 组 成 和 等 度 洗 脱 区 间, 以 得 到 大 约 为 5 的 胰 岛 素 保 留 时 间,A- 脱 酰 胺 胰 岛 素 则 刚 好 在 梯 度 洗 脱 开 始 之 前 出 峰 时 间 () %B 用 于 含 量 测 定 的 流 动 相 : 流 动 相 A. mol/l 硫 酸 盐 缓 冲 液 ( 将 8.4 g 无 水 硫 酸 钠 溶 于 ml 水 中, 加 入.7 ml 磷 酸, 并 用 乙 醇 胺 调 节 ph 至.3, 混 匀 ) 流 动 相 B 乙 腈 : 水 (74:6) 本 文 所 用 材 料 样 品 猪 胰 岛 素 ( 由 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 提 供 ) 色 谱 柱 Agilent ZORBAX SB-C8, mm, 5 µm ( 部 件 号 ) Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8, mm, 5 µm ( 部 件 号 ) Agilent Poroshell SB-C8, 4.6 mm,.7 µm ( 部 件 号 ) Agilent Poroshell EC-C8, 4.6 mm,.7 µm ( 部 件 号 ) 色 谱 系 统 Agilent SL LC 系 统, 配 备 二 元 泵 柱 温 箱 (TCC) 高 效 自 动 进 样 器 和 二 极 管 阵 列 检 测 器 (DAD) 结 果 与 讨 论 传 统 的 色 谱 柱 Ch. P 规 定 的 色 谱 柱 填 料 为 十 八 烷 基 硅 烷 键 合 硅 胶 (C8), 该 填 料 也 属 于 USP L 填 料 Ch. P 方 法 通 常 使 用 传 统 的 5 µm 填 料 色 谱 柱, 但 在 结 果 满 足 要 求 的 情 况 下, 也 可 使 用 更 小 粒 径 填 料 的 色 谱 柱 因 此, 首 先 采 用 Agilent ZORBAX SB-C8,4.6 5 mm,5 µm 色 谱 柱 运 行 该 方 法, 根 据 Ch. P 方 法 的 要 求, 调 整 流 动 相 的 组 成 以 使 胰 岛 素 的 保 留 时 间 大 约 为 5 有 关 物 质 和 含 量 测 定 的 色 谱 图 分 别 见 图 和 图 胰 岛 素 分 析 的 系 统 适 用 性 实 验 要 求 胰 岛 素 峰 和 A- 脱 酰 胺 胰 岛 素 峰 的 分 离 度 不 小 于.8, 且 胰 岛 素 峰 的 拖 尾 因 子 不 大 于.8 如 图 和 图 所 示, 这 两 种 传 统 的 色 谱 柱 均 满 足 Ch. P 中 系 统 适 用 性 实 验 的 要 求 与 SB-C8 色 谱 柱 相 比,Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8 色 谱 柱 展 现 了 更 为 对 称 的 色 谱 峰 及 更 高 的 柱 效, 这 可 能 是 由 于 两 种 色 谱 柱 之 间 的 两 点 差 异 造 成 的 第 一 个 差 异 是 Eclipse Plus C8 色 谱 柱 完 全 封 端, 而 SB-C8 色 谱 柱 未 封 端 封 端 的 色 谱 柱 通 常 使 碱 性 化 合 物 获 得 更 好 的 峰 形 第 二 个 差 异 是 孔 径 不 同 (Eclipse Plus C8 颗 粒 孔 径 为 95 Å,SB-C8 颗 粒 孔 径 为 8Å) 较 大 孔 径 的 Eclipse Plus C8 色 谱 柱 有 利 于 扩 散, 进 而 提 高 柱 效 并 改 善 峰 形
3 5 () %B N = 73 Tf =.6 Norm A- Rs = N = 588 Tf = 图. 采 用 传 统 的 Agilent ZORBAX SB-C8 色 谱 柱 (4.6 5 mm,5 µm) 进 行 有 关 物 质 分 析 的 色 谱 图 mau Agilent ZORBAX SB-C mm, 5 µm N = 76 Tf =.7 Rs = %A - 6%B µl A- 5 N = 774 Tf = mau 3 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C mm, 5 µm 5 5 N = 845 Tf =. Rs = 3. 5 N = 489 Tf = 图. 采 用 传 统 的 Agilent ZORBAX SB-C8 色 谱 柱 (4.6 5 mm,5 µm) 和 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8 色 谱 柱 (4.6 5 mm,5 µm) 进 行 含 量 测 定 的 色 谱 图 3
4 Agilent Poroshell 色 谱 柱 本 研 究 通 过 采 用 Agilent Poroshell SB-C8 色 谱 柱 (4.6 mm,.7 µm) 来 实 现 胰 岛 素 中 有 关 物 质 分 析 方 法 的 转 换 对 流 动 相 组 成 稍 作 调 整 以 满 足 Ch. P 的 相 关 要 求 当 将 原 方 法 调 整 成 为 一 个 新 方 法 时 必 须 重 新 计 算 相 关 的 梯 度 洗 脱 时 间 和 进 样 量 为 保 证 分 离 度 和 整 体 分 离 效 果, 应 保 持 方 程 中 组 分 的 保 留 指 数 K* 恒 定 方 程 : K*= (tgf)/(s DF Vm) 其 中 : t G 表 示 洗 脱 时 间 F 表 示 流 速 S 是 一 个 常 数 Vm 表 示 柱 体 积 (Vm= P (d/) (L)(.6), L 表 示 柱 长, d 表 示 柱 内 径 ) DF ΔΦ 表 示 梯 度 程 序 中 有 机 相 改 变 的 百 分 比 根 据 方 程, 在 柱 内 径 和 柱 长 改 变 时 需 相 应 改 变 流 速 和 梯 度 洗 脱 时 间 为 保 证 色 谱 峰 的 响 应 与 原 方 法 一 致, 进 样 量 需 按 比 例 随 柱 体 积 调 整 ( 方 程 ) 方 程 : (d /) L = (d /) L 其 中 : d, d 分 别 代 表 柱 柱 的 柱 内 径 L, L 分 别 代 表 柱 柱 的 柱 长 采 用 Agilent Poroshell SB-C8 色 谱 柱 (4.6 mm,.7 µm) 运 行 一 个 新 的 梯 度 洗 脱 方 法, 用 于 分 离 分 析 胰 岛 素 中 的 有 关 物 质 色 谱 图 及 相 关 数 据 见 图 3 采 用 Poroshell SB-C8 色 谱 柱 (4.6 mm,.7 µm) 和 Poroshell EC-C8 色 谱 柱 (4.6 mm,.7 µm) 运 行 含 量 测 定 方 法 采 用 Poroshell 色 谱 柱 获 得 的 色 谱 峰 与 传 统 的 SB-C8 色 谱 柱 获 得 的 色 谱 峰 ( 图 ) 相 比, 在 许 多 方 面 得 到 了 改 善, 诸 如 峰 型 柱 效 和 分 离 度 Poroshell 色 谱 柱 的 柱 效 比 传 统 5 µm 色 谱 柱 高 4 到 6 倍 采 用 Poroshell 色 谱 柱 分 析 检 测 到 一 些 微 小 的 杂 质 峰 ( 图 3), 这 是 由 于 采 用 了 表 面 多 孔 的 色 谱 柱 增 加 了 柱 效 提 高 了 分 析 灵 敏 度 改 善 了 峰 型 和 分 离 度 当 然, 这 些 杂 质 可 能 也 存 在 于 用 传 统 5 µm 色 谱 柱 分 离 的 过 程 中, 但 其 低 柱 效 的 宽 峰 降 低 了 分 离 度, 以 至 于 很 难 检 测 到 这 些 杂 质 () %B A µl 4 Rs =.4 4 N = 96 Tf =. 3 Rs = N = 997 Tf = 图 3. 采 用 Agilent Poroshell SB-C8 色 谱 柱 (4.6 mm,.7 µm) 分 析 胰 岛 素 中 有 关 物 质 的 色 谱 图 4
5 mau Agilent Poroshell SB-C8 (4.6 mm,.7 µm) N = 86 Tf =.6 Rs = %A - 6%B 3.33 µl A- N = 377 Tf =.97 mau Agilent Poroshell EC-C8 (4.6 mm,.7 µm) N = 9768 Tf =. Rs=6. N = 7 Tf = 图 4. 采 用 Agilent Poroshell SB-C8 色 谱 柱 (4.6 mm,.7 µm) 和 Poroshell EC-C8 色 谱 柱 (4.6 mm,.7 µm) 分 析 胰 岛 素 的 色 谱 图 采 用 Agilent Poroshell SB-C8 和 EC-C8 色 谱 柱 分 析 胰 岛 素 能 获 得 良 好 的 分 离 性 能 ( 图 4) 它 们 可 轻 易 满 足 系 统 适 用 性 实 验 的 要 求 表 面 多 孔 的 Poroshell 色 谱 柱 所 具 有 的 小 粒 径 (.7 µm) 和 大 孔 径 ( Å) 的 特 点, 使 其 分 离 性 能 得 到 极 大 提 升 关 于 Poroshell 系 列 色 谱 柱 填 料 孔 径 粒 径 和 分 子 量 之 间 关 系 的 更 多 信 息, 见 应 用 报 告 CHCN 进 样 的 重 现 性 对 于 可 靠 的 分 析 结 果 十 分 重 要 Ch. P 要 求 连 续 5 次 重 复 进 样 的 相 对 标 准 偏 差 (RSD) 小 于 % 这 是 大 多 数 LC 方 法 的 一 个 典 型 要 求 采 用 Poroshell 色 谱 柱 ( 图 5) 分 析 猪 胰 岛 素 和 A- 脱 酰 胺 胰 岛 素, 连 续 重 复 进 样 5 次, 其 峰 面 积 的 RSD 值 分 别 为.% 和.4%, 轻 松 满 足 该 项 要 求 Norm RSD =.% 4 3 RSD =.4% 图 5. 采 用 Agilent Poroshell SB-C8 色 谱 柱 (4.6 mm,.7 µm) 连 续 进 样 5 次 获 得 的 叠 加 色 谱 图 5
6 结 论 胰 岛 素 分 析 方 法 从 传 统 的 5 µm 色 谱 柱 上 成 功 转 换 到 表 面 多 孔 的 Agilent Poroshell 色 谱 柱 上, 分 析 性 能 得 到 显 著 提 升 粒 径 为.7 µm, 孔 径 为 Å 的 Poroshell 填 料 色 谱 柱 能 高 效 地 分 析 小 分 子 蛋 白, 如 胰 岛 素, 且 容 易 满 足 Ch. P 胰 岛 素 分 析 的 系 统 适 用 性 实 验 要 求 采 用 Poroshell 色 谱 柱 的 新 方 法 非 常 适 合 用 于 胰 岛 素 的 质 量 控 制 分 析 参 考 文 献. 中 国 药 典 ( 版 ), 胰 岛 素, 美 国 药 典 USP 3( 第 卷 ), 胰 岛 素, 更 多 信 息 如 需 了 解 我 们 产 品 和 服 务 的 更 多 信 息, 请 访 问 我 们 的 网 站 安 捷 伦 对 本 资 料 可 能 存 在 的 错 误 或 由 于 提 供 展 示 或 使 用 本 资 料 所 造 成 的 间 接 损 失 不 承 担 任 何 责 任 本 资 料 中 的 信 息 说 明 及 技 术 规 格 等 如 有 变 更, 恕 不 另 行 通 知 安 捷 伦 科 技 ( 中 国 ) 有 限 公 司, 年 9 月 日, 中 国 印 刷 CHCN
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